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Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg, Fakultät Life Science
Optimierung eines Infektionsmodells für Dengue-M/E
pseudotypisierte HIV-1-Partikel
Bachelorarbeit
im Studiengang Biotechnologie
vorgelegt von
Maibritt Kretschmer
2164659
Hamburg, 21. März 2017
1. Gutachter: Prof. Dr. Wacker, Claus-Dieter HAW Hamburg
2. Gutachter: Dr. Schreiber, Michael BNITM
Es kommt nicht darauf an, mit dem Kopf durch die Wand zu rennen,
sondern mit den Augen die Tür zu finden.
- Werner von Siemens
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 9
1.1 Pseudotypisierte Viruspartikel 9
1.2 Humanes Immundefizienz-Virus-Typ-1 12
1.2.1 Pseudotypisierte HIV-1-Partikel 12
1.3 Denguevirus 13
1.3.1 Virale Hüllproteine M/E 14
1.3.2 Der Denguevirus Zelleintritt 16
1.4 Vorarbeiten 17
1.5 Ziel der Arbeit 17
2 Material und Methoden 18
2.1 Geräte, Materialien und Chemikalien 18
2.1.1 Geräte und Materialien 18
2.1.2 Chemikalien und Reagenzien 19
2.1.3 Molekulargewichtsstandard 20
2.1.4 Plasmide 20
2.1.5 Zellen 20
2.2 Mikrobiologische Methoden 21
2.2.1 Medium und Agar-Platten 21
2.2.2 Kultivierung von E. coli 22
2.2.3 Herstellung chemokompetenter Bakterien 22
2.3 Molekularbiologische Methoden 22
2.3.1 Plasmid Transformation in E. coli 22
2.3.2 Plasmid-Präparation 23
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 24
2.3.4 DNA-Sequenzierung 25
2.4 Zellbiologische Methoden 26
2.4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 26
2.4.2 Transfektion von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen 26
2.4.3 Infektion eukaryotischer Zellen mit partikelhaltigen 27
Überständen
2.4.4 Luciferase-Assay 28
2.4.5 Bestimmung der TCID50 (tissue culture infectious dose) 29
3 Ergebnisse 30
3.1 Transfektion von HEK293T-Zellen zur Herstellung 30
pseudotypisierten HIV-1-Partikel
3.1.1 Herstellung der DENV-2 und DENV-3 pseudotypisierten 33
Partikel in 6-well-Zellkulturplatten
3.1.2 Herstellung der HIV-1 pseudotypisierten Partikel in 35
6-well-Zellkulturplatten
3.1.3 Herstellung der pseudotypisierten Partikel mit den 36
Hüllproteinen aller vier Dengue Serotypen
3.2 Infektion eukaryotischer Zellen mit pseudotypisierten 38
Partikeln
3.2.1 Infektion eukaryotischer Zellen mit DENV-2 und DENV-3 38
pseudotypisierten Partikeln
3.2.2 Infektion von U87-Zellen mit HIV-1 pseudotypisierten 42
Partikeln
3.2.3 Bestimmung der TCID50 von DENV-2 und DENV-3 43
Pseudotypen in Zellkulturüberständen
3.2.4 Methoden zur Verbesserung des Infektionsmodells 45
3.2.5 Einfluss der Zelldichte auf das Infektionsmodell 49
4 Diskussion 51
4.1 Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel 51
4.2 Verbesserung des Infektionsmodells 54
4.3 Bedeutung des Infektionsmodells für Dengue-M/E 55
pseudotypisierte HIV-1-Partikel
5 Zusammenfassung 58
5.1 Summary 59
6 Literaturverzeichnis 60
II Anhang 63
6
Verzeichnis der Abkürzungen
ATCC American Type Culture Collection
BIV Bovines Immundefizienz-Virus
CDY-TDV Denguevirus Impfstoff, Handelsname Denvaxia®
C-Protein capsid Protein
ddH2O doppelt destilliertes Wasser
DENV Denguevirus
DENV-1 Denguevirus Serotyp-1
DENV-2 Denguevirus Serotyp-2
DENV-3 Denguevirus Serotyp-3
DENV-4 Denguevirus Serotyp-4
DHF dengue hemorrhagic fever, Hämorrhagisches-Dengue-Fieber
DNA desoxy ribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
DSS Dengue-Schock-Syndrom
E. coli Escherichia coli
ELISA enzyme linked immunosorbent assay, enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
E-Protein envelope Protein
ED3 envelope Proteindomäne 3
FCS fetale calf serum, fötales Rinderserum
FIV Felines Immundefizienz-Virus
GFP grün fluoreszierendes Protein
HIV-1 Humanes Immundefizienz-Virus-Typ-1
HIV-2 Humanes Immundefizienz-Virus-Typ-2
HSV Herpes-simplex-Virus
JEV Japanische Enzephalitis-Virus
kb Kilobasenpaare
LB lysogeny broth, Nährmedium
LCM Lymphozytäre Choriomeningitis
MLV Murines Leukämie-Virus
M-Protein membrane Protein
NKR nicht kodierende Region
7
NT Neutralisationstest
OD560 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 560 nm
ORF open reading frame, Offener Leserahmen
prM-Protein precursor membrane-Protein (Vorläufer des M-Proteins)
RLU relative light units, relative Lichteinheiten
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
SIV Simianes Immundefizienz-Virus
TBEV tick-borne encephalitis virus, Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus
TCD50 tissue culture infectous dose
VSV Vesikular Stromatitis-Virus
VSV-G Glykoprotein G des Vesikular Stromatitis-Virus
WHO World Health Organisation, Welt-Gesundheitsorganisation
WNV Westnil-Virus
YFV yellow fever virus, Gelbfiebervirus
YT yeast trypton, Nährmedium
Verzeichnis der Abbildungen
Abb. 1 Schematische Darstellung der Herstellung eines Dengue-M/E 11
pseudotypisierten HIV-1-Partikels.
Abb. 2 Denguevirus. 15
Abb. 3 Membranfusion der Dengueviren. 16
Abb. 4 Ausbeute DENV-2 pseudotypisierter Partikel. 40
Abb. 5 Ausbeute DENV-3 pseudotypisierter Partikel. 41
8
Verzeichnis der Tabellen
Tab. 1: Beispiele pseudotypisierter HIV-1-Partikel. 10
Tab. 2: DNA-Verhältnisse der Transfektionsexperimente (6-well-Platte). 31
Tab. 3: DNA-Verhältnisse der Transfektionsexperimente (24-well-Platte). 32
Tab. 4: Luciferase-Aktivitäten der DENV-2 transfizierten HEK293T-Zellen. 34
Tab. 5: Luciferase-Aktivitäten der DENV-3 transfizierten HEK293T-Zellen. 34
Tab. 6: Luciferase-Aktivitäten der HIV-1 transfizierten HEK293T-Zellen. 35
Tab. 7: Luciferase-Aktivitäten der transfizierten HEK293T-Zellen in 24-well 37
Zellkulturplatten.
Tab. 8: Luciferase-Aktivitäten der infizierten VeroB4-Zellen – Infektion mit 40
DENV-2 pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 9: Luciferase-Aktivitäten der infizierten VeroB4-Zellen – Infektion mit 41
DENV-3 pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 10: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektion mit HIV-1 43
pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 11: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – TCID50-Reihen 44
von DENV-2 und DENV-3 pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 12: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektionen und 46
TCID50-Reihen mit HIV-1 pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 13: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektionen und 47
TCID50-Reihen mit HIV-1 pseudotypisierten Partikeln.
Tab. 14: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektionen mit DENV-2 48
pseudotypisierten Partikeln in Abhängigkeit von FCS.
Tab. 15: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektionen mit DENV-2 50
pseudotypisierten Partikeln bei verschiedenen Zelldichten.
9
1 Einleitung
1.1 Pseudotypisierte Viruspartikel
Pseudotypisierung bezeichnet den Austausch der Hüllproteine eines Virus mit den
Hüllproteinen eines anderen Virus. Die Information für die Hüllproteine ist im Genom des
Partikel bildenden Virus deletiert.1,2,3
Durch die Transfektion des deletierten Genoms entstehen
Viruspartikel ohne Hülle. Bei einer Co-Transfektion zusammen mit den Hüllproteinen eines
anderen Virus können umhüllte pseudotypisierte Partikel hergestellt werden (siehe Abb. 1).
Pseudotypiserte Partikel spielen bei der Analyse von Viren eine wichtige Rolle und werden in
diversen experimentellen und klinischen Anwendungsgebieten eingesetzt.1,4,5
Mit Hilfe
lentiviraler Vektoren können verschiedenste pseudotypisierte Partikel erstellt werden, mit denen
z.B. der Zelleintritt, veränderter Tropismus, die Funktion von Rezeptoren oder Proteinen sowie
die Wirkung von Medikamenten in Bezug auf die unterschiedlichen Hüllproteine untersucht
werden können.1,3
Pseudotypisierte Viruspartikel besitzen dadurch, dass Hüllproteine substituiert werden, ein
deletiertes Genom (env-). Mit den pseudotypisierten Partikeln (env
+) können entsprechende
eukaryotische Zellen infiziert werden. Die Viruspartikel können in die Zellen eindringen, aber
keine neuen infektiösen Partikel bilden. Diese Art der Infektion wird auch als single round
infection bezeichnet.1,8
In den Vektorplasmiden ist das Hüllprotein durch Reportergene, wie z.B.
Luciferase oder GFP (grün fluoreszierendes Protein), ersetzt, wodurch die Infektion der
Pseudotypen gemessen werden kann.2,3,8
In der Gruppe der Lentiviren, die zu der Familie der Retroviren gehören, eignen sich
verschiedene Virusarten, besonders das Humane-Immunodefizienz-Virus-Typ-1 (HIV-1), als
Vektor für pseudotypisierte Partikel (weitere sind HIV-2, SIV, FIV oder BIV).3 Besonders HIV-1
(env+) wird als Vektor in Kombinationen mit unterschiedlichen Hüllproteinen aus diversen
Virusklassen verwendet (siehe Beispiele Tabelle 1).1,2,3,4,5,6,9
Pseudotypen, die Glycoproteine von
Lyssaviren, LCM-Viren, Alphaviren, Filoviren oder Retroviren tragen, sind in der Literatur
beschrieben.3 Allerdings wurde über pseudotypisierte HIV-1 Partikel mit Hüllproteinen von
Dengueviren, die der Baltimore-Gruppe IV der ss(+)RNA Viren angehören, erst eine
wissenschaftliche Arbeit veröffentlicht.
10
Die pseudotypisierten Partikel werden mittels Transfektion von Zellen mit Vektoren hergestellt.
Die Transfektion ist eine wirksame Methode um genetisches Material, wie Plasmid-DNA oder
RNA, in eukaryotische Zellen einzubringen. Für die Partikelbildung werden die eingebrachten
Plasmide in den Zellen exprimiert, aber nicht ins Genom integriert (transient transfection). Zur
Steigerung der Transfektionseffizienz werden kationische Lipide verwendet. Mit Hilfe einer Co-
Transfektion können zwei Plasmide gleichzeitig in die eukaryotischen Zellen gebracht werden,
um sowohl den Virus-Vektor, als auch die Hüllproteine zu exprimieren.7,10,11
Im verwendeten
lentiviralen Vektorsystem werden für die Bildung Dengue M/E-pseudotypisierter HIV-1-Partikel
ein HIV-1-Vektorplasmid und ein DENV-Hüllproteinplasmid verwendet.
Tab. 1: Beispiele pseudotypisierter HIV-1-Partikel.
Baltimore *
Gruppe, Genom Familie Gattung Art / Hüllproteine
pseudotypisierter
Partikel
IV, ss(+) Togaviridae Alphavirus Ross-River-Virus HIV-1(RRV)
Semliki-Forest-Virus HIV-1(SFV)
V, ss(-)
RNA nicht
segmentiert
Rhabdoviridae
Vesiculovirus VSV-G HIV-1(VSV-G)
Lyssavirus Rabiesvirus HIV-1(Rabies)
Filoviridae Ebolavirus EboZ HIV-1(EboZ)
V, ss(-)
RNA
segmentiert
Bunyaviridae Hantavirus Hantavirus HIV-1(HTNV)
Arenaviridae Arena-Virus LCM-Virus HIV-1(LCMV-Arm53b)
VI, ss(+) Retroviridae Lentivirus HIV-1 HIV-1(HIV-1)
Gammaretrovirus Murine Leukämievirus HIV-1(MulV)
* Aufgezeigt sind die in der Literatur häufig aufgeführten Hüllproteine
pseudotypisierter HIV-1-Partikel. Die Virusarten der Hüllproteine sind nach
Baltimore-Gruppen geordnet und in Genom, Familie und Gattung gegliedert.
11
Abb. 1 Schematische Darstellung der Herstellung eines Dengue-M/E
pseudotypisierten HIV-1-Partikels.14
Exemplarisch dargestellt ist die Herstellung eines DENV-1-M/E pseudotypisierten
Partikels mittels Co-Transfektion des Vektorplasmids (pNLlucAM) und des
Hüllproteinplasmids (pHAD1). Bei dem HIV-1 basierten Viruspartikel wurden die
äußeren HIV-1-Hüllproteine durch die Hüllproteine des DENV (Dengue M/E)
ausgetauscht. Das HIV-1-Genom enthält statt der Information der HIV-1-
Hüllproteine ein Reportergen (luc), welches das Enzym Luciferase unter der
Kontrolle des SV40-Promotors exprimiert.
12
1.2 Humanes Immundefizienz-Virus-Typ-1
Das Humane Immundefizienz-Virus-Typ-1 (HIV-1) zählt zu der Gattung der
Lentiviren und gehört der Familie der Retroviridae an. Das Virusgenom setzt sich aus einer
einzelsträngigen +Strang-RNA zusammen, die in zwei identischen Kopien vorliegt. Neben den
für Retroviren üblichen Antigenen gag (Group specific Antigen), pol (Polymerase) und env
(Envelope) verfügt das HIV-1-Genom zusätzlich über sechs weitere Gene: tat, rev, vif, vpr, vpu
und nef.12,13
Besonders nef (Negative Factor) sowie vpr (Viral Protein R) spielen bei dem
Retrovirusvektor für die Bildung der pseudotypisierten Partikel eine wichtige Rolle.
Untersuchungen haben ergeben, dass Vektoren, die vpr+ und nef
+ sind, die optimalen
Virusvektoren darstellen.14
Die virale RNA wird von einem kegelförmigen Kapsid
eingeschlossen, was aus dem Protein p24 gebildet wird. In der Membran des HIV-1 sind sog.
spikes eingebettet. Die spikes bilden sich aus den trimeren Transmembranproteinen gp41 und
gp120. Die Transmembranproteine gp41 und gp120 entstehen durch die proteolytische Spaltung
des Vorläuferproteins gp160 (env).12,13
1.2.1 Pseudotypisierte HIV-1-Partikel
Die Fähigkeit des HIV-1, pseudotypisierte Virionen zu bilden, zeigte sich bei Zellen,
in denen das Wildtyp-HIV-1 vermehrt wurde und die zusätzlich mit weiteren Viren infiziert
waren. Aus mehreren Studien geht hervor, dass mit MLV, amphotropen MLV oder HSV
infizierte HIV-1 Wildtyp-Zellen phänotypisch gemischte Virionen bilden.15
Durch das Einlagern
der Hüllproteine (phenotype mixing) in die Virusmembran wird den HIV-1-Partikeln der
Phänotyp und somit auch der Tropismus der fremden Hüllproteine verliehen.15,16
Zu den ersten und immer noch am häufigsten verwendeten Hüllproteinen lentiviraler
Pseudotypen gehört das Vesicular stomatitis Virus Hüllprotein (VSV-G).15,16,17,18,19,20
Die VSV-G
pseudotypisierten Partikel weisen eine große Stabilität auf. Zusätzlich treten Wechselwirkungen
zwischen dem Hüllprotein VSV-G und einem ubiquitären Zellrezeptor auf, wodurch ein
umfassender Tropismus hervorgerufen wird. Das Hüllprotein VSV-G gilt durch dessen häufige
und erfolgreiche Verwendung als Standard für die Effizienz der Pseudotypen-Bildung.15,16,17
Mit Hilfe pseudotypisierter HIV-1 Partikel lässt sich eine Transfektion sowohl in sich teilenden,
als auch in ruhenden Zellen durchführen. Demnach wächst die Zahl weiterer Glykoproteine für
pseudotypisierte HIV-1 Vektoren stetig.15,16
13
1.3 Denguevirus
Flaviviren gehören der Familie der Flaviviridae an. Diese Virusfamilie umfasst neben
den Flaviviren noch die drei Genera Hepaciviren, Pegiviren und Pestiviren.15,16,17,18
Die Viren der Flaviviridae sind lediglich entfernt verwandt, weisen jedoch Übereinstimmungen
bezüglich der Genomorganisation, der nicht-strukturellen Proteinmuster, sowie der Morphologie
und Replikationsstrategie auf. Das Genom aller Flaviviren besteht aus einem
(+)-RNA-Einzelstrang. Die größten Unterschiede zeigen sich hinsichtlich der biologischen
Eigenschaften, wie die Vektor-Abhängigkeit oder der Wirtsbereich.15,16,17,18,19
Die Gattung der Flaviviren umfasst mehr als 70 verschiedene Virustypen. Zu den wichtigsten
human- und tierpathogenen Flaviviren gehören das namensgebende Gelbfiebervirus (yellow fever
virus, YFV), das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV), das Westnil-Virus (WNV), das
Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (tick-borne encephalitis virus, TBEV) und das
Denguevirus (DENV).15,16,17,19
Durch Übertragung der Viren mittels Arthropoden (Mücken, Zecken) werden diese auch als
Arboviren bezeichnet.16,17,19
Dengueviren besitzen als natürlichen Wirt den nichtmenschlichen Primaten und werden durch die
Moskitos der Aedes-Gattung verbreitet. Vor allem die Arten A.aegypti und A.albopictus gelten als
häufigster Überträger.16,18,19,20,21
Dengueviren lassen sich in vier Serotypen (DENV-1 bis DENV-
4) unterscheiden. Durch die Verschleppung der Aedes-Insekten infolge des zunehmenden Flug-
und Reiseverkehrs, überlappen die ehemals komplett abgegrenzten Epidemie-Zonen. Dadurch
haben sich die Verbreitungsgebiete der Serotypen des DENV weltumspannend auf den tropischen
und subtropischen Gürtel ausgeweitet. Insofern ist das Denguevirus das bedeutendste und
häufigste von Arthropoden übertragende Flavivirus.16,18,19,20,21
Beim Menschen wird durch die Infektion mit DENV das sog. Denguefieber ausgelöst. Das Virus
verursacht laut WHO jährlich 50 Millionen Infektionen weltweit, wodurch Fiebererkrankungen
und Hämorrhagien hervorgerufen werden. Durch die dramatische Virusverbreitung leben über
2,5 Milliarden Menschen in DENV Risikogebieten.16,18
Eine Infektion mit DENV kann sowohl
symptomatisch als auch asymptomatisch verlaufen. Bei einem asymptomatischen
Krankheitsverlauf werden Antikörper gegen den jeweiligen Serotyp gebildet, obwohl der Patient
keine Symptome zeigt. Aus einem symptomatischen Krankheitsverlauf mit grippeähnlichem
Fieber können sich zusätzlich ein Hämorrhagisches Denguefieber (dengue hemorrhagic fever,
DHF) und ein Dengue-Schock-Syndrom (DSS) entwickeln.16,18,19,20,21
14
Bei einer weiteren Infektion mit einem anderen Serotyp erhöht sich das Risiko auf einen
schweren Krankheitsverlauf aufgrund des „Immune-Enhancements“. Dengue-Infektionen werden
symptomatisch behandelt, wobei hämorrhagische Verläufe intensivmedizinisch überwacht
werden müssen. Eine antivirale Therapie gegen das Denguevirus wurde noch nicht
entwickelt.20,21
Allerdings wurde im Jahr 2015 erstmals ein DENV-Impfstoff zugelassen. Das
Vakzin Denvaxia® (CYD-TDV) des Unternehmens Sanofi Pasteur Ltd. wird für epidemische
DENV-Gebiete von der WHO empfohlen, ist von dieser jedoch noch nicht präqualifiziert. Der
Impfstoff konnte infolge durchgeführter Phase-III-Studien laut Sanofi eine Wirksamkeit von ca.
60% erzielen.22,25
1.3.1 Virale Hüllproteine M/E
Die Dengueviren enthalten, wie alle Flaviviren, eine einzelne Kopie einer positiv-
Strang-RNA. Das Genom codiert für einen einzigen offenen Leserahmen (Open Reading Frame,
ORF; 10,7 kb) und ist eingerahmt von nicht kodierenden Regionen (NKRs).15,16,18
Durch die
Translation des Leserasters entsteht ein einziges Polyprotein, das in Struktur- und
Nichtstrukturproteine proteolytisch gespalten wird.16,18
Die drei Strukturproteine bestehen aus
den sphärischen Kapsid (capsid, C), dem Membranprotein mit dessen Vorläufer (membrane, M
bzw. pre membrane, prM) sowie dem Hüllprotein (envelope, E). Das DENV-Kapsid ist umgeben
von einer Hüllmembran, in der das Membranprotein und das Hüllprotein integriert sind. Die
beiden Proteine liegen als Homodimere vor. Sie sind jeweils durch einen Membrananker in die
Hüllmembran eingelagert. Bei nicht ausgereiften Dengueviren formen prM-E-Trimere 60 sog.
spikes auf der Virusoberfläche. Mittels einer proteolytischen Spaltung vom Vorläufer-Teil („pr“)
des Membranproteins erfolgt die Modifizierung zu reifen infektiösen Viren. Es bildet sich eine
glatte Oberfläche, die aus 90 E-Homodimeren besteht, welche in sog. rafts aus drei parallelen
Dimeren angeordnet sind. Dadurch wird die richtige Oberflächenbeschaffenheit für den
Zelleintritt gewährleistet.15,16,17,18
Die vier Serotypen des DENV unterscheiden sich in ihrer
Antigenstruktur. Die verschiedenen Subtypen haben eine 60-80%ige Übereinstimmung in ihrem
Genom. Die größten Differenzen liegen besonders in den Domänen des Oberflächenproteins E.20
15
A Genomstruktur des Dengue-Virus18
B Schematische Darstellung des Denguevirus
Abb. 2 Denguevirus.
(A) Das einzelsträngige RNA-Genom besteht aus einem einzigen offenen
Leserahmen und wird von zwei nicht kodierenden Regionen (NKRs) flankiert. Der
ORF kodiert ein Polyprotein, das in drei Strukturproteine und fünf
Nichtstrukturproteine gegliedert wird: C (capsid), prM (precursor membran), E
(envelope) und NS1-5.
(B) Das Denguevirus formiert sich aus einem Nukleokapsid (C), welches die
(+)Strang-RNA enthält. Umgeben wird das Kapsid von einer Hüllmembran, in der
die Hüllproteine prM und E verankert sind. Während der Reifung der Viruspartikel in
den Endosomen erfolgt, aufgrund einer proteolytischen Spaltung des prM, eine
Konformationsänderung der Heterodimere prM und E.
16
1.3.2 Der Denguevirus Zelleintritt
Das E-Protein spielt beim Zelleintritt eine zentrale Rolle. Es induziert sowohl die
Rezeptorbindung als auch die pH-abhängige Fusion mit der Membran. Zusätzlich wird auf dem
E Glycoprotein (ED3) eine Rezeptorbindungsdomäne vermutet. Der Prozess des Zelleintritts
beruht auf einer rezeptor-vermittelten Endozytose.15,17,18
Eingeleitet wird der Zelleintritt durch
die Protonierung bestimmter Aminosäuren. Durch die Verschiebung des pH-Wertes in ein saures
Milieu, wird eine Konformationsänderung der Virusoberfläche bewirkt. Infolge der pH-
Veränderung dissoziieren die E-Homodimere. Die Fusionspeptide an den Spitzen dieser
Monodimere können somit in die Zell-Endosomenmembran eingebracht werden. Aufgrund der
Konformationsänderung wird das E-Protein mit dem Fusionspeptid relokalisiert, sodass sich eine
Haarnadelschleife ausbildet und sich das Peptid sowie der Membrananker nebeneinander
befinden. Es entsteht eine trimere Konformation des E-Proteins, wodurch die Zell- und die
Virusmembran zusammengezogen werden und eine Fusionspore ausprägt wird. Das virale
Nukleokapsid wird in das Zytoplasma freigesetzt. Dadurch kann das virale Genom translatiert
und repliziert werden.15,16,17,18
Der Vorgang des Zelleintritts verläuft bei allen vier Serotypen
konform, wobei durch die unterschiedlichen Antigenstrukturen vom Serotyp abhängige
Rezeptoren gebunden werden.20
Infolge des phenotype mixing werden auf die Dengue-M/E-pseudotypisierten HIV-1-Partikel die
Eigenschaften des Denguevirus Zelleintritts übertragen. Die Infektion eukaryotischer Zellen mit
den Dengue-M/E-pseudotypisierten HIV-Partikeln erfolgt demnach durch eine DENV Rezeptor-
vermittelte Endozytose, unabhängig vom HIV-1-Zelleintritt.
Abb. 3 Membranfusion der Dengueviren.
(1) Die E-Homodimere sind auf der Virusoberfläche in Form von Rafts angeordnet.
(2) Die pH-Verschiebung in ein saures Milieu bewirkt eine Dissoziierung der Dimere.
Durch eine daraus folgende Konformationsänderung kann das Fusionspeptid mit der
Zell-Endosomenmembran Wechselwirkungen eingehen. (3)-(4) Aufgrund weiterer
Konformationsänderungen und der Trimerisierung des E-Proteins werden Zell- und
Virusmembran zusammengezogen. (5) Es entsteht eine Fusionspore, durch die das
virale Nukleokapsid in das Zytoplasma freigesetzt werden kann.
17
1.4 Vorarbeiten
Die Forschung an Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1-Partikeln ist immer noch
sehr begrenzt. Es wurde erst eine wissenschaftliche Arbeit zu diesem Thema veröffentlicht.26
Mit
dem in der Veröffentlichung dargestellten pNL4-3-Luc-R-E
--Vektor lassen sich die Partikel
jedoch nicht produzieren, sodass Verbesserungen vorgenommen werden mussten. Im Zuge einer
Dissertation in der LG-Schreiber (BNITM) wurde mit dem Aufbau eines pseudotypisierten
HIV-1-Vektorsystems mit den Hüllproteinen des Denguevirus begonnen. Die optimalen HIV-1-
Vektoren wurden ermittelt (pNLlucAM). Außerdem wurden die Expressionsplasmide für die
Dengue-Hüllproteine konstruiert (pHAD1-D4). Damit wurde erstmals erreicht, dass
reproduzierbare Infektionen gemessen werden konnten. Durch eine Transfektion in 6-well-
Zellkulturplatten konnten z. B. 20 Infektionsexperimente durchgeführt werden.
Während des Praxissemesters wurden die Vektorplasmide und Hüllproteinplasmide vervielfältigt
sowie aufgereinigt. Des Weiteren wurden die ersten Transfektionsexperimente durchgeführt.
Dabei wurden unter anderem das Protokoll und Transfektions-Reagenz der Firma Incella bei
variierenden DNA-Mengen getestet. Auch die optimale Transfektionszeit wurde ermittelt.
1.5 Ziel der Arbeit
Erstes Ziel der Arbeit war die Steigerung der Partikelproduktion. Die Plasmid-
Mengen, die für die Transfektion eingesetzt wurden, sollten gesteigert werden und die
resultierenden Transfektionsergebnisse und Infektionsergebnisse mit Hilfe der Luciferase-
Aktivitäten verglichen werden. Ziel war es, eine größere Ausbeute an pseudotypisierten Partikeln
zu erreichen, um mehr Infektionsexperimente mit einer Transfektion durchführen zu können.
Zweites Ziel der Arbeit war die Quantifizierung der Transfektions-Ausbeuten. Durch die TCID50
Bestimmung sollte die infektiöse Dosis ermittelt werden.
Drittes Ziel der Arbeit war die Reproduzierbarkeit des Infektionsmodells. Die Infektionen
eukaryotischer Zellen mit den pseudotypisierten Partikeln sollten auf ein 96-well-Format
übertragen werden, um gleichmäßige Infektionen erreichen und wiedergeben zu können.
18
2 Material und Methoden
2.1 Geräte, Materialien und Chemikalien
2.1.1 Geräte und Materialien
Gerät/Material Bezeichnung Hersteller
Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN Biorad
Inkubator Heraeus BBD 220 Thermo Electron Corporation
Küvetten Mikroküvetten Shimadzu Corporation
Mikroplatten Luminometer Centro LB 960 Berthold Technologies
Mikroskop Diavert Leitz
Schüttelinkubator 3031 GFL
Sterilwerkbank Sterilgard III Avance The Baker Company
Thermocycler Thermomixer Comfort Eppendorf
UV/Vis-Spektrometer UV-160A Shimadzu Corporation
Vortexer D-6012 NeoLab
VF2 Janke & Kunkel IKA
Labortechnik
Zentrifugen Centrifuge 5810R Eppendorf
Avanti J-26 Beckmann Coulter
Optima XE-90
Ultracentrifuge
Beckmann Coulter
Biofuge pico Heraeus
19
2.1.2 Chemikalien und Reagenzien
Substanz Hersteller
Agar Difco
Agarose Biozym
Borsäure Merck
Bromphenolblau Merck
Caesiumchlorid Sigma-Aldrich
DMEM Gibco
DTT Merck
EDTA Carl Roth
Eisessig Merck
Essigsäure Carl Roth
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich
Fötales Rinderserum (FCS) PanBiotech
Glukose Carl Roth
Glycerin Carl Roth
Hefeextrakt Difco
Kaliumacetat Carl Roth
Natriumchlorid Carl Roth
Natriumhydroxid Carl Roth
Penicillin/Streptomycin Gibco
RPMI Gibco
Salzsäure Carl Roth
SDS Carl Roth
Tris Carl Roth
Triton X-100 Merck
Trypton Carl Roth
20
2.1.3 Molekulargewichtsstandard
Generuler 1 kb DNA Ladder Thermo Scientific
2.1.4 Plasmide
Plasmid Beschreibung
pNLlucAM Plasmid mit HIV-1 deletiertem Genom (env-, Luc
+)
pgp160 Expressionsvektor für NL43-gp160
pcBD1 Expressionsvektor für DENV-1-M/E
pHAD2 Expressionsvektor für DENV-2-M/E
pHAD3 Expressionsvektor für DENV-3-M/E
pHAD4 Expressionsvektor für DENV-4-M/E
Die verwendeten Plasmide wurden im Vorfeld in der Laborgruppe Schreiber hergestellt.
2.1.5 Zellen
Zellen Organismus ATCC Herkunft
HEK293T Homo Sapiens CRL-11268 Friedrich-Löffler-Institut,
Riems-Greifswald
U87 CXCR4 Homo Sapiens - Bernhard-Nocht-Institut für
Tropenmedizin, Hamburg
VeroB4 Cercopithecus aethiops CCL-81
Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und
Zellkulturen, Braunschweig
21
2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2.1 Medium und Agar-Platten
LB Medium: 10 g Trypton
10 g NaCl
5 g Hefeextrakt
dYT Medium: 16 g Trypton
5 g NaCl
10 g Hefeextrakt
YT Medium: 8 g Trypton
5 g NaCl
5 g Hefeextrakt
LB Agarplatten: 10 g Trypton
10 g NaCl
5 g Hefeextrakt
16 g Agar
YT Agarplatten 8 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
16 g Agar
Für das Ansetzen der Medien und des Agars wurden die aufgelisteten Komponenten
eingewogen und mit 1000 ml doppelt destilliertem Wasser aufgefüllt. Bei 121°C und 1,5 bar
wurden die Lösungen autoklaviert. Die Zugabe von Antibiotika Lösungen erfolgte nach dem
Abkühlen auf <55°C, da diese Zusätze hitzeempfindlich sind.
Ampicillin: 4 ml/l (60 mg/ml)
22
2.2.2 Kultivierung von E. coli
Die Vermehrung von Bakterien (E. coli Stamm DH5α) in einer Flüssigkultur erfolgte
durch das Animpfen mit einer Einzelkolonie. Im Schüttelinkubator wurden die Flüssigkulturen
über Nacht kultiviert (37°C, 180 rpm, Schüttelinkubator GFL, 3031).
Für Vermehrung von Bakterien auf YT-Agar wurden Bakterien-Flüssigkulturen ausgestrichen
und bei 37°C über Nacht inkubiert.
2.2.3 Herstellung chemokompetenter Bakterien
Die Herstellung chemokompetenter Zellen geschah mittels der Calciumchlorid-
Methode. DH5α-Zellen wurden auf LB-Agar ohne Antibiotikazusätze ausgestrichen. Drei ml YT-
Medium wurden mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C im Rotor kultiviert.
Mit 1 ml der Vorkultur wurden 100 ml YT-Medium inokuliert. Im Schüttelinkubator wurden die
Bakterien inkubiert, bis eine optische Dichte von OD560 = 0,4 erreicht wurde. Bei 4°C und
5000 rpm wurden die Bakterien für 15 min abzentrifugiert (Eppendorf, Centrifuge 5810R; Rotor
FA-45-6-30). Die Bakterien wurden in 40 ml sterilfiltriertem 50 mM CaCl2 resuspendiert und
5 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt (4°C, 5000 rpm, 15 min;
Eppendorf, Centrifuge 5810R, Rotor FA-45-6-30). Die Bakterien wurden in 2 ml 50 mM CaCl2
suspendiert und über Nacht auf Eis gestellt. Die Suspension wurde mit 2 ml 50 %igem Glycerin
versetzt und in 200 µl Portionen aufgeteilt. Nach dem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff
wurden die kompetenten Zellen bei -70°C gelagert.
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Plasmid Transformation in E. coli
Chemokompetente DH5α-Zellen wurden auf Eis aufgetaut und mit 1µl Plasmid
versetzt (100 ng Plasmid/100 ml Zellen). Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis folgte ein
Hitzeschock im Heizblock bei 42°C für 3 min. Die abgekühlten Bakterien wurden mit 800 µl
YT-Medium versetzt und für 30 min bei 37°C und 800 rpm inkubiert. Je 200 µl der
Bakterienkultur wurden auf eine YT-Amp-Platte ausplattiert. Der Rest der Bakterienkultur wurde
für 5 min bei 8000 rpm zentrifugiert, in 200 µl YT-Medium resuspendiert und ebenfalls
ausgestrichen. Über Nacht inkubierten die Platten bei 37°C.
23
2.3.2 Plasmid-Präparation
Plasmide wurden mit Hilfe der CsCl-Methode im Zuge einer Plasmid
Maxipräparation isoliert und aufgereinigt. Je 200 ml einer Bakterienkultur wurden in der
Beckmann Zentrifuge (Beckmann Coulter, Avanti J-26; Rotor JA-14) auf 10.000 rpm
beschleunigt. Die Zellen wurden in 5 ml der Lösung 1 resuspendiert, in 50 ml Falcon Tubes
überführt und in 10 ml der Lösung 2 lysiert. Nach 5-minütiger Inkubation wurden 7,5 ml der
Lösung 3 zur Neutralisation hinzugegeben. Die Suspension wurde 10 min auf Eis inkubiert und
anschließend bei 8000 rpm und 4°C für 20 min zentrifugiert (Eppendorf, Centrifuge 5810R;
Rotor FA-45-6-30). Der Überstand wurde mit 0,7 Vol. Isopropanol versetzt und für 20 min
inkubiert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 5000 rpm und 18°C für 20 min (Eppendorf,
Centrifuge 5810R; Rotor FA-45-6-30) der nach dem Waschen des Sediments mit 10 ml 70%igem
Ethanol wiederholt wurde. Die DNA wurde anschließend in 4 ml TE Puffer gelöst und 150 µl
EtBr (10 mg/ml) sowie 4,9 g CsCl hinzugegeben. Die Lösung wurde bei 4000 rpm für 10 min
zentrifugiert (Eppendorf, Centrifuge 5810R; Rotor FA-45-6-30). Für die
Dichtegradientenzentrifugation wurde die DNA-Lösung in 5 ml Quick Seal Tubes gegeben. Mit
Hilfe von 0,9 mm x 40 mm Kanülen sowie 5ml Spritzen ohne Kolben ließen sich die Röhrchen
befüllen, exakt austarieren und zuschmelzen. Vor dem Beladen wurde die Dichtheit durch
Drücken der Röhrchen überprüft. Über Nacht wurden die Tubes bei 70000 rpm und 25°C
zentrifugiert (Beckman Coulter, Optima XE-90 Ultracentrifuge; Rotor NVT90).
Mittels einer Kanüle und einer Spritze wurde die untere Plasmid-DNA Bande aus dem Röhrchen
gezogen. Um einen Unterdruck zu verhindern, wurde mit einer kleinen Kanüle ein Luftloch in
den oberen Teil des Quick Seal Tubes gestochen. Zum Schutz vor Verletzungen und dem
Durchstechen wurde eine abgeschnittene Pipettenspitze auf die 0,9 mm x 40 mm Kanüle
gesteckt, sodass nur ca. 0,8 cm der Kanüle freilagen. Mit der Kanüle wurde an dem unteren Rand
der Bande in das Röhrchen gestochen und die Plasmid-DNA durch Aufziehen der 2 ml Spritze
extrahiert. Die Plasmid-DNA wurde in 1,5 ml Eppendorf-Gefäße überführt. Durch dreimaliges
behandeln der wässrigen Phase mittels Zugabe von 1 Vol. n-Butanol, wurde das EtBr extrahiert.
Die Lösung wurde mit 0,7 Vol. NaAc und 2 Vol. 97 %igem EtOH versetzt und für 20 min bei
10000 rpm zentrifugiert (Heraeus, Biofuge pico). Die Plasmide wurden zweimal mit 70 %igem
EtOH gewaschen und anschließend in 500 µl TE Puffer gelöst.
24
Lösung 1: 50 mM Glukose
10 mM EDTA
25 mM Tris-HCl pH 8,0
Lösung 2: 0,2 M NaOH
1 % SDS
Lösung 3: 3 M Kaliumacetat
2 M Essigsäure
TE-Puffer: 10 mM Tris
1 M EDTA pH 8,0
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese
Plasmide und DNA-Fragmente wurden durch Ektrophorese in Agarosegelen
aufgetrennt. Für die Gele wurde eine 0,9 %ige Agarosekonzentration benötigt. Zum Lösen wurde
die Agarose in TBE-Puffer aufgekocht. In ein vorbereitetes Gelbett (7 cm x 7 cm) wurde 1 µl
Ethidiumbromid (10 mg/ml) pipettiert und die Gelflüssigkeit nach dem Abkühlen auf ca. 56°C in
das Bett gegossen. Der Kamm mit der benötigten Taschenanzahl wurde eingesetzt. Das
ausgehärtete Agarosegel wurde mit dem Gelbett in eine Elektrophoresekammer gesetzt und mit
TBE-Puffer überschichtet. Der Kamm wurde entfernt. Die aufzutrennenden DNA-Proben wurden
mit 6-fach Ladepuffer und 3 Vol. ddH2O versetzt und in die Probentaschen pipettiert. Bei einer
Spannung von 100 V wurden die DNA-Proben für 1h aufgetrennt. Die Banden wurden durch
UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Zur Kontrolle der Proben dienten probenspezifische
Marker. Zum Bestimmen der Molekulargewichte lief ein 1 kb Molekulargewichtsmarker im Gel
mit.
TBE-Puffer: 90 mM Tris
90 mM Borsäure
2,5 mM EDTA
25
DNA Ladepuffer: 50 % Glycerin
0,25 % Bromphenolblau
in 1 Vol. TAE-Puffer
TAE-Puffer: 40 mM Tris
2 mM EDTA
20 mM Eisessig
2.3.4 DNA-Sequenzierung
Die isolierte Plasmid-DNA der Denguefieber Serotypen (pHAD1, pHAD2, pHAD3,
pHAD4) wurden von der Firma LGC Genomics sequenziert.
Die Proben wiesen alle eine Konzentration von 1 µg/µl auf. Für die Sequenzierung wurde ein
Probenvolumen von je 3 µl Plasmid und 10 µl ddH2O benötigt. Die Primer wurden im Voraus
ausgewählt und von LGC Genomics hinzugefügt. Es wurde jeweils ein Lauf in Vorwärtsrichtung
(forward, F) und ein 2. Lauf in entgegengesetzter Richtung (reverse, R) durchgeführt.
Nach der Sequenzierung wurden die Ergebnisse mit den Sequenzen verglichen, die in der
Genbank hinterlegt sind, und auf Fehler geprüft.
Vektor Sequenz-Primer
pHAD1 CMV-F (CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)
pcDNA3.1-R (TAGAAGGCACAGTCGAGGCT)
pHAD2 CMV-F (CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)
pcDNA3.1-R (TAGAAGGCACAGTCGAGGCT)
pHAD3 CMV-F (CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)
pcDNA3.1-R (TAGAAGGCACAGTCGAGGCT)
pHAD4 CMV-F (CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)
pcDNA3.1-R (TAGAAGGCACAGTCGAGGCT)
26
2.4 Zellbiologische Methoden
2.4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen
Die Vermehrung eukaryotischer Zellen erfolgte in supplementiertem RPMI-Medium
bzw. supplementiertem DMEM-Medium im Inkubationsschrank (Haraeus, BBD 6220) bei 37°C
und 5 % CO2. Die Zellen wurden alle 3-5 Tage, je nach Zelldichte, rekultiviert. Mit Hilfe des
Mediums und ggf. Zellschabern wurden die adhärenten Zellen von der Wand der
Zellkulturflaschen gelöst und aufgenommen. Für die Rekultivierung wurden die eukaryotischen
Zellen gleichmäßig aufgeteilt.
RPMI suppl.: RPMI Medium 1640 (1X) + GlutaMAXTM
-I (Gibco)
5 % FCS (PAN)
5,5 ml Pen Strep (Gibco)
5000 U/ml Penicillin
5000 µg/ml Streptomycin
DMEM suppl.: DMEM (1X) + GlutaMAXTM
-I (Gibco)
10 % FCS (PAN)
5,5 ml Pen Strep (Gibco)
5000 U/ml Penicillin
5000 µg/ml Streptomycin
2.4.2 Transfektion von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen
Die pseudotypisierten Partikel wurden durch eine DNA-Transfektion in HEK293T-
Zellen hergestellt. Die Ausführungen erfolgten entweder in 6-well- oder in 24-well-
Zellkulturplatten. Mit Hilfe der ScreenFect® A Transfektions-Reagenzien (Incella) wurden die
Transfektionen gemäß dem Hersteller-Protokoll durchgeführt. Pro 1 µl Plasmid-DNA wurden
3 µl ScreenFect®
A Reagenz verwendet. Die Plasmid-DNA und das Transfektions-Reagenz
wurden jeweils mit ScreenFect®
Verdünnungspuffer versetzt. Die HEK293T-Zellen wurden mit
supplementiertem RPMI Medium (mit 10 % FCS) von der Wand der Zellkulturflaschen gelöst
und suspendiert.
27
Die Zellsuspension wurde zusammen mit dem Transfektionskomplex in die Zellkulturplatten
(Sarstedt) ausgesät und für drei Stunden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert (Inkubationsschrank;
Haraeus, BBD 6220). Anschließend wurde der Zellkulturüberstand verworfen und durch neues
RPMI suppl. (mit 10 % FCS) ersetzt. Nach 2-3 Tagen konnten die Überstände und die Zellen
analysiert werden.
Transfektionsschema
1.) Transfektionskomplex aus Transfektions-Reagenz + Verdünnungspuffer und
Plasmid-DNA + Verdünnungspuffer
2.) Inkubation für 20 min bei RT
3.) Zugabe der Zellsuspension und Aussäen in die Zellkulturplatten
4.) Inkubation für 3 h (Haraeus, BBD 6220; 37°C, 5 % CO2)
Für weitere Details bezüglich der Transfektionen in 6-well- und 24-well-
Zellkulturplatten siehe Tab.2, Tab.3)
2.4.3 Infektion eukaryotischer Zellen mit partikelhaltigen Überständen
Die Infektion eukaryotischer Zellen mit den pseudotypisierten HIV-1-Partikeln aus
den Zellkulturüberständen der Transfektion wurde in 96-well-Platten durchgeführt. Nierenzellen
von Grünen Meerkatzen (VeroB4-Zellen) können mit Dengue pseudotypisierten Partikeln
infiziert werden, während für die Übertragung von Viruspartikeln mit den Hüllproteinen des
HIV-1 eine menschliche Glioblastom Zelllinie (U87-Zellen) verwendet wurde. Die jeweiligen
Zellen waren in supplementiertem DMEM-Medium (mit 10 % FCS) suspendiert. Sie wurden in
die Zellkulturplatten (Sarstedt bzw. Thermo Fisher Scientific) ausgesät und im Brutschrank
(Haraeus, BBD 6220; 37°C, 5 % CO2) inkubiert, bis die Kavitäten bis zu 80 % bedeckt waren.
Für die Infektion wurden die partikelhaltigen Zellkulturüberstände verdünnt. Die Verdünnungen
wurden auf ein Endvolumen von 200 µl bezogen. Die Proben wurden zusammen mit dem
DMEM-Medium so auf die Zellen gegeben, dass ein Volumen von 100 µl entstand. Nach einer
einstündigen Adsorption im Inkubationsschrank bei 37°C und 5 % CO2 (Haraeus, BBD 6220)
erfolgte die Zugabe von weiteren 100 µl Medium pro well.
Die infizierten Zellen wurden in den Zellkulturplatten für 2-3 Tage inkubiert (Haraeus, BBD
6220; 37°C, 5 % CO2) und anschließend analysiert.
28
2.4.4 Luciferase-Assay
Die Effizienz der Transfektion von Plasmiden, sowie die Effizienz der Infektion mit
pseudotypisierten Partikeln wurde mit Hilfe eines Luciferase-Assays überprüft. Sowohl die
Plasmide, die in HEK293T-Zellen transfiziert wurden, als auch die pseudotypisierten Partikel
exprimieren das Enzym Luciferase.
Für die Messung der Transfektions-Effizienz wurden die transfizierten Zellen zusammen mit dem
darüber liegenden partikelhaltigen Zellkulturüberstand entnommen und in 1,5ml Eppendorf-
Gefäße überführt. Die Zellen wurden bei 10000 rpm kurz abzentrifugiert (Heraeus Biofuge pico;
1 min, RT) und mit Lysispuffer versetzt. Bei -20°C wurden die lysierten Zellen gelagert. Die
Bestimmung der Luciferase-Aktivität in den transfizierten, lysierten Zellen erfolgte mit Hilfe des
Mikroplatten Luminometers (Berthold Technologies, Centro LB 960) und des Luciferase Assay
Reagent (LAR, Promega). Je 10 µl lysierte Zellen wurden mit 50 µl LAR-Substrat in die wells
von weißen 96-well-Platten (Thermo Fisher Scientific, unbeschichtet) gegeben. Direkt im
Anschluss wurden die Proben im Gerät gemischt und vermessen.
Für die Messung der Infektionsraten wurden die infizierten Zellen lysiert und unmittelbar
vermessen. Der Zellkulturüberstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 96-well-Platten
mit 10 µl Lysispuffer gelöst. Nach der Zugabe von 50 µl LAR-Substrat pro well wurde die Platte
direkt im Luminometer (Berthold Technologies, Centro LB 960) vermessen.
Das Luminometer wurde so eingestellt, dass die Platte für zwei Sekunden geschüttelt wird. Die
Messzeit betrug eine Sekunde pro well.
Die Lichtemission, die bei der Umsetzung von Luciferin zu Oxyluciferin durch Luciferase
entsteht, wurde als relative Lichteinheit (relative light units, RLU) detektiert.
Lysepuffer: 25 mM Tris
2 mM EDTA
2 mM DTT
10 % Glycerol
1 % Triton x-100
Luminometer Protokoll
1.) shake by plate (2 sec, speed slow, diameter 0.1)
2.) measurement by wells (1 sec)
29
2.4.5 Bestimmung der TCID50 (tissue culture infectious dose)
Mit Hilfe von Infektionsreihen lässt sich die infektiöse Dosis der partikelhaltigen
Zellkulturüberstände messen, sodass 50 % Infektionsexperimente erfolgreich verlaufen. Die
infektiöse Dosis ist z. B. bei der vierten Verdünnung erreicht, wenn bei acht
Infektionsexperimenten die ersten vier positiv waren und die restlichen negativ. Die serielle 1:2-
Partikelverdünnung (1:5 bis 1:10240) wurde in beschichteten 96-well-Platten durchgeführt. Die
verwendeten Zellen (VeroB4-Zellen bzw. U87-Zellen) wurden zuvor ausgesät und inkubiert,
sodass eine 80 %ige Konfluenz erreicht war. In die 96-wells wurden jeweils 100 µl DMEM-
Medium vorgelegt. Für die anfängliche Partikelverdünnung von 1:5 wurden 80 µl partikelhaltiger
Überstand und 20 µl Medium zusätzlich in die Reihe der Zellkulturplatte hinzugefügt. Die
infektiösen Überstände (100 µl) wurden für eine Stunde auf den Zellen adsorbiert
(Inkubationsschrank Haraeus, BBD 6220; 37°C, 5 % CO2). Anschließend wurden weitere 100 µl
DMEM-Medium hinzugegeben. Nach 2-3 tägiger Inkubation konnten die Ergebnisse der TCID50-
Reihen mittels des Luciferase-Assays ermittelt werden.
30
3 Ergebnisse
3.1 Transfektion von HEK293T-Zellen zur Herstellung pseudotypisierter
HIV-1-Partikel
In dieser Arbeit wurde die Herstellung der Dengue-pseudotypisierten HIV-1-Partikel
erweitert und optimiert. Für die Transfektion wurden die aufgereinigten HIV-1 Plasmide gp160
und pNLlucAM sowie die DENV-Plasmide pHAD1-pHAD4 verwendet. Das Plasmid
pNLlucAM dient als rekombinanter Vektor, welcher durch die Deletion der Hüllproteine einen
Replikations-inkompetenten HIV-1-Vektor darstellt. Auf dem rekombinanten Vektor ist
außerdem das Luciferase-Reportergen lokalisiert. Im Zuge der Transfektion wird das Reportergen
abgelesen und Luciferase in den Zellen gebildet. Die Luciferase wirkt als Katalysator für die
oxidative Umwandlung von Luciferin zu Oxiluciferin, wodurch eine Biolumineszenz verursacht
wird. Diese kann im Luminometer detektiert werden.
Mit Hilfe des Screenfect A-Reagenzes (Incella) wurden verschiedene DNA-Verhältnisse von
Vektor- und Hüllplasmid auf ihre Transfektionseffizienz getestet. Die DNA-Menge der
Hüllplasmide überwog bei allen folgenden Transfektionsexperimenten. DNA-Verhältnisse
zwischen 2µl/4µl und 10µl/50µl bzw. zwischen 0,6µl/1,4µl und 3,3µl/16,7µl wurden für die
Partikelbildung getestet (siehe Tab. 2, Tab. 3). Durch das bereits erfolgreich etablierte HIV-1
pseudotypisierte HIV-1-System galt die Transfektion mit den Plasmiden pNLlucAM und pgp160
als Kontrolle für die Funktionalität des Systems. Die Entstehung der Partikel wurde durch die
Luciferase-Aktivität in den transfizierten Zellen mittels des Luciferase-Assays nachgewiesen.
Der Transfektionskomplex wurde aus dem Screenfect A-Reagenz und der DNA angesetzt, die
jeweils zuvor mit dem Screenfect A-Puffer verdünnt wurden. Nach 20-minütiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurde der Komplex auf die Zellen gegeben. Je nach Transfektionsmethode
wurden die Zellen am Tag zuvor in 6-well- bzw. 24-well-Platten ausgesät oder als Zellsuspension
erst zusammen mit dem Transfektionskomplex ausgesät. Die effektivste Transfektionszeit wurde
im Voraus bereits getestet. Demnach wurde der Transfektionskomplex für 3 h im Brutschrank
(Haraeus, BBD 6220; 37°C, 5 % CO2) inkubiert. Abschließend wurde der Komplex verworfen
und 3 ml (6-well) bzw. 1 ml (24-well) RPMI-Medium wurde auf die Zellen gegeben.
Je nach Methode blieben auch hier die Zellen entweder komplett adhärent oder wurden vom
Boden der wells gelöst. Nach zweitägiger Inkubation im Brutschrank wurden die partikelhaltigen
Überstände abgenommen und die Zellen lysiert. Die Zellkulturüberstände wurden in 200 µl
Aliquots eingeteilt und bei -70°C gelagert, um diese stabil zu halten. (2.4.2)
31
Das Luciferase-Assay der transfizierten HEK293T-Zellen wurde ausschließlich mit dem LAR-
Substrat durchgeführt. Die abzentrifugierten Zellen wurden mit 200 µl (Transfektion in der
6-well-Platte) bzw. 100 µl (Transfektion in der 24-well-Platte) Lysepuffer versetzt und darin
gelöst. Das Assay erfolgte für jede Transfektion einmalig und jeweils nach dem Einfrieren der
lysierten Zellen bei -20°C. (2.4.4)
Tab. 2: DNA-Verhältnisse der Transfektionsexperimente (6-well-Platte).
Plasmide DNA-Mengen *1
Gesamtmenge Reagenz-Menge *2
Vektor pNLlucAM 2 µl 6 µl 21 µl
Hüllproteine 4 µl
Vektor pNLlucAM 3 µl 10 µl 33 µl
Hüllproteine 7 µl
Vektor pNLlucAM 5 µl 20 µl 63 µl
Hüllproteine 15 µl
Vektor pNLlucAM 7 µl 30 µl 93 µl
Hüllproteine 23 µl
Vektor pNLlucAM 8 µl 45 µl 138 µl
Hüllproteine 37 µl
Vektor pNLlucAM 10 µl 60 µl 183 µl
Hüllproteine 50 µl
Puffermenge DNA-
Verdünnung 120 µl
Puffermenge Reagenz-
Verdünnung 120 µl
Menge Zellsuspension 1250 µl
*1 DNA-Konzentration: 1 µg/µl
*2 Screenfect A (Incella)
32
Tab. 3: DNA-Verhältnisse der Transfektionsexperimente (24-well-Platte).
Plasmide DNA-Mengen *1
Gesamtmenge Reagenz-Menge *2
Vektor pNLlucAM 0,6 µl 2 µl 3 µl
Hüllproteine 1,4 µl
Vektor pNLlucAM 1 µl 3,5 µl 4,5 µl
Hüllproteine 2,5 µl
Vektor pNLlucAM 1,6 µl 6,5 µl 7,5 µl
Hüllproteine 4,9 µl
Vektor pNLlucAM 2,3 µl 10 µl 11 µl
Hüllproteine 7,7 µl
Vektor pNLlucAM 2,6 µl 15 µl 16 µl
Hüllproteine 12,4 µl
Vektor pNLlucAM 3,3 µl 20 µl 21 µl
Hüllproteine 16,7 µl
Puffermenge DNA-
Verdünnung 40 µl
Puffermenge Reagenz-
Verdünnung 40 µl
Menge Zellsuspension 420 µl
*1 DNA-Konzentration: 1 µg/µl
*2 Screenfect A (Incella)
33
3.1.1 Herstellung der DENV-2 und DENV-3 pseudotypisierten Partikel in
6-well-Zellkulturplatten
Begonnen wurden die Transfektionsexperimente in 6-well-Zellkulturplatten
(Sarstedt). In der Literatur werden pseudotypisierte DENV-2-Partikel bevorzugt, da diese die
besten Ergebnisse aufweisen. Demnach wurde das lentivirale System zuerst mit DENV-2
Hüllproteinen durchgeführt. Nach erfolgreicher Transfektion wurden zusätzlich DENV-3
pseudotypisierte HIV-1-Partikel hergestellt. Das Austesten des Protokolls und des
Transfektionsreagenzes mit variierenden DNA-Mengen ergab veränderte Luciferase-Aktivitäten
bei höheren DNA-Mengen. Somit wurden für die Co-Transfektionen mit Vektor- und Hüll-
Plasmid die DNA-Mengen in verschiedenen Verhältnissen erweitert, um eine Limitation der
Luciferase-Aktivität in den transfizierten Zellen zu ermitteln. Die Transfektionen der HEK293T-
Zellen wurden für alle DNA-Verhältnisse gleichzeitig in einer 6-well-Platte durchgeführt.
Aufgrund möglicher Wechselwirkungen werden in einer Zellkulturplatte nur Pseudotypen mit
denselben Hüllplasmiden transfiziert. Die HEK293T-Zellen wurden in großen Zellkulturflaschen
(Sarstedt) gezüchtet, von der Wand gelöst und als Zellsuspension zusammen mit dem
Transfektionskomplex in die wells ausgesät. Während der Zugabe des neuen RPMI-Mediums
wurden die adhärenten Zellen erneut vom Boden gespült. Die Zellkulturplatten wurden jeweils
2 Tage bei 37°C und 5 % CO2 (Haraeus, BBD 6220) inkubiert.
Die variierenden DNA-Mengen während der Transfektion sorgen für eine erkennbare Abnahme
in den Luciferase-Aktivitäten der HEK293T-Zellen. Je mehr Plasmid in die Zellen gegeben
wurde, desto weniger Luciferin wurde in den Zellen umgesetzt. Wie in Tab. 4 gezeigt, sinken die
Luciferase-Aktivitäten mit jedem DNA-Verhältnis. Ab einer transfizierten Plasmid-
Gesamtmenge von 30 µl stabilisieren sich die Werte im Bereich von 105 RLUs.
Die Luciferase-Aktivitäten der pNLlucAM/pHAD3 transfizierten HEK293T-Zellen zeigen eine
ähnliche Entwicklung, wie die Transfektionen mit den DENV-2 Hüllproteinen. Ebenfalls sinken
die Luciferase-Aktivitäten in den Zellen mit steigender Plasmid-Menge. Allerdings nimmt die
Luciferase-Aktivität langsamer ab. Wie Tab. 5 zeigt, stabilisieren sich die Luciferase-Aktivitäten
der DENV-3 transfizierten Zellen bei höheren 106 RLUs.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
Die Ergebnisse dieser Transfektionen ergaben die höchsten Luciferase-Aktivitäten bei einer
transfizierten Plasmid-Gesamtmenge von 6 µl. Dies entspricht einem molaren Verhältnis von 1:6
(HIV-1-Vektor zu DENV-Hüllplasmid).
34
Tab. 4: Luciferase-Aktivitäten der DENV-2 transfizierten HEK293T-Zellen.
pNLlucAM/pHAD2
DNA-
Verhältnis *
2 µl
+4 µl
3 µl
+7 µl
5 µl
+15 µl
7 µl
+23 µl
8 µl
+37 µl
10 µl
+50 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU] 2·10
9 3·10
7 4,9·10
5 2·10
5 2·10
5 1,8·10
5
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
Tab. 5: Luciferase-Aktivitäten der DENV-3 transfizierten HEK293T-Zellen.
pNLlucAM/pHAD3
DNA-
Verhältnis *
2 µl
+4 µl
3 µl
+7 µl
5 µl
+15 µl
7 µl
+23 µl
8 µl
+37 µl
10 µl
+50 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU] 2·10
9 2·10
7 9·10
6 3·10
6 1·10
6 4·10
6
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
35
3.1.2 Herstellung der HIV-1 pseudotypisierten Partikel in 6-well
Zellkulturplatten
Zum Vergleich der hergestellten Dengue M/E-pseudotypisierten HIV-1-Partikel mit
dem bereits etablierten HIV-1-System wurden zusätzlich Transfektionen mit einem gp160-
Plasmid durchgeführt. Erneut wurde in den 6-well-Platten transfiziert. Allerdings wurden
anfänglich nur die Plasmid-Mengen 2 µl+4 µl, 3 µl+7 µl und 5 µl+15 µl eingesetzt und
anschließend die HEK293T-Zellen auf ihre Luciferase-Aktivität getestet. Die Herstellung der
partikelhaltigen Überstände erfolgte identisch zu der Transfektion der DENV-2 und DENV-3
pseudotypisierten Partikel in 6-well-Zellkulturplatten (Sarstedt).
Die unterschiedlichen DNA-Mengen, die während der Transfektion eingesetzt wurden, haben bei
den HIV-1 pseudotypisierten HIV-1 Partikeln den gleichen Transfektionseffekt, wie bei den
DENV pseudotypierten HIV-1 Partikeln. Je mehr Plasmid in die HEK293T-Zellen gegeben
wurde, desto weniger Luciferin wurde in den Zellen umgesetzt. Wie Tab. 6 zeigt, sinken die
Luciferase-Aktivitäten der transfizierten Zellen bei jedem steigenden DNA-Verhältnis um eine
Zehnerpotenz. Es wurden Luciferin Umsätze zwischen 107 und 10
5 detektiert.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
Die Ergebnisse waren ähnlich, wie bei den Transfektionen DENV pseudotypisierter HIV-1-
Partikel. Die höchsten Luciferase-Aktivitäten entwickelten sich bei einer transfizierten Plasmid-
Gesamtmenge von 6 µl, was einem molaren Verhältnis von 1:6 (HIV-1-Vektor zu HIV-1-
Hüllplasmid) entspricht.
Tab. 6: Luciferase-Aktivitäten der HIV-1 transfizierten HEK293T-Zellen.
pNLlucAM/pgp160
DNA-Verhältnis * 2 µl+4 µl 3 µl+7 µl 5 µl+15 µl
Luciferase-Aktivität
[RLU] 1·10
7 1·10
6 1,7·10
5
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
36
3.1.3 Herstellung der pseudotypisierten Partikel mit den Hüllproteinen aller
vier Dengue Serotypen
Im weiteren Vorgehen wurden die Transfektionen mit allen vier Dengue Serotypen
durchgeführt. Um die Ergebnisse besser reproduzieren zu können, wurde in 24-well-Platten
(Sarstedt) mit Dreifachbestimmungen transfiziert. Die DNA-Verhältnisse der 6-well-
Transfektionen sollten beibehalten werden, um dieselben Ergebnisse zu erzielen. Anhand des
Screenfect A-Protokolls wurden die Puffer- und Reagenzmengen für die 24-well-Transfektionen
ermittelt und auf die 6-well DNA-Verhältnisse übertragen (siehe Tab. 2).
Für eine gleichmäßige Zellverteilung wurden die HEK293T-Zellen einen Tag vor der
Transfektion in den wells ausgesät, sodass die Kavitäten zu 80 % adhärent bedeckt waren. Daher
wurde zu dem Transfektionskomplex lediglich das DMEM-Medium hinzugefügt, bevor alles auf
die Zellen gegeben wurde, ohne diese vom Boden der wells zu lösen. Die Inkubationszeit der
Platten bei 37°C und 5 %CO2 (Haraeus, BBD 6220) für 3 h blieb unverändert. Bei der Zugabe
des Mediums wurde erneut darauf geachtet, dass die Zellen nicht gelöst werden. Die
Zellkulturplatten wurden jeweils 2 Tage bei 37°C und 5 % CO2 (Haraeus, BBD 6220) inkubiert.
Die Luciferase-Aktivitäten der transfizierten und lysierten HEK293T-Zellen sollen die
Ergebnisse der 6-well-Transfektionen wiederspiegeln und die Gleichmäßigkeit darstellen.
Bei allen Serotypen zeigen die Luciferase-Aktivitäten der transfizierten Zellen ähnliche
Entwicklungen. Wie in Tab. 7, lässt sich trotz steigender eingesetzter DNA-Menge kein Verlauf
in den Messwerten bestimmen. Die Dreifachbestimmungen der gleichen Plasmid-Verhältnisse
schwanken stark untereinander, sodass Luciferase-Aktivitäten zwischen 104 und 10
9 RLUs
detektiert wurden.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
Ergebnis war, dass die Transfektionen Dengue-M/E pseudotypisierter HIV-1-Partikel auch in
24-well-Zellkulturplatten mit den angepassten und umgerechneten DNA-Verhältnissen
erfolgreich verlaufen. Es wurden hohe Luciferase-Aktivitäten zwischen 104 und 10
9 RLUs
gemessen, wobei sich die Entwicklungen der Transfektionen in der 6-well-Zellkulturplatte nicht
bestätigen ließen. Zusätzlich sind erste Unregelmäßigkeiten im System aufgetreten.
37
Tab. 7: Luciferase-Aktivitäten der transfizierten HEK293T-Zellen in 24-well-
Zellkulturplatten.
pNLlucAM/pcBD1
DNA-
Verhältnis *
0,6 µl
+ 1,4 µl
1 µl
+ 2,5 µl
1,6 µl
+ 4,9 µl
2,3 µl
+ 7,7 µl
2,6 µl
+ 12,4 µl
3,3 µl
+ 16,7 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU]
2·106 2·10
6 2·10
6 6,5·10
6 1,5·10
6 2·10
6
1·106 4·10
6 6,8·10
5 1,9·10
6 1·10
6 1·10
6
1,5·106 1,7·10
6 1,7·10
6 2,7·10
6 3·10
6 6·10
5
pNLlucAM/pHAD2
DNA-
Verhältnis *
0,6 µl
+ 1,4 µl
1 µl
+ 2,5 µl
1,6 µl
+ 4,9 µl
2,3 µl
+ 7,7 µl
2,6 µl
+ 12,4 µl
3,3 µl
+ 16,7 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU]
8·105 7,8·10
6 2·10
7 1,5·10
7 2·10
7 2·10
7
3,9·105 8,9·10
6 7,7·10
6 1·10
7 2·10
7 1,9·10
7
5,9·106 3,8·10
6 9,9·10
6 1·10
7 2·10
7 2·10
7
pNLlucAM/pHAD3
DNA-
Verhältnis *
0,6 µl
+ 1,4 µl
1 µl
+ 2,5 µl
1,6 µl
+ 4,9 µl
2,3 µl
+ 7,7 µl
2,6 µl
+ 12,4 µl
3,3 µl
+ 16,7 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU]
1,8·105 1,5·10
5 2·10
5 1,7·10
5 6,9·10
5 8·10
5
1·105 1·10
5 2·10
5 1,6·10
5 1·10
6 9·10
5
2·105 8,9·10
4 3,5·10
5 2,6·10
5 6,9·10
5 5,7·10
5
pNLlucAM/pHAD4
DNA-
Verhältnis *
0,6 µl
+ 1,4 µl
1 µl
+ 2,5 µl
1,6 µl
+ 4,9 µl
2,3 µl
+ 7,7 µl
2,6 µl
+ 12,4 µl
3,3 µl
+ 16,7 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU]
2·109 2·10
9 5·10
6 2·10
7 7,8·10
6 2·10
9
2,7·106 2·10
9 2,8·10
6 2·10
9 1·10
7 2·10
7
1·107
1,6·107 1,5·10
7 2·10
9 5,6·10
6 2·10
9
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
38
3.2 Infektion eukaryotischer Zellen mit pseudotypisierten Partikeln
Während der lipophilen Co-Transfektion mit den Vektor- und den Hüllplasmiden
werden die pseudotypisierten Partikel aus den HEK293T-Zellen geschleust. Mit Hilfe der
partikelhaltigen Zellkulturüberstände lassen sich entsprechende eukaryotische Zelllinien
infizieren. Die pseudotypisierten Partikel tragen durch die Co-Transfektion ebenfalls das
Luciferase-Reportergen. Nach dem Virus-Eintritt in die Zelle wird das Genom der Partikel
abgelesen. Demnach kann die Infektion in den Zellen mittels des Luciferase-Assays
nachgewiesen werden.
Die Infektionen wurden in 96-well-Zellkulturplatten (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die
eukaryotischen Zellen wurden im Vorwege ausgesät, sodass die Fläche der wells zum Zeitpunkt
der Infektion zu ca. 80 % adhärent bedeckt war. Alle partikelhaltigen Überstände wurden für die
Infektionen verdünnt. Überwiegend wurden Infektionen angesetzt, um die Gleichmäßigkeit des
lentiviralen Systems zu überprüfen. Allerdings wurde mit Hilfe der Infektionen auch die
Herstellung der pseudotypisierten Partikel aus den Transfektionen überprüft und es wurden
Verdünnungsreihen für TCID50-Experimente eingesetzt. Jede der Infektionen wurden mit einem
Volumen von 100 µl pro well angesetzt. Die partikelhaltigen Überstände wurden für eine Stunde
auf den Zellen im Inkubationsschrank (Haraeus, BBD 6220; 37°C, 5 % CO2) adsorbiert.
Anschließend wurden jeweils weitere 100 µl Medium hinzugegeben. (2.4.3)
Zusätzlich wurden die Zellkulturplatten für 2-3 Tage bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert (Haraeus,
BBD 6220), bevor die infizierten Zellen lysiert und auf ihre Luciferase-Aktivität getestet wurden.
(2.4.4)
3.2.1 Infektion eukaryotischer Zellen mit DENV-2 und DENV-3
pseudotypisierten Partikeln
Die ersten Infektionsexperimente wurden durchgeführt, um die Herstellung der
pseudotypisierten Partikel nachzuweisen. Die partikelhaltigen Überstände aus den 6-well-
Transfektionen wurden 1:5 verdünnt. Auf den adhärent ausgesäten VeroB4-Zellen, wurden 40 µl
Überstand und 60 µl DMEM-Medium für 1 h im Inkubationsschrank adsorbiert. Anschließend
wurden 100 µl Medium hinzugefügt.
39
Die weißen Zellkulturplatten wurden für zwei Tage bei 37°C und 5 %CO2 (Haraeus, BBD 6220)
inkubiert. Jede dieser Infektionen wurde einmalig und mit Einfachbestimmungen durchgeführt.
Um die Infektionseffizienz zu bestimmen, wurden die Überstände verworfen. Die Platten wurden
nicht ausgeklopft. Nach der Lyse und der Zugabe des LAR-Substrats wurden die VeroB4-Zellen
im Luminometer (Berthold Technologies, Centro LB 960) vermessen. Die Messung wurde so oft
durchgeführt, bis der Höhepunkt der Luciferase-Reaktion erreicht wurde.
Die variierenden DNA-Mengen, die für die Transfektionsexperimente eingesetzt wurden,
spiegeln sich auch in den Infektionseffizienzen wieder. Mit steigenden Plasmid-Mengen wurden
auch mehr VeroB4-Zellen infiziert. Wie in Tab. 4 aufgezeigt, steigen die Luciferase-Aktivitäten
mit jedem DNA-Verhältnis. Ab einer transfizierten Plasmid-Gesamtmenge von 30 µl stabilisieren
sich die Werte im Bereich von 105 RLUs. In Abb. 4 ist der Zusammenhang zwischen der
Herstellung der pseudotypisierten Partikel und der Infektion mit den partikelhaltigen Überständen
dargelegt. Während die Luciferase-Aktivitäten der transfizierten Zellen sinken, steigen die
Luciferase-Aktivitäten der infizierten Zellen bei höheren DNA-Verhältnissen.
Die infizierten VeroB4-Zellen mit DENV-3 pseudotypisierten Partikeln lassen entsprechende
Effizienzen wie die vorherigen Infektionen erkennen. Infolge höherer transfizierter Plasmid-
Mengen steigt die Luciferin-Umsetzung in den VeroB4-Zellen. Wie Tab. 9 verdeutlicht, erhöhen
sich die Luciferase-Aktivitäten mit jedem DNA-Verhältnis. Bei einer transfizierten Plasmid-
Gesamtmenge von 60 µl sinken die Werte von 104 RLUs auf 10
3 RLUs wieder. Der direkte
Zusammenhang zwischen Transfektion und Infektion des pseudotypisierten Systems ist in Abb. 5
dargestellt. Mit zunehmenden DNA-Verhältnissen nehmen die Transfektionseffizienzen ab und
die Infektionseffizienzen steigen.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
Die Ergebnisse brachten die höchsten Luciferase-Aktivitäten durch Infektion eukaryotischer
Zellen mit partikelhaltigen Überständen, die mit einer Gesamtmenge von 45 µl transfiziert
wurden. Dies gleicht einem Mol-Verhältnis von 1:14 (HIV-1-Vektor zu DENV-Hüllplasmid).
Die Resultate sind entgegengesetzt der Transfektionsergbenisse und beschreiben die Verbindung
zwischen Transfektion und Infektion. Für weitere Infektionsexperimente wurden ausschließlich
die Überstände der DNA-Verhältnisse 8 µl+37 µl verwendet.
40
Tab. 8: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektion mit DENV-2
pseudotypisierten Partikeln.
pNLlucAM/pHAD2
DNA-
Verhältnis *
2 µl
+4 µl
3 µl
+7 µl
5 µl
+15 µl
7 µl
+23 µl
8 µl
+37 µl
10 µl
+50 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU] 5·10
3 4·10
3 2,6·10
4 2·10
5 2·10
5 1,8·10
5
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
Abb. 4 Ausbeute DENV-2 pseudotypisierter Partikel.
Dargestellt sind die Luciferase-Aktivitäten der VeroB4-Zellen, die mit DENV-2
pseudotypisierten Partikeln infiziert wurden. Die Herstellung der Partikel erfolgte mit
den angegebenen DNA-Gesamtmengen in 6-well-Tranfektionen. Die partikelhaltigen
Überstände wurden für die Infektion 1:5 verdünnt.
0
50000
100000
150000
200000
250000
6 µg 10 µg 20 µg 30 µg 45 µg 60 µg
RL
U/1
0 µ
l Z
elll
ysa
t
DNA/6-well
DENV-2 Pseudotypen
2,5·105
2·105
1,5·105
1·105
5·104
1·103
41
Tab. 9: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektion mit DENV-3
pseudotypisierten Partikeln.
pNLlucAM/pHAD3
DNA-
Verhältnis *
2 µl
+4 µl
3 µl
+7 µl
5 µl
+15 µl
7 µl
+23 µl
8 µl
+37 µl
5 µl
+15 µl
Luciferase-
Aktivität [RLU] 2·10
2 1·10
2 5,6·10
2 1·10
4 2·10
4 7·10
3
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
Abb. 5 Ausbeute DENV-3 pseudotypisierter Partikel.
Dargestellt sind die Luciferase-Aktivitäten der VeroB4-Zellen, die mit DENV-3
pseudotypisierten Partikeln infiziert wurden. Die Herstellung der Partikel erfolgte mit
den angegebenen DNA-Gesamtmengen in 6-well-Tranfektionen. Die partikelhaltigen
Überstände wurden für die Infektion 1:5 verdünnt.
2,5·104
2·104
100,0
5100,0
10100,0
15100,0
20100,0
25100,0
6 µg 10 µg 20 µg 30 µg 45 µg 60 µg
RL
U/1
0 µ
l Z
elll
ysa
t
DNA/6-well
DENV-3 Pseudotypen
1,5·104
1·104
5·103
1·102
2,5·104
2·104
42
3.2.2 Infektion von U87-Zellen mit HIV-1 pseudotypisierten Partikeln
Mit Hilfe von Infektionsexperimenten wurden die HIV-1 pseudotypisierten Partikel
in den Zellkulturüberständen, die mittels der drei verschiedenen DNA-Verhältnisse im Zuge der
Transfektion hergestellt wurden, detektiert. Auch die partikelhaltigen Überstände mit den pgp160
pseudotypisierten Partikeln wurden für diese Infektionen 1:5 verdünnt. Hingegen wurden
Glioblastom-Zellen (U87) anstatt von Nierenzelle (VeroB4) mit HIV-1 infiziert. Die U87-Zellen
wurden wie die VeroB4-Zellen im Vorwege in die weißen Zellkulturplatten (Thermo Fisher
Scientific) ausgesät und die verdünnten partikelhaltigen Überstände bei der richtigen Dichte auf
den Zellen adsorbiert. Die Zellkulturplatten wurden ebenfalls für zwei Tage bei 37°C und 5 %
CO2 (Haraeus, BBD 6220) inkubiert. Ferner wurde auch das Luciferase-Assay wie bei der
Infektion eukaryotischer Zellen mit DENV-2 und DENV-3 pseudotypisierten Partikeln
durchgeführt.
Die partikelhaltigen Überstände der unterschiedlichen DNA-Verhältnisse zeigen umgekehrte
Infektionseffizienzen bei steigenden Plasmid-Mengen im Gegensatz zu den DENV
pseudotypisierten Partikeln. Mit steigenden DNA-Mengen sinken die relativen Lichteinheiten der
infizierten Zellen beträchtlich. Wie in Tab. 10, kamen die höchsten Luciferase-Aktivitäten in den
U87-Zellen vor, die mit Überständen infiziert wurden, welche mit der niedrigsten Gesamtmenge
transfiziert wurden. Es wurden Infektionseffizienzen zwischen 105 und 60 RLUs detektiert,
wobei sich die niedrigen Messwerte im Bereich der Leerwerte <130 relativen Lichteinheiten
befinden.
Die Ergebnisse haben die höchsten Luciferase-Aktivitäten bei einer transfizierten Plasmid-
Gesamtmenge von 6 µl ergeben, was einem molaren Verhältnis von 1:6 (HIV-1-Vektor zu
HIV-1-Hüllplasmid) entspricht. Die Resultate überschneiden sich mit den
Transfektionseffizienzen der HIV-1 pseudotypisierter HIV-1-Partikel, unterscheiden sich jedoch
von den Infektionseffizienzen Dengue-M/E pseudotypisierter HIV-1-Partikel. Für weitere
Infektionsexperiemente wurden die Überstände der DNA-Verhältnisse 2 µl+4 µl verwendet.
43
Tab. 10: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektion mit HIV-1
pseudotypisierten Partikeln.
pNLlucAM/pgp160
DNA-Verhältnis * 2 µl+4 µl 3 µl+7 µl 5 µl+15 µl
Luciferase-Aktivität
[RLU] 1·10
5 3,6·10
3 6·10
1
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
3.2.3 Bestimmung der TCID50 von DENV-2 und DENV-3 Pseudotypen im
Zellkulturüberstand
Die partikelhaltigen Zellkulturüberstände mit den enthaltenen DENV-2 und DENV-3
pseudotypisierten Partikeln wurden für weitere Experimente verwendet. Mit den Überständen,
welche die höchsten Infektionseffizienzen aufweisen (DNA-Verhältnisse 7 µl+23 µl und
8 µl+37 µl), wurden Verdünnungsreihen angesetzt, um Infektionsdosen abschätzen zu können,
durch die 50 % der Zellkultur infiziert werden. Diese Mengen sind grundlegend für
weiterführende Experimente, wie Neutralisationstests. Für die TCID50-Reihen wurden die
partikelhaltigen Überstände anfänglich 1:5 und anschließend seriell 1:2 verdünnt. Es wurden
Vierfachbestimmungen durchgeführt. Die Zellkulturplatten wurden für 2 Tage im Brutschrank
inkubiert (Haraeus, BBD 6220; 37°C und 5 % CO2).
Bei höheren Verdünnungen der Überstände wurden die Zellen mit weniger pseudotypisierten
Partikeln infiziert. Es wurde daher weniger Luciferin in den VeroB4-Zellen umgesetzt und eine
abnehmende Luciferase-Aktivität detektiert. Wie Tab. 11 zeigt, treten innerhalb der
Verdünnungsreihen abweichende Messwerde auf, welche die abnehmenden Reihen unterbechen.
Außerdem stimmen die Mehrfachbestimmungen nicht immer überein. Die Infektionseffizienzen
der DENV-2 pseudotypisierten Partikel ergeben Werte zwischen 106 und 10
2 RLUs, während die
Luciferase-Aktivitäten der DENV-3 pseudotypisierten Partikel überwiegend im Bereich von
102 RLUs liegen.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
44
Ergebnis war, dass für weitere Infektionsexperimente mit DENV-2 pseudotypisierten Partikeln,
wie Neutralisationstests, eine 1:100 Verdünnung optimal ist, sodass die partikelhaltigen
Überstände einer Transfektion in 6-well-Zellkulturplatten für 3000 Infektionsexperimente (im
96-well Format) ausreicht. Die Resultate der Infektionen mit DENV-3 pseudotypisierten
Partikeln zeigten zu viele Instabilitäten auf, um genaue Aussagen treffen zu können.
Die TCID50-Reihen ergaben Unregelmäßigkeiten im Infektionsmodell.
Tab. 11: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – TCID50-Reihen von
DENV-2 und DENV-3 Pseudotypen.
Verdünnungen pNLlucAM+pHAD2, 7 µl/23 µl pNLlucAM+pHAD3, 8 µl/37 µl
1:5 4·106 4·10
6 5·10
6 5·10
6 4·10
5 2,7·10
2 4,7·10
3 9·10
3
1:10 4·106 2,9·10
6 2·10
6 1·10
6 4,6·10
2 9,8·10
4 3,8·10
4 9,6·10
4
1:20 2,5·106 8,7·10
5 9·10
5 6·10
5 2,5·10
2 1·10
4 1,7·10
2 1,5·10
2
1:40 8,5·105 4,5·10
5 4·10
5 5·10
5 2·10
2 1·10
5 1,8·10
2 1,7·10
2
1:80 3,9·105 1,5·10
5 1,5·10
3 8·10
3 1,8·10
2 1,8·10
2 1,5·10
2 1,6·10
2
1:160 5,7·104 3·10
4 1·10
5 2·10
3 2·10
2 1,6·10
2 1,8·10
2 1,6·10
2
1:320 2·102 7·10
3 1,5·10
2 1·10
5 1,8·10
2 1·10
2 5·10
3 1,5·10
2
1:640 1,5·102 3,6·10
2 1·10
2 2·10
3 1,5·10
2 1,7·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2
1:1280 1,7·102 1,7·10
2 1,7·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2 1·10
2 1·10
2
1:2560 2·104 1,7·10
2 1,7·10
2 1,9·10
2 1·10
2 1·10
2 1,5·10
2 1,8·10
2
1:5120 1·102 1,5·10
2 1,7·10
2 1,6·10
2 1,6·10
2 1,8·10
2 1·10
2 1,5·10
2
1:10240 1,6·102 1,5·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2 1·10
2 1,5·10
2 1,5·10
2
45
3.2.4 Methoden zur Verbesserung des Infektionsmodells
Die Regelmäßigkeit des lentiviralen Vektorsystems wurde zuerst mit den bereits
eingeführten HIV-1 pseudotypisierten Partikeln erprobt. Es wurde eine erneute Transfektion mit
den Plasmiden pNLlucAM/pgp160, pNLlucAM und pgp160 durchgeführt. Die Hälfte der
partikelhaltigen Überstände wurde durch einen 0,45 µm Vorsatzfilter filtriert, um mögliche
HEK293T-Zellen aus den Überständen zu entfernen. Die partikelhaltigen Überstände wurden für
zwei verschiedene Infektionsexperimente verwendet. Die Experimente unterschieden sich in den
verwendeten Zellkulturplatten und der daraus folgenden Durchführung des Luciferase-Assays.
Im ersten Versuch wurden die Zellen in klare Zellkulturplatten (Sarstedt) ausgesät und nach der
Zelllyse in unbeschichtete, weiße Zellkulturplatten überführt. Im zweiten Experiment wurden die
Zellen in speziell beschichtete weiße Zellkulturplatten (Thermo Fisher Scientific) ausgesät und
während des kompletten Prozesses in den Platten behalten.
Die Kenntnisse aus den Infektionen eukaryotischer Zellen mit pseudotypisierten Partikeln zur
Stabilisierung des Infektionsmodells wurden auf die Infektionen mit DENV-2 pseudotypisierten
Partikeln übertragen. Es wurde eine mögliche Beeinflussung des Infektionsmodells durch das im
Medium enthaltene FCS vermutet. Demnach wurden VeroB4-Zellen infiziert, die sowohl im
DMEM-Medium mit als auch im DMEM ohne FCS ausgesät wurden. Auch die partikelhaltigen
Überstände wurden mit den entsprechenden Medien verdünnt.
Die Ergebnisse zeigten, dass der Vergleich der Infektionen mit nicht filtrierten und filtrierten
partikelhaltigen Überständen keine Unterschiede in den Verteilungen darlegt. Die
Doppelbestimmungen ergaben keine übereinstimmenden Messwerte und auch die Luciferase-
Aktivitäten der 1:50-Verdünnungen schwankten. Die Messungen der infizierten U87-Zellen in
den weißen Zellkulturplatten ließen keine Luciferase-Aktivitäten im Bereich der Leerwerte
ermitteln, dennoch konnte keine Stabilität erreicht werden.
Die unterschiedlichen Medien haben keine Divergenzen in den Messergebnissen aufgezeigt.
Allerdings ist eine Wirkung des FCS auf die pseudotypisierten Partikel trotzdem nicht
ausgeschlossen, da die Plasmide mit FCS-haltigem Medium transfiziert wurden und die
Überstände demnach auch FCS enthalten.
46
Tab. 12: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektionen und
TCID50-Reihen mit HIV-1 pseudotypisierten Partikeln. *
Verdünnungen pNLlucAM+pgp160
2 µl+4 µl, nicht filtriert pNLlucAM+pgp160
2 µl+4 µl, filtriert
pNLlucAM+pgp160 2 µl+4 µl
vorherige Transfektion
1:5 3,5·104 9·10
4 2·10
4 3,9·10
4 1,8·10
4 1·10
4
1:10 1,9·104 5,6·10
3 5,9·10
4 2,9·10
4 1·10
4 4,6·10
3
1:20 4,9·103 2·10
3 3·10
3 1·10
2 4·10
1 1,6·10
2
1:40 1,5·103 4·10
1 9·10
1 3,5·10
3 6·10
1 5·10
1
1:80 3·101 8,7·10
3 2·10
1 2·10
1 7·10
2 5·10
2
1:160 4·101 4·10
1 5·10
1 5·10
1 4·10
1 4·10
1
1:320 3·101 4·10
1 5·10
1 2·10
1 8,7·10
3 3·10
1
1:640 3·101 4·10
1 5·10
1 4·10
1 2,8·10
2 4·10
1
Verdünnung
pNLlucAM
+pgp160
2 µl+4 µl nicht filtriert
pNLlucAM
+pgp160 2 µl/4 µl filtriert
pNLlucAM
+pgp160
2 µl/4 µl vorherige
Transfektion
pNLlucAM
2 µl nicht filtriert
pNLlucAM
2 µl filtriert
pgp160
2 µl filtriert
1:50
3·103 3·10
2 6,7·10
2 5·10
1 4·10
1 5·10
1
8,6·103 6·10
3 4·10
3 6·10
1 5·10
1 3·10
1
1·104 1,6·10
2 1·10
3 4·10
1 5·10
1 5·10
1
2·103 7·10
2 4·10
1 4·10
1 4·10
1 5·10
1
2,8·102 3·10
3 5·10
1 6·10
1 6·10
1 4·10
1
3·104 1·10
4 9·10
2 5·10
1 4·10
1 5·10
1
3,9·103 1,7·10
3 1,5·10
2 5·10
1 5·10
1 4·10
1
8·103 4,6·10
3 5·10
1 4·10
1 5·10
1 3·10
1
* Die Infektionen wurden in klaren, beschichteten 96-well-Zellkulturplatten
(Sarstedt) durchgeführt.
47
Tab. 13: Luciferase-Aktivitäten infizierter U87-Zellen – Infektionen und
TCID50-Reihen mit HIV-1 pseudotypisierten. *
Verdünnungen pNLlucAM+pgp160
2 µl/4 µl, nicht filtriert
pNLlucAM+pgp160
2 µl/4 µl, filtriert
pNLlucAM+pgp160
2 µl/4 µl vorherige Transfektion
1:5 2,9·105 1,8·10
5 1,9·10
5 1,5·10
5 1·10
4 2·10
4
1:10 4,5·104 3,5·10
4 5·10
4 1·10
5 3,9·10
4 8·10
4
1:20 7·103 2,6·10
4 1,8·10
4 2·10
3 3,5·10
4 4,6·10
4
1:40 1·104 1·10
4 2·10
4 1·10
4 1,5·10
2 2·10
4
1:80 1·104 1,7·10
3 5,5·10
3 4·10
1 4·10
1 1,7·10
4
1:160 3·101 6·10
3 2,8·10
3 4·10
1 3·10
1 2·10
1
1:320 3·101 4·10
1 1·10
4 2·10
1 3·10
1 7·10
3
1:640 5·101 2·10
1 5,7·10
2 4·10
3 3·10
1 3·10
1
Verdünnung pNLlucAM/pgp160
2 µl/4 µl, nicht filtriert
pNLlucAM/pgp160
2 µl/4 µl, filtriert
pNLlucAM/pgp160
2 µl/4 µl vorherige Transfektion
1:50
3,5·104 5,6·10
3 2,7·10
4
3·104 1,6·10
4 1,7·10
4
1,5·103 7,5·10
3 8,8·10
3
1·104 5·10
2 2·10
3
2·104 4·10
2 9,9·10
2
1·104 2·10
4 3·10
3
3·104 1·10
4 1·10
4
5,5·104 1,8·10
4 1,7·10
3
* Die Infektionen wurden in weißen, beschichteten 96-well-Zellkulturplatten
(Thermo Fisher Scientific, Nunc™, 137101) durchgeführt.
48
Tab. 14: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektionen mit DENV-2
pseudotypisierten Partikeln in Abhängigkeit von FCS.
pNLlucAM/pHAD2, 7 µl+23 µl, 1:50
DMEM
mit FCS
5,6·104 7,7·10
4 3·10
4 4·10
4 5·10
4 1,5·10
4 4,6·10
4 1·10
4
2,5·104 1·10
5 1·10
4 1·10
4 1,6·10
4 1·10
4 1,6·10
3 6·10
4
DMEM
ohne FCS
6,5·104 4,7·10
4 4·10
4 4·10
3 1·10
4 8·10
4 6·10
4 6·10
4
1,9·104 1,5·10
4 4·10
3 1,8·10
4 9,7·10
3 1,9·10
3 7·10
4 1·10
4
49
3.2.5 Einfluss der Zelldichte auf das Infektionsmodell
Bei zu hohen Zelldichten kann es zu Zellkontakthemmungen kommen. Dadurch kann
die Zellteilung eingestellt und die Infektion beeinflusst werden. Demnach wurden VeroB4-Zellen
in drei verschiedenen Zelldichten ausgesät. Die Zellen einer vollgewachsenen Zellkulturflasche
(Sarstedt, 75 cm²) wurden mit 5 ml Trypsin/EDTA (Pan Biotech) für 10 min inkubiert. Mit einem
Zellschaber wurden die Zellen von der Wand der Flasche gelöst und in ein 50 ml Falkon
(Sarstedt) überführt. Das Falkon wurde mit DMEM-Medium ohne weitere Zusätze aufgefüllt. Die
Zellen wurden bei 1200 rpm für 15 min abzentrifugiert (Beckmann Coulter Avanti J-26; Rotor
JA-14). Nach dem Ersetzen des Überstands durch neues Medium erfolgte ein weiterer
Zentrifugationsschritt. Die VeroB4-Zellen wurden in weiße, beschichtete Zellkulturplatten mit
klarem Flachboden (Thermo Fisher Scientific) ausgesät, um das Zellwachstum nachvollziehen zu
können. Die Infektion wurde mit einer 1:50-Verdünnung der partikelhaltigen Überstände
durchgeführt. Es wurde erneut lediglich mit DENV-2 pseudotypisierten Partikeln infiziert.
Die Zellkulturplatte wurde für zwei Tage inkubiert (Haraeus, BBD 6220; 37°C und 5 % CO2).
Für die Messung der Luciferase-Aktivität wurden die klaren Böden mit einer weißen Folie
verschlossen. Das Luciferase-Assay wurde mit Hilfe des Lyse-Puffers und des LAR-Substrats
ausgeführt.
Die Messergebnisse des Luciferase-Assays bestätigen die angenommenen
Zellkontakthemmungen bei zu hohen Zelldichten. Die Zelldichte 1 wurde so ausgesät, dass die
96-wells vollgewachsen waren, bei der Zelldichte 2 waren die Flächen zu ca. 85% adhärent
bedeckt. Bei einer Zelldichte von ca. 70%, die bei der Zelldichte 3 ausgesät wurde, sind die
Infektionsraten am gleichmäßigsten. Wie Tab. 15 zeigt, werden die Luciferase-Aktivitäten bei
geringeren Zelldichten stabiler. Bei der Zelldichte 3 werden alle Aktivitäten im Bereich von
104 RLUs detektiert.
Die Leerwerte des Luciferase-Assays weisen leichte Schwankungen auf, befinden sich aber bei
den angegebenen Messbedingungen im Bereich von <130 relativen Lichteinheiten.
Das Ergebnis war ein Einfluss der Zelldichte auf das Infektionsmodell. Die Zelldichte von
ca. 70 % ergaben die gleichmäßigsten Infektionsergebnisse. Der klare Boden der
Zellkulturplatten ermöglicht eine Kontrolle der Zelldichten und des Zellwachstums.
50
Tab. 15: Luciferase-Aktivitäten infizierter VeroB4-Zellen – Infektionen mit DENV-2
pseudotypisierten Partikeln bei verschiedenen Zelldichten.
pNLlucAM/pHAD2, 8 µl/37 µl, 1:50
Zelldichte 1 4·10
4 4,5·10
2 1,5·10
2 1·10
2 2·10
3 2,7·10
2 4·10
4 1·10
4
2·102 1,8·10
3 2·10
4 1,5·10
2 1·10
2 4·10
3 1·10
4 8,8·10
4
Zelldichte 2
1:2
8,6·103 1,7·10
4 2,5·10
4 5·10
4 7·10
4 1·10
5 2,8·10
4 1·10
5
1·105 8·10
3 1·10
4 2·10
4 7·10
4 2,5·10
3 1,5·10
4 1·10
5
Zelldichte 3
1:4
1·104 5,5·10
4 1,7·10
4 4,9·10
4 2·10
4 4,9·10
4 1·10
4 1·10
4
9·104 1,5·10
4 1·10
4 2·10
4 4,9·10
4 1,7·10
4 8,7·10
4 1,6·10
4
51
4 Diskussion
4.1 Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel
Pseudotypisierte Viruspartikel dienen zur Untersuchung von Virusinfektionen. Ein
Vorteil ist, dass kein Virus-Wildtyp vorhanden sein muss. Amplifizierte DNA oder auch nur
Sequenzdaten der Hüllproteine reichen aus, um sie rekombinant herzustellen. Ein weiterer Vorteil
ist, dass nicht der vollständige Viruszyklus durchlaufen werden muss und somit nur der
Viruseintritt (single round infection) beobachtet werden kann. Die von außen intakt aussehenden
Viruspartikel tragen virale Hüllproteine, die sich von denen des eigentlichen, partikel-bildenden
Virus unterscheiden. Im Genom des Virusvektors sind die homologen Hüllproteine deletiert. Die
fremden, heterologen Hüllproteine werden in trans von einem zweiten Plasmid exprimiert.
Anstelle des Gens für die Hüllproteine (env), enthält der Virusvektor ein Reportergen für z.B. das
Enzym Luciferase. Dadurch kann der Viruseintritt sehr einfach gemessen werden. Mit dieser
Methode lassen sich die Eigenschaften von Hüllproteinen, von verschiedenen natürlichen
Virusvarianten, von Mutanten oder auch Chimären analysieren.
Mit diversen Hüllproteinen unterschiedlicher Virusklassen wurden pseudotypisierte HIV-1-
Partikel erfolgreich eingeführt. Ein Infektionsmodell mit Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1-
Partikeln konnte jedoch noch nicht etabliert werden. In der wissenschaftlichen Literatur wurde
nur eine Arbeit publiziert, die sich mit kompletten DENV pseudotypisierten HIV-1-Partikeln
befasst.26
In dieser Arbeit wurde der Virusvektor NL4-3R-E
- verwendet der env und vpr neagtiv
(env-, vpr
-) ist. Das Reportergen ist in diesem Vektor anstelle des nef Gens inseriert. Daher ist
dieser Vektor zusätzlich auch nef negativ (nef -). Mit diesem Vektor waren infektiöse Dengue-
M/E Pseudotypen nicht reproduzierbar herzustellen. Im Zuge einer Dissertation wurde das
lentivitrale System verbessert.14
Entgegengesetzt zu der von Hu et al. (2007) veröffentlichten
Methode, konnte durch die Forschung von Auerswald (2016) der pNLlucAM-Vektor als
optimaler Vektor für das System ermittelt werden. Dieser Vektor exprimiert die akzessorischen
Faktoren Nef und R und ist somit nef + und vpr
+.14,26
Das Luciferase-Reportergen ersetzt in
diesem Vektor das env Gen und ist unabhängig von der Regulation des HIV-1 unter der Kontrolle
des SV40 Promotors. Unter Verwendung des pNLlucAM Vektors war es möglich, reproduzierbar
infektiöse Dengue M/E Pseudotypen zu produzieren, wenn auch in kleinen Mengen. So reichen
die gebildeten Partikel-Mengen aus einer 6-well-Transfektion für ca. 15-20 Infektions-
experimente (im 96-well Format). Mit einer solchen Transfektion ist es daher nicht möglich,
z.B. eine TCID50 zu bestimmen.
52
Für eine TCID50-Bestimmung müssen mindestens 4x12 Infektionsexperimente (im 96-well-
Format) durchgeführt werden.
Bei den Vorarbeiten von Auerswald (2016) war die Co-Transfektion der beiden Plasmide,
Virusvektor und Hüllproteinvektor, mithilfe des Luziferase-Reproterenzyms kontrolliert und auch
optimiert worden. Auerswald (2016) verfolgte die Annahme, dass bei hohen Luciferasewerten
auch die Co-Transfektion für die Viruspartikel-Bildung am optimalsten ist. Dies entspricht auch
den Vorgehensweisen in der Literatur in Zusammenhang mit der Transfektionen von
eukaryotischen Zellen. In dieser Arbeit wurde allerdings dieser indirekte Ansatz zur Kontrolle der
Co-Transfektionen verworfen und durch einen direkten Ansatz ersetzt. Die Co-Transfektionen
wurden zwar auch anhand der Luciferaseaktivität überprüft. Zusätzlich wurden aber auch
gleichzeitig die infektiösen Titer in den Zellkulturüberständen der co-transfizierten Zellen
gemessen. Der Ansatz, die Plasmid-DNA-Mengen bei der Co-Transfektion erheblich zu steigern,
erwies sich als hilfreich. Durch den Einsatz steigender Plasmid-Mengen wurden zwar sinkende
Transfektionsergebnisse in Bezug auf die Luciferaseaktivität gemessen, dennoch beobachtete
man eine stark gestiegene Infektionseffizienz der Dengue M/E pseudotypisierten Viruspartikel.
Daran sieht man, dass nur die direkte Kontrolle der infektiösen Titer in den Zellkulturüberständen
die Bildung pseudotypisierter Partikel quantitativ nachweisen konnte. Der indirekte Ansatz zu
Kontrolle der Co-Transfektionen führt zu falschen Rückschlüssen.
In dieser Arbeit wurden Plasmid-Gesamtmengen zwischen 6 µg und 60 µg transfiziert. Die
höchsten Transfektionsergebnisse wurden bei der geringsten DNA-Menge von 6 µg gemessen.
Die lysierten, transfizierten HEK293T-Zellen zeigten Luciferase-Aktivitäten bis 109 RLUs. Mit
steigenden DNA-Mengen sanken die Messwerte bis auf 105 RLUs. In den Vorarbeiten von
Auerswald (2016) wurden die Luciferase-Aktivitäten der transfizierten Zellen mit dem
Vektorplasmid und den DENV-Hüllproteinplasmiden nicht gemessen, sodass die
Transfektionsergebnisse nicht verglichen werden konnten.
In Form partikelhaltiger Überstände wurden eukaryotische Zellen mit den Pseudotypen infiziert.
Bei den Infektionsergebnissen wurde eine umgekehrte Entwicklung im Gegensatz zu den
Tranfektionsergebnissen gemessen. Die höchsten Ergebnisse infolge der Infektion mit den
Dengue-M/E pseudotypiserten HIV-1-Partikeln wurden durch Partikel mit 45 µg transfizierter
Plasmid-Menge gemessen. Dies entspricht einem molaren Verhältnis von 1:14 HIV-1-
Vektorplasmid zu Hüllproteinplasmid. Die lysierten, infizierten VeroB4-Zellen zeigten
Luciferase-Aktivitäten bis 2·105 RLUs. Bei höheren Plasmid-Mengen sanken die Luciferase-
Aktivitäten wieder.
53
Bei niedrigeren Plasmid-Mengen war ein Abfall der Luciferase-Aktivitäten bis zu 102 RLUs zu
messen. In den Vorarbeiten von Auerswald (2016) wurden lediglich 2 µl Plasmid-DNA
transfiziert. Mit den partikelhaltigen Überständen wurden eukaryotische Zellen infiziert und auf
ihre Luciferase-Aktivität getestet. Es wurden Luciferase-Aktivitäten bis zu 105 RLUs gemessen.
Diese Werte überschneiden sich mit den in dieser Arbeit gemessenen Luciferase-Aktivitäten.
Allerdings ist die Infektiosität der partikelhaltigen Überstände dieser Arbeit deutlich höher,
sodass etwa 3000 Infektionsexperimente (im 96-well Format) mit einer Transfektion in 6-well-
Zellkulturplatten durchgeführt werden können, anstatt 15-20. Zusätzlich wurden die Überstände
in dieser Arbeit für die Infektionen 1:5 verdünnt. Dennoch konnten diese hohen Luciferase-
Aktivitäten für die infektiösen Pseudotypen gemessen werden.
Aufgrund der hohen Titer wurden die pseudotypisierten Partikel nicht durch
Ultrazentrifugationsverfahren wie Differentialzentrifugation aufgereinigt und weiter
aufkonzentriert (Vgl. 29
), sodass keine zusätzlichen Reinigungsschritte nötig waren.
Eine Erklärung für das Phänomen des umgekehrten Zusammenhangs der Transfektions- und
Infektionsergebnisse wäre, dass bei der Plasmid-Co-Transfektion ein Limit überschritten werden
muss, um genügend virales Genom zu erzeugen, welches auch in Partikel verpackt werden kann.
Gleichzeitig muss auch ein Überschuss an M/E Hüllprotein produziert werden, was sich in die
äußere Zellmembran integrieren kann. Infolge einer ansteigenden Partikelproduktion bleibt
weniger Vektor-Plasmid in den HEK293T-Zellen zurück, wodurch sich die Aktivität für das
Enzym Luciferase verringert. Als optimaler Wert für die Co-Transfektion hat sich in dieser
Arbeit die transfizierte Plasmid-Gesamtmenge von 45 µl bei einer Zelldichte von 5·106 Zellen in
6-well-Zellkulturplatten erwiesen. Dies entsprach einer Fläche von 8,87 cm2.
Insgesamt betrachtet wurde das Dengue-M/E Pseudotypen-System um den Faktor 100-200
optimiert und seine Ausbeute verbessert.
54
4.2 Verbesserung des Infektionsmodells
Während der Infektion mit den partikelhaltigen Zellkulturüberständen binden die
Hüllproteinen der Partikel an kompatible zelluläre Rezeptoren eukaryotischer Zellen und können
dadurch mit der Zellmembran verschmelzen. Wie bei klassischen Infektionen wird das virale
Genom in die eukaryotischen Zellen eingebracht.15,16,17,18
Ziel eines solchen Systems ist es z.B.
Seren von Dengue infizierten Personen auf neutralisierende Antikörper zu untersuchen.
Damit kann man den anti-Dengue Immunstatus von Patienten genauer analysieren. Die Bindung
von Antikörpern an ein Antigen, wie es in der diagnostischen Routine durchgeführt wird, sagt
nichts aus über die neutralisierende Aktivität, den Schutz, den ein Patient gegen das Denguevirus
entwickelt hat, aus.
Dafür sind Dengue-Neutralisationstests eine wichtige Methode. Pseudotypisierte Viren fallen
außerdem in die Sicherheitsstufe BSL2 und können daher in jedem diagnostischen Labor
durchgeführt werden. Arbeiten mit Dengueviren, die normal replizieren, fallen dagegen unter die
Sicherheitsstufe BSL3.
Für diagnostische Neutralisationsstudien wird in 96-well-Mikrotiterplatten gearbeitet. Die
bisherigen Arbeiten orientierten sich an Methoden zu HIV-1. Mit Dengue M/E Pseudotypen im
96-well Format gab es bisher keine genauen Daten zur Durchführung von Infektionsstudien.
In der Arbeit stellte sich heraus, dass es bei der Adaption an das 96-well Format Schwierigkeiten
mit der Reproduktion der Infektionen gab. Obwohl in der Mehrzahl der 96-wells Infektionen
gemessen wurden, schwankten die Werte stark und es wurden sogar vereinzelt Nullwerte
beobachtet.
Grund war zum einen die Methode der Lysis. Die in der Literatur beschrieben Methode bei
HIV-1 permissiven Zellen funktionierte mit dem Luciferase-Substrat (Bright-Glow, Promega)
nicht einwandfrei. Dieses zeitlich stabile Kombinations-Substrat, das die Lyse beinhaltet, zeigte
Schwankungen bei den Messungen. Man muss davon ausgehen, dass nur bei vollständiger Lyse
gleichmäßige Luciferase-Werte detektiert werden können. Die Verwendung einer Methode bei
der Lyse- und Substratreaktion getrennt durchgeführt wurden (LAR Substrat), war erfolgreicher.
Hier tritt allerdings das Problem der Zellverschleppung auf, was auch zu Schwankungen bei den
Messungen führen kann. Die geeignetste Methode ist die Methode mit dem LAR-Substrat.
Hiermit wurden in dieser Arbeit die hohen und stabilen Infektionswerte gemessen. Für zukünftige
Arbeiten wäre es eventuell von Bedeutung, das Luciferase-Reportergen gegen eine Konstruktion
auszutauschen bei der das Enzym in den Zellkulturüberstand segregiert wird. Dafür müsste
allerdings der Virusvektor umgebaut werden.
55
Zum anderen stellte sich heraus, dass die Zelldichte einen starken Einfluss auf die Messungen
hatte. Aus den Infektionsexperimenten in dieser Arbeit geht hervor, dass bei einer etwas
geringeren Zelldichte von ca. 70% die größte Stabilität des Infektionsmodells erreicht wird, da
die Zellen während der zweitägigen Inkubation sich weiter teilen und die 96-wells zunehmend
bedecken. Mit der geringeren Zelldichte konnte gewährleistet werden, dass eine komplette
Konfluenz verhindert wurde.
Es wurden diverse mögliche Einwirkungen auf die Infektionen erwogen und dessen Wirkung
untersucht. Den größten Einfluss spielen die eukaryotischen Zelllinien und deren Dichte in den
96-well-Platten. Durch die Wahl der richtigen Zellkulturplatten muss während der gesamten
Infektion eine vollständige Adhärenz der Zellen am Boden der Kavitäten gewährleistet sein. Eine
Konfluenz der Zellen kann außerdem zu einer Zellkontakthemmung führen.
Dadurch wird die Zellteilungsrate vermindert bzw. verhindert. Infolge eingeschränkter
Zellteilung wird auch der Zellmetabolismus reduziert, wodurch auch der Infektionsprozess
eingeschränkt wird.27,28
Die geringere Zelldichte hatte wahrscheinlich auch einen positiven
Einfluss auf die Lyse des Zellrasens und damit auf die Messung der Luciferase-Aktivität.
4.3 Bedeutung des Infektionsmodells für Dengue-M/E pseudotypisierte
HIV-1-Partikel
Die Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1 Partikel ermöglichen nicht nur die
genauere Untersuchung der Funktion der Hüllproteine sowie der Interaktionen zwischen dem
Virus und der humoralen Immunantwort, oder die Quantifizierung des Viruseintritts in
eukaryotische Zellen und dessen Inhibition. Mithilfe der umhüllten pseudotypisierten Partikel
können außerdem auch ELISA-Tests durchgeführt werden und die Pseudotypen können die
klassischen Dengueviren in Neutralisationstest (NT) ersetzten. Der Neutralisationstest eignet sich
besonders gut, um die neutralisierende Immunantwort gegen die verschiedenen DENV-Serotypen
zu bestimmen. Das Testen der serotyp-spezifischen Immunantwort wird normalerweise mit
Dengueviren im BSL3 Labor durchgeführt. Die Dengueviren stammen zum Teil aus
unterschiedlichen Regionen und werden bevorzugt nach den vier Gruppen DENV1, -2, -3 und -4
eingeteilt und verwendet. Bisher stand diese Serotypen-Einteilung im Vordergrund. Allerdings
unterscheiden sich Dengueviren auch innerhalb der Serotypen-Gruppe. Daher ist es von Vorteil,
den Immunstatus von Patienten, die induzierte DENV neutralisierende Antikörperantwort mit den
Viren zu untersuchen die auch in den Regionen vorkommen, in denen die Patienten leben. Dies
56
ist mit dem Pseudotypensystem möglich, da man nicht auf isolierte Dengueviren sondern nur auf
Sequenzdaten angewiesen ist.
Durch das Testen von Patientenisolaten kann mittels des NTs die Neutralisationsprävalenz des
Serums und folglich dessen DENV-Serotyp quantifiziert werden. Ein solcher Serotyp-Nachweis
kann zum Beispiel bei Impfkandidaten eingesetzt werden.
Das Unternehmen Sanofi Pasteur Ltd. entwickelte einen tetravalenten und rekombinanten
Lebendimpfstoff gegen das Denguevirus.22,23,24,25
Der Impfstoff Denvaxia® (CYD-TDV) ist das
erste DENV-Vakzin, das zugelassen wurde. Dennoch empfiehlt die WHO eine Einführung des
Impfstoffs nur in Gebieten mit hohen DENV Infektionsraten. Allerdings ist die Effektivität des
Vakzins stark vom Alter der Impfkandidaten abhängig.22,25
Bei Erwachsenen wurde eine
Verbesserung von ca 35-50% beobachtet. Bei Kindern war das aber erstaunlicherweise nicht so.
Es wurde gezeigt, dass in der Gruppe der Kinder < 9 Jahren das Risiko, eine Dengueinfektion zu
bekommen nach einer Impfung steigt. Das könnte damit zusammenhängen, dass Erwachsene
schon öfters Kontakt mit Dengueviren hatten und die Vakzine eine bestehende Immunantwort
verstärkt aber nicht neu initiert. Damit wäre es eine Verstärkung der durch natürliche Infektionen
entstandenen Immunantwort. Bei Kindern könnte es sein, dass sie noch nicht diese
Immunantwort entwickelt haben. Die Vakzine initiiert nun eine Vakzine-spezifische
Immunantwort, die nicht zu den Viren passt, die in der Gegend der Patienten endemisch sind. Die
Antikörper-vermittelte-Verstärkung einer Infektion (ADE, antibody dependent enhancing)
könnte so zu einem erhöhten Risiko bei Dengue naiven Personen, Kindern < 9 Jahre, führen. Hier
könnte das Dengue M/E Pseudotypensystem helfen. Es könnte den Immunstatus der zu
impfenden Personen bestimmen und die Impfgruppe würde nicht nach ihrem Alter, sondern nach
ihrem anti-Dengue Immunstatus zusammengesetzt. Auch würde es sich eigenen, den Impferfolg
genauer zu analysieren. Durch die Analyse der Serologie und die zusätzliche Abgrenzung des
Serotyps durch das Infektionsmodell mit Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1-Partikeln könnte
einen gezielteren Einsatz des DENV Impfstoffs CYD-TDV begünstigt werden. Zusätzlich könnte
das Vakzin erweitert werden, sodass der tetravalente Impfstoff in die vier Serotypen aufgespalten
wird und somit noch bestimmter immunisiert werden kann und die Nebenwirkungen sowie
kreuzweise auftretende Immunverstärkungen weiter reduziert werden.
57
Die umhüllten pseudotypisierten Partikel bieten viele Vorteile im Gegensatz zu den klassischen
Dengueviren. Die Pseudotypen können innerhalb von zwei Tagen hergestellt werden und
benötigen demnach nur ein Drittel der Zeit für deren Kultivierung im Unterschied zu normalen
Dengueviren. Außerdem besteht durch die Infektionseigenschaften (single round infection) der
pseudotypisierten Partikel ein deutlich reduzierteres Infektionsrisiko beim Umgang mit den
Viruspartikeln. Das Pseudotypen-System kann durch die verschiedenen Hüllproteine beliebig
modifiziert, angepasst und spezifiziert werden. Besonders hinsichtlich der vier Serotypen können
die Transfektionen einzeln optimiert werden. Die Infektionen eukaryotischer Zellen mit
partikelhaltigen Überständen erreichen zudem ähnlich hohe Virustiter, wie die Infektionen mit
Virusüberständen (Vgl. 14
).
Aufgrund der Bedeutung der Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1-Partikeln ist es sehr
aussichtsreich, ein solches Infektionsmodell weiterzuführen. Im weiteren Verlauf sollten die
Co-Transfektionen zur Herstellung der Partikelüberstände mit allen vier Serotypen in 6-well-
Zellkulturplatten durchgeführt werden. Mit den partikelhaltigen Überständen sollten mit den in
dieser Arbeit beschriebenen Optimierungen stabile Infektionsraten beobachtet werden. Dadurch
können die pseudotypisierten Partikel in Zukunft für Neutralisationstests verwendet werden. Um
die Perspektiven der Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1-Partikel hinreichend validieren zu
können, sollten Patientenseren, die mit klassischen Virusüberständen im Zuge des NTs untersucht
wurden, mit den partikelhaltigen Überständen in Kontrollexperimenten getestet werden. Bei
deckungsgleichen und übereinstimmenden Ergebnissen kann das Pseudotypen-System die
normalen Virusneutralisationstests ersetzen.
58
5 Zusammenfassung
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel mit
den Hüllproteinen aller DENV Serotypen hergestellt. Dies erfolgte mit Hilfe von jeweils zwei
Plasmiden. Ein Plasmid codiert für das Virusgenom (pNLlucAM), das andere Plasmid codiert für
die M/E-Hüllproteine des entsprechenden DENV. Um die Menge der infektiösen Titer von M/E-
Pseudotypen zu steigern, wurde die Luciferase-Aktivität der co-transfizierten HEK293T-Zellen
gemessen. Zusätzlich wurden die partikelhaltigen Zellkultur-überstände auf Infektiosität der
Pseudotypen getestet. Ergebnis war ein umgekehrter Zusammenhang. Bei Steigerung der Menge
an Plasmid-DNA bei der Transfektion ging die Luciferase-Aktivität in den transfizierten
HEK291T-Zellen zurück, während die Infektiosität der Partikel anstieg. Der Schwellenwert für
die DNA-Menge war bei 45 µg Plasmid-DNA im molaren Verhältnis 1:14 von Virusvektor zu
M/E-Expressionsvektor. Die 45 µg Plasmid-DNA bezog sich auf 5·106 Zellen in einem 6-well,
was einer Fläche von etwa 9 cm2 entsprach. Bei einer transfizieren Plasmid-Menge über 45 µg
wurden abnehmende Pseudotypen-Titer gemessen. Bei geringeren Plasmid-Mengen sank die
Infektiosität um den Faktor 100. Demnach wurde die transfizierte DNA-Menge gegenüber dem
Incella Transfektionsprotokoll und vorherigen Arbeiten um das 17,5-fache gesteigert. In den
Kontrollexperimenten mit HIV-1 pseudotypisierten HIV-1-Partikeln hingegen wurden die
höchsten Infektiositäten der partikelhaltigen Überstände bei geringen Plasmid-Mengen gemessen,
wodurch sich die Resultate konkret auf Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1 Partikel beziehen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Partikelfiltration, des FCS und der Zelldichte
auf die Infektion untersucht, um das Infektionsmodell zu verbessern. Die größte Bedeutung für
die Infektionen zeigten die Zelldichten der DENV permissiven VeroB4-Zelllinie. Bei zu hohen
Zelldichten trat eine Zellkontakthemmung auf, welche die Infektion einschränkte und selektiv
auch inhibierte. Ergebnis war eine optimale Zelldichte von etwa 70% zum Zeitpunkt der
Infektion, um gleichmäßig Infektionsraten zu erzielen.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die Transfektions-Ausbeuten durch TCID50-Bestimmungen
quantifiziert. Die infektiöse Dosis DENV-2 pseudotypisierter HIV-1-Partikel entsprach einer
Verdünnung von 1:100. Demnach können mit einer Transfektion in 6-well-Platten etwa 3000
Infektionsexperimente (im 96-well-Format) durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigten eine
Steigerung der Infektiosität der partikelhaltigen Zellkulturüberstände um das 150-fache im
Gegensatz zu vorherigen Arbeiten. Daher konnten durch die gesteigerten transfizierten Plasmid-
Mengen deutlich mehr Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel gebildet werden.
59
5.1 Summary
In the first part of this study dengue-M/E pseudotyped HIV-1 particles with the
envelope proteins of all four DENV serotypes were produced. The particles were made using two
plasmids. One plasmid encodes the viral HIV-1 (env- Luc
+) genome (pNLlucAM) while the other
plasmid encodes for example the DENV-1-M/E envelope proteins, respectively. To increase the
amount of the infectious titers of M/E pseudotypes the luciferase activity of the co-transfected
HEK293T cells were measured. Additionally, the infectiosity of the cell culture supernatant
containing the particles was tested by VeroB4 infection. The outcome was a reversed correlation.
With the increase of transfected plasmid DNA the luciferase activity in the transfected HEK293T
cells decreased, whereas the infectiosity of the pseudotyped particles increased. The threshold of
the DNA amount was 45 µg plasmid DNA with a molar ratio of 1:14 of viral vector to M/E
expression vector. The 45 µg plasmid DNA referred to 5·106 cells in the 6-well-cell culture plate
which is equivalent to a surface of approximately 9 cm2. At a transfected amount of plasmid
above 45 µg decreasing infectiosities were detected. At a lower amount of plasmid the
infectiosity decreased by a factor of 100. Thus, the transfected amount of DNA was 17,5-fold
higher compared to the Incella transfection protocol and previous studies. During the control
experiments with HIV-1 pseudotyped HIV-1 particles however the slightest amounts of plasmid
DNA resulted in the highest infeciosities of the cell culture supernatant containing the particles.
Therefore these results are highly specific for the generation of dengue-M/E pseudotyped
HIV-particles.
In the second part of this study the impact of particle filtration, FCS concentration and the cell
density on VeroB4 infections were determined to improve the pseudotype infection model. The
disseminated cells showed the major significance. At excessive cell densities a cell contact
inhibition occurred which restricted and selectively inhibited the infections. The result was an
ideal cell density of approximately 70% at the time of the infection to detect consistent infection
rates.
In the third part of this study the yields of the transfections were quantified by a TCID50 assay.
The infectious dose of DENV-2 pseudotyped HIV-1 particles equated to a dilution of 1:100.
Thus, about 3000 infection experiments (in 96-well) can be performed with supernatants
transfected in 6-well-cell cultures. The results showed a general 150-fold increase of the
infectiosity of the cell culture supernatant containing the particles compared to previous studies.
Therefore significantly more dengue-M/E pseudotyped HIV-1 particles were generated by the
optimized protocol for pseudotype generation, presented in this study.
60
6 Literaturverzeichnis
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62
Danksagung
Dr. Michael Schreiber danke ich aufrichtig für das Ermöglichen dieser Arbeit, die
Aufnahme in seine Laborgruppe und die Vergabe des spannenden Themas. Zusätzlich möchte ich
mich für die aufmerksame und engagierte Betreuung sowie für die Übernahme als Zweitgutachter
bedanken. Durch unermüdliche Erklärungen, Raum für eigenständiges Arbeiten und die
Blickwinkel auf neue Lösungsansätze, konnte ich mich deutlich weiterentwickeln und meine
Kenntnisse erweitern.
Weiterer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Claus-Dieter Wacker für die Betreuung der Bachelorarbeit als
Erstgutachter. Trotz der vielen Verpflichtungen als Präsident der HAW sowie als Professor und
der daraus resultierenden limitierten Zeit konnte ich durch den Erhalt einer sehr
entgegenkommenden Unterstützung alle Fragen und Schwierigkeiten schnell klären und
erfolgreich arbeiten.
Für die anfängliche Einarbeitung und die freundliche Hilfe bei Problemen im Labor bedanke ich
mich bei Kerstin Krausz. Mit ihr und der studentischen Hilfskraft Julian Leefmann entstanden
immer nette Gespräche in der Laborgruppe, die den Laboralltag vereinfacht und zu einer
angenehmen Laboratmosphäre beigetragen haben.
Meine tiefste Verbundenheit widme ich meiner Familie, insbesondere meiner Mutter und meiner
Schwester, die mich während meines Studiums durchgängig unterstützt, bei diversen Zweifeln
ermutigt und auch mal vom Stress abgelenkt haben.
63
II Anhang
A Ergebnisse der 2. Transfektion HIV-1 pseudotypisierter HIV-1-Partikel
pNLlucAM/pgp160 pNLlucAM pgp160
DNA-
Verhältnis *
2 µl+4 µl 2 µl 2 µl
filtriert nicht filtriert filtriert nicht filtriert filtriert nicht filtriert
Luciferase-
Aktivität [RLU] 2·10
9 1,9·10
7 2·10
9 2·10
9 4,5·10
3 5·10
3
* zusammengesetzt aus Vektor- und Hüll-Expressionsplasmiden, 1 µg/µl
B prM/E-Sequenzen der DENV-Hüllplasmide
pcBD1
CTCTCTGGCTACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGCCGCCGCCT
GTCTGTGACCATGCTCCTTATGCTGCTGCCCACAGCCCTGGCGTTCCATCTGACGACA
CGAGGGGGAGAGCCGCACATGATAGTCAGCAAGCAGGAAAGAGGAAAGTCACTTTT
GTTCAAGACCTCTGTAGGTGTCAACATGTGCACCCTTATTGCGATGGATCTGGGAGA
GTTGTGTGAGGACACAATGACCTACAAATGCCCCCGGATCACTGAGGCGGAACCAG
ATGATGTTGACTGTTGGTGCAATGCCACGGACACATGGGTGACCTATGGAACGTGTT
TTCAAACTGGCGAACACCGACGAGACAAACGTTCCGTCGCATTGGCCCCACACGTGG
GGCTTGGCCTAGAAACAAGAGCCGAAACATGGATGTCCTCTGAAGGCGCTTGGAAA
CAGATACAAAAAGTAGAGACTTGGGCTCTGAGACACCCAGGATTCACGGTGATAGC
CCTTTTTCTAGCACATGCCATAGGAACATCCATCACCCAGAAAGGGATCATTTTTATT
TTGCTGATGCTGGTAACACCATCTATGGCCATGCGATGCGTGGGAATAGGCAACAGA
GACTTTGTGGAAGGACTGTCAGGAGCAACATGGGTGGATGTGGTACTGGAGCATGG
AAGTTGCGTCACCACCATGGCAAAAAATAAACCAACACTGGACATTGAACTCTTGAA
GACGGAGGTCACAAACCCTGCAGTTCTGCGTAAACTGTGTATTGAAGCTAAAATATC
AAACACAACCACCGATTCGAGATGTCCAACACAAGGAGAAGCCACACTGGTGGAAG
AACAGGACGCGAACTTTGTGTGCCGACGAACGTTCGT
64
pHAD2
CTCTCTGGCTACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCTCTAGAGCCG
CCGCCATGGCAGGCATGATCATTATGCTGATTCCAACAGTGGCGTTCCATCTAACCA
CACGTAACGGAGAACCACACATGATCGTCAGTATACAAGAGAAAGGGAAAAGTCTT
CTGTTTAAAACAGAGGATGGCGTGAACATGTGCACCCTCATGGCCATGGACCTTGGT
GAATTGTGTGAAGACACAATCACGTACAAGTGTCCCCTTCTCAGGCAGAATGAGCCA
GAAGACATAGACTGTTGGTGCAACTCCACGTCCACGTGGGTAACCTATGGGACTTGT
ACCACCACGGGAGAACATAGAAGAGAAAAAAGATCAGTGGCACTCGTTCCACATGT
GGGAATGGGACTGGAGACGCGAACCGAAACATGGATGTCATCAGAAGGGGCTTGGA
AACATGCCCAGAGAATTGAAACTTGGATCCTGAGACATCCAGGCTTCACCATAATGG
CAGCAATCTTGGCATACACCATAGGGACGACACATTTCCAGAGAGCCCTGATTTTCA
TCCTACTGACAGCTGTCGCTCCTTCAATGACAATGCGTTGCATAGGAATATCAAATA
GAGACTTTGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGCTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATG
GAAGCTGTGTGACGACGATGGCAAAAAACAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATA
AAAGCGGAA GCCAAACAGCCTGCCACCCTAAGGAAGTACTG
pHAD3
CTCTCTGGCTACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGCCGCCGCCA
TGACATCGTTCTGTCTCATGATGATGTTACCAGCAACACTTGCTTTCCACTTAACTTC
ACGAGATGGAGAGCCGCGCATGATTGTGGGGAAGAATGAAAGAGGAAAATCCCTAC
TTTTTAAGACAGCCTCTGGAATCAACATGTGCACACTCATAGCCATGGATTTGGGAG
AGATGTGTGATGACACGGTCACTTACAAATGCCCCCACATTACCGAAGTGGAGCCTG
AAGACATTGACTGCTGGTGCAACCTTACATCGACATGGGTGACTTATGGAACATGCA
ATCAAGCTGGAGAGCATAGACGCGATAAGAGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCATGTC
GGCATGGGACTGGACACACGCACTCAAACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGGAG
ACAAGTCGAGAAGGTAGAGACATGGGCCCTTAGGCACCCAGGGTTCACCATACTAG
CCCTATTTCTTGCCCATTACATAGGCACTTCCTTGACCCAGAAAGTGGTTGTTTTTGT
ACTATTAATGCTGGTTACCCCATCCATGACAATGAGATGTGTGGGAGTAGGAAACAG
AGATTTTGTGGAAGGCCTATCGGGA GCTACGTGGGTTGACGTGGTGCTC
65
pHAD4
CTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGCCGCCGC
CATGACGATAACATTGCTGTGCTTGATTCCCACCGTAATGGCGTTTCACTTGTCAACA
AGAGATGGCGAACCCCTTATGATAGTGGCAAAACACGAAAGGGGGAGACCTCTCTT
GTTTAAGACAACAGAGGGAATCAACAAATGCACTCTTATTGCCATGGACCTGGGTGA
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GGACATTGATTGCTGGTGCAATCTCACGTCTGCCTGGGTCATGTATGGGACATGCAC
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GAATGGGATTGGAGACAAGGGCTGAGACATGGATGTCATCGGAAGGGGCTTGGAAA
CATGCTCAGAGGGTAGAGAGTTGGATACTCAGAAACCCAGGATTCGCTCTCTTGGCA
GGATTTATGGCCTATATGATTGGGCAAACAGGAATCCAGCGAACAGTCTTCTTTGTT
CTAATGATGCTGGTCGCCCCATCCTACGGAATGCGATGCGTGGGAGTGGGGAACAG
AGACTTTGTGGAAGGAGTCTCAGGTGGAGCATGGGTCGATTTGGTGCTAGAACATGG
AGGATGTGTCACAACCATGGCCCAGGGAAAACCAACCTTGGATTTTGAACTGATCAA
GACAACAGCCAAGGAAGTGGCTCTGTTAAGAACCTATTGCATTGAAGCCTCGATATC
AAACATAACCACGGCAACAAGATGTCCAACGCAAGGAGAACCTTATCTCAAAGAGG
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