UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

Katedra biochemických věd

Kolorektální karcinom - klinickobiochemické vyšetření

Bakalářská práce

Vedoucí bakalářské práce: PharmDr. Miloslava Netopilová, PhD.

Hradec Králové 2010 Jana Kämpfová

2

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.

3

Obsah 1 ÚVOD ................................................................................................................................ 5

2 TLUSTÉ STŘEVO ............................................................................................................ 6

2.1 Anatomie tlustého střeva ............................................................................................. 6

2.1.1 Slepé střevo (caecum) .......................................................................................... 6

2.1.2 Tračník (colon) ..................................................................................................... 6

2.1.3 Konečník (rectum) ................................................................................................ 7

2.2 Histologie střevní stěny ............................................................................................... 7

3 KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM ...................................................................................... 9

3.1 Definice ....................................................................................................................... 9

3.2 Výskyt .......................................................................................................................... 9

3.3 Etiologie ..................................................................................................................... 10

3.4 Zevní faktory ............................................................................................................. 10

3.4.1 Tuk a maso ......................................................................................................... 10

3.4.2 Obezita a hyperinzilínemie ................................................................................. 10

3.4.3 Kouření a alkohol ............................................................................................... 10

3.4.4 Rostlinná strava .................................................................................................. 11

3.4.5 Reprodukční aktivita a hormonální léčba ........................................................... 11

3.5 Vnitřní faktory ........................................................................................................... 11

3.5.1 Věk ..................................................................................................................... 11

3.5.2 Rodinná anamnéza ............................................................................................. 12

3.5.3 Idiopatické střevní záněty ................................................................................... 12

3.5.4 Střevní polypy .................................................................................................... 12

3.6 Typy nádorů ............................................................................................................... 12

3.7 Patogeneze ................................................................................................................. 13

3.8 Klinický obraz ........................................................................................................... 14

3.9 Diagnostika ................................................................................................................ 14

4 NÁDOROVÉ MARKERY .............................................................................................. 16

4.1 Obecná charakteristika............................................................................................... 16

4.1.1 Rozdělení nádorových markerů.......................................................................... 16

4.1.2 Statistická charakteristika markerů .................................................................... 16

4.1.3 Poţadavky .......................................................................................................... 17

4.1.4 Kinetika nádorových markerů ............................................................................ 18

4.1.5 Význam před- a pooperačních hodnot nádorových markerů ............................. 18

4.1.6 Význam nádorových markerů pro kontrolu efektu terapie ................................ 19

4.1.7 Faktory ovlivňující stanovení a interpretaci nádorových markerů ..................... 19

4.2 Karcinoembryonální antigen ..................................................................................... 20

4.3 CA 19-9 ..................................................................................................................... 21

4.4 CA 72-4 ..................................................................................................................... 22

4.5 Tkáňový polypeptidový antigen, tkáňový polypeptidový specifický antigen .......... 22

5 DALŠÍ VYŠETŘENÍ ....................................................................................................... 24

5.1 Hematologická vyšetření ........................................................................................... 24

5.2 Test na okultní krvácení............................................................................................. 24

6 METODY STANOVENÍ ................................................................................................. 26

7 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................ 30

7.1 Automatické analyzátory ........................................................................................... 30

7.1.1 Analyzátor COBAS E 411 ................................................................................ 30

4

7.1.2 Analyzátor IMMULITE 1000 ........................................................................... 30

7.1.3 Analyzátor IMMULITE 2000 ........................................................................... 30

7.1.4 Analyzátor IMX ................................................................................................ 31

7.2 Hladiny nádorových markerů u pacientů s kolorektální karcinomem ...................... 32

7.2.1 Zhoubný nádor tlustého střeva .......................................................................... 32

7.2.2 Zhoubný nádor rektosigmoideálního spojení .................................................... 37

7.2.3 Zhoubný nádor rekta ......................................................................................... 40

8 ZÁVĚR ............................................................................................................................. 44

9 LITERATURA ................................................................................................................. 45

10 SEZNAM ZKRATEK ...................................................................................................... 46

5

1 ÚVOD Zhoubné nádory obecně patří mezi nejčastější příčiny úmrtí ve všech civilizovaných ze-

mích. Karcinomy tlustého střeva a konečníku jsou jedny z nádorových onemocnění, jejichţ

výskyt v poslední době, hlavně díky špatnému ţivotnímu stylu, stoupá. Hlavním cílem, jak

zabránit rozvoji a nevratným následkům nádorového onemocnění, je co nejvčasnější diagnóza

a zastiţení nádoru v počátečním stádiu. K tomuto účelu se pouţívá řada zobrazovacích metod,

které však často nejsou dostatečně citlivé, aby právě v počátečním stádiu nádor zachytily.

Takovou moţnost nabízí stanovení nádorových markerů.

Ačkoliv je nádorových markerů velké mnoţství, mají omezenou specifitu a často se mo-

hou kombinovat, jejich stanovením pomocí imunochemických metod lze často prokázat nádor

aţ tisíckrát menší neţ pouţívanými zobrazovacími metodami. Stanovení tumorových markerů

nabízí mnoho variabilních moţností vyuţití, jak pro diagnostiku nádorů, tak i pro monitoring

následné léčby. I proto jsem si toto zajímavé téma vybrala pro svou Bakalářskou práci.

Cílem mé práce je podat přehled a vlastnosti nádorových markerů používaných v současnosti k diagnostice kolorektálního karcinomu. Ukázat možnosti jejich použití, případně kombinace markerů vhodné pro konkrétní karcinom.

6

2 TLUSTÉ STŘEVO

2.1 Anatomie tlustého střeva

Tlusté střevo (intestinum crassum) je poslední úsek trávicí trubice, asi 1,5 m dlouhý, který po stranách a nahoře obkružuje kličky tenkého střeva. Začíná v pravé jámě kyčelní nejobjemnější částí – slepým střevem (caecum), pokračuje jako tračník (colon) vzestupný, příčný, sestupný, který přechází do esovité kličky. Na ni navazuje poslední část tlustého střeva – konečník (rektum), ležící již v malé pánvi. Hlavní funkcí je vstřebá-vání vody a zahuštění obsahu. Sliznice tlustého střeva je bez klků a tvoří poloměsíčité řasy. Obsahuje velké množství hlenových žláz, jejichž produkt chrání sliznici. Svalovina má dvě vrstvy, cirkulární a podélnou. Smrštěním cirkulární svaloviny vznikají výpuky, jejich poloha se mění; postupují od slepého střeva ke konečníku a posunují střevní ob-sah. Zesílením podélné svaloviny vznikají tři bělavé, podélné pruhy táhnoucí se celým tlustým střevem od apendixu až po konečník (taenie). Jejich poloha se mění. V místě tae-nií se ještě nacházejí zvláštní menší stopkaté vychlípeniny peritoneálního povlaku tlus-tého střeva (appendices epiploicae), obsahující tuk, který jim dodává žlutou barvu. Tlusté střevo zásobuje a. mesenterica superior a inferior, ke konečníku přicházejí ještě větve z vnitřní kyčelní tepny, a. iliaca interna. Žíly z tlustého střeva až po horní část konečníku odvádějí krev do v. portae, ze zbytku konečníku pak do dolní duté žíly. Ve stěně koneční-ku (v horní části) tak je další portokavální anastomóza (při přetlaku ve v. portae vznikají vnitřní hemeroidy). V podkoží kolem análního otvoru jsou žilní pleteně, které se mohou patologicky rozšiřovat a vznikají pak zevní hemeroidy. Míza odtéká přes předsunuté uzliny u stěny střeva do coeliackých uzlin, z rekta pak do uzlin v malé pánvi. Inervaci hladké svaloviny tlustého střeva zabezpečují autonomní nervy, zevní příčně pruhovaný svěrač konečníku je inervován míšními nervy a podléhá volní kontrole (Lukáš a kol., 2005).

2.1.1 Slepé střevo (caecum)

Slepé střevo leží v pravé jámě kyčelní, zleva do něj ústí konečná část tenkého střeva, ileum. Ústí je opatřeno řasou (valva ileocaecalis), která brání zpětnému posunu obsahu. Na dolním konci odstupuje červovitý přívěsek (appendix vermiformis), dlouhý průměrně 5 – 10 cm. Stálou polohu má jen jeho začátek, který se promítá do bodu ležící-ho na čáře spojující přední horní trn kosti kyčelní s pupkem, asi 6 cm od trnu. Konec mů-že zaujímat skoro jakoukoliv polohu v dutině břišní nebo pánevní. Při nejčastější poloze směřuje apendix dolů do malé pánve. Nachází se v něm velké množství lymfatické tkáně, která je příčinou častých zánětů apendixu (Lukáš a kol., 2005).

2.1.2 Tračník (colon)

Na slepé střevo navazuje vzestupný tračník (colon ascendens), který probíhá vzhůru po pravé straně břišní dutiny (přirostlý na zadní stěnu) až po játra, kde jaterním ohbím přechází do tračníku příčného (colon transversum). Příčný tračník kříží břišní du-tinu zprava doleva až ke slezině. Je zavěšen na peritoneálním závěsu (mesocolon

7

transversum), a jako girlanda visí před kličkami tenkého střeva dolů. Slezinným ohbím přechází pak do sestupného tračníku (colon descendens), který jde podél levé stěny břiš-ní do levé jámy kyčelní, kde pokračuje v esovitou kličku (colon sigmoideum). Sestupný tračník je opět fixován k zadní stěně břišní, esovitá klička má závěs – mesosigmoideum, je tedy pohyblivá a vstupuje do malé pánve, kde na ni navazuje poslední úsek tlustého střeva, konečník (rectum) (Lukáš a kol., 2005).

2.1.3 Konečník (rectum)

Konečník je 12 – 15 cm dlouhý, leží těsně před křížovou kostí a řitním otvorem, anus ústí ven. V pánvi se rozšiřuje do ampuly, dolů se zužuje do análního kanálu (canalis analis). V ampule rekta je sliznice složena do tří příčných řas. Největší je střední řasa, Kohlrauschova, je na pravé straně vzdálena asi 5 cm od řitního otvoru. Na konci anální-ho kanálu jsou dva svěrače, vnitřní je z hladké svaloviny, zevní z příčně pruhované (Lukáš a kol., 2005).

2.2 Histologie střevní stěny

Střevní stěna je tvořena pěti základními vrstvami: sliznicí (tunica mucosa), slizniční svalovinou (lamina muscularis mucosae), podsliznicí (tunica submucosa), zevní svalovou vrstvou (tunica muscularis externa) a serózou (tunica serosa).

Sliznice střeva je složena z intestinálního epitelu a slizničního stromatu (lamina propria mucosae). Sliznice tlustého střeva má vyhlazený povrch s nesčetnými záhyby. Na povrch sliznice ústí jednoduché tubulózní žlázky (Lieberkühnovy krypty). Intestinální epitel se vyskytuje na povrchu sliznice i ve slizničních kryptách. Povrchový epitel slizni-ce tračníku je tvořen cylindrickými buňkami absorpčními (transport vody a iontů) a po-hárkovými (syntéza a sekrece hlenu). Epitel krypt představuje heterogenní buněčná po-pulace složená z buněk absorpčních a pohárkových, nezralých a nediferencovaných bu-něk prekurzorových a buněk neuroendokrinních. Krypty jsou regenerační zónou slizni-ce, odkud epitelie migrují směrem k povrchu a postupně se diferencují (Holubec a kol., 2004).

Neuroendokrinní buňky tvoří součást difúzního neuroendokrinního systému. Jsou zde dva typy intestinálních endokrinních buněk. Enterochromafinní (EC) buňky jsou hlavní buněčnou populací gastrointestinálního endokrinního systému, jejich sekrečním produktem je serotonin. Další endokrinní buňky vytvářející peptické hormony, např. somatostatin, gastrin, cholecystokinin, pankreatický polypeptid, glukagon apod. V proximální části tračníku se vyskytují i buňky Panethovy, které obsahují lysozym, kte-rý má antibakteriální účinky a hraje roli při kontrole střevní flóry (Holubec a kol., 2004).

Epitel spočívá na bazální membráně, která jej odděluje od slizničního stromatu. Slizniční stroma je tvořeno řídkým vazivem a prostoupeno fibroblasty, makrofágy, lym-focyty, plazmatickými buňkami a ojedinělými neuroendokrinními buňkami. Většina bu-něk stromatu je odpovědná za lokální imunologicky zprostředkovanou obrannou reakci proti škodlivým agens ve střevním obsahu. Cévní struktury slizničního stromatu jsou reprezentovány krevními a lymfatickými kapilárami. Lymfatické cévy sliznice tračníku se však vyskytují pouze v oblasti mezi slizniční svalovinou a bázemi krypt a nezasahují do horních částí slizničního stromatu (Holubec a kol., 2004).

8

Sliznice je oddělena od podsliznice (submukózy) tenkým pruhem slizniční svalovi-ny (lamina muscularis mucosae). Na obou stranách této svaloviny ve všech částech stře-va je lymfatická tkáň vytvářející lymfatické folikuly. Nejvíce lymfatické tkáně je v apendixu. Lymfoidní infiltráty a lymfatické folikuly prezentují tzv. slizniční lymfatickou tkáň (Mucosa-Associated-Lymfoid-Tissue, MALT). Podsliznice má podobné složení jako slizniční stroma. Hojně jsou přítomny krevní a lymfatické cévy a je vytvořen submukózní neurální plexus Meissnerův (Holubec a kol., 2004).

Zevní svalovina se skládá z vnitřní cirkulární a zevní longitudinální vrstvy, mezi nimiž je přítomen nervový plexus Auerbachův. Svalovinou prostupují krevní a lymfatic-ké cévy. V oblasti myenterického plexu a v cirkulární svalové vrstvě jsou lokalizovány intersticiální Cajalovy buňky, které plní funkci peacemakeru a regulují spontánní intes-tinální motilitu. Jsou charakterizovány expresí povrchového tyrozinkinázového c-kit receptoru (produkt protoonkogenu). Tyto buňky jsou považovány za prekurzor gastrointestinálních stromálních tumorů (GIST) (Holubec a kol., 2004).

Tunica serosa je tenká vrstva vaziva, bohatá na krevní a lymfatické cévy a tukovou tkáň. Na povrchu je kryta jednovrstevným plochým epitelem (mezotelem) (Holubec a kol., 2004).

9

3 KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM

Kolorektální karcinom je nejčastějším nádorem trávicího ústrojí a druhým nejčas-tějším nádorovým onemocněním u mužů a žen. Alarmující je neustále vzrůstající trend výskytu této choroby, který v naší populaci přetrvává již několik desetiletí. Přestože ko-lorektální karcinom je jedním z mála nádorových onemocnění, kde je realizována pri-mární i sekundární prevence nádoru, je současný stav diagnostiky a léčby kolorektální-ho karcinomu značně neuspokojivý. Navzdory tomu, že kolorektální karcinom je dobře přístupný vyšetření, přichází téměř polovina nemocných v pokročilých stádiích s postižením lymfatických uzlin a s výskytem vzdálených metastáz. To negativně ovliv-ňuje výsledky léčby a dlouhodobého přežití pacientů. Základem komplexní léčby tohoto nádorového onemocnění nadále zůstává chirurgický výkon. Rozsah chirurgické radikali-ty však již nelze dále zvětšovat. V onkologické terapii došlo v poslední době ke zlepšení kvality života a prodloužení přežití především u nemocných s pokročilým či metastatic-kým kolorektálním karcinomem. Výsledky však nadále nejsou uspokojivé. Úspěšná léčba kolorektálního karcinomu je možná jen při včasné diagnostice nádorového onemocnění za široké týmové mezioborové spolupráce. Stejně jako vývoj screeningových programů jsou důležité i metody rozvíjející primární a sekundární prevenci. Nezbytná je také peč-livá dispenzarizace pacientů po provedené primární terapii nádoru ve specializovaných centrech. Pouze tak lze včas diagnostikovat recidivu či progresi nádorového onemocně-ní. Budoucnost diagnostiky a léčby kolorektálního karcinomu spočívá ve výsledcích mo-lekulární biologie a genové terapie, kdy bude možné posoudit individuální riziko a pro-gnózu pacienta a podle těchto znaků bude zvolena kauzální terapie (Holubec a kol., 2004).

3.1 Definice

Kolorektální karcinom je zhoubný (maligní) nádor vycházející z buněk sliznice tlustého střeva. Patří mezi tzv. adenokarcinomy, tedy nádory žlázového původu a je nejenom nejčastějším zhoubným nádorem střeva, ale i nejčastější malignitou trávicího traktu vůbec. Rozlišuje se karcinom konečníku (rekta) a tračníku (colon), a to především z důvodů částečně odlišného přístupu k léčbě obou typů nádoru (Lukáš a kol., 2005).

3.2 Výskyt

Kolorektální karcinom patří v současné době mezi tři nejčastější zhoubné nádory. Od konce 80. let zaujímá naše země čelné postavení v incidenci kolorektálního karcino-mu na světě. Každoročně onemocní v ČR přibližně 80 mužů a téměř 60 žen na 100 000 obyvatel. U obou pohlaví se u nás jedná o druhou nejčastější malignitu po karcinomu plic, resp. mammy. Kolorektální karcinom je typický svými geografickými variacemi, celosvětově se jeho výskyt liší až dvacetinásobně. Nejvíce je postižena populace v průmyslových zemích euroamerické oblasti, v Austrálii a na Novém Zélandu, nejnižší výskyt je v subsaharské Africe a v Asii (Indie) (Lukáš a kol., 2005).

10

3.3 Etiologie

Rozdíly v incidenci kolorektálního karcinomu v různých oblastech světa svědčí pro význam zevních, především nutričních faktorů na vznik onemocnění. Častější výskyt kolorektálního karcinomu v některých rodinách nasvědčuje však také vlivům genetic-kým. Vznik kolorektálního karcinomu je tedy podmíněn interakcí zevních a vnitřních faktorů (Lukáš a kol., 2005).

3.4 Zevní faktory

3.4.1 Tuk a maso

V oblastech s vysokou spotřebu tuku je kolorektální karcinom častější než v zemích, kde je jeho spotřeba nízká. Důležité je však nejen množství, ale především složení tuku. Prokarcinogenní účinek stoupá se zvýšeným obsahem omega-6 polynenasycených mastných kyselin (omega-6 PUFA), zatímco preventivní efekt mají omega-3 polynenasy-cené (omega-3 PUFA) mastné kyseliny a kyselina olejová. Hlavním zdrojem omega-3 PUFA je rybí tuk a olivový olej je zdrojem kyseliny olejové. Epidemiologické studie po-tvrzují nižší výskyt kolorektálního karcinomu v populacích s vysokým příjmem ryb. Ně-které studie ukázaly, že hem obsažený v červeném mase způsobuje poškození sliznice tlustého střeva a hyperproliferaci epitelu a pravděpodobně tak zvyšuje riziko kolorek-tálního karcinomu. Díky obsahu heterocyklických aminů jsou ještě vyššímu riziku vysta-veni konzumenti silně smaženého a pečeného masa. Karcinom tračníku se v této skupině vyskytuje přibližně třikrát a karcinom rekta až šestkrát častěji než v kontrolním vzorku populace (Lukáš a kol., 2005).

3.4.2 Obezita a hyperinzilínemie

Obezita zvyšuje riziko karcinomu tračníku u mužů asi o dvojnásobek, obézní ženy mají riziko vyšší o 40 %. Přibližně dvojnásobný výskyt kolorektálního karcinomu byl zjištěn u pacientů s hyperglykemií nalačno i po zátěži glukózou a u nemocných s hyper-inzulínemií. Inzulín a tzv. inzulínu-podobné růstové faktory mají významný prorůstový účinek ve sliznici tlustého střeva a v buňkách kolorektálního karcinomu a tato skuteč-nost je základem tzv. „inzulínové hypotézy“ patogeneze kolorektálního karcinomu. Epi-demiologické studie navíc potvrzují protektivní účinek fyzické aktivity na vznik kolorek-tálního karcinomu. Jedním z mechanizmů by mohl být efekt fyzické zátěže na redukci nadváhy a zlepšení výše uvedených metabolických parametrů (Lukáš a kol., 2005).

3.4.3 Kouření a alkohol

Podobně jako řada jiných nádorů i kolorektální karcinom je častěji spojen s nikotinizmem. Aktivní kuřáci (minimálně 20 cigaret denně) mají více než dvojnásobné riziko vzniku kolorektálního karcinomu, toto riziko narůstá s délkou kouření. Souvislost mezi zvýšeným příjmem alkoholem a rizikem kolorektálního karcinomu byla poprvé popsána v roce 1957 u pijáků piva. Některé studie potvrzují vyšší výskyt rakovi-

11

ny střeva u pijáků alkoholu, jiné nikoli; žádná studie neprokázala snížení rizika v souvislosti s pitím alkoholu (Lukáš a kol., 2005).

3.4.4 Rostlinná strava

Dietní vláknina, obsažená kromě zeleniny a ovoce především v cereáliích, byla vždy po-važována za jeden z nejvýznamnějších ochranných faktorů. Většina epidemiologických studií ukazuje na příznivý efekt zvýšeného příjmu vlákniny na snížení výskytu karcino-mu tračníku a rekta i na incidenci adenomových polypů. Předpokládaný mechanizmus spočívá ve zvětšení objemu stolice, zředění karcinogenně působících látek a urychlení jejich eliminace ze střeva. U zvířat snižuje celulóza a hemicelulóza hladinu některých bakteriálních enzymů ve střevě a brání aktivaci karcinogenů. Mastné kyseliny s krátkým řetězcem, které vznikají fermentací vlákniny v tlustém střevě, mohou snížením pH ovlivnit karcinogenezi ve střevě. Vliv ovoce a zeleniny na výskyt kolorektálního karci-nomu byl zkoumán v mnoha studiích a většina z nich prokázala snížení rizika vzniku rakoviny tračníku i konečníku u osob konzumujících velká množství rostlinné potravy, především zeleniny. Studie hodnotící efekt ovoce na snížení výskytu kolorektálního kar-cinomu nejsou tak jednoznačné jako v případě zeleniny nebo luštěnin. Nedostatek ně-kterých mikronutrientů (vitamíny, stopové prvky, kyselina listová) může přispívat ke vzniku kolorektálního karcinomu. Nízký příjem karotenu, riboflavinu, kyseliny askorbo-vé a vápníku je častěji spojen se vznikem karcinomu střeva. Velký význam je přikládán kyselině listové (Lukáš a kol., 2005).

3.4.5 Reprodukční aktivita a hormonální léčba

Od 70. let minulého století se řada studií zabývala vztahem mezi počtem porodů, vě-kem v době prvního porodu, užíváním perorální kontraceptiv a rizikem kolorektálního karcinomu u žen. Výsledky studií nejsou jednoznačné, zdá se však, že u nulipar je výskyt kolorektálního karcinomu zvýšen. Naopak užívání hormonální antikoncepce snižuje ri-ziko karcinomu rekta a tračníku přibližně na polovinu a tento efekt přetrvává až 10 let po vysazení léčby (Lukáš a kol., 2005).

3.5 Vnitřní faktory

3.5.1 Věk

Věk je významným rizikovým faktorem při vzniku většiny nádorů, včetně kolorek-tálního karcinomu. Až 90 % nemocných je starších 50 let, zatímco před 40. rokem života je diagnóza tohoto onemocnění vzácná. Časný vznik kolorektálního karcinomu je obvyk-le považován za nepříznivý prognostický faktor, i když studie z poslední doby ukazují, že prognóza mladších nemocných se při správné léčbě liší od pacientů ve vyšším věku. U mladších nemocných je významně častější pozitivní rodinná anamnéza (Lukáš a kol., 2005).

12

3.5.2 Rodinná anamnéza Rodinná anamnéza je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících vznik kolorek-

tálního karcinomu. Výskyt tohoto onemocnění u příbuzných prvního stupně (rodiče – děti, sourozenci) zvyšuje riziko onemocnění nejméně dvoj- až šestinásobně v závislosti na počtu postižených příbuzných a jejich věku v době diagnózy kolorektálního karcino-mu. Anamnéza adenomových polypů u prvostupňových příbuzných zvyšuje riziko kolo-rektálního karcinomu rovněž 2 – 4násobně. Je tedy zřejmé, že rodinná anamnéza kolo-rektálního karcinomu a/nebo adenomu je velmi důležitým údajem a v poslední době je používán pro případy rodinného výskytu termín „familiární“ forma kolorektálního kar-cinomu (Lukáš a kol., 2005).

3.5.3 Idiopatické střevní záněty Idiopatické střevní záněty, zejména ulcerózní kolitida, jsou spojeny s vyšším výsky-

tem kolorektálního karcinomu. Toto riziko stoupá s délkou trvání choroby a rozsahem postižení střeva – nejvíce ohroženi jsou nemocní s postižením celého tračníku (Lukáš a kol., 2005).

3.5.4 Střevní polypy Polypy jsou časté u dospělých osob starších 50let. Nejběžnější a klinicky důležité

jsou adematózní polypy, které představují asi polovinu až dvě třetiny všech polypů ko-nečníku a tračníku a jsou spojeny s největším rizikem kolorektálního karcinomu. Další histologické typy, hyperplastické a zánětlivé polypy, nezvyšují riziko invazivního karci-nomu. Pravděpodobnost přechodu adematózního polypu v invazivní karcinom se zvyšu-je s velikostí polypu. Na adenomy v oblasti rektosigmoidea je nutno pohlížet jako na markery možného závažnějšího postižení proximální části střeva (Adam a kol., 2003). Růst polypu a jeho postupná maligní transformace je pomalý proces. Odhaduje se, že adenomatózní polyp menší než 1 cm potřebuje až 10 let k tomu, aby se stal invazivním karcinomem. Dále bylo zjištěno, že výrazně souvisí velikost polypu se stupněm dysplazie (Adam a kol., 2003).

3.6 Typy nádorů

Nádor je nejčastěji lokalizován v oblasti sigmatu (20 %) a ve vzestupném tračníku (15 %). Příčný a sestupný tračník jsou postihovány stejně často (7 %) a zbylá procenta připadají na karcinom rekta. Histologicky se prakticky vždy jedná o adenokarcinom, kte-rý bývá buď nemucinózní (85 %, bez tvorby hlenu) nebo mucinózní (15 %, s tvorbou hlenu). Nádory rostou zpočátku v místě svého vzniku ve střevě nebo konečníku, pak prorůstají stěnou střevní. Později mohou prorůstat do okolních orgánů, šířit se lymfatic-kými cestami do spádových uzlin nebo proniknout do krve a krevním oběhem se šířit do vzdálených orgánů, nejčastěji do jater, ale i jinam, jako např. do plic a kostí (Vorlíček a kol., 2006).

13

3.7 Patogeneze Nádory tlustého střeva a rekta můžeme rozdělit na sporadické formy, které před-

stavují asi 80% všech nádorů kolorekta a familiární (hereditární) formy, které tvoří asi 20% všech těchto nádorů.

Sporadická forma kolorektálního karcinomu se vyznačuje kompletním vyřazením obou alel důležitého genu z funkce, nicméně k této změně je třeba ještě dalších dvou mu-tací v somatické buňce. Pravděpodobnost tohoto jevu je poměrně malá a takto způsobe-né nádory vznikají ve vyšším věku. Naproti tomu při hereditární formě je zárodečná mu-tace přítomna ve všech buňkách jedince. Druhá alela genu má normální funkci a rozvoj nádorového bujení se projeví až tehdy, když je vyřazena somatickou mutací i druhá ko-pie identického genu a dojde k poruše regulace buněčného cyklu či opravě chyb DNA. U hereditární formy nádorového onemocnění tedy stačí k vyřazení genu pouze jediná mutace somatické buňky. Oproti sporadické formě kolorektálního karcinomu je tedy u hereditárních forem riziko malignizace mnohem vyšší, pravděpodobnost takové muta-ce je vysoká a posouvá se do mladších věkových kategorií (Holubec a kol., 2004).

Genetický model vzniku kolorektálního karcinomu předpokládá mutaci protoon-kogenů a inaktivaci tumor supresorových genů. Pro vznik nádorového onemocnění musí dojít ke kumulaci těchto změn. Ke genetickým změnám (mutacím) vedou mutageny, ji-miž mohou být rozličné exogenní faktory. Mutací pozměněné geny jsou navíc citlivější na změny zevního prostředí. Protoonkogeny jsou normální geny, které mohou být aktivo-vány mutací jedné alely. Takto aktivované protoonkogeny se nazývají onkogeny. Naru-šují normální buněčný růst a celulární diferenciaci. U kolorektálního karcinomu svědčí řada údajů o velkém významu mutace K-ras genu při vzniku dysplazií a kancerogenezi. K-ras gen je nejčastějším onkogenem (Holubec a kol., 2004).

Tumor supresorové geny (antionkogeny), respektive jejich proteinové produkty, kontrolují normální buněčnou proliferaci a diferenciaci. Při selhání této kontroly přejde diferenciace normálních kolonocytů do nádorové transformace. Ztráta funkce (inaktiva-ce) při velké chromozomové aberaci obou kopií supresorových genů (otcovské a mateř-ské) má závažný význam v kancerogenezi kolorektálního karcinomu. Jde především o gen p53 (na krátkém raménku 17. chromozomu-p17), APC gen (na dlouhém raménku 5. chromozomu-q5) a DCC gen-q18. Ztráta heterozygozity (mutace a delece) těchto genů se zásadně podílí na přeměně adenomu v karcinom a na vývoji malignity. Tyto změny jsou zjistitelné u 70 – 80 % kolorektálních nádorů. V poslední době se ukazuje, že existu-jí ještě další geny s vlastnostmi tumor supresorových genů: JV 18, DPC 4, MADR 2. Vý-znamnou roli u části sporadických karcinomů (cca 20 %) hrají také geny MLH1 a MSH2, MSH6, PMS1, PMS2 a jiné podobně fungující. Tyto geny kódují proteiny, které reparují chybné spojení nukleotidů (mismatch repair), které se objevují během replikace DNA. Ztráta funkce těchto genů vede k instabilitě genomu a k odpadnutí nápravy chybného spojení párových bází v nukleotidových sekvencích. Zárodeční mutace těchto genů jsou zodpovědné za nepolypózní hereditární karcinomové syndromy (HNPCC), ale ukázalo se, že hrají roli i u sporadických nádorů. Asi 90 % hereditárních nepolypózních karcino-mů vykazuje tzv. mikrosatelitovou instabilitu (MSI). Jde o mikrosatelity repetitivní DNA neznáme funkce v průběhu celého genomu. U karcinomů jde o poruchu genů udržujících integritu DNA. Vyšetření tohoto fenotypického znaku genetického defektu je možno po-užít jako testu ke zjištění suspektní heredity kolorektálního karcinomu (Holubec a kol., 2004).

14

3.8 Klinický obraz Klinická symptomatologie kolorektálního karcinomu je zejména v časných stádiích

mizivá, a přitom jde v časných stádiích o velmi dobře léčitelné onemocnění. Klinické pří-znaky se ale objevují bohužel většinou až u pokročilých nádorů. Závisí především na lo-kalizaci nádoru v různých částech tlustého střeva a typu expanze – intraluminální či ex-traluminální.

Nádor na počátku svého vzniku může růst skrytě, bez zevních projevů. Později se může projevovat místními i celkovými příznaky. Nejčastějšími místními příznaky jsou změny v častosti vyprazdňování a charakteru stolice. Může se objevit zácpa, průjem, střídání zácpy a průjmů, časté nucení na stolici s pocitem nedostatečného vyprázdnění. Ve stolici může být přítomna krev nebo hleny. Někde se mohou objevit bolesti břicha nebo v oblasti konečníku, trvalé nebo přechodné, popř. související s odchodem stolice (Vorlíček a kol., 2006).

Při lokalizaci karcinomu v pravé polovině tlustého střeva dominují příznaky z chronických ztrát krve, které mohou dosáhnout až 6 ml denně. Náhodně zjištěná, či klinicky symptomatická sideropenní mikrocytární anémie proto může být prvním a je-diným příznakem nádoru. Makroskopická příměs krve na stolici, či odchod čerstvé krve konečníkem (neteroragie, hematochezie), je patrna zejména při procesech v distální čás-ti tračníku – v oblasti rektum-sigma, v orálnějších partiích tlustého střeva již makrosko-picky krev detekovatelná nebývá a její přítomnost je možno odhalit testem na okultní krvácení (Lukáš a kol., 2005).

Pokročilý a někdy i generalizovaný karcinom tlustého střeva nemusí mít střevní symptomatologii a pacienta k lékaři přivedou povšechné známky nádorového onemoc-nění s dominujícím váhovým úbytkem až ke kachexii, nechutenstvím, celkovou slabostí, anemií (Lukáš a kol., 2005).

Kolorektální karcinom mívá tendenci poměrně dlouho růst mírně, než začne za-kládat metastázy. Patří mezi dobře léčitelné nádory, pokud je zachycen v časném stadiu. U pacientů s nepokročilými nádory lze ve velké většině případů dosáhnout trvalého vy-léčení. U pokročilých nádorů je léčba obtížnější a náročnější, ale i zde je možné dosáh-nout u řady pacientů dlouhodobějšího přežívání bez známek nemoci (Vorlíček a kol., 2006).

3.9 Diagnostika

Screening je definován jako vyšetření asymptomatických (bezpříznakových) osob na přítomnost nádoru ve střevě. Je základem prevence kolorektálního karcinomu a nej-slibnější metodou, která může v dohledné době vést k podstatnému snížení výskytu a úmrtnosti na kolorektální onemocnění. Nejčastěji používanou screeningovou metodou je vyšetření stolice na přítomnost okultního krvácení (viz Kap. 5.2). Aplikace screenin-gových metod se liší podle stupně rizika, kterému jsou příslušné osoby vystaveny. V běžné populaci by měl být screening kolorektálního karcinomu zahájen ve věku 50 let. U osob s rodinnou anamnézou kolorektálního karcinomu je doporučeno hranici posu-nout již na 40 let, kdy je riziko podobné jako v ostatní populaci ve věku o 10 let vyšším (Lukáš a kol., 2005).

U nemocných s klinickými symptomy nebo s podezřením na kolorektální karcinom je vždy nutno provést kolonoskopické vyšetření celého tlustého střeva. Endoskopie umožňuje vizuální posouzení nálezu (velikost, makroskopický vzhled, stupeň obstrukce

15

střevního lumen) a odběr bioptických vzorků k histologickému vyšetření (Lukáš a kol., 2005).

U nemocných s diagnózou střevního karcinomu je třeba provést následující vyšetře-ní: sonografii nebo CT jater a rentgen hrudníku k vyloučení metastáz; CT malé pánve a endosonografie rekta u karcinomu rekta; stanovení hladiny karcinoembryonálního anti-genu (viz Kap. 4.2) (Lukáš a kol., 2005).

Diferenciální diagnóza kolorektálního karcinomu je široká. Nejčastěji přichází v úvahu krvácení z hemeroidů, divertikulární choroba a syndrom dráždivého tračníku. U starších pacientů s predisponujícím kardiovaskulárním onemocněním je nutno uvažo-vat o střevní ischemii, u nemocných po předchozí aktinoterapii (např. pro gynekologický nádor) o poradiační kolitidě a proktitidě. Zejména u mladších osob je nutno vyloučit Crohnovu chorobu nebo ulcerózní kolitidu, i když první ataku střevního zánětu lze pozo-rovat i ve věku nad 50 let (Lukáš a kol., 2005).

16

4 NÁDOROVÉ MARKERY

4.1 Obecná charakteristika Sérové nádorové markery představují důležité parametry, které mohou usnadnit

predikci vývoje onemocnění u onkologicky nemocných. Nádorovým markerem je che-mická substance přítomná v nádoru, nebo produkovaná nádorem nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost tumoru. Tato substance se u zdravého jedince buď vůbec nevy-skytuje anebo se vyskytuje v podstatně nižší koncentraci, něž je tomu v případě přítom-nosti nádoru (Adam a kol., 2003). Může jít o antigeny lokalizované na povrchu buněč-ných membrán obsažené v cytoplazmě, solubilní antigeny obsažené v biologických teku-tinách, enzymy metabolických drah či fragmenty cytoplazmatických struktur uvolňova-né do okolí při zániku buněk (Holubec a kol., 2004).

4.1.1 Rozdělení nádorových markerů

Nádorové markery se dělí do tří skupin, mezi kterými však neexistuje vždy ostré rozhraní: onkofetální antigeny, tkáňově či orgánově specifické antigeny a nespecifické antigeny.

Onkofetální antigeny jsou molekuly, které organismus fyziologicky produkuje ve fetálním období vývoje a po narození je tvoří jen v souvislosti s nějakým onemocněním, zpravidla nádorovým – sem se řadí α1-fetoprotein (AFP), lidský choriový gonadotropin (hCG), karcinoembryonální antigen (CEA), placentární alkalická fosfatáza (PLAP) a ně-které další.

Tkáňově či orgánově specifické antigeny jsou látky, které se normálně nacházejí ve zdravé tkáni či orgánu a mimo něj pronikají jen v minimálním množství. Teprve při onemocnění, nečastěji nádorovém (ale v menším míře i při zánětech nebo traumatizaci), dochází k jejich uvolnění. Je to např. prostatický specifický antigen (PSA) a dnes již prak-ticky nepoužívaná prostatická kyselá fosfatáza (PAP), neuron specifická enoláza (NSE), mozkový S-100b protein, rozpustné fragmenty cytokeratinů (TPA, TPS, CYFRA 21-1), většina CA antigenů definovaných pomocí monoklonálních protilátek (Mab), antigen karcinomů ze skvamózních buněk (SCC), thyreoglobulin (Tg) a hormony nádorů žláz, které je fyziologicky produkují. Při metastázách do kostí se jako tumorové markery mo-hou uplatňovat i některé parametry užívané u kostního metabolismu.

Mezi nespecifické antigeny patří ferritin, laktátdehydrogenáza (LD), thymidinki-náza (Tk), β2-mikroglobulin (β2-M), některé reaktanty akutní fáze (RAF), na lipidy váza-ná sialová kyselina (LASA) a řada dalších, méně často užívaných markerů (Zima, 2002).

4.1.2 Statistická charakteristika markerů

Výpověď jednotlivých markerů je nutno vždy statisticky zhodnotit, aby lékaři vě-děli, jakou mají tyto markery výpovědní hodnotu. Nejfrekventovanějším atributem vy-šetřovacích metod je jejich senzitivita a specificita. Diagnostická senzitivita se určuje na skupině nemocných. Je definována jako poměr počtu pozitivních nálezů v souboru ne-mocných ku celkovému počtu vyšetřovaných nemocných. Senzitivita je u většiny marke-rů v počátku nemoci relativně nízká, pohybuje se kolem 10 – 30 %, v případě manifest-

17

ního onemocnění je větší než 50 % a v případě metastatického onemocnění dosahuje 70 – 90 % (Adam a kol., 2003).

Diagnostická specificita se určuje na skupině zdravých lidí. Je definována jako poměr správně negativních vyšetření ku všem vyšetřeným zdravým nemocným. Pro stanovení specificity je nutno správně nastavit hranici patologických a normálních vý-sledků, dle anglické terminologie cut-off (Adam a kol., 2003).

Koncentrace markerů se obvykle pohybuje v pásmu velmi nízkých koncentrací, ne v oblasti gramů či molů, jak je obvyklé u běžných biochemických parametrů, ale v oblasti mikrogramů až nanogramů/litr. Z toho vyplývá, že analytické metody musí být velmi sofistikované, aby taková malá množství mohly stanovit. Výsledky samozřejmě závisí na jednotlivých analytických postupech, a proto normální a patologické hodnoty určitého markeru jsou definovány vždy pro jednotlivé metodické postupy. To je rozdíl od ostat-ních biochemických analýz, např. cholesterolu nebo glukózy, kde jsou laboratorní meto-dy většinou standardizované a výsledky srovnatelné ve všech nemocnicích. Při hodno-cení výsledku analýzy jednotlivých markerů je nutno vždy přihlížet k normám vydaným provádějící laboratoří (Adam a kol., 2003).

4.1.3 Požadavky

Požadavky kladené na ideální nádorová marker jsou následující: produkován pouze u maligních onemocnění, orgánově specifický, vyskytuje se ve vysokých koncent-racích v biologických tekutinách, koreluje s velikostí nádoru, koreluje se stadiem one-mocnění, koreluje s prognózou, koreluje s účinností terapie (Holubec a kol., 2004).

Žádný z dnes známých nádorových markerů tyto přísné požadavky nesplňuje. V klinické praxi mají současné nádorové markery největší význam při sledování účin-nosti léčby a mohou upozornit na progresi, či recidivu nádorového onemocnění. První odběr markerů by měl být proveden ještě před zahájením onkologické léčby v rámci vstupního vyšetření, poté v průběhu onkologické léčby a v rámci poléčebného sledování. Klinický význam má především dynamika hodnot markerů při dlouhodobém monitoro-vání, než jednotlivý jednorázový odběr. Normální hladina nádorového markeru nevylu-čuje progresi či recidivu onemocnění, protože může dojít k růstu klonu nádorových bu-něk, které neprodukují monitorovaný marker. Mírný vzestup hodnoty markeru nad fyzi-ologické rozmezí může být způsoben řadou neonkologických onemocnění. Výrazný vze-stup monitorovaného markeru je obvykle spojen s progresí či recidivou onemocnění. Včasné zachycení progrese či recidivy onemocnění je velmi cenná informace, přesto sa-motný vzestup markeru neopravňuje k zahájení léčby, ale je důvodem pro podrobné vyšetření. Při negativním výsledku ostatních vyšetření a přetrvávající zvýšené hodnotě markeru provádíme častější kontroly. Postupný pokles hodnoty markeru při dlouhodo-bém monitorování je obvykle spojen s úbytkem počtu nádorových buněk při úspěšně vedené léčbě a tím podává zpětnou informaci o účinnosti léčby. Pokles hodnoty markerů může být ale také spojen s dediferenciací nádorových buněk, v případech, kdy dobře či středně diferencované nádorové buňky marker produkovaly, ale málo diferencované nádorové buňky již marker neprodukují. Často každá recidiva nádorového onemocnění je spojena s nižším stupněm diferenciace. Z těchto důvodů je nutné hodnoty nádorových markerů interpretovat vždy v kontextu s ostatními vyšetřeními (Petera a kol., 2005).

Nádorové markery obecně nejsou diagnostickou pomůckou, i když mohou po-skytnut informaci, která může k diagnostickému postupu přispět. O výběru a nasazení nádorových markerů před terapií a v průběhu léčby se zpravidla rozhoduje na základě

18

klinického a histologického nálezu. Jen výjimečně, u málo diferencovaných nádorů, kde neznáme primární ložisko, je někdy vhodné vyšetřit větší množství nádorových markerů a pokusit se tak nádor blíže charakterizovat. Diagnostickou cenu má v tomto případě pouze pozitivní nález nádorových markerů. Negativní nález v žádném případě nezna-mená nepřítomnost nádoru (Zima, 2002).

Indikace vyšetření nádorových markerů u karcinomu tlustého střeva mají své li-mitace. Jde o doplňkovou diagnostickou metodu se svým konkrétním významem a přes-ností pro každou diagnózu. Pro správnou interpretaci výsledků je proto nezbytná nejen správná volby nádorových markerů, ale především způsob jejich klinického hodnocení. U nádorů tlustého střeva a konečníku je hlavním stanovovaným markerem karcinoem-bryonální antigen (CEA; Kap. 4.2). Jako marker druhé volby je doporučován CA 19-9 (Kap. 4.3). Jako optimální se jeví kombinace těchto dvou markerů. K dalším markerům, které jsou studovány v souvislosti s kolorektálním karcinomem patří proliferační mar-kery (TPA, TPS; Kap. 4.5), CA 72-4 (Kap. 4.4), dále pak ostatní nádorové markery CA ty-pu (CA 242, CA 195), a řada jiných (Holubec a kol., 2004).

4.1.4 Kinetika nádorových markerů

Vzestup markerů po chemoterapii odpovídá progresi nádoru při neúčinné léčbě. Čas, za který marker zdvojnásobí svoji absolutní hodnotu (zdvojovací čas markeru), od-povídá exponenciálnímu růstu nádorových buněk v závislosti na čase. Čím kratší je tento zdvojovací čas markeru, tím agresivnější je růst nádoru, což bylo potvrzeno jak u kolo-rektálních nádorů, tak u karcinomu prsu (Adam a kol., 2003).

4.1.5 Význam před- a pooperačních hodnot nádorových markerů

Obecně jsou vysoké předoperační hodnoty považovány za nepříznivý prognostic-ký faktor. Ve většině případů s příznivou prognózou dochází po operaci k normalizaci hladin nádorových markerů, a naopak při přetrvávajících elevacích nádorových markerů je riziko recidivy 2 – 3krát vyšší než u nemocných s normálními hladinami. Stanovení předoperačních hodnot má dále význam pro posouzení léčebné odpovědi na primární terapii a možné určení reziduálního nádoru ve srovnání s hladinami pooperačními. Pře-doperační hodnoty CEA byly v celé řadě studií hodnoceny jako nezávislý prognostický faktor, který koreluje s velikostí primárního nádoru a stadiem onemocnění. Předoperač-ní hodnoty CEA korelují s velikostí primárního nádoru a stupněm postižení uzlin a hod-noty CA 19-9 korelují poměrně významně s výskytem distančních metastáz. S dobou bezpříznakového přežití a s celkovým přežitím korelují hodnoty CEA i CA 19-9. Pro sta-novení nádorových markerů po operaci je nezbytné, aby se vyšetření provádělo nejdříve za 14 dní až měsíc po chirurgickém zákroku. Je to nutné vzhledem k biologickému polo-času sledovaných nádorových markerů. Stanovení pooperačních hodnot nádorových markerů má praktický především význam u CEA, kde můžeme dle poklesu hladin tohoto markeru hodnotit úspěšnost resekčního výkonu, popř. mohou elevované hladiny CEA upozornit na reziduální nádorovou masu, pokud jejich hodnoty neklesnou do 4 – 6 týd-nů po operaci (Holubec a kol., 2004).

19

4.1.6 Význam nádorových markerů pro kontrolu efektu terapie Dlouhodobé sledování hladiny CEA u kolorektálních karcinomů, které jej produ-

kují, je vhodným prostředkem pro sledování účinnosti pooperačních radio- či chemote-rapie. Normalizace hladin CEA po aktinoterapii svědčí o tom, že byly zničeny všechny nádorové buňky ležící v ozářeném poli. Při sledování účinnosti chemoterapie se posuzu-je 80 % korelace hladin CEA s klinickým průběhem onemocnění a vzestup hladin je vět-šinou prvním příznakem progrese, který včas poukáže na neúčinnost terapie. Při kalku-laci poměru poklesu hodnot před a po skončení pooperační radio- či chemoterapie rea-guje nejrychleji poměr poklesu CEA, a to i přes to, že má oproti CA 19-9 a CA 72-4 nejdelší biologický poločas. Stejně jako u předoperačních hladin má i výše hodnot nádo-rových markerů po skončení primární terapie (operace, event. následné radio- či chemo-terapie) prognostický význam. Pokud po skončení terapie nedojde k poklesu hodnot nádorových markerů, je riziko úmrtí 3 – 6krát vyšší (v závislosti na stádiu onemocnění) než u pacientů s nezvýšenými hodnotami. Toto zjištění má praktický význam především u pacientů se stadiem III, u kterých je odhad prognózy důležitý z hlediska dalšího sledo-vání a volby další léčebné strategie. Pokud je u těchto pacientů vysoká pravděpodobnost progrese onemocnění, měli by být sledováni v kratších časových intervalech a měla by u nich být individuálně volena agresivnější terapie při recidivě onemocnění (Holubec a kol., 2004).

4.1.7 Faktory ovlivňující stanovení a interpretaci nádorových mar-kerů

Musí se brát v úvahu falešná pozitivita výsledků u některých benigních onemoc-nění, u kuřáků a při léčbě některými cytostatiky (fluorouracil, levamizol). Lehce či kolí-savě zvýšená pooperační hladina CEA může být často způsobena abúzem nikotinu, či v populaci se poměrně často vyskytujícím benigním onemocněním jater. Pokud je de-tekována zvýšená hladina CEA u pacienta, který měl do té doby normální hodnoty, je třeba vyšetření zopakovat pokud možno ze stejného séra k vyloučení možné laboratorní chyby. V úvahu by měly být vzaty i výsledky jaterních testů a vyšetření ledvin, protože jaterní či renální insuficience mohou být příčinou nespecifického zvýšení CEA. Další ne-specifické ovlivnění hodnot může být způsobeno celou řadou chyb vznikajících v preanalytické a analytické fázi stanovení nádorových markerů. Ordinující lékař by měl zasílat vzorky k analýze do stejné laboratoře, která stanovuje nádorové markery jednou metodikou. Pouze tak se lze vyhnout nesprávné interpretaci výsledků, u kterých je rozdíl hodnot způsoben volbou metody stanovení. Pro kvalitní klinické hodnocení vyšetření nádorových markerů je tedy nutná úzká interdisciplinární spolupráce, při které jsou pokud možno vyloučeny nespecifické vlivy, které mohou provedená stanovení ovlivnit (Holubec a kol., 2004).

20

4.2 Karcinoembryonální antigen Karcinoembryonální antigen (CEA), popsaný r. 1965, patří k nejdéle stanovovaným

markerům. Je to onkofetální protein s pravděpodobnou rolí v procesu buněční adheze. CEA patří do imunoglobulinové supergenové rodiny, jejíž produkty jsou jak komplexní molekuly vyskytující se na buněčné membráně, tak i extracelulární molekuly s velice rozdílnými funkcemi. Mechanismus působení CEA je dosud nejasný. Předpokládá se, že funkcí CEA je především působit jako repulsní molekula zabraňující kontaktu mezi buň-kami. Exprese těchto molekul na povrchu nádorových buněk, která může vést k narušení nádorové struktury, pak může usnadňovat jejich migraci a motilitu, tj. tvorbu metastáz (Šimíčková a kol., 2001).

Za fyziologických podmínek je CEA produkována ve vyvíjejícím se embryu, kde je syntetizovaný v epiteliálních buňkách, a to především na jejich membránách. Ve fetálním séru je prokazatelný od 8. týdne těhotenství. Jeho produkce je nejvyšší v období kolem 22. týdne gravidity. V dospělém věku je syntetizován v minimálním množství epiteliál-ními buňkami střevní sliznice, žaludku a bronchů (Šimíčková a kol., 2001).

Referenční interval závisí ve značné míře na použité metodě stanovení. Horní li-mit je jednotlivými výrobci udán v rozmezí 2-5 μg/l. Z klinického hlediska proto není vhodné často měnit způsob stanovení CEA, protože to ztěžuje interpretaci výsledků (Zi-ma , 2002). CEA představuje pro kolorektální nádor marker 1. volby s výraznou korelací ke klinickému stadiu. Senzitivita a specificita stanovení kolísá podle typu sledovaného nádoru a stadia onemocnění. Pro nádory zažívacího traktu se pohybuje senzitivita ob-vykle při návratu onemocnění (při 90% specificitě) pro kolorektální karcinom kolem 60%, pro nádory žaludku asi 40-50%. Pokles hodnot CEA asi ve 4. týdnu po chirurgic-kém zákroku může poskytnout údaj o úspěšnosti terapie, podobně lze hodnotit efekt chemo- či radioterapie, pokud byly hodnoty před terapií zvýšené (Šimíčková a kol., 2001). Korelace také existuje mezi přeléčenou koncentrací CEA a délkou pooperačního bezpříznakového přežití. CEA se používá k detekci recidivy u kurativně operovaných pacientů. Recidivu detekuje CEA citlivěji než CT nebo sonografie (Adam a kol., 2003). Při stabilních hodnotách je pravděpodobnost recidivy onemocnění malá, naopak plynule se zvyšující hodnoty CEA po dobu 2 měsíců signalizují poměrně spolehlivě růst nádoru. Hodnoty vyšší než 10 μg/l znamenají obvykle progresi maligního procesu (Šimíčková a kol., 2001). Zvláště vzhledem k častému nespecifickému zvýšení CEA je zde rozhodující dynamika změny (Zima, 2002).

CEA nelze použít pro screening a ke stanovení diagnózy. Pouze v situaci, kde není známa lokalizace primárního nádoru, může (spolu s dalšími markery) mít jeho hladina význam při určení diagnózy (Šimíčková a kol., 2001).

Výrazně pozitivní bývá CEA u medulárního thyroideálního karcinomu, zvýšený však může být i u jiných karcinomů, např. prsu, plic, žaludku, pankreatu, u nichž může v pokročilých stádiích dosahovat až 50-70 % (Zima , 2002). Jeho výskyt je vázán na lépe diferencované struktury epiteliálních buněk těchto nádorů, kde je uložen na apikální straně buňky. U nádorů nediferencovaných je jeho distribuce homogenní, v anaplastických nádorech obvykle chybí. Předoperační hodnoty CEA >40 μg/l jsou cha-rakteristické pro kratší interval bezpříznakového přežití nemocných s karcinomem mléčné žlázy. Koncentrace vyšší 50 μg/l svědčí s vysokou pravděpodobností o jaterních nebo kostních metastázách (Šimíčková a kol., 2001).

Nevýhodou CEA je časté zvýšení u nemaligních onemocnění. Vyšší hodnoty jsou u starších lidí, zejména u kuřáků, u lidí se sníženou funkcí ledvin, u alkoholiků s jaterní cirhózou a u zánětlivého onemocnění střeva a plic. Hladiny vyšší než 5 μg/l se nacházejí

21

u benigních chorob jako například jaterní cirhóza (32%), onemocnění jater obecně (11%), Crohnova choroba (6%), střevní polypy (16%), onemocnění plic (15%), ledvin (11%), žlučníku a žlučových cest (11%), pankreatitida (22%), kouření (8%) (Šimíčková a kol., 2001).

4.3 CA 19-9

CA 19-9 je sialylovaný pentasacharid lakto-N-fukopentózy II, tj. haptenu determi-nanty lidské Lewis (a)-krevní skupiny. Vyskytuje se jako glykolipid ve tkáni nebo mucin v séru, molekulová hmotnost asi 36 kDa (lipid) event. výrazně vyšší (mucin). Sacharido-vý podíl obsahuje fukózu a sialovou kyselinu. Jeho úloha je dosud neznámá, vzhledem k asociaci mezi nespecifickým zvýšením některých adhezních molekul a CA 19-9 v séru není vyloučena jeho možná vazba jako ligand např. na E-selektin. Předpokládá se event. společný původ CA 19-9 a E-selektinu na biliárních buňkách. In vitro byla rovněž proká-zána vazba CA 19-9 epitopu na cytokeratin 8. Přítomnost takto vázaného cytokeratinu koreluje se zvýšenou invazivitou in vitro i in vivo (Šimíčková a kol., 2001).

CA 19-9 patří k tumor-asociovaným antigenům definovaným na podkladě mono-klonálních protilátek. Vyvíjející se plod jej syntetizuje v epiteliálních strukturách pan-kreatu, žlučových cest, v žaludku. Stopová množství jsou produkována i v dospělosti, především ve žlázových strukturách pankreatu, žlučníku, bronchů. Kolem 5% populace tento antigen vůbec netvoří, osoby se skupinou Lewis a- a Lewis b- nemají pro syntézu nutný enzym fukozyltransferázu (Šimíčková a kol., 2001).

Diskriminační hladina se v séru i plazmě pohybuje do 37kU/l (1 U = 0,8 μg/l) (Zi-ma, 2002). Při maligních onemocněních dosahuje koncentrace CA 19-9 v sé-ru mnohonásobku hodnoty diskriminační hranice (až 106 kU/l) (Zima, 2002). Biologický poločas je asi 5 dní (Šimíčková a kol., 2001).

U kolorektálního karcinomu má CA 19-9 ověřený prognostický význam (Zima, 2002). Senzitivita tohoto markeru u karcinomů kolorekta dosahuje 18 – 58 %. Stanovuje se často v kombinaci s CEA. Koncentrace CA 19-9 obvykle nekoreluje výrazně s nádorovou hmotou. Výrazné zvýšení hladiny často s exponenciálním nárůstem (nad 1000 kU/l) jsou však průkazem metastáz. Koncentrace CA 19-9 také dobře korelují s hodnocením efektu terapie. CA 19-9 není vhodný pro screening. Přes vysokou senziti-vitu není možno užít tento marker pro časnou primární diagnostiku tohoto onemocnění (Šimíčková a kol., 2001).

Z dalších nádorů je jeho výskyt charakteristický pro adenokarcinomy žaludku, pan-kreatu, jater a vybraných gynekologických nádorů (Šimíčková a kol., 2001). Největší vý-znam má pro pacienty s karcinomem pankreatu, kde se klinická specifita i senzitivita pohybují mezi 70-90%. I když tento marker může být zvýšen i u pankreatitidy, jeho po-kles při zklidnění zánětu zpravidla vyřeší diagnostickou nejistotu. Jako „cut off“ hodnota pro odlišení karcinomu pankreatu od benigních onemocnění se zpravidla bere hodnota 100 U/ml, při které se dosahuje 62% senzitivity a 92% specificity. Velmi dobré výsledky dává i použití CA 19-9 u karcinomů žlučových cest. Na hranici použitelnosti jsou výsled-ky u karcinomu žaludku a určitý význam má stanovení CA 19-9 i u mucinózního karci-nomu ovaria (klinická senzitivita 70-90%), u ostatních nádorů nemá jeho stanovení praktický smysl (Zima, 2002).

I mírná cholestáza může způsobit výrazné zvýšení CA 19-9 koncentrace v séru. Z dalších onemocnění jsou zvýšené hladiny nalézány u benigních a zánětlivých onemoc-

22

nění žaludku, střeva, pankreatu a jater. Benigní onemocnění jsou zdrojem koncentrací zvýšených většinou do hodnoty až 100kU/l (Šimíčková a kol., 2001).

4.4 CA 72-4 CA 72-4 je antigen glykoproteinového typu determinovaný monoklonálními proti-

látkami. Za fyziologického stavu jej především produkuje vyvíjející se plod, a to v povrchových epitelech žaludku, jícnu a pankreatu. Zdrojem v dospělosti jsou přede-vším maligní nádory žaludku, střeva, pankreatu, mléčné žlázy a některých nádorů ovaria (mucinózní typy). Je degradován játry a vylučován ledvinami (Šimíčková a kol., 2001).

Referenční interval je do 6 kU/l (Zima , 2002) CA 72-4 je vysoce specifický 92 – 95% a odliší maligní od benigních onemocnění

(Adam a kol., 2003). Pro screening a stanovení diagnóz se neužívá (snad jen pro určení neznámého primárního nádoru). Je vhodný ke sledování nemocných s kolorektálním karcinomem, neprodukujícím CEA nebo CA 19-9. Koncentrace CA 72-4 koreluje s přítomností vzdálených metastáz (Šimíčková a kol., 2001).

V kombinaci s CEA může odlišit benigní a maligní proces pankreatu vyšetřením te-kutiny cyst (Šimíčková a kol., 2001). Nejvyšší diagnostická senzitivita (28-80%) v závislosti na klinickém stadiu je u karcinomu žaludku. Pro toto onemocnění představu-je marker první volby. Výskyt u dalších tumorů je nižší, u kolorektálního karcinomu 20-41%, pankreatu 17-35%, ovariálního karcinomu 48-82% (Adam a kol., 2003). Je vhodný rovněž ke sledování nemocných s karcinomem dolní třetiny jícnu a pankreatu, event. mucinového typu ovariálního karcinomu. vykazuje rovněž dostatečnou senzitivitu pro monitorování nemocných s metastázami uvedených nádorů do jater (Šimíčková a kol., 2001).

CA 72-4 může být v séru zvýšen u jaterní cirhózy, akutní pankreatitidy, chronické bronchitidy, vředové choroby žaludku a zánětlivých onemocněních GIT (Šimíčková a kol., 2001).

4.5 Tkáňový polypeptidový antigen, tkáňový polypeptidový specific-ký antigen

Fyziologicky je tkáňový polypeptidový antigen (TPA) a tkáňový polypeptidový specifický antigen (TPS) produkován trofoblastem placenty. Lze jej prokázat i v intenzivně se dělících epiteliích různých orgánů vyvíjejícího se plodu. Je nalézán v malých koncentracích i ve tkáni močového měchýře, mléčné žlázy, plic a trávicího trak-tu zdravých dospělých (Šimíčková a kol., 2001).

Tkáňový polypeptidový antigen byl prokázán v r. 1957 Bjorklundem et al. jako an-tigen epiteliálních buněk karcinomů. Je to polypeptid, jehož struktura odpovídá směsi fragmentů cytokeratinů (Šimíčková a kol., 2001).

Byl prokázán ve většině karcinomů. Přítomnost TPA v séru u nemocných s výraznou proliferací maligního nádoru vedla z počátku k představě jeho přímé vazby s procesem proliferace. Dalšími experimenty bylo prokázáno, že jeho výskyt v séru je vázán na rozdíl od diferenciačních antigenů spíše s buněčnou aktivitou než s objemem nádorové hmoty. Tato aktivita může reflektovat nejen proces dělení buněk, ale i apoptó-zu, event. degradaci tkáně a nekrózu. Antigen s velice podobnou charakteristikou, defi-

23

novaný na podkladě další monoklonální protilátky, byl nazván TPS (tkáňový polypepti-dový specifický antigen) (Šimíčková a kol., 2001).

Imunohistochemická nebo kvantitativní analýza tkáňového TPA/S dosud nevedla k jednoznačným závěrům o jeho úloze, což odpovídá zřejmě složitému procesu fragmen-tace této cytoskeletární složky a její roli při buněčném dělení. Je degradován játry a vy-lučován ledvinami. Pro TPA je jako horní hranice udávána hodnota mezi 85-130 U/l, u TPS je za horní hranici považována hodnota 80 U/l (Zima , 2002). Biologický poločas TPA je asi 7 dní (Šimíčková a kol., 2001).

Vzhledem k nízké specifitě je TPA poměrně málo používaným markerem. TPA a TPS dobře korelují s progresí (90%) i odpovědí na léčení (80%) u kolorektálního kar-cinomu, a proto jsou doporučovány jako doplňkové markery (Zima , 2002). Sérový TPA/S je univerzální nádorový marker vhodný především pro dlouhodobé sledování nemocných a hodnocení účinnosti terapie. Pro screening a stanovení diagnózy, ani k odhadnutí závažnosti onemocnění se nepoužívá (Šimíčková a kol., 2001).

Zvýšené hodnoty TPA byly zjištěny u 80-100% pacientů s pokročilým karcinomem prsu, plic, krčku děložního, ovaria, močového měchýře. TPS se jeví specifičtější pro kar-cinom prsu a ovaria (Zima , 2002).

TPA/S může být nespecificky zvýšen při některých onemocnění jater (cirhóza, hepa-titida), rovněž i u infekčních onemocněních. Radioterapie vede rovněž k dočasnému ne-specifickému zvýšení TPA/S v séru. Míra falešné pozitivity může být ovlivněna typem použité soupravy (Šimíčková a kol., 2001).

24

5 DALŠÍ VYŠETŘENÍ

Téměř každému pacientovi se odebírá krev a moč na biochemická vyšetření. Prová-dí se jich velké množství a záleží na úvaze lékaře, která vyšetření budou ordinována.

Laboratorní nález bývá chudý; pozitivní bývá zpravidla až v pozdních stadiích nádo-rového onemocnění. Bývá urychlena sedimentace erytrocytů, vysoké CRP, zvýšená kon-centrace mukoproteinů, zmnožené α-globuliny, popřípadě známky sekundární anemie (Holubec a kol., 2004).

5.1 Hematologická vyšetření Poruchy v krevním obraze jsou způsobeny buď vlastním nádorovým onemocně-

ním nebo vznikají jako vedlejší projevy onkologické léčby. Nejčastěji se vyšetřuje počet leukocytů, trombocytů, erytrocytů, hematokrit, množství hemoglobinu, kostní dřeň, cha-rakter krvetvorby a zastoupení jednotlivých buněčných linií. O stavu bílých krvinek v periferní krvi se informujeme vyšetřením diferenčního obrazu, počtu a morfologie leu-kocytů. K nespecifickému vyšetření patří vyšetření rychlosti sedimentace červených kr-vinek. Zrychlenou sedimentaci nacházíme u řady maligních nádorů, ale na druhé straně mohou být hodnoty sedimentace ve fyziologických rozmezích až u 10 % pokročilých nádorů (Vorlíček a kol., 2006)

5.2 Test na okultní krvácení Je to nejrozšířenější screeningové vyšetření stolice na přítomnost krve, užívané

k hromadné detekci polypózních adenomů tlustého střeva a časných stádií kolorektální-ho karcinomu u osob starších 45let (u osob s rizikovou rodinnou anamnézou i dříve) (Dienstbier a Skála, 1995). Test na přítomnost okultního krvácení ve stolici zjišťuje pří-tomnost krve ve stolici, která může pocházet z kolorektálního karcinomu nebo z velkých polypů (více než 2cm). Malé polypy nemají tendenci krvácet. Výtěžnost testu na okultní krvácení omezuje skutečnost, že krvácení z karcinomových nebo velkých adematózních polypů je jen občasné. Proto je nutné opakovat tyto testy v pravidelných intervalech (Adam a kol., 2003). Vyšetřovaná osoba doma odebírá tři dny po sobě pomocí papírové špachtle malý kousek stolice a nanáší jej dvojmo do okének „psaníčka“ (psaníčka dosta-ne tři). V okénku je filtrační papír preparovaný guajakovou silicí. Psaníčko vždy uzavře a po třech dnech všechna odevzdá k vyhodnocení. Vyhodnocení je jednoduché a rychlé. Aby se omezily nespecificky pozitivní výsledky je třeba, aby vyšetřovaný jedl ve dnech odběrů vzorků stravu co nejbohatší na vlákninu jako zeleninu, saláty, ovoce, celozrnné pečivo, ořechy a vynechal masová jídla s obsahem jatečné krve, jídla ze syrového masa

(tatarský biftek) a neužíval Celaskon, Ascorutin, Acylpyrin a Pelentan. Doporučuje se neprovádět test po dobu menstruace. Naopak lehká krvácení z dásní a z nosu nepředsta-vují překážku pro jeho uskutečnění. Při průjmu test neprovádět, pacient by měl počkat, dokud se neobnoví normální střevní činnost. Při pozitivitě je nutné odeslat nemocného na odborné pracoviště, kde je možnost i endoskopického vyšetření (Dienstbier a kol., 1995).

25

Jednou z možností vyšetření okultního krvácení je test hemo FEC. Jde o kvalitativní test na průkaz okultního krvácení ve stolici, hemo FEC je vhodný také jako screeningový test in vitro pro včasnou detekci kolorektálního karcinomu v profesionálním sektoru. Principem testu je, že reakční plocha kartičky obsahuje indikátor - chromatograficky purifikovanou frakci guajakové pryskyřice. Detekční činidlo tvoří stabilizovaný alkoho-lický roztok peroxidu vodíku. Hemoglobin po reakci s peroxidem vodíku katalyzuje díky svému peroxidáze podobnému působení oxidaci indikátoru a v přítomnosti krve (hemo-globinu) způsobuje modré zbarvení reakční zóny. Spolehlivost výsledků závisí rozhodu-jící měrou na správném provedení testu pacientem. Negativní výsledek je bez modrého zabarvení. Pozitivní má jakékoli modré zabarvení, které se objeví do 30 sekund. Nestej-noměrné slabě modré zbarvení jediného ze šesti vzorků představuje pozitivní nález, kte-rý vyžaduje další vyšetření. Zjištění okultního krvácení ve stolici není přímým důkazem patologie dolního intestinálního traktu. Pozitivní test musí být vždycky dále posouzen kolonoskopií. Hemo FEC nerozlišuje mezi zdroji krvácení v horním gastrointestinálním traktu (např. v žaludku, tenkém střevě) a kolorektálními zdroji krvácení (Roche Diagnos-tics GmbH).

26

6 METODY STANOVENÍ Nádorové markery se stanovují většinou pomocí imunoanalytických metod, jako je

RIA (Radioimmunoassay), IRMA (Immunoradiometric Assay), ELISA (Enzyme Linked Im-munosorbent Assay). Ve stále větší míře se používají imunoanalytické systémy, které vy-užívají buď výše uvedení metody značení, nebo fluorescenční či chemiluminiscenční značky (Zima, 2002).

Stanovení se provádí na speciálních automatických analyzátorech. Imunochemické analyzátory jsou zpravidla určeny k automatizaci heterogenní imunoanalýzy. Jsou schopné provést separační krok a oddělit tím navázaný imunokomplex na stěně zku-mavky, mikrotitrační destičky, frity, na kuličkách, na mikrokuličkách nebo na magnetic-kých zrnech od volných reaktantů. Separace se děje tak, že se pevná fáze s navázaným imunokomplexem propláchne a volné reaktanty se odsají nebo odfiltrují. Pak se provádí detekce enzymového markeru fotometricky, fluorometricky nebo chemiluminometricky. Analyzátory provádějící detekci používají jako detektor fotonásobič. Z široké nabídky imunochemických analyzátorů jsou v českých laboratořích zastoupeny především pří-stroje Abbott a DPC, dále výrobky firem Bayer, Beckman, Dade-Behring, Hitachi, Johnson a Johnson a Wallac (Zima , 2002).

Základem imunochemických metod je reakce mezi antigenem (Ag) a specifickou protilátkou (Pl) za vzniku imunokomplexu (AgPl) (Doležalová a kol., 1995).

Antigeny jsou látky schopné vyvolat v živém organismu, pro který jsou látkou ci-zorodou, tvorbu specifických protilátek. Na povrchu molekuly Ag mají různý počet de-terminantních skupin, ale organismus reaguje tvorbou protilátek pouze na ty determi-nantní skupiny, které jsou pro něj cizí. Antigeny bývají vysokomolekulární látky (bílko-viny, glykoproteiny, nukleotidy, lipoproteiny, mikroorganismy, viry, živočišné buňky atd.). V biologickém materiálu se v biochemii nejčastěji stanovují bílkoviny a apolipopro-teiny. Pouze kompletní antigen může vyvolat imunitní odpověď. Hapten (nekompletní antigen) vyvolá tvorbu protilátek jen v případě, je-li navázán na bílkovinný nosič (albu-min). Hapteny jsou nízkomolekulární peptidy, léčiva, hormony, steroidy či izolované determinantní skupiny antigenu (Doležalová a kol., 1995).

Protilátky jsou bílkoviny vykazující specifickou vazebnou aktivitu na antigen, na jehož podnět se vytvořily. Mají elektroforetickou pohyblivost beta1 až gama globulinů a označují se názvem imunoglobuliny. V laboratoři se obvykle používají jako komerčně vyráběné protilátky, které jsou obsaženy v antiséru. Ta se připravují imunizací zvířat (králík, morče, prase, koza, ovce, kůň) obvykle opakovaným intravenózním podáváním antigenu. Zvířeti se dlouhodobě (po dobu 2-6 měsíců) aplikuje emulze čistého antigenu s Freundovým adjuvans, které má za úkol zvýšit antigenní odezvu zvířete na aplikovaný antigen. Potom se provede odběr krve a získá se sérum, kterému se říká antisérum. Z něj se pak izolují frakce imunoglobulinů s přítomnými monoklonálními protilátkami proti všem determinantním skupinám antigenu, které byly pro zvíře látkou cizorodou. Takto připravená antiséra však obsahují heterogenní směs různých polyklonálních protilátek, proti jednotlivým determinantním skupinám antigenu. Polyklonální protilátky pak s těmito determinantními skupinami antigenu specificky reagují. Komerční antiséra pro-ti lidským sérovým bílkovinám bývají monovalentní (obsahují protilátky proti jedné stanovované bílkovině) nebo polyvalentní (obsahují protilátky proti mnoha bílkovinám) (Doležalová a kol., 1995).

27

V laboratořích se používají reakce mezi antigenem a protilátkou k průkazu a ke kvantitativné detekci antigenů a protilátek. Je-li antigen v rozpustné formě, jedná se o precipitaci. Při této reakci tvoří antigen (Ag) se svojí specifickou protilátkou (Pl) imuno-komplex zvaný precipitát, který po dosažení větších rozměrů vypadne z roztoku. Množ-ství precipitátu je závislé na kvantitativním poměru antigenu a protilátky. Reakce probí-há lineárně jen při optimálním poměru koncentrací obou reaktantů. V přebytku antigenu se imunokomplex rozpouští, zatím co v nadbytku protilátky se tvoří nerozpustné imu-nokomplexy (vyjímku tvoří imunoglobuliny, které mohou být současně protilátkou i an-tigenem a imunokomplex se zde rozpouští i v přebytku protilátky). Při imunochemic-kých reakcích se proto pracuje v zóně ekvivalence, kdy je poměr koncentrace obou reak-tantů optimální. Docílí se toho vhodným naředěním protilátky nebo antigenu, kdy se vzorek analyzuje ve více ředěních. Dalším typem reakce antigenu a protilátky je agluti-nace. Tuto reakci dává antigen navázaný na buňky, kde se specifickou protilátkou tvoří dobře viditelné vločky nebo zrníčka – aglutinát (Doležalová a kol., 1995).

Reakcí antigenu a protilátky lze s vyhovující přesností stanovit antigeny vyskytu-jící se v biologickém materiálu obvykle v koncentracích nad 10 mg/l. Je-li koncentrace nižší, pak je vhodné přidat do reakce třetí reaktant - antigen nebo protilátku značenou např. radioizotopem (u izotopových imunochemických metod) nebo jiným značkovacím indikátorem (u neizotopových imunochemických metod). Izotopové a neizotopové imuno-

chemické metody jsou oproti klasickým imunochemickým metodám podstatně citlivější. Používají se pro stanovení vysokomolekulárních látek např. bílkovin a jiných antigenů nebo haptenů (hormony, léčiva), vyskytujících se v biologickém materiálu ve stopovém množství tj. koncentrací pod 10 mg/l (Doležalová a kol., 1995).

Izotopové a neizotopové imunochemické metody pracují se třemi reaktanty. U kompetitivních (soutěživých) technik jsou jimi stanovovaný antigen (Ag), stejný anti-gen značený značkou X (AgX) a specifická protilátka proti stanovovanému antigenu v limitovaném množství (Pl). U nekompetitivních (nesoutěživých) metod jsou to stano-vovaný antigen (Ag), specifická protilátka v nadbytečném množství navázaná na pevnou fázi (Pl*) a značená specifická protilátka v nadbytku (PlX). Značkou (indikátorem) X mů-že být vhodný radioizotop nebo jiné značkovací indikátory např. fluoreskující látky či látky zhášející fluorescenci, enzymy, enzymové inhibitory, substráty, kofaktory, kom-plexy těžkých kovů, cheláty lanthanidových kovů apod. (Doležalová a kol., 1995).

Kompetitivní (soutěživé) metody se značeným antigenem a s limitovaným množ-stvím protilátky jsou metody založené na kompetitivním principu, kdy stanovovaný an-tigen a stejný antigen značený vhodnou značkou X (AgX) soutěží ve vazbě na limitované množství specifické protilátky s vysokou asociační konstantou. Tyto metody vyžadují delší inkubaci pro ustanovení termodynamické rovnováhy. Ke stanovovanému Ag ve vzorku se přidá známé množství stejného antigenu značeného značkou X (AgX). Oba tyto antigeny budou soutěžit o vazbu na svoji specifickou protilátku (Pl) a budou se na ni vázat ve stejném poměru, ve kterém byly zastoupeny ve směsi na počátku reakce. Vzniknou imunokomplexy Ag - Pl a AgX - Pl. Poněvadž se do reakce dává jen malé (limi-tované) množství protilátky, zůstanou v reakční směsi vždy též nezreagované – volné molekuly Ag a AgX, na které se protilátka již nedostala. Vlastnosti značky X se pak využí-vají buď k detekci značeného imunokomplexu AgX – Pl nebo volného AgX. Při stanovení imunokomplexu AgX – Pl je naměřená veličina nepřímo úměrná koncentraci stanovova-ného antigenu, při měření vlastnosti značky X u volného značkovaného antigenu AgX je přímá úměra mezi naměřenou veličinou a koncentrací antigenu (Doležalová a kol., 1995).

28

Kompetitivní metody se dále dělí na homogenní a heterogenní analýzu. U homogenní

analýzy není třeba oddělovat volný AgX od značeného imunokomplexu Ag

X – Pl, protoţe

s vazbou na protilátku můţe dojít ke změně fyzikálně chemických vlastností v „mikrookolí“

značky X. Imunokomplex AgX – Pl je pak inaktivní (nedává signál) a měří se pouze signál

volného AgX

. Příkladem je homogenní enzymoimunoanalýza (EMIT), kdy se měří enzymová

aktivita nezreagovaného AgE: po ukončené imunoreakci se přidá substrát enzymu navá-zaného na Ag a po následné inkubaci se měří absorbance barevného produktu, která je přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu (příp. haptenu) ve vzorku (Doleža-lová a kol., 1995).

U heterogenního uspořádání kompetitivní analýzy se můţe měřit buď signál volného

AgX nebo signál značeného imunokomplexu Ag

X – Pl. Poněvadţ signál zde zastávají obě

sloţky (AgX i Ag

X - Pl), je třeba před měřením jednu či druhou sloţku z roztoku izolovat

např. vysráţením a centrifugací apod. a zbývající sloţku odstranit vymýváním. Příkladem

tohoto typu stanovení je radioimunoanalýza (RIA): u klasické RIA je Pl v tekutém stavu, na

rozdíl od RIA techniky na pevné fázi, kde je Pl vázaná v limitovaném mnoţství na pevnou

fázi (Pl*). Ke značení antigenů se používá radioaktivní izotop jodu 125I nebo tritium 3H. Oddělování imunokomplexu AgX – Pl od volného AgX (což je podstatě separace volné a vázané radioaktivity) u klasické RIA se provádí technikou srážení imunokomplexů po-lyetylénglykolem, dvojí protilátky, nebo odstraněním volné radioaktivní frakce (AgX ) adsorbcí. RIA na pevné fázi (solid-phase) se od klasické RIA liší tím, že se ke směsi sta-novovaného Ag a přidaného značeného AgX nepřidává protilátka v roztoku, ale je v limi-tovaném množství vázána na pevnou fázi – imunosorbent (Pl*). Imunokomplexy Ag – Pl* a AgX – Pl* se pak již nemusí oddělovat od AgX separačními technikami jako u klasické RIA, ale mohou se od volných Ag a AgX přímo oddělit centrifugací apod. Jako pevná fáze mohu sloužit různé látky (imunosorbenty) a to nerozpustné částice celulózy, polyakry-lamidový gel, Sephadex apod. Analogickou metodou je heterogenní enzymoimunoanalýza

(ELISA), avšak ke značení se zde používá enzym (E), který štěpí specifický substrát na barevný produkt. Pro značení se používají různé enzymy – nejčastěji křenová peroxidá-za, alkalická fosfatáza, glukosaoxidáza, beta-galaktosidáza apod. Pro imunoreagencie značenou alkalickou fosfatázou se jako substrát používá p-nitrofenylfosfát, pro peroxi-dázu peroxid vodíku a uvolněný kyslík při enzymové reakci oxiduje bezbarvý chromo-gen (o-fenylendiamin) na barevný produkt (žlutooranžové zbarvení). Výsledné zbarvení se měří fotometricky. Od předchozí homogenní techniky EMIT se liší tím, že se měří en-zymová aktivita značeného imunokomplexu, avšak před přidáním substrátu je třeba odstranit volný značený antigen – to se provádí obdobně jako u RIA metod. U kompeti-tivní fluoroimunoanylýza (FIA; fluorescent immunoassay) je antigen značen fluorescenční

značkou (např. fluoresceinem) a měří se fluorescence značkovaného imunokomplexu po odstranění volného značkovaného antigenu či haptenu, na který se protilátka již nedo-stala (Doležalová a kol., 1995).

Nekompetitivní (nesoutěţivé) metody jsou techniky, při které se pouţívá dvou speci-

fických protilátek proti stejnému antigenu. První specifická protilátka je v nadbytku navázaná

na pevnou fázi (např. na stěnu umělohmotné zkumavky – Pl*). Druhá specifická protilátka je

značena značkou X (PlX) a je namířena proti jinému vazebnému místu antigenu. Obě speci-

fické protilátky jsou monoklonální. Stanovovaný antigen se váţe na první specifickou proti-

látku a dojde k reakci Ag + Pl* ↔ Ag – Pl*. Po vypláchnutí zkumavky se přidá

v nadbytečném mnoţství značená protilátka proti stanovovanému antigenu (PlX), která se na-

váţe na druhé vazebné místo (na „druhou stranu“) antigenu. Přebytek volné značené protilát-

ky (PlX) se odstraní promýváním. Měří se signál imunokomplexu Pl – Ag – Pl

X vázaného na

pevnou fázi. Výhodou těchto metod je krátká inkubační doba a vysoká citlivost. Mezi tyto

29

metody patří imunometrická analýza (IRMA) s protilátkou značenou radioaktivním izotopem

jodu 125

I nebo triciem 3H; sendvičové testy ELISA s protilátkou značenou enzymem (po-

dobně jako u kompetitivních metod ELISA); nekompetitivní enzymoimunoanalýza na mik-

ročásticích (MEIA), u nichţ narozdíl od předchozích technik EIA, kdy se měřila intenzita zbarvení fotometricky, reaguje enzym s fluorogenním substrátem a měří se intenzita fluorescence; nekompetitivní fluoroimunoanalýza (FIA) s protilátkou značenou fluorescenč-ním barvivem (Doležalová a kol., 1995).

30

7 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

7.1 Automatické analyzátory

Stanovení nádorových markerů se na oddělení klinické biochemie Nemocnice Chomutov

provádí na několika automatických analyzátorech, jejichţ popis je uveden v následujících

podkapitolách.

7.1.1 Analyzátor COBAS E 411 Imunoanalytický systém Roche Diagnostics Cobas E 411 je plně automatický, snadno ovladatelný, softwarem řízený systém pro imunoanalytická stanovení. Určen je pro in vitro kvantitativní a kvalitativní stanovení širokého okruhu analytů pomocí elek-trochemiluminiscenční technologie (ECL). Systém se skládá z analyzátoru, který provádí všechny činnosti pro plně automatické zpracování vzorku a stanovení, a řídící jednotky, která analyzátor ovládá prostřednictvím softwaru. Proces zahrnuje zaregistrování vzor-ku pacienta, ECL detekci a přenos výsledků (Roche Diagnostics). Na tomto přístroji stanovujeme z nádorových markeru CEA, PSA, fPSA, AFP, NSE, protein S100 a z dalších analytů vitamín B12, kys. listovou, luteinizační hormon , folikulostimu-lační hormon, estradiol, prolaktin, progesteron, testosteron, kortizol, mozkový natriure-tický peptid, C-peptid prekurzoru insulinu, thyreotropní hormon, , trijodthyronin, vol-nou frakci tyroxinu.

7.1.2 Analyzátor IMMULITE 1000 Immulite 1000 je analyzátor pro automatizovanou imunoanalýzu tak zvaně „po pacientech“, určený k provádění chemiluminiscenčních imunometrických analýz. Systém je konstruován pro speciální reakční kyvetu, která umožňuje rychlé a účinné promývání kuličky potažené protilátkou pomocí otáčení reakční kyvety kolem její delší, vertikální osy. Vzorek, přebytek činidla a promývací roztok jsou zachyceny v koaxiální odpadové komůrce, která je součástí reakční kyvety. Systém Immulite používá jako pevnou fázi plastikovou kuličku potaženou specifickou protilátkou pro daný analyt ve speciálně tvarované reakční kyvetě. Tato reakční kyveta slouží jako reakční nádobka pro imunoreakci, inkubaci, promývání a vývin signálu. Chemiluminiscenční substrát reaguje s enzymovým konjugátem vázaným na kuličce a vznikající emise světla je přímo úměrná množství analytu, které bylo původně přítom-no v analyzovaném vzorku (DPC CZECH s r.o.). Z nádorových marekrů zde stanovujeme TPS, z ostatních analytů troponin I.

7.1.3 Analyzátor IMMULITE 2000 Immulite 2000 je automatický imunochemický analyzátor, pracující na principu chemiluminiscence. Zpracovává in vitro vzorky biologických tekutin. Vzorky se do ana-lyzátoru vkládají v primárních nebo sekundárních zkumavkách o průměru od 12 do 16

31

mm a výšce od 75 do 100 mm, nebo ve speciálních mikrozkumavkách s držáky (DPC CZECH s r.o.). Provádíme zde vyšetření nádorových markerů CA 153, CA 125, CA 19-9 a z dalších ana-lys Imunoglobulin E, ferritin, parathormon, homocystein, beta-2-mikroglobulin v moči a séru.

7.1.4 Analyzátor IMX

IMX je analyzátor pro automatizovanou heterogenní imunoanalýzu MEIA (Micropar-

ticle Enzyme Immunoassay). Reakční nádobka obsahuje matrice se skleněnými vlákny. Přidá

se roztok obsahující mikročástice, na které je navázána v přebytku protilátka proti stanovova-

nému antigenu a vzorek se stanovovaným antigenem (mikročástice zvětší povrchovou plochu

a urychlují reakci). Antigen vytvoří se svojí protilátkou komplex. Po promytí se přidá enzy-

mový konjugát obsahující alkalickou fosfatázu, který se naváţe na imunokomplexy vázaný na

mikročásticích, ty se pevně zachytí na skleněných vláknech, zatímco ostatní reaktanty se od-

straní vymytím pufrem. Pak se přidá fluorogenní substrát, který je alkalickou fosfatázou ště-

pen a uvolní se fluorescenční látka – fluorofor. Fluorescence se měří kineticky.

Stanovujeme zde SCC a z dalších tacrolimus.

32

7.2 Hladiny nádorových markerů u pacientů s kolorektální karcinomem

Podle lokalizace nádoru se rozlišují tři číselníkové diagnózy kolorektálního karcinomu:

C189 označuje zhoubný nádor tlustého střeva, C19 zhoubný nádor rektosigmoideálního spo-

jení a C20 zhoubný nádor konečníku.

7.2.1 Zhoubný nádor tlustého střeva

Změny hladin nádorových markerů CEA a CA 19-9 u pacientů se zhoubným nádorem

tlustého střeva (C189) ukazují obr. 1, 2, 3 a 4.

U pacienta A hladina obou markerů korelovala s průběhem onemocnění: zvýšené hladiny

byly zjištěny při počáteční diagnóze a rovněţ vţdy při regresi onemocnění, kdy asi o měsíc

předcházely nálezu metastáz pomocí dalších vyšetřovacích technik. Hladina CA 19-9 byla

výrazně vyšší neţ CEA a rychleji reagovala na znovuobjevení nádorových buněk.

Také u pacienta B byla zjištěna vysoká hladina obou markerů při diagnóze, po nedokon-

čené chemoterapii se hladina udrţuje mírně zvýšená, ale zatím nebyly zjištěny metastázy.

Naopak pacient C je příkladem nemocného, u kterého nebyly v době diagnózy zhoubné-

ho nádoru uvedené markery zvýšeny; jejich rychlý vzestup byl zaznamenán aţ těsně před ob-

jevením metastáz v játrech. I u tohoto pacienta zvýšení hladiny CA19-9 předcházelo nárůstu

CEA o 1 měsíc.

U pacienta D byl karcinom tlustého střeva diagnostikován ve stadiu metastáz do jater a

oba markery byly výrazně zvýšeny. Po operaci a následné chemoterapii i radioterapii se hla-

diny obou markerů dále zvyšovaly. Po nasazení biologické léčby se sice hladiny začaly sniţo-

vat, ale klinicky došlo k další progresi onemocnění a vzniku nových metastáz.

33

PACIENT A

Ţena nar. 1959

Únor 2004 diagnostikován karcinom vzestupného tračníku

zjištěny metastázy v uzlinách

Chemoterapie – ukončena v září 2004

Únor 2005 kontrolní kolposkopie a CT – bez průkazu patologie

Listopad 2005 podezřelý nález na vaječníku – zahájena nová chemoterapie

Srpen 2006 podle vyšetření kompletní remise onemocnění

Květen 2007 zjištěny metastázy do vzdálených uzlin

Chemoterapie

Leden 2008 znovu kompletní regrese nálezu dle zobrazovacích vyšetření

Květen 2008 kostní metastáza v obratli – provedena operace obratle

Další chemoterapie

10

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0

100

200

300

400

500

600

700

800

ún

or

04

kvě

ten

04

srp

en 0

4

listo

pad

04

ún

or

05

kvě

ten

05

srp

en 0

5

listo

pad

05

ún

or

06

kvě

ten

06

srp

en 0

6

listo

pad

06

ún

or

07

kvě

ten

07

srp

en 0

7

listo

pad

07

ún

or

08

kvě

ten

08

srp

en 0

8

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

-9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

chemoterapie

chemoterapie

operace +chemoterapie

chemoterapie

Obr. 1: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta A se zhoubným nádorem tlustého střeva

(C189)

34

PACIENT B

Ţena nar. 1938

28.6.2004 chemoterapie, která ale pro intoleranci ukončena v červenci 2004

Dále jen sledována: ultrazvuk, kolposkopie negativní, skelet bez známek metastatického

postiţení

1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

50

100

150

200

250

červ

en 0

4

září

04

pro

sin

ec 0

4

bře

zen

05

červ

en 0

5

září

05

pro

sin

ec 0

5

bře

zen

06

červ

en 0

6

září

06

pro

sin

ec 0

6

bře

zen

07

červ

en 0

7

září

07

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

-9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

vyšetření negativní, bez metastáz

chemoterapie

Obr. 2: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta B se zhoubným nádorem tlustého střeva

(C189)

35

PACIENT C

Ţena nar. 1953

Květen 2007 diagnostikován adenokarcinom tlustého střeva s invazí do kostí

Červen 2007 operace

histologie – metastázy do uzlin a okolí

Chemoterapie

Leden 2008 metastázy do jater a pankreatu

Únor 2008 exitus letalis

13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

květ

en 0

7

červ

en 0

7

červ

enec

07

srp

en 0

7

září

07

říje

n 0

7

listo

pad

07

pro

sin

ec 0

7

led

en 0

8

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

metastázy

operace + chemoterapie

Obr. 3: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta C se zhoubným nádorem tlustého střeva

(C189)

36

PACIENT D

Muţ narozen 1944

LEDEN 2008 karcinom tlustého střeva s metastázami do jater

Operace

12 cyklů chemoterapie

Zahájena radioterapie

ČERVEN 2008 biologická léčba (nová chemoterapie)

ZÁŘÍ 2008 kontrolní CT jater – více metastáz (nové i metastáze do plic)

3

0

50

100

150

200

250

300

350

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

ún

or

08

bře

zen

08

du

ben

08

květ

en 0

8

červ

en 0

8

červ

enec

08

srp

en 0

8

září

08

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

9 (

kU/l

)

C199

CEA

biologická léčba

chemoterapiea radioterapie

Obr. 4: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta D se zhoubným nádorem tlustého střeva

(C189)

37

7.2.2 Zhoubný nádor rektosigmoideálního spojení

Změny hladin nádorových markerů CEA a CA 19-9 u pacientů se zhoubným nádorem

rektosigmoideálního spojení (C19) ukazují obr. 5, 6 a 7.

Pacientu E byl nádor diagnostikován ve stadiu pokročilých metastáz, hladina CEA a

především CA 19-9 však byla zvýšena poměrně málo; během chemoterapie klesají oba mar-

kery současně.

Rovněţ u pacienta F byl nádor zjištěn ve stadiu metastáz, hladiny obou markerů,

zejména CA 19-9 byly výrazně vyšší neţ u pacienta D. Úspěšná léčba byla doprovázena po-

klesem obou markerů na fyziologické hodnoty. Později se však objevily další metastázy, ale

hladina ani jednoho markerů se nezvýšila.

U pacienta G byly hladiny CEA při zjištění choroby i po nasazení chemoterapie ve fy-

ziologickém rozmezí, naopak hladina CA 19-9 zůstávala zvýšená i v průběhu léčby.

PACIENT E

Ţena nar. 1947

Červen 2008 diagnostikován karcinom v oblasti rektosigmoideálního spojení

Metastáze do jater, ovaria a v pobřišnici

Ordinována chemoterapie, nyní po 9.cyklu chemoterapie

9

0

5

10

15

20

25

30

0

20

40

60

80

100

120

červ

en 0

8

červ

en 0

8

červ

enec

08

červ

enec

08

červ

enec

08

červ

enec

08

červ

enec

08

srp

en 0

8

srp

en 0

8

srp

en 0

8

srp

en 0

8

září

08

září

08

září

08

září

08

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

chemoterapie

Obr. 5: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta E se zhoubným nádorem rektosigmoideální-

ho spojení (C19)

38

PACIENT F

Ţena nar. 1962

Červenec 2007 diagnostikován karcinom rektosigmatu,

suspektní metastáze do jater

ozáření, chemoterapie

Říjen 2007 operace a resekce jaterních metastáz

pooperačně další chemoterapie

Červen 2008 dle zobrazovacích vyšetření kompletní remise

Červenec 2008 metastáze v mozku – ozáření

Listopad 2008 metastáze do jater

14

0

20

40

60

80

100

120

140

0

500

1000

1500

2000

2500

červ

enec

07

srp

en 0

7

září

07

říje

n 0

7

listo

pad

07

pro

sin

ec 0

7

led

en 0

8

ún

or

08

bře

zen

08

du

ben

08

květ

en 0

8

červ

en 0

8

červ

enec

08

srp

en 0

8

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

ozáření + chemoterapie

operace + chemoterapie

metastázy

Obr. 6: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta F se zhoubným nádorem rektosigmoideálního

spojení (C19)

39

PACIENT G

Muţ nar. 1932

Srpen 2006 diagnostikován karcinom v oblasti rektosigmoideálního spojení, bez metastáz

do uzlin, ale předpoklad metastáz do jater

Chemoterapie

Březen 2007 nepotvrzeny metastázy v játrech - cysty

12

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

srp

en 0

6

říje

n 0

6

pro

sin

ec 0

6

ún

or

07

du

ben

07

červ

en 0

7

srp

en 0

7

říje

n 0

7

pro

sin

ec 0

7

ún

or

08

du

ben

08

červ

en 0

8

CEA

(m

ikro

g/l)

CA

19

9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

chemoterapie

Obr. 7: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta G se zhoubným nádorem rektosigmoideální-

ho spojení (C19)

40

7.2.3 Zhoubný nádor rekta

Změny hladin nádorových markerů CEA a CA 19-9 u pacientů se zhoubným nádorem

konečníku (C20) ukazují obr. 7 aţ 10.

U pacienta H byla zjištěna vyšší hladina CEA současně s objevem nádoru. Po operaci

hladiny markeru dále stoupaly, k poklesu došlo aţ po nasazení chemoterapie, která vedla

k regresi nálezu. Později ale došlo k opětovnému nárůstu hladiny CEA a generalizaci one-

mocnění. Naproti tomu CA 19-9 je stále negativní (méně neţ 2,5 kU/l) a měla by se nechat

vyšetřit krevní skupina, zda není přítomna Lewis(a,b), v takovém případě je vyšetření CA 19-

9 zbytečné.

Nádorové markéry u pacienta I byly sledovány aţ dva roky od diagnózy a úspěšné tera-

pii, kdy pacient nevykazoval ţádné klinické příznaky onemocnění. CEA byla v bezpříznako-

vém období na fyziologických hodnotách, vzestup hladiny byl zjištěn měsíc před objevem

metastázy v obratli. Po nasazení chemoterapie došlo k poklesu. Hladiny CA 19-9 nepřesáhly

po celou dobu fyziologické rozmezí, maximální zjištěná hladina byla 5,2 kU/l.

Hladina CEA u pacienta J byla při zjištění nádoru fyziologická, přestoţe nádor byl inope-

rabilní, a neměnila se ani v průběhu následné chemoterapie. K prudkému nárůstu hladiny

CEA došlo současně s objevem metastáz, a dále stoupala i po nasazení nové chemoterapie.

Hladiny CA 19-9 naproti tomu byly patologicky zvýšeny od objevení nádoru a nereagovaly

na chemoterapii, k poklesu došlo aţ po nasazení druhé chemoterapie po zjištění metastáz.

41

PACIENT H

Ţena nar. 1934

ČERVEN 2004 diagnostikován karcinom rekta – provedeno předoperační ozáření

ZÁŘÍ 2004 operace – bez známek metastatického postiţení

Pacientka pouze sledována, odmítá chemoterapii

ČERVENEC 2006 známky progrese onemocnění – zjištěny metastázy na plicích

Zahájena chemoterapie

Po chemoterapii regrese nálezu, ale postupná generalizace onemocnění

5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

CEA

mik

rog/

l)

CA 1

99 (k

U/l

)

CA 199

CEA

chemoterapie

Obr. 8: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta H se zhoubným nádorem rekta (C20)

42

PACIENT I

Muţ nar. 1961

r. 2001 diagnostikován karcinom rekta

operace, radioterapie

PROSINEC 2005 vyšetření bez známek onemocnění

PROSINEC 2007 bolesti zad – diagnostikován rozpad obratle – v něm metastáza

ÚNOR 2008 zahájena chemoterapie

7

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

20

40

60

80

100

120

pro

sin

ec 0

3

bře

zen

04

červ

en 0

4

září

04

pro

sin

ec 0

4

bře

zen

05

červ

en 0

5

září

05

pro

sin

ec 0

5

bře

zen

06

červ

en 0

6

září

06

pro

sin

ec 0

6

bře

zen

07

červ

en 0

7

září

07

pro

sin

ec 0

7

bře

zen

08

CA

19

9 (

kU/l

)

CEA

(m

ikro

g/l)

CEA

CA 199

rozpad obratle - metastáza

bez známek onemocnění

Obr. 9: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta I se zhoubným nádorem rekta (C20)

43

PACIENT J

Ţena nar. 1948

ZÁŘÍ 2007 karcinom rekta

Primárně ozářeno

ŘÍJEN 2007 operace – nález inoperabilní

LISTOPAD 2007 zahájena chemoterapie (6 cyklů)

KVĚTEN 2008 nově metastázy na pobřišnici – zahájena nová chemoterapie

Podle zobrazovacích metod vyšetření rozsáhlé prorůstání nádoru v malé pánvi

11

0

50

100

150

200

250

300

0

10

20

30

40

50

60

říje

n 0

7

listo

pad

07

pro

sin

ec 0

7

led

en 0

8

ún

or

08

bře

zen

08

du

ben

08

kvě

ten

08

červ

en 0

8

CEA

(m

ikro

g/l(

CA

19

9 (

kU/l

)

CA 199

CEA

chemoterapiemetastázy

chemoterapie

operace

Obr. 10: Hladiny CEA a CA 19-9 v séru pacienta J se zhoubným nádorem rekta (C20)

44

8 ZÁVĚR

Kolorektální karcinom je maligní nádor vycházející z buněk sliznice tlustého střeva. Řadí

se mezi nádory ţlázového původu – adenokarcinomy.

Screening se provádí pomocí testu na okultní krvácení u bezpříznakových osob nad 50.

let a u osob s rodinou anamnézou nad 40. let. Tento test je zaloţen na detekci peroxidázové

aktivity hemoglobinu.

Diagnóza se opírá o výsledky okultního krvácení, kolonoskopického vyšetření tlustého

střeva s odběrem bioptického vzorku. U pacientů s diagnózou kolorektálního karcinomu je

potřeba provést sonografii, CT jater, RTG hrudníku k vyloučení metastáz, CT malé pánve,

endosonografii rekta u nádoru konečníku a stanovení nádorových markerů.

Pro kolorektální karcinom jsou charakteristické nádorové markéry CEA, CA 19-9, CA

72-4, TPS, TPA. Nejsou vhodné pro primární diagnózu, ale umoţňují sledování průběhu

onemocnění a následné léčby. Z těchto nádorových markerů nesplňuje ţádný předpoklady pro

ideální tumorový marker, především nejsou specifické jen pro daný nádor, ale zvyšují se i při

zánětech a jiných onemocněních těchto orgánů.

Referenční interval CEA je v rozmezí 2-5 μg/l podle typu použitého setu. Pro kolo-rektální karcinom se pohybuje senzitivita kolem 60% při 90% specificitě. Pokles hodnot CEA asi ve 4. týdnu po chirurgickém zákroku může poskytnout údaj o úspěšnosti terapie. Hodnoty vyšší než 10 μg/l znamenají obvykle progresi maligního procesu.

Diskriminační hladina CA 19-9 se v séru i plazmě pohybuje do 37kU/l. Při malig-ních onemocněních dosahuje koncentrace CA 19-9 v až 106 kU/l. Senzitivita tohoto mar-keru u karcinomů kolorekta dosahuje 18 – 58 % a má prognostický význam. Koncentra-ce CA 19-9 obvykle nekoreluje výrazně s nádorovou hmotou. Výrazné zvýšení hladiny často s exponenciálním nárůstem (nad 1000 kU/l) je však průkazem metastáz. Stanovuje se často v kombinaci s CEA.

V experimentální části jsou uvedeny změny hladin obou markerů u pacientů léčených

v nemocnici Chomutov. I na tomto malém souboru pacientů je vidět velká variabilita hladin

a nedostatečná korelace s klinickým průběhem:

Téměř ideální korelace mezi hladinou obou markerů a průběhem nemoci a úspěš-ností terapie byly zaznamenány u pacienta A, B a E

Naproti tomu u pacienta C byly hladiny v době diagnózy nádoru ve fyziologic-

kých mezích a k jejich vzestupu došlo aţ při vzniku metastáz

Naopak u pacienta D patologické hladiny obou markerů začaly klesat po nasazení biologické léčby, přestoţe nedošlo k zastavení nádorového bujení, ale ke vzniku

metastáz; podobně nebyl vznik metastáz doprovázen zvýšením hladin markerů

u pacienta F

U pacientů G, I a J byla zvýšena pouze hladina CA 19-9, zatímco hladina CEA byla ve fyziologickém rozmezí; u pacienta I a J došlo k prudkému nárůstu CEA aţ

při vzniku metastáz

Pacient H měl negativní hodnoty CA 19-9 a doporučovala bych vyšetřit krevní

skupinu na přítomnost Lewis (a,b): v případě pozitivního výsledku se u těchto pa-

cientů CA 19-9 tvořit nebude, protoţe nemají pro syntézu nutný enzym fukozyl-

transferázu a je tedy zbytečné tento marker u nich vyšetřovat

Z uvedeného vyplývá, ţe nádorové markery mohou být velmi uţitečné pro sledování vý-

voje onemocnění a úspěšnosti léčby, ale neměly by se pouţívat jako základ pro diagnostiku

a vţdy by se mělo pohlíţet na kaţdého pacientka individuálně.

45

9 LITERATURA

Adam Z., Vorlíček J., Koptíková J.: Obecná onkologie a podpůrná léčba, Grada Publishing,

Praha 2003, 787 stran

Dienstbier Z., Skála E.: Nádorová diagnostika pro lékaře v praxi, Grada Publishing,

Praha 1995, 183 stran

Doleţalová V. a kolektiv autorů: Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii, In-

stitut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví BRNO,

Brno 1995, 286 stran

Holubec L. a kolektiv: Kolorektální karcinom – současné moţnosti diagnostiky a léčby, Gra-

da Publishing, Praha 2004, 175 stran

Lukáš K. a kolektiv: Gastroenterologie a hepatologie pro zdravotní sestry, Grada Publishing,

Praha 2005, 288 stran

Petera J. a kolektiv autorů: Obecná onkologie – učebnice pro lékařské fakulty, Karolinum,

Praha 2005, 205 stran

Šimíčková M., Nekulová M., Černoch M., Valík D.: Nádorové markery 2001, Roche

diagstics, 64 stran

Vorlíček J., Abrahámová J., Vorlíčková H. a kolektiv: Klinická onkologie pro sestry,

Grada Publishing, Praha 2006, 328 stran

Zima T.: Laboratorní diagnostika, Galén, Praha 2002, 728 stran

Uţivatelská příručka COBAS E 441

Roche Diagnostics 2001 – 2006

Návod k obsluze IMMULITE 2000

DPC CZECH s r.o.

Příručka pro obsluhu IMMULITE

DPC BIOVENDOR

Verze 2,0

46

10 SEZNAM ZKRATEK

A AFP - α1-fetoprotein Ag – antigen AgX - antigen značený značkou X AgPl – imunokomplexy

C CEA - karcinoembryonální antigen CYFRA 21-1 - cytokeratinový fragment 21-1

E E – enzym EC – enterochromafinní ECL - elektrochemiluminiscenční technologie EIA – Enzymoimunoanalýza ELISA - Heterogenní enzymoimunoanylýza EMIT - Homogenní enzymoimunoanalýza

F FIA – Fluoroimunoanylýza fPSA - volná frakce PSA

G GIST - gastrointestinální stromální tumory

H hCG - lidský choriový gonadotropin HNPCC - nepolypózní hereditární karcinomové syndromy

I IRMA - Immunoradiometric Assay - imunometrická analýza

M Mab - monoklonální protilátka MALT - Mucosa-Associated-Lymfoid-Tissue - slizniční lymfatická tkáň MEIA - nekompetitivní enzymoimunoanalýza na mikročásticích

O omega-6 PUFA - omega-6 polynenasycené mastné kyseliny omega-3 PUFA - omega-3 polynenasycené mastné kyseliny

47

P PAP - prostatická kyselá fosfatáza PEG – polyetylénglykol Pl - protilátka PlX - značená specifická protilátka v nadbytku Pl* - specifická protilátka v nadbytečném množství navázaná na pevnou fázi PLAP - placentární alkalická fosfatáza PSA - prostatický specifický antigen

R RIA – radioimunoanalýza - Radioimmunoassay

T TPA - Tkáňový polypeptidový antigen TPS - tkáňový polypeptidový specifický antigen