Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Tomislav Hudina

Palinološka analiza i određivanje sadržaja kemijskih elemenata medova

sjeverozapadne Hrvatske

Diplomski rad

Zagreb, 2012.

Ovaj rad, izrađen na Botaničkom zavodu i Zavodu za analitičku kemiju

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom prof. dr.

sc. Božene Mitić i doc. dr. sc. Sande Rončević, predan je na ocjenu Biološkom

odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja

zvanja magistar eksperimentalne biologije.

HVALA…

… mojim mentoricama i asistentu Ivanu Nemetu na pomoći u planiranju i provedbi

istraživanja te pisanju ovog rada.

… dr. sc. Ivani Hrgi i dr. sc. Barbari Stjepanović koje su zaslužne za determinaciju

peludnih zrnaca te mr. sc. Dariu Lasiću na pomoći u pripremi preparata peludi.

… članovima Pčelarskog društva Zagreb, a posebno mr. sc. Nenadu Strižaku, što

su dali uzorke svojih medova za ovo istraživanje i što su mi prenjeli djelić svoga

pčelarskog znanja i iskustva.

… mojim prijateljima, a posebno Behiji i Anji na savjetima i kritičkom čitanju rada.

… profesoru Toniju Nikoliću, nakon čijih sam predavanja još na prvoj godini

preddiplomskog studija Molekularne biologije odlučio postati botaničar.

I na kraju, hvala mojim roditeljima i sestri te ostatku obitelji što su mi uvijek pružali

potporu i vjerovali u mene.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Diplomski rad

PALINOLOŠKA ANALIZA I ODREĐIVANJE SADRŽAJA KEMIJSKIH ELEMENATA

MEDOVA SJEVEROZAPADNE HRVATSKE

Tomislav Hudina

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Med je cijenjena, ali još uvijek slabo istražena prehrambena namirnica. Cilj ovog istraživanja

bio je dati doprinos poznavanju medova sjeverozapadne Hrvatske. Istraživanje je

provedeno na 25 uzoraka medova te je obuhvaćalo palinološku i kemijsku analizu.

Palinološka analiza provedena je determinacijom i prebrojavanjem peludnih zrnaca

izoliranih iz medova. Kemijska analiza obuhvaćala je spektrometrijsko određivanje sadržaja

17 odabranih kemijskih elemenata u uzorcima medova pomoću atomske emisijske

spektrometrije uz induktivno spregnutu plazmu (ICP-AES). Svim su uzorcima snimljeni i

ATR (prigušena ukupna refleksija) spektri. Utvrđeno je da samo palinološka analiza nije

dovoljna za određivanje botaničkog podrijetla medova, iako je dobra za određivanje

geografskog podrijetla. Analiza sadržaja elemenata pokazala se preciznijom u klasifikaciji

medova, ali za konačnu potvrdu botaničkog podrijetla ipak je potrebno provesti i palinološku

analizu. ATR spektri, samo na temelju asignacije prominentnih vrpci, ne mogu poslužiti za

klasifikaciju uzoraka medova, već je potrebna detaljna asignacija.

(54 stranice, 20 slika, 11 tablica, 41 literaturni navod, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici

Ključne riječi: melisopalinologija, ICP-AES, botaničko podrijetlo medova, ATR

Voditelj: Dr. sc. Božena Mitić, izv. prof. i Dr. sc. Sanda Rončević, doc.

Ocjenitelji: Dr. sc. Božena Mitić, izv. prof.

Dr. sc. Sanda Rončević, doc.

Dr. sc. Nataša Bauer, doc.

Rad prihvaćen: 21. lipnja 2012.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Department of Biology

Graduation Thesis

PALYNOLOGICAL ANALYSIS AND DETERMINATION OF CHEMICAL ELEMENTS IN

HONEYS FROM NORTHWESTERN CROATIA

Tomislav Hudina

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

Honey is appreciated, but still poorly investigated nutritional ingredient. The aim of this

study was to contribute to the knowledge about honeys from Northwestern Croatia. The

study was conducted on 25 samples of honeys and includes palynological and chemical

analysis. Pollen analysis was performed by counting and determination of pollen extracted

from honey samples. Chemical analysis included the spectrometric determination of 17

selected chemical elements in honey samples using ICP-AES (Inductively Coupled Plasma

Atomic Emission Spectrometry) method. In addition, ATR (Attenuated Total Reflection)

spectra were recorded to all samples. It turned out that only palynological analysis is

insufficient to determine the botanical origin of honey, although it is good for determining the

geographic origin. Elements content analysis proved to be more precise for classification of

the honeys, but for the final confirmation of botanical origin it is still necessary to implement

palynological analysis. ATR spectra can’t be used to classify honey samples just based on

the assignment of prominent bands, ie without detailed assignment.

(54 pages, 20 figures, 11 tables, 41 references, original in: Croatian)

Thesis deposited in Central Biological Library

Key words: mellisopalynology, ICP-AES, botanical origin of honey, ATR

Supervisor: Dr. Božena Mitić, Assoc. Prof. and Dr. Sanda Rončević, Asst. Prof.

Reviewers: Dr. Božena Mitić, Assoc. Prof.

Dr. Sanda Rončević, Asst. Prof.

Dr. Nataša Bauer, Asst.Prof.

Thesis accepted: June 21, 2012

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................ 1

1.1. O medu i pčelama ........................................................................................ 1

1.2. Palinologija ................................................................................................... 5

1.2.1. Opći pojmovi .......................................................................................... 5

1.2.2. Građa peludnog zrnca ............................................................................ 8

1.2.3. Klasifikacija peludnih zrnaca .................................................................. 9

1.2.4. Primjena analize peludi ........................................................................ 12

1.3. Atomska emisijska spektrometrija uz induktivno spregnutu plazmu ............ 13

1.3.1. Opći pojmovi ........................................................................................ 13

1.3.2. Načela rada metode ............................................................................. 13

1.3.3. Primjenjivost metode ............................................................................ 15

1.4. Prigušena ukupna refleksija ........................................................................ 16

1.4.1. Opći pojmovi ........................................................................................ 16

1.4.2. Načela rada metode ............................................................................. 17

1.4.3. Primjenjivost metode ............................................................................ 18

1.5. Dosadašnja istraživanja .............................................................................. 18

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA .................................................................................. 20

3. MATERIJALI I METODE .................................................................................. 21

3.1. Uzorci meda ............................................................................................... 21

3.2. Palinološka analiza ..................................................................................... 22

3.2.1. Priprema preparata .............................................................................. 22

3.2.2. Determinacija i prebrojavanje peludnih zrnaca ..................................... 23

3.3. Kemijska analiza ......................................................................................... 23

3.3.1. Kemikalije i uređaji ............................................................................... 23

3.3.2. Priprema uzoraka ................................................................................. 25

3.3.3. Mjerenje koncentracije elemenata u uzorcima ...................................... 26

3.3.4. Snimanje ATR spektara ....................................................................... 27

3.4. Statistička analiza ....................................................................................... 27

4. REZULTATI ..................................................................................................... 29

4.1. Sastav peludnih zrnaca u medu .................................................................. 29

4.2. Sadržaj kemijskih elemenata ...................................................................... 33

4.3. Rezultati statističke analize ......................................................................... 39

4.4. ATR spektri ................................................................................................. 42

5. RASPRAVA ..................................................................................................... 45

6. ZAKLJUČAK .................................................................................................... 50

7. LITERATURA................................................................................................... 51

1

1. UVOD

1.1. O medu i pčelama

Još od vremena sakupljačkih društava med se koristi u prehrani

čovječanstva. Štoviše, sve dok nije izumljena, a onda i usavršena tehnologija

proizvodnje šećera, med je bio jedino sladilo u ljudskoj prehrani. Ove činjenice

govore u prilog tome da je med oduvijek bio iznimno važna i cijenjena namirnica.

Danas je šećer uvelike zamijenio med kao sredstvo za zaslađivanje, ali med postaje

sve popularniji zbog svojih povoljnih utjecaja na ljudsko zdravlje.

Med jest sladak, gust, viskozni, tekući ili kristalizirani proizvod što ga

medonosne pčele (Apis mellifera L.) proizvode od nektara medonosnih biljaka ili

sekreta živih dijelova biljaka ili izlučevina kukaca koji sišu na živim dijelovima biljaka,

koje pčele skupljaju, dodaju mu vlastite specifične tvari, izdvajaju vodu i odlažu u

stanice saća do sazrijevanja (Anonymus 2009). Prema tome med dijelimo na

nektarni med, kojeg pčele proizvode od nektara, i medljikovac, kojeg proizvode od

medne rose koju izlučuju kukci (najčešće lisne uši) koji se hrane biljnim sokovima.

Nektar je tekućina koju biljke proizvode u nektarijima koji su uglavnom

smješteni unutar cvijeta, ali mogu biti i ekstrafloralni, tj. smješteni izvan cvijeta.

Nektariji mogu biti na cvjetištu ili na organima podrijetlom od lista. Izlučivanje

nektara događa se u nektarijima iz sekretornih stanica. Sastav nektara razlikuje se

ovisno o biljnoj vrsti. Udio šećera je obično oko 40% ali i to može znatno varirati

(Forcone i sur. 1997). Od šećera najzastupljeniji su glukoza i fruktoza, a osim

šećera u manjim su količinama prisutne i aminokiseline, bjelančevine enzimatske i

neenzimatske funkcije, različite organske kiseline, fosfati, vitamini, flavonoidi te

mikroelementi i elementi u tragovima (Heil 2011, Afik i sur. 2008).

U sastavu meda osim nektara kojeg pčele dodatno obogaćuju vlastitim

tvarima nalazi se i pelud. Sastav peludi u medu odražava botaničko ali i geografsko

podrijetlo meda, a ovisi o tome koje se medonosne biljke nalaze u okruženju

košnica. Poznato je da pčele mogu sakupljati nektar i pelud u radijusu od otprilike 5

do 7 kilometara oko košnice, pa pomoću sastava peludnih zrnaca u medu možemo

vidjeti koje medonosne biljke rastu u okruženju košnice. Pčelinja zajednica u

prosjeku donese od 10 do 400 g peludi dnevno. Međutim, u jakoj kestenovoj paši

2

može donijeti i do 2 kg peludi dnevno što znači da za vrijeme kestenove paše

zajednica može prikupiti punih 7-8 okvira tj. 10-15 kg peludi (Šimić 1980).

U komercijalnoj pčelarskoj proizvodnji zastupljena su dva osnovna tipa

košnica. To su nastavljače (Langstroth-Rootove, LR) i lisnjače (Anton- Žnidaričeve,

AŽ) košnice (Slika 1). U oba tipa košnica pčele ulaze kroz otvor koji nazivamo leto.

Razlika između ovih košnica očituje se u tome što se LR košnice otvaraju odozgo te

se uvijek mogu dodavati novi nastavci kako bi se povećala košnica, dok su AŽ

košnice napravljene u obliku ormarića koji ima vrata sa stražnje strane te se njihova

veličina ne može mijenjati. Unutarnja organizacija obaju tipova košnica je jednaka.

Svaki nastavak ispunjen je, ovisno o izradi, najčešće s 10 okvira unutar kojih pčele

izgrade saće od voska kojeg izlučuju iz svojih voštanih žlijezda na zatku. Okvir su

zapravo četiri letvice spojene u obliku pravokutnika između kojih pčele izgrade saće

u dva sloja tako da jedan sloj ima otvore na lijevoj, a drugi na desnoj strani. Stanice

saća u obliku su šesterokuta koji su složeni jedan uz drugog te su nagnuti pod

kutem od 5 do 20° u odnosu na horizontalu kako bi se spriječilo izlijevanje nektara iz

saća (Katalinić i sur. 1968).

Slika 1: Tipovi košnica. LR (tamne s limenim krovom) i AŽ (bijele s šareno obojenim

letima) košnice. (izvor: www.pdz.hr/)

3

Pčele najčešće pelud skladište odvojeno od nektara u tzv. okvire peludnjake

(Slika 2). Međutim kada se većina peludi iz tih okvira potroši pčele postupno počinju

puniti prazne stanice saća nektarom. Manja količina primješane peludi nalazi se i u

nektaru kojeg pčele odlažu u okvire koji su velikom većinom ispunjeni samo

nektarom (Katalinić i sur. 1968).

Slika 2: Okvir peludnjak. Stanice saća ispunjene s peludi žutonarančaste su boje

dok su prazne stanice saća tamnosmeđe. (izvor: www.pdz.hr/)

Kada pčele poklope oko 30% stanica saća ispunjenim medom voštanim

poklopčićima kažemo da je med sazrio te je spreman za vrcanje (Slika 3). Vrcanje

meda je postupak u kojem se okviri na kojima ima meda vade iz košnice, skidaju se

voštani poklopci te se okviri stavljaju u vrcaljku kako bi se iz njih izvadio med.

Vrcaljka je uređaj u kojem se pomoću centrifugalne sile prilikom okretanja okvira s

medom med vadi iz stanica saća (Katalinić i sur. 1968).

Za Hrvatsku su zabilježene ukupno 343 medonosne biljke iz 77 porodica

(Nikolić 2012). Među njima dominiraju Fabaceae s 12,2% i Lamiaceae s 11,7%. U

prvih deset porodica po broju medonosnih biljaka nalaze se još i Rosaceae,

Asteraceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Salicaceae, Apiaceae, Ranunculaceae i

Aceraceae. Međutim, ovakav poredak porodica ne odražava se u sastavu peludi u

medu jer ne proizvode sve biljke jednake količine peludi i nektara pa ih tako i pčele

ne posjećuju jednako rado.

4

Slika 3: Okvir sa saćem ispunjenim medom. Skidanje voštanih poklopaca sa saća

prije vrcanja. U ponekim stanicama saća vide se ostatci peludi iz okvira peludnjaka.

(izvor: www. pdz. hr/)

Medove osim na nektarne i medljikovce, dijelimo i obzirom na botaničko

podrijetlo. Botaničko podrijetlo medova odnosi se na sastav peludnih zrnaca koji

upućuje na to od nektara kojih su biljaka pčele napravile med. Geografsko podrijetlo

medova ukazuje na to da je neki med proizveden npr. u Mediteranskom ili

kontinentalnom području, a može se odrediti na temelju sastav peludnih zrnaca

biljaka koje su karakteristične za određeno područje. Tako prema botaničkom

podrijetlu razlikujemo monoflorne, poliflorne i miješane medove (Anonymus 2000).

Općenito, da bi se neki med mogao nazvati monoflorni mora sadržavati najmanje

45% peludi podrijetlom od iste vrste, no postoje i iznimke:

pitomi kesten (Castanea sativa Miller) 85%

lucerna (Medicago sp.) 30%

ružmarin (Rosmarinus officinalis L.) 30%

lipa (Tilia sp.) 25%

kadulja (Salvia sp.) 20%

bagrem (Robinia pseudoacacia L.) 20%

lavanda (Lavandula sp.) 20%.

5

Poliflorni med podrijetlom je od različitih biljnih vrsta, a ne može se ni po kojoj

svrstati u kategoriju monoflornog meda (ovdje spadaju cvjetni i livadni medovi).

Miješani med jest mješavina nektarnog meda i medljikovca (Anonymus 2000).

Pelud u medu po svojoj se zastupljenosti dijeli u četiri skupine:

jako učestala ili predominantna (više od 45%)

učestala ili sekundarna (16-45%)

rijetka ili bitna sporedna (3-15%)

sporadična (manje od 3%).

U Hrvatskoj se proizvoni desetak sorata medova među kojima su najpoznatiji

bagremov, kestenov, lipov, amorfin, zlatošipkin, kaduljin, ružmarinov, dračin, repičin,

suncokretov, livadni, cvjetni itd. Osim meda postoje i drugi proizvodi koje možemo

dobiti od pčela. To su prvenstveno propolis, cvjetni prah odnosno pelud, pčelinji

vosak, matična mliječ i pčelinji otrov. No najveća vrijednost pčela zapravo je njihova

uloga u oprašivanju biljaka.

1.2. Palinologija

Palinologija je grana botanike koja se bavi proučavanjem fosilne i recentne

peludi, spora biljaka i gljiva, algalnih cisti te mikroskopskih dijelova biljaka. Proučava

njihovu strukturu, oblik, rasprostranjivanje i preživljavanje u različitim uvjetima

okoliša.

1.2.1. Opći pojmovi

Pojmovi pelud i polen dolaze od grčke riječi „palíno“ (παλύνω) što znači

posipati odnosno latinske riječi „pollen“ što znači prah, a u hrvatskom se jeziku

koriste kao istoznačnice. Jednostanična peludna zrnca nazivaju se i mikrospore, a

nakon prve mitotičke diobe razvijaju se u reducirani muški gametofit. Taj gametofit

odgovoran je za nastajanje muških gameta koje nakon spajanja s jajnom stanicom

iste biljne vrste tvore zigotu iz koje će se razviti nova jedinka.

Unutar biljnoga carstva postoji izmjena generacija kod svih organizama (Slika

4). Izmjenjuju se dvije generacije koje nazivamo gametofit i sporofit.

6

Gametofit je spolna generacija koja ima haploidan (n) broj kromosoma i na

njoj se mitotičkom diobom razvijaju gamete koje nakon oplodnje formiraju embrio

(2n) s kojim započinje razvoj sporofita, nespolne generacije. Sporofit, koji je po

kromosomskom sastavu diploidan (2n), u sporangijima, nespolnim rasplodnim

organima, stvara mejotičkom diobom haploidne (n) spore iz kojih se ponovo razvija

spolna generacija tj. gametofit. Prema tome, jednostanično peludno zrnce zapravo

je haploidna spora koja nakon prve mitotičke diobe postaje muški gametofit. Unutar

muškog gametofita razvija se, između ostalog, spermalna stanica koja nakon što se

spoji s jajnom stanicom završava haploidnu fazu gametofita i ponovo tvori diploidnu

fazu tj. sporofit.

Slika 4: Shematski prikaz izmjene generacija kod biljaka. (vlastiti crtež)

Peludna se zrnca razvijaju unutar antera prašnika kod golosjemenjača i

kritosjemenjača. Prašnici su preobraženi listovi sjemenjača koji se najčešće sastoje

od dva dijela, tj. drška (filamenta) i prašnice (antere). Prašnica se sastoji od

peludnica (polenovnica) unutar kojih se mejotičkom diobom razvijaju peludna zrnca,

tj. mikrospore. Unutar polenovnice nalazi se sporogeno tkivo (arhespor) iz kojeg

nastaju peludna zrnca. Arhespor je obavijen tapetumom koji služi za prehranu

peludnih zrnaca, izlučivanje kaloze, proizvodnju peludnog ljepila te proizvodnju

proteinskih viscinskih niti i trifina. Iznad tapetuma nalaze se još i parenhimski

međusloj, vlaknati sloj (endotecij) koji služi za otvaranje polenovnica nakon

sazrijevanja peludi te vanjska epiderma antere.

7

Sporogeno tkivo ili arhespor zapravo je nakupina matičnih stanica koje, da bi

od njih nastala peludna zrnca, prolaze kroz mejotičku diobu. Prilikom te diobe,

stanice koje nastaju ostaju priljubljene jedna uz drugu te tvore tetradu. Formiranje

tetrade događa se zato što se četiri novonastale stanice peludnih zrnaca

(mikrosporocite) nalaze unutar kalozne stijenke sporogene matične stanice. Još

unutar kalozne ovojnice dolazi do formiranja stijenke peludnih zrnaca. Najprije se

formira celulozna primarna eksina koja služi kao kalup oko kojeg se odlaže

sporopolenin kojeg stvara sama stanica peludnog zrnca. Taj se sporopolenin zatim

zamjenjuje sporopoleninom kojeg produciraju stanice tapetuma, nakon čega dolazi

do razgradnje kalozne ovojnice oko tetrade. Po razgradnji kaloze ispod

sporopoleninske ovojnice koja predstavlja eksinu stvara se glikoproteinski sloj,

intina. Povezanost četiriju stanica u tetradi rezultatira nastajanjem ožiljaka na

mjestima dodira koji se vide nakon odvajanja stanica iz tatrade prilikom sazrijevanja

peludnih zrnaca. Prije samog otvaranja prašnica jednostanična peludna zrnca

prolaze kroz mitotičku diobu te postaju muški gametofit. Nakon procesa

dehidratacije dolazi do otvaranja prašnica te su dvo- odnosno trostanična peludna

zrnca spremna za rasprostranjivanje (Mitić 2011).

Peludna se zrnca, kako bi se zatvorio životni ciklus biljke, moraju naći na

mikropili sjemenog zametka golosjemenjača odnosno njuški tučka kritosjemenjača.

U tu svrhu evolucijski se razvio čitav niz prilagodbi za rasprostiranje peludnih zrnaca

odnosno za oprašivanje. Oprašivanje je proces prijenosa peludi na njušku tučka

odnosno mikropilu sjemenog zametka. Oprašivanje se može događati vjetrom

(anemofilija), vodom (hidrofilija), kukcima (entomofilija), pticama (ornitofilija),

šišmišima (hiropterofilija) itd.

Ovisno o načinu na koji se pelud pojedine biljke rasprostranjuje mijenja se

njegova morfologija. Tako je npr. pelud anemofilnih biljaka sitan, gladak, suh i

najčešće okrugao što mu olakšava lebdjenje u zraku. Nasuprot tome, peludna

zrnaca biljaka koje se oprašuju kukcima ili nekim drugim životinjama, najčešće su

većih dimenzija, imaju raznolike površinske strukture te su više ili manje ljepljiva

kako bi se spriječili ili barem smanjili gubitci tijekom transporta (Mitić 2011).

8

1.2.2. Građa peludnog zrnca

Višestanično peludno zrnce, tj. reducirani muški gametofit sastoji se od

nekoliko stanica i stijenke koja ih obavija. Muški gametofit kritosjemenjača u

konačnici se sastoji od samo tri stanice (dvije spermalne stanice i stanica peludne

mješinice), dok je gametofit golosjemenjača manje reduciran. On se sastoji od jedne

do nekoliko protalijskih stanica, stanice peludne mješinice, stanice drška te dvije

spermalne stanice.

Stijenka peludnog zrnca građena je od dva sloja (Slika 5). Unutarnji sloj

građen od celuloze, pektina, kaloze i proteina naziva se intina, dok je vanjski sloj

građen od sporopolenina i polisaharida te se naziva eksina. Sporopolenin je polimer

karotenoida i karotenoidnih estera koji se raspada tek pri temperaturi od 500°C te

daje iznimnu čvrstoću peludnim zrncima. Eksinu dalje dijelimo na neksinu i seksinu.

Neksina se nalazi uz intinu te se iznad nje nalazi seksina koja je odgovorna za

različitu skulpturiranost peludnih zrnaca.

Slika 5: Shematski prikaz građe stijenke peludnog zrnca. (prilagođeno prema

Moore i Webb 1978)

Osnovna literatura u proučavanju i opisivanju karakteristika peludnih zrnaca

je udžbenik Moore i Webb (1978) te rječnici Hesse i sur. (2009), Punt (1994) te

Faegri i Iversen (1989).

9

1.2.3. Klasifikacija peludnih zrnaca

Peludna su zrnca trodimenzionalne čestice okruglog do ovalnog oblika.

Razlikuju se po broju, položaju i tipu apertura (otvora kroz koje klije peludna

mješinica), izgledu površine stijenke, obliku te veličini.

Postoje dva osnovna tipa apertura, pore (porus) i brazde ili kolpe (colpus).

Prema tome, peludna zrnca dijelimo na poratna, kolpatna i kolporatna (ukoliko imaju

oba tipa apertura) te inaperturatna ako uopće nemaju vidljivih apertura (Hesse i sur.

2009). Aperture mogu biti smještene u jednoj (ekvatorijalnoj) ravnini ili se mogu

nalaziti razbacane po cijeloj površini peludnog zrnca. Ukoliko su aperture smještene

u jednoj ravnini nazivu peludnog zrnca dodajemo prefiks zono-, a prefiks panto-

dodajemo ako su aperture smještene po cijeloj površini peludnog zrnca. Ovisno o

tome koliko se apertura nalazi na peludnom zrncu, nazivu dodajemo prefiks mono-

za jednu, di- za dvije, tri- za tri, tetra- za četiri, penta- za pet, heksa- za šest te poli-

za sedam i više apertura (Tablica 1). Tako npr. rod Corylus (lijeska) ima

trizonoporatna, rod Acer (javor) trizonokolpatna, rod Tilia (lipa) trizonokolporatna, a

rod Chenopodium (loboda) polipantoporatna peludna zrnca.

Tablica 1: Shematski prikaz i primjer imenovanja peludnih zrnaca obzirom na broj,

položaj i tip apertura. Lijevi crtež prikazuje polarni, a desni ekvatorijalni pogled na

peludno zrnce. (prilagođeno prema Moore i Webb 1978)

Di- Tri- Tetra- Penta- Heksa- Poli-

zonoporatno

zonokolpatno

zonokolporatno

pantoporatno

pantokolpatno

pantokolporatno

10

Peludna zrnca mogu biti polarna i apolarna. Kod polarnih možemo razlikovati

proksimalni i distalni pol dok kod apolarnih to nije moguće (Slika 6). Polarna peludna

zrnca mogu bit izopolarna (oba pola jednaka) ili heteropolarna (polovi se razlikuju),

te možemo razlikovati polarnu i ekvatorijalnu os (Hesse i sur. 2009).

Slika 6: Shematski prikaz tetrade peludnih zrnaca. (prilagođeno prema Frenguelli i

sur. 1991)

Skulpturiranost eksine također je vrlo važna za klasifikaciju peludnih zrnaca.

Ona je rezultat različitih morfoloških karakteristika seksine. Seksina je građena od

kolumela iznad kojih se nalazi tektum, a takva se pelud naziva tektatna (Frenguelli

2003). Tektum ponekad može i izostati ili biti tek djelomično prisutan pa govorimo o

intektatnim odnosno semitektatnim peludnim zrncima (Slika 7).

Slika 7: Klasifikacija peludnih zrnaca obzirom na građu tektuma. (prilagođeno

prema Frenguelli 2003)

11

Kod tektatnih i semitektatnih tipova, kolumele mogu biti povezane na različite

načine te tako tvore različite uzorke skulpturiranosti (Slika 8). Ako su povezane u

dva smjera dobiva se mrežasti uzorak – retikulum. Stijenke retikuluma nazivaju se

muri, a udubine između njih lumina. Strijatni (isprugan, izbrazdan) uzorak nastaje

kada su muri i lumina međusobno paralelni. Rugulatni uzorak je međuoblik

mrežastog i strijatnog peludnog zrnca (Hesse i sur. 2009). Kad nema tektuma,

umjesto kolumela dolazit će brojni drugačiji oblici: bakule (valjkastog oblika), klave

(kijačastog oblika), pili (oblik sa glavičastim vrškom), geme (pupoljastog oblika),

bradavice, skabre (ljuskasti oblik) ili zrnca (Hesse i sur. 2009).

Slika 8: Shematski prikaz tipova skulpturiranosti eksine. (prilagođeno prema

Frenguelli i sur. 1991)

Postoji nekoliko tipova podjela peludnih zrnaca po obliku. Možemo ih

razlikovati prema izgledu polarnog odnosno ekvatorijalnog pogleda ili prema omjeru

duljina polarne i ekvatorijalne osi (usp. Slika 6). Što je omjer između duljine polarne

(P) i ekvatorijalne (E) osi veći peludna su zrnca izduženija u smjeru polarne osi, a

12

što je omjer manji zrnca su izduženija u smjeru ekvatorijalne osi. Prema tome

razlikujemo sljedeće kategorije peludnih zrnaca:

P/E > 2 perprolatna

P/E = 2.00 – 1.34 prolatna

P/E = 1.33 – 1.15 subprolatna

P/E = 1.14 – 1.01 prolatno-sferoidalna

P/E = 1 sferična

P/E = 0.99 - 0.89 oblatno-sferoidalna

P/E = 0.88 - 0.76 suboblatna

P/E = 0.75 - 0.50 oblatna

P/E < 0.50 peroblatna

Osim po obliku, peludna se zrnca razlikuju i po veličini. Većina biljaka ima

pelud veličine od 2 do 300 µm, no postoje i iznimke. Pelud promjera manjeg od 10

μm smatra se vrlo sitnom, od 10 do 24 μm sitnom, od 25 do 49 μm srednje velikom,

velika peludna zrnca su promjera od 50 do 99 μm, a vrlo velika zrnca su ona

promjera od 100 do 200 μm. Zrnca veća od 200 μm nazivaju se divovska (Frenguelli

2003).

1.2.4. Primjena analize peludi

Unatoč sitnim dimenzijama, peludna su zrnca vrlo otporna na okolišne uvjete

pa je njihova iskoristivost u različitim znanstvenim disciplinama i strukama poprilično

česta. Pelud je između ostalog predmet istraživanja u aerobiologiji,

melisopalinologiji, forenzici, paleopalinologiji, polinacijskoj ekologiji te mnogim

drugim znanstvenim disciplinama.

Melisopalinološka istraživanja imaju mnogostruku primjenu u analizama

meda ali svoje rezultate mogu, osim u biologiji, koristiti i u drugim znanstvenim

disciplinama. Osim određivanja botaničkog i geografskog podrijetla meda, ovakva

istraživanja mogu se kombinirati s različitim kemijskim, fizikalnim i sličnim

istraživanjima te se rezultati mogu tumačiti s različitih aspekata. Osim u medu

peludna se zrnca mogu proučavati i u drugim pčelinjim proizvodima (prvenstveno

pelud, ali i pčelinji vosak i propolis) te se na taj način može potvrditi ili opovrgnuti

njihovo geografsko podrijetlo.

13

1.3. Atomska emisijska spektrometrija uz induktivno spregnutu plazmu

1.3.1. Opći pojmovi

Atomska emisijska spektrometrija (AES), uz atomsku apsorpcijsku

spektrometriju (AAS) i atomsku fluorescencijsku spektrometriju (AFS), jedna je od

tehnika analitičke spektrometrije kojom se podaci dobivaju iz atomskih spektara u

optičkom dijelu elektromagnetskog spektra. Optički dio predstavljaju ultraljubičasti

(UV), vidljivi (VIS) i bliski infracrveni (NIR) dio spektra. Atomski spektri posljedica su

pojave da pobuđeni elektroni u atomima ili jednoatomnim ionima emitiraju zračenje

određene valne duljine prilikom povratka iz pobuđenog u osnovno stanje. Navedene

tehnike atomske spektrometrije široko se primjenjuju za kvalitativno i kvantitativno

određivanje sadržaja različitih elemenata u uzorcima. Kvantitativne informacije, koje

pokazuju sadržaj analita, proizlaze iz intenziteta apsorpcije ili emisije

elektromagnetskog zračenja. Kvalitativna analiza, kojom se određuje prisutnost

određenog analita ili skupine analita u uzorku, opisuje se prisutnim valnim duljinama

na kojima se zbiva apsorpcija ili emisija (Boss i Fredeen 1999).

1.3.2. Načela rada metode

Temeljni procesi u atomskoj emisijskoj spektrometriji uz induktivno spregnutu

plazmu (engl. Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry, ICP-

AES) uključuju tri osnovna koraka. Ti koraci su redom: atomizacija uzorka tj.

stvaranje atoma, pobuđivanje i emisija. Atomizacija se postiže visokotemperaturnim

izvorima koji su u emisijskim metodama ujedno i izvori pobuđivanja vanjskih

elektrona u elektronskom omotaču atoma ili iona. Postoje tri osnovna tipa

ekscitacijskih izvora koji se koriste u atomskoj emisijskoj spektrometriji. To su

plamen, plazma i električna izbijanja. Mogućnost određivanja pojedinih elemenata

ovisi i o temperaturama koje se postižu u tim izvorima (Boumans 1987).

Plazma je, po definiciji, bilo koji oblik tvari koji sadrži značajniju količinu (>1%)

elektrona i pozitivnih iona kao i neutralne atome, radikale i molekule. Do ionizacije

kod ovog eksitacijskog izvora dolazi na slijedeći način: inertni plin, argon, usmjeren

je kroz plamenik koji se sastoji od tri koncentrične cijevi izrađene od kvarca. Oko

vrha plamenika omotana je bakrena zavojnica koja je spojena na radiofrekvencijski

(RF) generator (Slika 9).

14

Slika 9: Shema i slika plamenika u kojem nastaje induktivno spregnuta plazma.

(prilagođeno prema Boumans 1987)

Primjenom RF generatora (obično snage 700-1500 W) dolazi do oscilacije

izmjenične struje unutar zavojnice. Frekvencija osciliranja odgovara frekvenciji

generatora i obično iznosi 27 ili 40 MHz. Oscilacija struje u zavojnici uzrokuje

električno i magnetsko polje u okolini bakrene zavojnice. Prilikom protoka argona,

iskra iz Tesline zavojnice uzrokuje izlazak elektrona iz argonovih atoma. Ti se

elektroni zatim ubrzavaju u magnetskom polju. Takvo povećanje kinetičke energije

elektrona naziva se induktivno sprezanje. Elektroni visoke energije sudaraju se s

atomima argona te iz njih izbijaju nove elektrone. To dovodi do kaskadne reakcije te

se napokon formira plazma koja se sastoji od atoma argona, elektrona i iona

argona. Plazma je vrlo intenzivne, blistavo bijele boje i toroidalnog oblika.

Temperatura nije jednaka na svim dijelovima plazme, proteže se od 6000 do 10000

K, a najveća je u jezgri (Boss i Fredeen 1999, Skoog i sur. 1999, Thompson i Walsh

1983). Kraj plazme stožastog je oblika te sliči plamenu.

Uzorci se u plazmu uvode u obliku otopina te se u tom obliku moraju i

pripremiti. Tekući uzorak se pomoću pumpe uvodi u raspršivač koji prevodi uzorak u

aerosol (koloidne čestice krutine ili tekućine raspršene u plinu). Argon nosi aerosol

uzorka kroz komoru za raspršivanje u središte plazme gdje molekule otapala

isparavaju te u plazmi preostaju mikroskopske čestice soli. Nakon toga slijedi

prijelaz čestica soli u plinovito stanje djelovanjem visoke temperature i njihova

atomizacija. Ti procesi se događaju u zoni zagrijavanja. Zatim slijede procesi

15

pobuđivanja i ionizacije koji se zbivaju u zoni zračenja i normalnoj analitičkoj zoni

plazme. Sudarom elektrona visoke energije i atoma analita nastaju ioni i dolazi do

pobuđivanja elektrona u atomima analita. Normalna analitička zona plazme je

područje u kojem se provodi spektralno promatranje tj. mjerenje emisije analita, jer u

tom području prevladava lokalna termička ravnoteža (Boss i Fredeen 1999).

O načinu promatranja analitičke zone ovisi način mjerenja. Prvi način je pri

aksijalnom položaju plamenika kod kojeg je plamenik postavljen horizontalno, a

analitičku zonu promatramo s vrha plazme. Zračenje prolazi duž cijele osi počevši

od inicijalne zone zračenja, normalne analitičke zone i vrha plazme nakon čega

ulazi u optički dio instrumenta. Drugi način je pri radijalnom položaju plamenika gdje

je plamenik namješten okomito, a zona se promatra sa strane. Zračenje se skuplja

na točno određenoj visini, najčešće u položaju od 12-16 mm iznad ruba zavojnice

gdje većina elemenata postiže svoj maksimum emisije. Aksijalni položaj

karakteriziran je većom osjetljivošću i većim vrijednostima intenziteta dok je za

radijalni značajno da se signal skuplja iz čitave normalne analitičke zone i ima

manje lutajućeg zračenja (Boss i Fredeen 1999).

1.3.3. Primjenjivost metode

ICP-AES se primjenjuje u analizi uzoraka različitog podrijetla. Mogu se

analizirati voda, zrak, geološki i biološki uzorci te industrijski proizvedeni materijali.

Tekućina, krutina i plin uspješno se uvode u ICP-AES sustav. Većina uzoraka koji

se analiziraju u ICP-u priprema se u obliku vodenih otopina, odnosno kiselih

vodenih otopina. Pri analizi uzoraka gdje se element nalazi u organskoj matrici

priprema teče na način da se spaljivanjem ili razaranjem prevede u anorgansku

matricu. Najčešće korišteni i najdjelotvorniji postupak je mikrovalno razaranje koje

različite tipove uzoraka prevodi u otopinu spremnu za uvođenje u instrument.

Prednost pred drugim postupcima daju joj visoka temperatura, povećani tlak,

zatvorene posude za razaranje, razaranje kiselinama koje skraćuje vrijeme

postupka, manje količine kiselina i zadržavanje hlapljivih elemenata (Sneddon

1998).

Glavna prednost ICP-AES tehnike je to što se veliki broj elemenata

kvalitativno i kvantitativno može odrediti u velikom koncentracijskom rasponu. To

proizlazi iz činjenice da su sve emisijske linije emitirane istovremeno.

16

ICP-AES je multielementna tehnika čije su detekcijske granice reda μg L-1,

odnosno μg kg-1 (ppb). Detekcijsku granicu definiramo kao najmanju koncentraciju

kod koje možemo sigurno ustvrditi da je prisutan određeni element u uzorku, a

mjerenja blizu detekcijske granice ne smatraju se kvantitativna. Preciznost i točnost

dovoljne su za većinu analiza na razini prisutnosti elemenata u tragovima.

Preciznost je obično ispod 1% relativne standardne devijacije (RSD) kada je

koncentracija analita sto puta veća od detekcijske granice, dok točnost ovisi o

sličnosti referentnih standarda s uzorkom te se za većinu metoda kreće u granicama

do 10%.

Također, prednost ove tehnike je da ima ponajmanje poteškoća s

interferencijama od svih atomskih spektometrijskih tehnika. Postoji nekoliko vrsta

interferencija od kojih razlikujemo kemijske, fizikalne, spektralne i memorijske (Boss

i Fredeen 1999, Thompson i Walsh 1983).

Efekt matrice spada u glavni tip interferencija. Efekti matrice mogu nastati

kod procesa raspršivanja, uvođenja uzoraka i u samoj plazmi. Dolazi do povećanja

ili smanjenja intenziteta signala analita kojeg uzrokuje neodgovarajuća koncentracija

npr. neke anorganske kiseline ili velika koncentracija nekog elementa. Glavni

elementi koji se lagano ioniziraju (kao što su Na, K, Mg, Ca) imaju karakterističan

efekt na elemente u tragovima i povećanje ili smanjenje koncentracije ovisno o

elementu. Efekt matrice nije zanemariv, a može se smanjiti dodatkom jednake

koncentracije reagensa prisutnog u uzorku i u standardne otopine ili metodom

dodatka standarda (Thompson i Walsh 1983).

1.4. Prigušena ukupna refleksija

1.4.1. Opći pojmovi

Infracrveni (IR) dio spektra zračenja odnosi se na valne duljine od 780 nm do

1 mm odnosno valne brojeve od 12800 do 10 cm-1 (valni broj jednak je recipročnoj

vrijednosti valne duljine). Infracrveni se dio spektra dijeli na blisko, srednje i daleko

infracrveno područje. Blisko infracrveno područje (NIR) proteže se od 12800 do

4000 cm-1, a za njega su karakteristične vibracijske vrpce molekula i elektronski

prijelazi. Za srednje infracrveno područje (MIR) karakteristične su vibracije molekula

s tim da je područje od 4000 do 400 cm-1 područje funkcionalnih skupina, a ispod

17

400 cm-1 nalazi se područje „otiska prsta“ (fingerprint region) karakteristično za

pojedinu molekulu. Za daleko infracrveno područje (FIR) koje obuhvaća područje od

400 do 10 cm-1 karakteristične su vibracijske i rotacijske vrpce molekula (Skoog i

sur. 1999).

Nama najzanimljivije područje jest srednje infracrveno područje, i to onaj dio

koji se odnosi na područje funkcionalnih skupina, a vezano je uz vibracije molekula.

Ono što možemo u ovome dijelu spektra promatrati su vibracije istezanja (streching)

i vibracije savijanja (bending) koje uzrokuju promjene kuta između kemijskih veza.

Da bi molekula bila aktivna u ovome području nužno je da tijekom vibracije dolazi do

promjene dipolnog momenta molekule. Prilikom toga, ukoliko frekvencija takvog

anharmoničkog oscilatora u molekuli odgovara frekvenciji elektromagnetnog

zračenja, dolazi do interakcije s električnim poljem elektromagnetskog zračenja i

apsorpcije energije. Ta apsorpcija energije rezultira stvaranjem vrpce odgovarajuće

širine koja se onda registrira u spektru (Skoog i sur. 1999).

Glavni dijelovi instrumenta za snimanje IR spektara su izvor zračenja, optički

sustav i detektor. Kao izvor infracrvenog zračenja mogu se koristiti Nerstov štapić

(užareni komadić keramike), Globarov izvor (silicijev karbid), živin luk, CO2 laser itd.

Filtri i monokromatori zračenja koji se upotrebljavaju u ovakvim uređajima mogu biti

prizme (od NaCl ili KBr), refleksijske rešetke te interferencijski i klinasti filtri.

Detektori koji se upotrebljavaju su termočlanak, bolometar, piroelektrični detektor i

dr. Svi ovi detektori funkcioniraju kao izuzetno osjetljivi termometri za mjeranje IR i

toplinskog zračenja.

1.4.2. Načela rada metode

Poseban oblik infracrvene spektroskopije je prigušena ukupna refleksija

(Attenuated Total Reflection – ATR). Metoda se temelji na činjenici da se refleksija

zračenja događa prilikom prelaska zračenja iz gušćeg u rjeđi medij. Poznato je da

se udio zračenja koji se pritom reflektira povećava s povećanjem upadnog kuta ali

samo do određene vrijednosti iza koje nastupa potpuna refleksija. Taj kut se naziva

granični kut totalne refleksije. Međutim, dokazano je teorijski i eksperimentalno da

tijekom refleksije zračenje malo prodire u rjeđi medij prije nego nastupi refleksija.

Dubina do koje to zračenje prodire u rjeđi medij ovisi o valnoj duljini upadnog

18

zračenja, indeksima loma gušćeg i rjeđeg sredstva te kutu loma zračenja. Prilikom

prodiranja zračenja u rjeđe sredstvo dio se zračenja u njemu apsorbira. Pošto

uređaj funkcionira na principu da je to rjeđe sredstvo uzorak kojem želimo snimiti

spektar apsorbiranog zračenja, kao rezultat na detektoru se očitava apsorpcijska

vrpca karakteristična za dotični uzorak (Atkins i de Paula 2005).

1.4.3. Primjenjivost metode

Kod ATR spektroskopije apsorbancija uzorka ovisi o sastavu uzorka te kutu

upadne zrake, dok debljina sloja uzorka na nju nema utjecaja. Dakle, važno je samo

da uzorak nanesemo tako da prekrije cijelu površinu pločice jer zračenje prodire

svega nekoliko mikrometara u uzorak. Uzorci kojima se može snimati ATR spektar

mogu biti različite tekućine, vlakna, tkiva biljnog i animalnog podrijetla, paste,

suspenzije, prah itd.

1.5. Dosadašnja istraživanja

Prva sustavna palinološka istraživanja u svijetu počela su u Skandinaviji

početkom 19. stoljeća. Međutim, ti znanstveni radovi nisu bili pisani na nekom od

svjetskih jezika te je razvoj istraživanja tekao sporo. Tek početkom 20. stoljeća,

kada su se radovi skandinavskih palinologa počela objavljivati na engleskom jeziku

te su se metode počele širiti najprije Europom, a zatim i ostatkom svijeta (Moore i

Webb 1978).

Palinološka istraživanja u Hrvatskoj počela su sedamdesetih godina

dvadesetog stoljeća te su se uglavnom svodila na palinotaksonomska proučavanja

biljnih populacija, determinaciju vrsta na temelju morfologije peludi te aerobiološke

analize (Volarić-Mršić 1970, Bedalov 1985, Lovašen-Eberhardt i sur. 1987).

Današnja istraživanja uglavnom su usmjerena na palinomorfološka istraživanja

(Mitić i Halbritter 2008), aerobiološke studije (Hrga i sur. 2009) i melisopalinološka

istraživanja (Svečnjak i sur. 2011, Kenjerić i sur. 2008). Melisopalinološka

istraživanja u pravilu se kombiniraju s nekim oblikom kemijskog istraživanja.

Općenito, i u svjetskim razmjerima, samostalna melisopalinološka istraživanja

su rijetka. Mnogo se češće takva istraživanja kombiniraju s raznim kemijskim

analizama uzoraka meda. Od kemijskih analiza najčešće se provodi određivanje

sadržaja i sastava šećera, udjela vode, određivanje pH i električne provodnosti

19

(Atrouse i sur. 2004, Serrano i sur. 2004). Rjeđe se provodi i spektrometrijsko

određivanje boje, aktivnosti enzima dijastaze i glukoza oksidaze te sadržaja

hidroksimetilfurfurala (Serrano i sur. 2004). Također, u nekim istraživanjima provodi

se i određivanje sadržaja teških metala, mikroelemenata i elemenata u tragovima

(Stankovska i sur. 2008, Tuzen i sur. 2007, Bratu i Georgescu 2005, Tuzen i Soylak

2005). Osim toga provode se i snimanja infracrvenih spektara uzoraka meda

(Svečnjak i sur. 2011).

20

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Obzirom na to da su dosadašnja istraživanja hrvatskih medova malobrojna i

mnogo toga još nije poznato, postojalo je mnogo mogućnosti za istraživanje ove

tematike. Imajući na umu veličinu uzorka i mogućnosti provedbe eksperimentalnog

dijela, izabrani su glavni ciljevi ovog rada:

1. provesti palinološku analizu uzoraka meda te analizirati botaničko podrijetlo

medova

2. utvrditi sadržaj odabranih metala i nemetala u medu

3. komparacijom ATR spektara utvrditi moguće razlike u sastavu uzoraka meda

4. odrediti postoji li korelacija između sadržaja izabranih metala i nemetala sa

sastavom peludnih zrnaca u medu

21

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Uzorci meda

Istraživanje je provedeno na 25 uzoraka meda proizvedenog 2011. godine.

Od ukupnog broja uzoraka njih 24 potječe iz sjeverozapadne Hrvatske, a jedan je

uzorak iz Dalmacije (uzorak 12M koji je poslužio kao kontrola). Tablica 2 prikazuje

podatke o uzorcima koji su zabilježeni prilikom prikupljanja. Uzorci meda prikupljeni

su direktno od pčelara te je svaki pčelar dao onoliko uzoraka koliko je sorata meda

proizveo te godine.

Tablica 2: Popis i opis uzoraka meda.

Uzorak Zaprimljen kao Boja Uskladišteno

u Lokacija Županija

1C cvjetni smeđecrvena aluminij /

inox Ribnik Karlovačka

1B bagremov crvenkastožuta aluminij /

inox Ribnik Karlovačka

1K kestenov smeđecrvena aluminij /

inox Ribnik Karlovačka

2C cvjetni svijetložuta lim / inox Rešetari Brodsko-posavska

2B bagremov zlatnožuta lim / inox Rešetari Brodsko-posavska

2S medljikovac tamnosmeđa lim / inox Rešetari Brodsko-posavska

3C cvjetni žutosmeđa lim Žunci, Vrbovec Zagrebačka

3B bagremov svijetložuta lim Žunci, Vrbovec Zagrebačka

4K kestenov smeđecrvena inox Bregana Zagrebačka

4Z zlatošipkin smeđecrvena inox Bregana Zagrebačka

5CB cvjetni i

bagremov žutosmeđa lim / inox Slavetić,

Jastrebarsko Karlovačka

5B bagremov žutosmeđa lim / inox Slavetić, Jastrebarsko

Karlovačka

6C cvjetni smeđecrvena plastika Vukomeričke Gorice

Zagrebačka

6B bagremov zlatnožuta plastika Vukomeričke Gorice

Zagrebačka

7B bagremov svijetložuta lim Čučerje Grad Zagreb

7K kestenov smeđecrvena lim Čučerje Grad Zagreb

8B bagremov svijetložuta plastika Hraščina, Trgovišće

Krapinsko-zagorska

22

Nastavak Tablice 2.

8K kestenov smeđecrvena lim Hraščina, Trgovišće Krapinsko-zagorska

9CB cvjetni i bagremov zlatnožuta plastika Šestine Grad Zagreb

9K kestenov smeđecrvena plastika Šestine Grad Zagreb

10B bagremov svijetložuta aluminij Bednja Varaždinska

11B bagremov svijetložuta lim Virovitica Virovitičko-podravska

12M livadni zlatnožuta plastika otok Žirje Šibensko-kninska

13B bagremov zlatnožuta staklo Marinovec, Zelina Zagrebačka

14A amorfin crvenkastožuta lim Novska Sisačko-moslavačka

Uzorci su pohranjeni u staklene bočice zapremine 250 mL što odgovara masi

od otprilike 450 grama. Bočice su zaklopljene plastičnim čepovima te su pohranjene

na tamnom i prozračnom mjestu pri sobnoj temperaturi do trenutka kada su uzorci

obrađivani.

3.2. Palinološka analiza

3.2.1. Priprema preparata

Da bi palinološka analiza uopće bila moguća potrebno je napraviti

mikroskopske preparate na kojima će se prebrojavati peludna zrnca. Za pripremu

preparata u tarirane plastične epruvete za centrifugiranje odvagano je otprilike 10

grama meda koji je prethodno miješan staklenim štapićem oko 1 minute kako bi se

dobila homogena smjesa. Zatim dodamo 20 mililitara destilirane vode te miješanjem

pomoću staklenog štapića uzorak u potpunosti otopimo. Tako pripremljenu

homogenu otopinu centrifugiramo 15 minuta pri 3700 okretaja u minuti. Nakon

centrifugiranja dobijemo talog u kojem su peludna zrnca i supernatant kojeg

uklonimo pomoću pipete, pazeći pritom da ostavimo otprilike 1 kap tekućine u kojoj

ćemo resuspendirati peludna zrnca iz taloga. Prethodno obilježeno predmetno

stakalce postavimo na komad papira na kojemu smo iscrtali dva kvadrata dimenzija

22 x 22 milimetra. Talog resuspendiramo pomoću plastične eze te ga nanesemo na

stakalce tako da imamo po dvije replike na svakome stakalcu. Tako pripremljena

stakalca u vodoravnom položaju stavimo u sušionik da se suše oko 10 minuta pri

temperaturi od 45°C. Kada se uzorci na stakalcima osuše na pokrovno stakalce

23

kapne se 1 kap gelvatola te se pokrovno stakalce oprezno spusti na mjesto gdje se

nalaze peludna zrnca. Gelvatol je tržišni naziv za smjesu koja se koristi za bojanje i

fiksiranje peludnih zrnaca, a sastoji se od polivinilnog alkohola gelvatola kojemu se

doda destilirana voda, fenol, glicerin i bazični fuksin koji služi kao boja. Preparate

zatim ostavimo da stoje otprilike 24 sata kako bi se istisnuo zrak ispod pokrovnog

stakalca te da bi se peludna zrnca obojila. Nakon toga preparati su spremni za

determinaciju i prebrojavanje.

3.2.2. Determinacija i prebrojavanje peludnih zrnaca

Prebrojavanje i determinacija peludnih zrnaca provedena je prema protokolu

kojeg su u svome radu dali Von der Ohe i sur. (2004). Na svakom je preparatu

prebrojavano po 300 peludnih zrnaca (Anonymus 2009). Prebrojavanje i

determinacija provedeni su pri povećanju od 400x na svjetlosnom mikroskopu Nikon

Eclipse E200. Peludna zrnca determinirana su uglavnom do razine porodice ili roda

dok su ona specifična determinirana do razine vrste. Za determinaciju je korišten

priručnik Von der Ohe i Von der Ohe (2000) te referentna zbirka peludnih zrnaca.

3.3. Kemijska analiza

Za određivanje sadržaja elemenata pomoću atomske emisijske

spektrometrije uz induktivno spregnutu plazmu potrebno je imati bistru otopinu

dobivenu razgradnjom uzorka. Za razaranje uzoraka meda isprobane su dvije

metode. Kjeldahlova razgradnja, tj. razaranje pomoću koncentrirane sumporne i

dušične kiseline te mikrovalna razgradnja pomoću dušične kiseline i vodikovog

peroksida. Prikladnija metoda za razgradnju uzoraka meda pokazala se mikrovalna

razgradnja te su svi uzorci obrađeni po toj metodi. Kao kontrola za mjerenja korišten

je standard NIST SRM 1571 (orchard leaves), za koji je specificiran sadržaj

elemenata čije smo koncentracije mjerili u uzorcima meda. Kontrolni uzorci prošli su

potpuno isti postupak kao i uzorci meda. Također, svim su uzorcima snimljeni i ATR

spektri.

3.3.1. Kemikalije i uređaji

U eksperimentalnom radu korištene su kemikalije pro analysis (p.a.) kvalitete.

Korišteni su 65%-tna dušična kiselina – HNO3 (Carlo Erba) i 30%-tni vodikov

24

peroksid – H2O2 (Kemika). Za pripremu svih otopina kao i za završno pranje posuđa

korištena je deionizirana destilirana (UHQ) voda, čija je otpornost bila 18,17 MΩ/cm.

Deioniziranje destilirane vode provodi se pomoću uređaja Milli-Q Millipore.

Laboratorijsko posuđe prije svakog korištenja bilo je oprano 10%-tnom HNO3 nakon

čega je isprano s UHQ vodom. Za pripremu kalibracijskih otopina te za dodavanje

kontrolnim uzorcima korištene su koncentrirane (1000 mg L-1) otopine standarda

metala (Merck K Ga A Certi PUR 1.11355.0100) te fosfora (Inorganic Ventures

CGS1-1) i sumpora (Merck K Ga A Certi PUR 1.70340.0100).

Za mikrovalno razaranje uzoraka meda korišten je uređaj Speed Wave MWS-

2 microwave system, Berghof. Teflonske posudice u koje se stavljaju uzorci prije

svakog novog seta uzoraka najprije su nekoliko puta isprane vodom, nakon čega se

u svaku posudicu stavi 10 ml 10%-tne dušične kiseline te se posudice zatvore i

stave u uređaj. Program za ispiranje sastoji se od tri koraka: 10 minuta pri 80°C uz

40% snage, zatim 10 minuta pri 135°C uz 40% snage te na kraju 10 minuta pri

120°C uz 40% snage. Nakon što završi program pranja, posudice se izvade iz

uređaja te nakon hlađenja izlijemo sadržaj, a posudice još jednom isperemo s UHQ

vodom.

Određivanje sadržaja odabranih metala te fosfora i sumpora provedeno je

pomoću uređaja Prodigy, High dispersion ICP, Leemam Labs Inc. Za propuhivanje

uzoraka kroz uređaj i kao izvor elektrona korišten je plin argon. Prije samog

postupka mjerenja koncentracije elemenata kroz uređaj se propuhuje argon kako bi

se uklonile nečistoće te kako bi se stabilizirali uvjeti. Uvjeti rada uređaja za korištenu

metodu prikazani su u Tablici 3.

ATR spektri uzoraka medova snimani su pomoću Brucker Vector 22 FT-IR

spektrometra s ATR nosačem. Pločica koja služi kao nosač uzorka napravljena je

od cinkovog selenida, a kao izvor zračenja služi silicijev karbid.

25

Tablica 3: Uvjeti rada ICP-AES za korištenu metodu.

Dio uređaja Opis

spektrometar Ešeletni polikromator visoke rezolucije

L-PAD CID kamera (detektor u čvrstom stanju)

RF-generator ˝free running˝ 40 MHz

vanjska snaga 1,1 kW

protok argona

vanjski: 18 L min-1

pomoćni: 0,8 L min-1

za raspršivanje: 1,1 L min-1

peristalička pumpa 1,0 mL/min

raspršivač pneumatski

komora za raspršivanje ciklonska

plamenik Fasselov tip, DUAL-VIEW

položaj plamenika aksijalni

integracijsko vrijeme mjerenja 5 s

3.3.2. Priprema uzoraka

U teflonske posudice, u kojima se provodi mikrovalna razgradnja, odvagano

je otprilike 500 mg uzorka meda. Svakom uzorku zatim je dodano po 4 mL

koncentrirane dušične kiseline i 4 mL koncentriranog vodikovog peroksida. Pošto se

uslijed kemijske reakcije u teflonskoj posudici razvijaju plinoviti produkti, tako

pripravljeni uzorci ostavljeni su otklopljeni otprilike pola sata uz povremeno

protresanje. Nakon toga teflonske su posudice zaklopljene te su stavljene u uređaj

za mikrovalnu razgradnju. Program korišten za razaranje uzoraka sastoji se od tri

koraka: 20 minuta pri 80°C uz 60% snage, zatim 15 minuta pri 135°C uz 70% snage

te na kraju 15 minuta pri 180°C uz 75% snage. Po završetku programa uzorci su

najprije ostavljeni da se hlade oko pola sata u uređaju nakon čega su izvađeni iz

uređaja te su ostavljeni da se hlade još oko pola sata. Nakon hlađenja u

posudicama se nalazila bistra prozirna otopina koja je prelivena u odmjerne tikvice

volumena 25 mL. Teflonske posudice zatim su nekoliko puta isprane malim

volumenima UHQ vode te je sva tekućina prelivena u tikvice. Nakon potpunog

hlađenja uzorci u tikvicama nadopunjeni su UHQ vodom do oznake. Kako bi se

provela kontrola preciznosti postupka te ima li u procesu razgradnje gubitaka, uz

uzorke koji su sadržavali samo med, dušičnu kiselinu i vodikov peroksid, paralelno

26

su obrađeni i uzorci kojima je uz navedeno dodano i 250 µL otopine standarda

metala. Napravljena su i dodatna dva uzorka od kojih je jedan slijepa proba, tj. samo

dušična kiselina i vodikov peroksid, a drugi se sastoji od dušične kiseline, vodikovog

peroksida i otopine standarda metala.

3.3.3. Mjerenje koncentracije elemenata u uzorcima

U svim uzorcima određivana je koncentracija 15 različitih metala te 2

nemetala. Od metala mjerena je koncentracija Ba, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg,

Mn, Na, Ni, Pb, Sr, i Zn. Određivani nemetali bili su P i S. Valne duljine pri kojima je

mjeren sadržaj elemenata, kao i detekcijske granice uređaja, navedene su u Tablici

4. Zbog mjerenja pri različitim razrjeđenjima, određivanje koncentracija metala i

nemetala napravljeno je odvojeno.

Tablica 4: Valne duljine pri kojima je mjeren sadržaja elemenata i detekcijske

granice uređaja. Svi elementi osim Ca mjereni su aksijalno, a Ca je mjeren radijalno.

Element Valna duljina

λ / nm Detekcijska granica uređaja

wL / µg kg-1

Ba 455,403 1,81

Ca 396,847 4,50

Cd 214,441 0,15

Co 228,615 0,36

Cr 267,716 2,40

Cu 324,754 0,16

Fe 259,940 0,18

K 766,491 4,15

Mg 285,213 0,99

Mn 259,372 0,07

Na 589,592 5,00

Ni 231,604 0,55

P 178,283 3,25

Pb 220,353 2,16

S 182,034 5,00

Sr 407,771 0,04

Zn 213,856 0,28

27

Prije početka mjerenja koncentracije metala u uzorcima napravljena je

kalibracija uređaja. Otopine multielementnog standarda metala za kalibraciju

napravljene su u koncentracijama od 0; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 1,5 i 2 mg L-1, a za

razrjeđivanje je korištena 2%-tna dušična kiselina. Nakon kalibracije uređaja

provedeno je mjerenje koncentracije metala. Prije mjerenja, bistre otopine dobivene

mikrovalnom razgradnjom razrijeđene su u kivete u omjeru 1:9. Sva mjerenja

provedena su u tri ponavljanja te je za svaki uzorak izračunata srednja vrijednost

sadržaja svakog metala.

Nakon toga mjeran je sadržaj nemetala. Otopine za kalibraciju pripravljene su

od otopina standarda fosfora i sumpora. Kalibracija je napravljena s otopinama

koncentracija 0; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20 i 50 mg L-1, a za njihovo razrijeđivanje

korištena je 2%-tna dušična kiselina. Nakon kalibracije provedeno je mjerenje iz

nerazrijeđenih uzoraka u jednom ponavljanju.

3.3.4. Snimanje ATR spektara

Snimanje spektra ne zahtijeva nikakvu predpripremu uzoraka nego je samo

potrebno na nosač uzorka nanijeti tanak sloj meda koji je prethodno homogeniziran

miješanjem pomoću staklenog štapića. Spektri nisu detaljno asignirani zbog

složenosti postupka nego je napravljena samo okvirna asignacija tako da se vide

dijelovi koji potječu od vode, C – H istezanja te dio spektra koji je vezan uz različite

organske funkcionalne skupine. Asignacija je postupak kojim se svakoj liniji u

spektru pridodaje podatak o njezinu podrijetlu.

3.4. Statistička analiza

Statistička analiza napravljena je metodom analize glavnih komponenata

(Principal Component Analysis, PCA). To je multivarijantna analiza kojom se

reducira određena količina podataka ako između danog seta varijabli postoji

korelacija. Cilj ove analize je saznati koliki je broj komponenata koje su linearna

kombinacija originalnog seta varijabli koje opisuju svaki uzorak. Nakon što smo PCA

analizom saznali koliki je broj komponenata (eigenvektora) koje najbolje opisuju

čitav uzorak (udio u ukupnoj varijanci veći od 5%), napravljena je k-means analiza.

Kombinacijom dvaju eigenvektora moguće je dobiti informaciju o tome kako se

grupiraju proučavane varijable (udjeli peludnih zrnaca i sadržaj elemenata). U kojem

28

će se kvadrantu naći koja varijabla određeno je vrijednošću eigenvektora za svaku

varijablu. Metoda k-means provodi grupiranje uzoraka u klastere (skupine) čiji broj

mora biti izabran a priori. Taj broj je upravo broj eigenvektora dobiven PCA

analizom čiji je udio u ukupnoj varijanci veći od 5%. Ova metoda provodi sortiranje

uzoraka na temelju svih varijabli koje ih opisuju (u ovom slučaju to su udjeli svakog

pojedinog elementa i peludnih zrnaca).

29

4. REZULTATI

4.1. Sastav peludnih zrnaca u medu

Determinacijom i prebrojavanjem peludnih zrnaca prikupljeni su podaci o

botaničkom podrijetlu medova (Tablica 5). Na temelju podataka o sastavu i udjelima

peludnih zrnaca u uzorcima, svakom je uzorku pripisana kategorija u koju ga

svrstavaju podaci o botaničkom podrijetlu (Tablica 6). Fotografije preparata peludnih

zrnaca (Slika 10) prikazuju kako izgledaju peludna zrnca nekih od zabilježenih svojti

u uzorcima medova.

Slika 10: Fotografije preparata nekih od zabilježenih peludnih zrnaca u uzorcima

medova (povećanje 400x). a- Castanea sativa, b- Robinia pseudoacacia, c-

Brassicaceae i Tilia sp., d- Tilia sp., e- Amorpha fruticosa, f- Apiaceae.

a

b

c

d

f

e

30

Tablica 5: Rezultati palinološke analize medova dani kao postotak od 300

prebrojenih zrnaca za svaki uzorak. Crveno označeni uzorci nisu imali dovoljan broj

peludnih zrnaca za analizu.

UZORAK 1C 1B 1K 2C 2B 2S 3C 3B 4K 4Z 5CB 5B 6C

Robinia pseudoacaccia

L. 1,0 2,0 0,3 4,0 25,8 67,3 1,3 0,7 5,6

Salix sp. 3,3 5,3 11,7 23,3 13,2 0,3 17,9

Castanea sativa Miller

85,7 84,7 96,4 55,3 1,0 96,7 95,3 1,6 96,7

Rosaceae 5,0 3,3 3,7 25,2 0,9 0,7 44,2 0,3

Brassicaceae 0,7 21,0 3,6 2,2 0,3 0,3 1,3

Asteraceae 1,3 2,0 1,0 2,3 4,5 0,6 2,0 3,3 0,7

Cyperaceae 3,3 0,6 0,3

Loranthaceae 0,6 1,0

Poaceae 0,6 0,3

Caryophyllaceae 1,5 0,3

Fabaceae 0,7 1,7 1,3 1,5 6,8 0,3 4,0 2,0

Apiaceae 0,3 0,3 2,0

Plantago sp. 0,3 0,3 0,7

Quercus sp. 1,7

Rhamnaceae 1,0 2,3

Acer sp. 1,0

Cornus sp. 0,7 0,3 4,0

Rumex sp.

Pinus sp. 1,0

Tilia sp. 0,3 0,3 0,3

Fraxinus sp. 1,0

Amorpha fruticosa L.

Cistaceae

Lamiaceae

Indet. 2,0 10,0 7,1 0,3 1,3 0,3

31

Nastavak Tablice 5.

UZORAK 6B 7B 7K 8B 8K 9CB 9K 10B 11B 12M 13B 14A

Robinia pseudoacaccia L.

24,8 1,0 13,6 2,6 7,0 13,7 22,0 33,6 34,3

Salix sp. 6,8 1,0 1,8 0,3 7,0 2,3 1,1 19,9

Castanea sativa Miller

28,8 94,9 65,3 88,5 66,0 81,7 24,3 8,2 6,7 0,7

Rosaceae 16,1 0,9 0,3 4,3 0,3 7,3 2,5 2,0 6,7

Brassicaceae 0,3 5,0 1,7 1,1 0,7 1,0

Asteraceae 3,7 1,0 2,8 1,9 1,3 1,3 4,8 1,2 0,3

Cyperaceae 0,3 0,3 0,3 0,6

Loranthaceae 6,8 1,0 3,0 0,7 2,1

Poaceae 0,7 16,0 1,0

Caryophyllaceae 0,3

Fabaceae 2,2 1,8 3,0 0,3 8,0 16,8 1,7 11,3

Apiaceae 1,5 0,3 0,7 1,0 0,6 1,0 0,9

Plantago sp. 0,3 1,5 0,3 4,0

Quercus sp. 0,3 0,7 0,6 1,7 0,4

Rhamnaceae 0,3 0,3 0,3 3,7 0,9

Acer sp. 0,3 0,3

Cornus sp. 2,2 0,3 0,3 0,3 0,3 1,3 6,3 6,1

Rumex sp. 1,0

Pinus sp. 0,3 0,4

Tilia sp. 0,3 1,7 2,3

Fraxinus sp. 0,7 3,3

Amorpha fruticosa L.

98,0

Cistaceae 66,7

Lamiaceae 8,7

Indet. 7,1 2,9 2,0 6,0 1,0 1,3 6,0 4,7 8,4

32

Tablica 6: Klasifikacija analiziranih uzoraka meda obzirom na botaničko podrijetlo

prema sastavu i udjelima peludnih zrnaca.

Uzorak Zaprimljen kao Predominantna pelud

> 45% Botaničko podrijetlo

1C cvjetni Castanea sativa kestenov

1B bagremov Castanea sativa kestenov

1K kestenov Castanea sativa kestenov

2C cvjetni nema cvjetni

2B bagremov nedovoljno peludnih zrnaca

2S medljikovac nedovoljno peludnih zrnaca

3C cvjetni Robinia pseudoacacia bagremov

3B bagremov Robinia pseudoacacia bagremov

4K kestenov Castanea sativa kestenov

4Z zlatošipkin Castanea sativa kestenov

5CB cvjetni i

bagremov nedovoljno peludnih zrnaca

5B bagremov nema cvjetni

6C cvjetni Castanea sativa kestenov

6B bagremov nedovoljno peludnih zrnaca

7B bagremov Robinia pseudoacacia bagremov

7K kestenov Castanea sativa kestenov

8B bagremov nema cvjetni

8K kestenov Castanea sativa kestenov

9CB cvjetni i

bagremov nema cvjetni

9K kestenov nema cvjetni

10B bagremov Robinia pseudoacacia bagremov

11B bagremov Robinia pseudoacacia bagremov

12M livadni Cistaceae (većinom Helianthemum

sp.) bušiniov (većinom

sunčanica)

13B bagremov Robinia pseudoacacia bagremov

14A amorfin Amorpha fruticosa amorfin

33

4.2. Sadržaj kemijskih elemenata

U analizu je uključeno 17 odabranih kemijskih elemenata od kojih je 15

metala, a preostala dva su nemetali. Prije samog mjerenja koncentracije elemenata

u uzorcima, napravljeni su baždarni dijagrami (Slika 11). Otopine za baždarne

dijagrame pripravljene su iz otopina multielementnog standarda za metale te

otopine fosfora i sumpora za nemetale.

Slika 11: Primjer baždarnog dijagrama za magnezij (Mg 285,213 nm).

Pošto svaki element ima više spektralnih linija pri kojima emitira zračenje, za

mjerenje koncentracija u uzorcima odabrane su linije za koje su dobivene baždarne

krivulje s najboljim koeficijentom korelacije (R> 0,995). Nakon što emitirano zračenje

padne na detektor (Slika 12), računalo pretvara intenzitet upadnog zračenja u

krivulju (Slika 13). Matematičkim postupkom integracije zatim se izračuna površina

ispod krivulje. Izračunata površina proporcionalna je koncentraciji elementa u

uzorku. Točna se koncentracija određuje tako što se izračunata vrijednost za uzorak

stavlja u omjer s vrijednošću izračunatom za poznatu koncentraciju elementa

korištenu za izradu baždarnog dijagrama.

34

Slika 12: Snimke s kamere detektora. Žuto područje pokazuje mjesto upada

emitiranog zračenja pojedinog elementa. Iznad mjesta upada pozicioniran je

pravokutnik unutar kojeg se integrira intenzitet zračenja. a – Ba 445,403 nm; b – Cd

214,441 nm; c – Cu 224,700 nm; d – Cu 324, 754 nm.

Slika 13: Profil linije Cd 214,441 nm. Strelica označava profil linije u uzorku meda, a

ostale krivulje su profili baždarnih otopina poznatih koncentracija.

Nakon provedenih mjerenja izračunati su maseni udjeli elemenata u uzorcima

te su rezultati podijeljeni u tri tablice obzirom na zabilježene udjele elemenata.

35

Općenito, najzastupljeniji element u svim uzorcima bio je kalij. U Tablici 7 prikazani

su glavni elementi čija je zastupljenost u uzorcima veća od 10 µg g-1. U tu skupinu

spadaju kalcij, kalij, magnezij, natrij te fosfor i sumpor.

Tablica 7: Maseni udjeli (w / µg g-1) glavnih elemenata. Oznaka < wL označava

udjele koji su ispod detekcijske granice uređaja.

Uzorak Ca

w ± σ / µg g-1

K

w ± σ / µg g-1

Mg

w ± σ / µg g-1

Na

w ± σ / µg g-1

P

w / µg g-1

S

w / µg g-1

1C 95,97 ± 0,001 1531,25 ± 0,019 27,67 ± 0,000 47,70 ± 0,007 63,36 41,08

1B 49,26 ± 0,002 641,21 ± 0,029 17,84 ± 0,001 58,94 ± 0,010 38,79 17,27

1K 225,78 ± 0,006 3139,87 ± 0,069 47,73 ± 0,001 27,87 ± 0,004 45,40 33,90

2C 85,60 ± 0,001 762,57 ± 0,020 25,10 ± 0,006 41,03 ± 0,013 46,35 23,56

2B 69,24 ± 0,020 334,30 ± 0,051 16,29 ± 0,002 166,52 ± 0,034 36,18 17,87

2S 80,97 ± 0,002 798,16 ± 0,009 59,97 ± 0,000 47,70 ± 0,002 86,15 42,95

3C 67,49 ± 0,001 993,56 ± 0,021 18,73 ± 0,001 89,51 ± 0,005 50,86 36,68

3B 75,57 ± 0,000 218,80 ± 0,001 5,30 ± 0,000 16,19 ± 0,002 32,81 8,87

4K 244,81 ± 0,006 4133,32 ± 0,158 57,79 ± 0,002 95,05 ± 0,020 61,60 43,35

4Z 144,96 ± 0,009 1740,48 ± 0,113 36,61 ± 0,003 126,65 ± 0,014 59,38 32,14

5CB 161,65 ± 0,004 470,32 ± 0,012 33,14 ± 0,001 12,91 ± 0,002 47,62 32,98

5B 61,95 ± 0,000 514,45 ± 0,001 25,53 ± 0,000 28,61 ± 0,005 48,64 31,98

6C 102,56 ± 0,003 1642,62 ± 0,014 42,52 ± 0,001 8,12 ± 0,000 55,57 31,57

6B 21,86 ± 0,000 339,89 ± 0,007 8,61 ± 0,001 28,19 ± 0,004 34,63 12,38

7B 24,38 ± 0,000 256,89 ± 0,001 5,75 ± 0,000 12,26 ± 0,001 28,36 10,57

7K 115,87 ± 0,001 2549,22 ± 0,036 24,50 ± 0,000 12,43 ± 0,001 52,33 26,84

8B 19,86 ± 0,000 235,42 ± 0,001 6,49 ± 0,000 < wL 34,55 10,68

8K 111,14 ± 0,002 2090,05 ± 0,078 35,86 ± 0,001 53,45 ± 0,002 56,50 30,29

9CB 35,61 ± 0,000 398,42 ± 0,001 10,30 ± 0,000 4,67 ± 0,001 43,08 17,04

9K 124,62 ± 0,001 2145,96 ± 0,005 36,09 ± 0,000 53,43 ± 0,001 52,74 23,95

10B 16,04 ± 0,000 212,52 ± 0,002 6,98 ± 0,000 11,46 ± 0,002 34,23 11,28

11B 81,76 ± 0,028 237,50 ± 0,095 9,38 ± 0,003 34,69 ± 0,047 29,99 11,02

12M 42,02 ± 0,004 161,41 ± 0,008 5,70 ± 0,001 56,84 ± 0,003 31,42 9,29

13B 12,93 ± 0,001 235,91 ± 0,004 5,95 ± 0,000 107,11 ± 0,005 38,75 10,13

14A 37,09 ± 0,002 151,71 ± 0,017 6,74 ± 0,000 29,72 ± 0,026 36,34 14,12

36

U Tablici 8 dani su elementi čiji se udjeli u uzorcima, uz par iznimaka, kreću

od 1 do 10 µg g-1. Tu spadaju barij, bakar, željezo, mangan i cink.

Tablica 8: Maseni udjeli (w / µg g-1) elemenata u tragovima. Oznaka < wL označava

udjele koji su ispod detekcijske granice uređaja.

Uzorak Ba

w ± σ / µg g-1

Cu

w ± σ / µg g-1

Fe

w ± σ / µg g-1

Mn

w ± σ / µg g-1

Zn

w ± σ / µg g-1

1C 1,891 ± 0,0001 1,604 ± 0,0001 0,288 ± 0,0002 5,921 ± 0,0000 1,192 ± 0,0000

1B 9,486 ± 0,0007 1,630 ± 0,0001 3,310 ± 0,0009 1,828 ± 0,0002 1,482 ± 0,0006

1K 1,155 ± 0,0001 2,385 ± 0,0003 3,912 ± 0,0005 36,662 ± 0,0006 1,565 ± 0,0001

2C 9,309 ± 0,0057 3,839 ± 0,0047 62,764 ± 0,0067 2,975 ± 0,0053 4,367 ± 0,0052

2B 9,074 ± 0,0013 1,543 ± 0,0001 14,474 ± 0,0029 < wL 0,817 ± 0,0003

2S 0,322 ± 0,0001 1,425 ± 0,0001 3,722 ± 0,0007 4,228 ± 0,0001 1,700 ± 0,0000

3C 9,770 ± 0,0002 1,834 ± 0,0000 1,962 ± 0,0003 < wL 0,981 ± 0,0000

3B < wL 2,131 ± 0,0004 3,125 ± 0,0011 < wL 10,701 ± 0,0002

4K 8,942 ± 0,0004 3,317 ± 0,0000 2,212 ± 0,0001 39,087 ± 0,0015 0,577 ± 0,0003

4Z 0,087 ± 0,0003 2,304 ± 0,0003 2,217 ± 0,0007 14,565 ± 0,0013 5,217 ± 0,0005

5CB < wL 2,047 ± 0,0001 1,462 ± 0,0001 < wL 6,676 ± 0,0000

5B 0,771 ± 0,0001 1,108 ± 0,0001 1,204 ± 0,0001 < wL 0,771 ± 0,0001

6C 0,394 ± 0,0001 1,575 ± 0,0001 1,969 ± 0,0000 6,644 ± 0,0000 2,461 ± 0,0001

6B 6,286 ± 0,0003 1,789 ± 0,0005 2,176 ± 0,0006 < wL 0,242 ± 0,0001

7B < wL 0,570 ± 0,0001 9,553 ± 0,0007 < wL 4,135 ± 0,0001

7K < wL 1,927 ± 0,0004 5,183 ± 0,0018 10,505 ± 0,0000 3,349 ± 0,0002

8B < wL 0,727 ± 0,0004 4,360 ± 0,0009 < wL 35,223 ± 0,0002

8K < wL 1,591 ± 0,0002 2,091 ± 0,0000 9,182 ± 0,0002 3,045 ± 0,0000

9CB < wL 0,810 ± 0,0001 3,897 ± 0,0011 < wL 0,965 ± 0,0000

9K 0,564 ± 0,0001 1,880 ± 0,0004 10,150 ± 0,0009 11,560 ± 0,0001 7,754 ± 0,0003

10B 1,201 ± 0,0001 0,416 ± 0,0001 4,713 ± 0,0010 < wL 2,079 ± 0,0002

11B < wL 1,672 ± 0,0003 2,546 ± 0,0009 < wL 2,660 ± 0,0009

12M 7,664 ± 0,0004 1,186 ± 0,0000 7,162 ± 0,0003 < wL 2,190 ± 0,0003

13B 0,474 ± 0,0002 0,517 ± 0,0001 3,060 ± 0,0004 < wL 14,181 ± 0,0003

14A < wL 1,141 ± 0,0004 5,394 ± 0,0013 < wL 3,216 ± 0,0005

37

Najmanje zastupljeni elementi u uzorcima prikazani su u Tablici 9. Njihovi

udjeli uglavnom su manji od 1 µg g-1. Tu spadaju kadmij, kobalt, krom, nikal, olovo i

stroncij.

Tablica 9: Maseni udjeli (w / µg g-1 ) elemenata u ultratragovima. Oznaka < wL

označava udjele koji su ispod detekcijske granice uređaja.

Uzorak Cd

w ± σ /µg g-1

Co

w ± σ /µg g-1

Cr

w ± σ /µg g-1

Ni

w ± σ /µg g-1

Pb

w ± σ /µg g-1

Sr

w ± σ /µg g-1

1C < wL 0,0411 ± 0,0001

0,0822 ± 0,0003

< wL < wL 0,2467 ± 0,0001

1B < wL < wL 0,5435 ± 0,0001

< wL 0,2964 ± 0,0006

0,2470 ± 0,0002

1K < wL 0,1118 ± 0,0001

0,2981 ± 0,0002

< wL 0,1863 ± 0,0010

0,3726 ± 0,0000

2C 1,7274 ± 0,0052

1,9194 ± 0,0052

2,0633 ± 0,0056

1,6795 ± 0,0057

2,3033 ± 0,0032

2,6871 ± 0,0067

2B < wL < wL 0,0907 ± 0,0001

< wL 0,0907 ± 0,0002

0,3176 ± 0,0001

2S < wL < wL 0,2298 ± 0,0000

< wL < wL 0,1838 ± 0,0000

3C 0,0853 ± 0,0000

< wL 0,0853 ± 0,0001

< wL 1,0666 ± 0,0011

0,2560 ± 0,0001

3B < wL < wL 0,1420 ± 0,0004

< wL 1,8939 ± 0,0010

0,2367 ± 0,0001

4K < wL < wL < wL < wL < wL 0,5769 ± 0,0002

4Z 0,0435 ± 0,0002

0,2609 ± 0,0005

0,1304 ± 0,0001

< wL < wL 0,3913 ± 0,0004

5CB < wL < wL < wL < wL < wL 0,3899 ± 0,0000

5B < wL 0,0482 ± 0,0003

0,3854 ± 0,0002

< wL < wL 0,2408 ± 0,0000

6C < wL < wL < wL < wL < wL 0,1476 ± 0,0000

6B 0,0484 ± 0,0002

0,0967 ± 0,0004

0,5803 ± 0,0002

< wL < wL 0,2418 ± 0,0003

7B < wL < wL 0,0951 ± 0,0001

< wL < wL 0,0951 ± 0,0000

7K < wL < wL 0,3211 ± 0,0001

< wL < wL 0,3670 ± 0,0001

8B < wL < wL 0,1453 ± 0,0004

< wL < wL 0,0484 ± 0,0000

8K < wL < wL 0,0455 ± 0,0002

< wL 0,4091 ± 0,0010

0,2727 ± 0,0000

9CB < wL 0,0772 ± 0,0000

0,3472 ± 0,0002

< wL 0,3472 ± 0,0017

0,1157 ± 0,0000

9K < wL < wL 0,3289 ± 0,0004

0,3759 ± 0,0005

< wL 0,2820 ± 0,0001

10B < wL 0,1386 ± 0,0003

0,2311 ± 0,0003

< wL < wL 0,0924 ± 0,0000

38

Nastavak Tablice 9.

11B 0,1140 ± 0,0000

< wL 0,0380 ± 0,0003

< wL

0,9119 ± 0,0018

0,3419 ± 0,0002

12M 0,0912 ± 0,0000

0,2281 ± 0,0000

0,4106 ± 0,0001

< wL

< wL 0,2281 ± 0,0001

13B 0,0862 ± 0,0002

0,2155 ± 0,0000

0,3017 ± 0,0002

< wL

< wL 0,2155 ± 0,0004

14A < wL < wL 0,5187 ± 0,0000

< wL

< wL 0,2075 ± 0,0001

Zastupljenost mjerenih kemijskih elemenata u uzorcima prikazana je na Slici

14. Iz prikaza je vidljivo kako su kestenovi medovi oni s najvećim masenim udjelima,

zatim slijede zlatošipkin med te cvjetni i konačno bagremovi medovi. Međutim,

prijelaz je kontinuiran i jasne granice nisu vidljive.

Slika 14: Grafički prikaz zastupljenosti mjerenih kemijskih elemenata u uzorcima

medova. Boja stupca odgovara klasi u kojoj je uzorak smješten prema k-means

statističkoj analizi.

Kao referentni materijal korišten je certificirani standard NIST SRM 1571

(orchard leaves). Određivanje sadržaja elemenata u ovom materijalu omogućilo je

da testiramo točnost metode usporedbom mjerenih i certificiranih vrijednosti (Tablica

10).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

4K

1K

7K

9K

8K

4Z

6C

1C

3C

2S

2C

1B

5CB

5B

2B

9CB

6B

13

B

11

B

3B

7B

8B

12M

10

B

14A

Zast

up

ljen

ost

kem

ijski

h e

lem

enat

a /

µg

g-1

39

Tablica 10: Rezultati mjerenja sadržaja elemenata u certificiranom standardu NIST

SRM 1571 (orchard leaves).

Element Certificirano

w / µg g-1

Mjereno

w ± σ / µg g-1

Ba (44) 47,2 ± 0,5

Ca 20900 20763 ± 3

Cd 0,11 0,23 ± 0,01

Co (0,2) 0,3 ± 0,01

Cr 2,6 3,0 ± 0,2

Cu 12 13,2 ± 0,3

Fe 300 300,1 ± 0,2

K 14700 13425 ± 8

Mg 6200 6182 ± 5

Mn 91 95,4 ± 0,2

Na 82 91 ± 5

Ni 1,3 2,1 ± 0,5

P 2100 2423 ± 2

Pb 45 45,6 ± 0,1

S (1900) 2076 ± 5

Sr 37 38 ± 2

Zn 25 28,2 ± 0,8

4.3. Rezultati statističke analize

Rezultati melisopalinološke analize i određivanja udjela kemijskih elemenata

u uzorcima prije zajedničke statističke obrade svedeni su na istu skalu (ppm), te su

takvi podaci logaritmirani po bazi 10. Nakon toga primijenjena je statistička metoda

PCA (Principal Component Analysis) kako bi se utvrdio broj klastera koji najbolje

opisuju cjeloviti set podataka. Broj klastera koji najbolje opisuje dani set podataka

očituje se u broju eigenvektora čiji je udio u varijanci viši od 5% te u ovom slučaju

iznosi 4.

40

Slika 15: Grafički prikaz rasporeda mjerenih varijabli. Pozicioniranje se temelji na

kombinaciji dvaju eigenvektora koji imaju najveće udjele u varijanci (vrijednosti u

zagradama). Kemijski elementi označeni su kemijskim simbolima, a svojte iz

palinološke analize trima početnim slovima naziva svojte (vidi Tablicu 5).

Nadalje, kombinacijom vrijednosti faktora (factor scores) eigenvektora

obzirom na cjelokupne podatke o pojedinom uzorku dobije se grafički prikaz

opažanja o uzorcima. Ta opažanja smiještaju uzorak u koordinatni sustav na položaj

koji određuje uređeni par vrijednosti (factor scores) izabranih eigenvektora s

najvećim udjelima u varijanci (F1 i F2) (Slika 16).

Ba

Ca

Cd

Co

Cr

Cu

Fe

K

Mg Mn

Na

Ni Pb

Sr

Zn

P

S Rob

Sal

Cas

Ros

Bra

Ast

Cyp

Lor Poa

Cyp Fab

Api

Pla

Que Rha

Ace

Cor

Rum

Pin

Til

Fra

Amo

Cis Lam

Indet.

-1

-0,5

0

0,5

1

-1 -0,5 0 0,5 1

-- o

s F

2 (

12

,10 %

) --

>

--os F1 (26,79 %) -->

Varijable (osi F1 i F2: 38,89 %)

41

Slika 16: Položaj uzoraka obzirom na opažanja temeljena na vrijednostima

eigenvektora (factor scores). Točke su naknadno obojene različitim bojama ovisno o

tome u koju skupinu (klaster) ih je grupirala k-means klasterska analiza.

Nakon što smo pomoću PCA analize saznali koliki je broj klastera koji

najbolje opisuju odnose među uzorcima napravljena ja k-means klaster analiza.

Klasterska k-means analiza provodi se na istom setu podataka kao i PCA analiza

samo što se kao ulaznu informaciju daje i broj klastera u koje želimo podijeliti naše

uzorke obzirom na vrijednosti njihovih varijabli. U ovom je slučaju provedeno

grupiranje u četiri klastera (Tablica 11).

1C

1B

1K 2C

2B

2S

3C

3B

4K

4Z

5CB

5B

6C

6B

7B 7K

8B

8K

9CB 9K

10B

11B

12M

13B

14A

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

-- o

s F

2 (

12

,10

%)

-->

-- os F1 (26,79 %) -->

Opažanja (osi F1 i F2: 38,89 %)

42

Tablica 11: Sastav klastera prema k- means klasterskoj analizi, s podacima koji

govore o kompaktnosti klastera.

Klaster 1 2 3 4

inercija unutar skupine podataka 122,316 130,954 42,871 0,000

minimalna udaljenost od centroida 2,730 2,861 2,125 0,000

prosječna udaljenost od centroida 3,386 3,773 2,864 0,000

maksimalna udaljenost od centroida 5,888 4,700 3,823 0,000

veličina klastera 10 9 5 1

1C 3C 2B 12M

1B 3B 2S

1K 5B 5CB

2C 7B 6B

4K 8B 14A

4Z 9CB

6C 10B

7K 11B

8K 13B

9K

4.4. ATR spektri

Pregledom ATR spektara uzoraka meda utvrđeno je da su svi spektri vrlo

slični (Slike 17, 18, 19 i 20). Svaki se spektar sastoji od nekoliko glavnih dijelova koji

se mogu jasno razlikovati. Dio spektra koji pokriva područje valnih brojeva od 3700

do 3000 cm-1 odnosi se na OH- istezanja u molekulama vode i hidroksilnim

skupinama organskih spojeva. Nakon toga dolazi dio spektra koji pokriva područje

valnih brojeva od 3000 do 2700 cm-1 koji se odnosi na C – H istezanja u organskim

spojevima. Prva sljedeća vrpca nalazi se na području 2250 do 1600 cm-1 a odnosi

se na deformacije molekula vode prisutnih u medu. Posljednji dio spektra koji se

nalazi na području ispod 1500 cm-1 uglavnom se odnosi na vrpce povezane s

različitim funkcionalnim skupinama ugljikohidrata. Ovaj posljednji dio spektra mogao

bi biti vrlo informativan ali detaljna analiza zbog složenosti nije uobičajena.

43

Slika 17: ATR spektar uzorka (10) bagremovog meda.

Slika 18: ATR spektar uzorka (1C) cvjetnog meda.

C:\Documents and Settings\zak\Desktop\MED\bagrem 10.0 bagrem 10 KBr pastila 2012/02/24

3348.5

83317.1

43283.9

2

2935.1

1

1646.1

2

1417.4

5

1025.2

2

918.7

0865.4

8817.7

4777.4

5

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

01

23

45

AT

R U

nits

C:\Documents and Settings\zak\Desktop\MED\cvjetni 1a.0 cvjetni 1a KBr pastila 2012/02/24

3297.5

33281.3

63241.8

8

2932.9

6

1644.6

1

1416.1

5

1026.0

91007.7

3

918.2

5865.2

9817.0

1775.7

6

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

01

23

45

AT

R U

nits

44

Slika 19: ATR spektar uzorka (9K) kestenovog meda.

Slika 20: ATR spektar uzorka (2S) medljikovca.

C:\Documents and Settings\zak\Desktop\MED\kesten 9b.0 kesten 9b KBr pastila 2012/02/22

3330.3

33295.8

23259.6

7

2933.5

5

1646.0

4

1417.5

0

1032.9

21012.6

0

918.5

5865.5

8817.2

1776.4

6

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

01

23

45

6

AT

R U

nits

C:\Documents and Settings\zak\Desktop\MED\sumski med 2c.0 sumski med 2c KBr pastila 2012/02/22

3283.0

03262.5

1

2933.5

8

1646.4

0

1417.5

8

1025.9

7

918.3

9865.3

1817.5

5776.4

7

100015002000250030003500

Wavenumber cm-1

01

23

45

6

AT

R U

nits

45

5. RASPRAVA

Analiza bioloških uzoraka u pravilu je vrlo kompleksan proces. Razlog tome

je što između proučavanih varijabli uvijek postoji barem neki oblik međuovisnosti.

Zbog toga je za kvalitetnu analizu u obzir potrebno uzeti veći broj varijabli koje će se

na kraju kombinirati kako bi se moglo objasniti dobivene rezultate. U ovom je

istraživanju proučavan sastav peludnih zrnaca te sadržaj odabranih kemijskih

elemenata u medu kako bi se pokušalo utvrditi može li se na temelju ta dva

parametra opisati uzorak meda.

Prilikom sakupljanja uzoraka od pčelara svaki je pčelar deklarirao svoje

uzorke. Prema osobno opaženim senzoričkim svojstvima (miris, okus, boja)

deklaracija je odgovarala onome što se nalazi u bočicama. Međutim, nakon

provedene palinološke analize pokazalo se da jedan dio uzoraka ne bi mogao biti

svrstan u deklariranu kategoriju, jer prema sastavu peludnih zrnaca pripada u neku

drugu kategoriju (Tablica 6).

Najčešći problem bio je prevelik broj peludnih zrnaca kestena u medovima

koji senzorički spadaju u kategoriju bagremovih ili cvjetnih medova (Tablica 6). Kao

objašnjenje ove pojave naveo bih da pčelari uvijek imaju veću ili manju zalihu okvira

s izgrađenim saćem koje mogu upotrijebiti u slučajevima kada je paša dobra pa je i

unos nektara u košnicu velik. To se obično događa u bagremovoj paši pa pčelari u

košnice dodaju okvire sa saćem koje su izvadili iz košnica prethodne jeseni prije

uzimljavanja pčela. Na tim okvirima uvijek zaostane ponešto peludi koju su pčele

sakupile kako bi njome hranile prvo proljetno leglo, dok su još vremenski uvjeti

hladni i paša je oskudna (Katalinić i sur. 1968).

Prva proljetna peludna paša je lijeska, ali kako ona cvate vrlo rano, nerijetko

je još vrlo hladno. Tada pčele koriste zalihe peludi koje su prikupile prethodne

sezone. Kako je zadnja obilna peludna i nektarna paša u većini sezona upravo

kestenova, onda se u okvirima peludnjacima (saće koje pčele ispunjavaju samo

peludom) nalaze velike količine kestenove peludi. Imajući na umu činjenicu da u

kestenovoj paši pčele mogu prikupiti i do 15 kg peludi po zajednici (Šimić 1980), što

je iznimno mnogo, za očekivati je da jedan dio te peludi ostane neiskorišten do

proljeća te ju pčele mogu koristiti u prehrani legla u početku sezone.

46

Također, jedan se dio nastavaka s okvirima sa saćem prije zimovanja uklanja

iz košnica kako bi se smanjio prostor u košnici kojeg će pčele morati grijati tijekom

zime. U proljeće kada se vremenski uvjeti poprave najprije počinje cvatnja vrba, a

zatim počinju cvjetati i voćke. Tada se povećava unos nektara i peludi u košnice te

pčele počinju proizvoditi prvi proljetni cvjetni med (Katalinić i sur. 1968). Ukoliko su

pčele do tada uspjele potrošiti sve zalihe prošlogodišnje peludi nakon vrcanja

proljetnog cvjetnog meda, desetak dana prije početka cvatnje bagrema, u medu bi

trebala prevladavati pelud voćaka (porodica Rosaceae), vrba i topola (porodica

Salicaceae), maslačka (porodica Asteraceae) i drugih biljaka koje cvatu ranije u

proljeće. Međutim, ukoliko pčele nisu uspjele potrošiti sve zalihe prošlogodišnje

peludi u tom će se medu, osim peludi voćaka, vrba i sličnih biljaka koje cvatu u rano

proljeće, pojaviti i peludna zrnca koja pripadaju biljkama koje cvatu od sredine ljeta

pa sve do kasne jeseni i tu će vrlo vjerojatno dominirati pelud kestena. Prema tome,

iako je sav kestenov med, zato što je loš za zimovanje pčela, izvađen iz košnica još

krajem lipnja ili početkom srpnja prethodne godine, u proljetnom cvjetnom medu

pojaviti će se velik broj peludnih zrnaca kestena te će na melisopalinološkoj analizi

biti okarakteriziran kao kestenov med.

Sada se postavlja pitanje, a kako se onda kestenova peludna zrnca mogu

naći u bagremovom medu iako kesten cvate oko mjesec dana nakon bagrema kada

se bagremov med već izvadi iz košnice? Postoje dva glavna razloga. Prvi je razlog

taj što nije u svim sezonama i u svim krajevima proljetna paša dovoljno obilna da bi

se proizvele količine cvjetnog meda koje bi bile isplative za vrcanje pa se te manje

količine cvjetnog meda ostavljaju u košnicama. Taj se med onda izvadi zajedno s

bagremovim medom krajem svibnja ili početkom lipnja. Drugi je pak razlog pojave

kestenovih peludnih zrnaca u bagremovom medu taj što je bagremova paša

najobilnija paša u većini krajeva kontinentalne Hrvatske ( Šimić 1980, Katalinić i sur.

1968). Zato se u bagremovoj paši često dogodi da pčelar u košnice mora dodavati

dodatne okvire s izgrađenim saćem koje ima pospremljene na zalihi, kako bi

pčelama osigurao dovoljno prostora za skladištenje prikupljenog nektara. Problem

kod bagrema kao medonosne biljke je što unatoč relativno visokoj produkciji nektara

ima relativno nisku produkciju peludi. Zbog toga je dovoljno da se u medu nalazi

20% peludnih zrnaca bagrema kako bi se med mogao klasificirati kao monoflorni

bagremov med (Anonymus 2009).

47

Nadalje, valja objasniti i zašto neki od medova nisu prošli palinološku analizu,

tj. na preparatu nije bilo moguće izbrojati 300 peludnih zrnaca kako je to bilo

predviđeno protokolom (Anonymus 2009). Osim što se bave proizvodnjom meda,

neki pčelari proizvode i druge pčelinje proizvode. Jedan od njih je i cvjetni prah

odnosno pelud. Pčelari skupljaju pelud na način da na leto košnice (otvor kroz koji

pčele ulaze u košnicu) postave tzv. „hvatač peludi“. To je naprava u obliku ladice

koja se postavi ispod košnice, a na mjestu leta ima postavljenu pločicu na kojoj su

otvori dovoljni tek da kroz njih prođe pčela ali grudice peludi u košaricama na

njezinom trećem paru nogu su preširoke te pelud prilikom provlačenja pčele otpada

u donji dio „hvatača peludi“. Pločica za skidanje peludi postavlja se obično u

jutarnjim satima te se nakon nekoliko sati uklanja kako bi pčele ipak mogle u

košnicu unijeti dovoljnu količinu peludi za prehranu legla. Stoga, razlog premalom

broju peludnih zrnaca u medu vrlo vjerojatno je pretjerano skupljanje peludi od

strane pčelara.

Drugi dio istraživanja odnosi se na određivanje sadržaja kemijskih elemenata

u uzorcima medova. Kao metoda za razaranje uzoraka izabrana je mikrovalna

razgradnja, a ne mokro Kjeldahlovo spaljivanje. Iako je u nekim radovima korištena i

ta metoda (Tuzen i sur. 2007) mikrovalna razgradnja mnogo se češće koristi

(Stankovska i sur. 2008, Tuzen i sur. 2007, Tuzen i Soylak 2005,). Kjeldahlovo

mokro spaljivanje koncentriranom sumpornom i dušičnom kiselinom pokazalo se

kao loš izbor iz nekoliko razloga. Zbog toga što se radi o otvorenom sustavu mogući

su gubitci hlapljivih elemenata kao i zbog eventualnog prskanja prilikom zagrijavanja

otvorenim plamenom. Drugi je razlog što se u tom slučaju zbog rada sa sumpornom

kiselinom, ne bi moglo mjeriti udjele sumpora s odgovarajućom preciznošću kao i to

da prilikom razgradnje nastaju netopivi sulfati koji se talože na stijenke Kjeldahlove

tikvice te ih kasnije nije moguće otopiti pa dolazi do gubitaka elemenata koji tvore

takve netopljive soli (npr. zemnoalkalijski elementi).

Sadržaj elemenata u uzorcima prema dobivenim rezultatima ipak bolje

opisuje uzorke od sastava peludi (Slika 14). Takav zaključak proizlazi iz činjenice da

peludna zrnca koja se u medu mogu naći zbog, kako je već rečeno, korištenja saća

koje je već prethodne sezone bilo u košnici za vrijeme neke druge paše, daju

iskrivljenu sliku o uzorcima. Međutim, analiza sadržaja elemenata manje je osjetljiva

48

u tom pogledu jer je maseni udio peludnih zrnaca u medu vrlo nizak, pa se ova

analiza temelji na stvarnom sastavu meda koji potječe od nektara ili medljike

podrijetlom s različitih biljaka. Zbog niskog masenog udjela peludi u medu utjecaj

sastava peludnih zrnaca na udjele kemijskih elemenata vrlo je nizak.

Analizom sadržaja elemenata u uzorcima uočeno je da postoje tri grupe

elemenata koje se razlikuju po zastupljenosti u uzorcima. To su glavni elementi

(Tablica 7), elementi u tragovima (Tablica 8) i elementi u ultratragovima (Tablica 9).

Najzastupljeniji od mjerenih elemenata u svim je uzorcima bio kalij. Kalij je općenito

najzastupljeniji od metala u medu (Kropf i sur. 2011, Pohl 2009, Stankovska i sur.

2007). Ukupni sadržaj mjerenih elemenata najveći je u kestenovim medovima, malo

manji u cvjetnim medovima te zlatošipkinom medu, a najmanji u bagremovim

medovima te amorfinu i mediteranskom medu, ali je prijelaz kontinuiran pa se jasne

granice ne mogu povući (Slika 14). Međutim isprekidanost boja stupića grafikona

(Slici 14) dokaz je tome da na smještanje uzoraka u klastere, osim sadržaja

elemenata , utjecaj ima i sastav i sadržaj peludnih zrnaca. Visok udio željeza u

odnosu na druge uzorke zabilježen je u uzorku 2C (Tablica 8). Razlog tome može

biti loša kvaliteta limenih bačvi u kojima je med skladišten kod pčelara (Tablica 2).

Općenito gledano, sadržaj metala odgovara rezultatima drugih radova (Stankovska i

sur. 2008, Pohl i Prusisz 2007, Bratu i Georgescu 2005, Atrouse i sur. 2004). Što se

tiče fosfora i sumpora izravno mjerenje njihove koncentracije metodom ICP-AES

nije opisano u literaturi.

Statistička analiza sadržaja elemenata i udjela peludnih zrnaca pokazala je

grupiranje uzoraka u tri skupine. Pri tome je jedan podatak (12M) izuzet iz skupina i

prezentira poseban uzorak (to je mediteranski med koji je bio kontrolni uzorak).

Kako se ovdje radi o mediteranskom medu, njegovo izdvajanje nije čudno ali se

točan razlog izdvajanja ne može navesti jer bi za to trebalo provesti dodatne

analize. Prva skupina uzoraka koja je statistički razvrstana u području negativnih

vrijednosti prve i druge glavne komponente, obuhvaća sve kestenove medove,

zlatošipkin med te bagremove medove s iznimno visokim udjelom kestenovih

peludnih zrnaca. Druga skupina, koju opisuje pozitivna vrijednost prve glavne

komponente, uključuje gotovo sve bagremove i cvjetne medove, osim manjeg broja

uzoraka koji su razvrstani kao treća skupina, a izdvajaju se po broju peludnih zrnaca

49

ispod granice određivanja botaničkog podrijetla. Posljednjoj skupini statistički je

ubrojen i med s najviše peludnih zrnaca amorfe vjerojatno zbog izrazito male

raznolikosti peludnih zrnaca, jer u tom uzorku s 98% prevladava pelud amorfe

(Tablica 5).

ATR spektri su djelomično asignirani, no oni nisu obuhvaćeni statističkom

analizom. Međutim, Svečnjak i sur. (2011) u svome radu detaljno su analizirali ATR

spektre uzoraka medova te se pokazalo kako se na temelju detaljno asigniranih

spektara i statističke analize rezultata može uspješno kategorizirati analizirane

medove. Osim ATR spektara za analize meda mogu se koristiti i klasični FT-IR

spektri (Lichtenberg-Kraag i sur. 2002).

50

6. ZAKLJUČAK

Temeljem provedenih analiza i pregledom dobivenih rezultata palinološke i

kemijske analize istraživanih uzoraka medova dobiveni su odgovori na pitanja

postavljena u ciljevima ovoga rada:

1. Pregledom svih preparata peludnih zrnaca izoliranih iz uzoraka meda utvrđeno je

da u većini medova prevladava pelud kestena. Kod četiriju uzoraka u preparatima

nije bilo dovoljno peludnih zrnaca za određivanje botaničkog podrijetla meda.

2. Melisopalinološka analiza, iako je nužna za konačnu potvrdu, sama nije dovoljna

za precizno određivanje botaničkog podrijetla medova, ali je dovoljna za određivanje

njihovog geografskog podrijetla (npr. kontinentalni i Mediteranski medovi u ovom

istraživanju).

3. Mjerenjem sadržaja odabranih metala i nemetala u medu zaključeno je da je

najzastupljeniji od tih elemenata kalij. Ova analiza pokazala se preciznijom za

određivanje botaničkog podrijetla meda od melisopalinološke analize.

4. Komparacija ATR spektara uz asignaciju samo prominentnih vrpci nije pokazala

gotovo nikakve razlike između uzoraka. Kako bi se uzorci mogli razlikovati morala bi

se provesti mnogo detaljnija asignacija spektara i to pogotovo područja valnih

brojeva nižih od 1500 cm-1.

5. Utvrđeno je da postoji povezanost između sadržaja kemijskih elemenata i

sastava peludnih zrnaca u medu.

6. Pokazalo se da je za potpuno precizno određivanje botaničkog podrijetla meda

potrebno provesti još neku kemijsku analizu koja bi dala još jednu razinu na kojoj bi

se uzorci mogli razdvojiti.

51

7. LITERATURA

Afik, O., Dag, A., Shafir, S. (2008): Honeybee, Apis mellifera, round dance is

influenced by trace components of floral nectar. Animal Behaviour 75 (2):

371-377.

Anonymus (2000): Pravilnik o kakvoći meda i drugih pčelinjih proizvoda. Narodne

novine 20/2000.

Anonymus (2009): Pravilnik o medu. Narodne novine 93/2009.

Atkins, P., de Paula, J. (2005): Elements of physical chemistry, 4th edition. Oxford

University Press, New York.

Atrouse, O. M., Oran, S. A., Al-Abbadi, S. Y. (2004): Chemical analysis and

identification of pollen grains from different Jordanian honey samples.

International Journal of Food Science and Technology 39: 413-417.

Bedalov, M. (1985): Scanning electron microscopy of pollen grains of some species

of the genus Arum (Araceae). Plant Systematics and Evolution 149: 211-216.

Boss, C. B., Fredeen, K. J. (1999): Concepts, instrumentation and techniques in

inductively coupled plasma optical emission spectrometry, 2nd Edition, Perkin

Elmer Corporation.

Boumans, P. W. J. M. (1987): Inductively coupled plasma emission spectroscopy,

Part I. Wiley, New York.

Bratu, I., Georgescu, C. (2005): Chemical contamination of bee honey – identifying

sensor of the environment pollution. Journal of Central European Agriculture

6 (1): 467-470.

Faegri, K., Iversen, J. (1989): Textbook of pollen analysis, 4th edition. John Wiley &

Sons, Chichester.

Forcone, A., Galetto, L., Bernardello, L. (1997): Floral nectar chemical composition

of some species from Patagonia. Biochemical Systematics and Ecology 25

(5): 395-402.

52

Frenguelli, G. (2003): Pollen structure and morphology. The 6th European Course

On Basic Aerobiology SECBA, Poznan, Interna scripta.

Frenguelli, G., Mincigrucci, G., Bricchi, E., Romano, B. (1991): Pollini allergenici:

morfologia e aspetti microscopici. Giornale Italiano di Allergologia e

Immunologia Clinica 1: 389-401.

Hesse, M., Halbritter, H., Zetter, R., Weber, M., Buchner, R., Frosch-Radivo, A.,

Ulrich, S. (2009): Pollen terminology, an illustrated handbook. Springer Wien,

New York.

Heil, M. (2011): Nectar: generation, regulation and ecological functions. Trends in

Plant Science 16 (4): 191-200.

Hrga, I., Mitić, B., Alegro, A., Dragojlović, D., Stjepanović, B., Puntarić, D. (2010):

Aerobiology of sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) in North-West Croatia.

Collegium Antropologicum 34 (2): 501-507.

Katalinić, J., Loc, D., Lončarević, S., Peradin, L., Šimić, F., Tomašec, I. (1968):

Pčelarstvo. Nakladni zavod Znanje, Zagreb.

Kenjerić, D., Primorac, Lj., Bubalo, D., Čačić, F., Corn, I. (2008): Palynological and

physicochemical characterisation of Croatian honeys - Christ’s horn (Paliurus

spina christi Mill.) honey. Journal of Central European Agriculture 9 (4): 689-

696.

Kropf, U., Korošec, M., Bertoncelj, J., Ogrinc, N., Nečemer, M., Kump, P., Golob, T.

(2011): Determination of the geographical origin of Slovenian black locust,

lime and chestnut honey. Food Chemistry 121: 839-846.

Lichtenberg-Kraag, B., Hedtke, C., Bienefeld, K. (2002): Infrared spectroscopy in

routine quality analysis of honey. Apidologie 33: 327-337.

Lovašen-Eberhardt, Ž.; Martinis, Z.; Tuđa, M. (1987): Trihomografske i

palinomorfološke karakteristike hrasta lužnjaka (Quercus robur L.) u odnosu

na druge hrastove u Jugoslaviji. Glasnik za Šumske pokuse, posebno izdanje

3: 347-355.

53

Mitić, B. (2011): Palinologija. Interna skripta. Zagreb.

Mitić, B., Halbritter, H. (2008): Pollen morphology of Degenia velebitica (Degen)

Hayek and Sibiraea altaiensis (Laxm.) C. K. Schneid. subsp. croatica Degen

– rare Croatian endemic plants from Velebit Mountains. Periodicum

Biologorum 110 (2): 181-185.

Moore, P. D., Webb, J. A. (1978): An illustrated guide to pollen analysis. Hodder and

Stoughton, Bungay.

Nikolić, T. (ur.) (2012): Flora Croatica Database. On-Line (http://hirc.botanic.hr/fcd).

Botanički zavod, Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu.

Pohl, P. (2009): Determination of metal content in honey by atomic absorption and

emission spectrometries. Trends in Analytical Chemistry 28: 117-128.

Pohl, P., Prusisz, B. (2007): Fractionation of calcium, iron, magnesium and zinc in

bee honeys by neans of tandem column ion exchange and flame atomic

absorption spectrometry. Canadian Journal of Analytical Sciences and

Spectroscopy 52 (4): 207-214.

Punt, W., Blackmore, S., Nilsson, S., Le Thomas, A. (1994): Glossary of pollen and

spore terminology. LPP Foundation, Utrecht.

Serrano, S., Villarejo, M., Espejo, R., Jordal, M. (2004): Chemical and physical

parameters of Andalusian honey: classification of Citrus and Eucalyptus

honeys by discriminant analysis. Food Chemistry 87: 619-625.

Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J. (1999): Osnove analitičke kemije, Školska

knjiga, Zagreb.

Sneddon, J. (1998): Microwave-enhanced chemistry, fundamentals, sample

preparation and applications. Edited by H. M. (Skip) Kingston and Stephen J.

Haswell. Microchemical Journal 59: 472-472.

Stankovska, E., Stafilov, T., Šajn, R. (2008): Monitoring oft race elements in honey

from the Republic of Macedonia by atomic absorption spectrometry.

Environmental Monitoring and Assessment 142: 117-126.

54

Svečnjak, L., Biliškov, N., Bubalo, D., Barišić, D. (2011): Application of infrared

spectroscopy in honey analysis. Agriculturae Conspectus Scientificus 76 (3):

191-195.

Šimić, F. (1980): Naše medonosno bilje. Znanje, Zagreb.

Thompson, M., Walsh, J. N (1983): A handbook of inductively coupled plasma

spectrometry. Blackie, Glasgow and London.

Tuzen, M., Silici, S., Mendil, D., Soylak, M. (2007): Trace element levels in honeys

from different regions of Turkey. Food Chemistry 103: 325-330.

Tuzen, M., Soylak, M. (2005): Trace heavy metal levels in microwave digested

honey samples from middle Anatolia, Turkey. Journal of Food and Drug

Analysis 13 (4): 343-347.

Volarić-Mršić, I. (1970): Istraživanje polena u uzduhu u nekim krajevima Hrvatske.

Acta Botanica Croatica 29: 83-94.

Von der Ohe, W., Persano Oddo, L., Piana, M. L., Merlot, M., Martin, P. (2004):

Harmonized methods of melissopalynology. Apidologie 35: 18-25.

Von der Ohe, K., Von der Ohe, W. (2000): Celle's melissopalynological collection.

Niedersächsisches Landesinstitut für Bienenkunde, Celle.

http://www.pdz.hr/