7
Pigmentation of gilthead seabream, Sparus aurata (L. 1875), using Chlorella vulgaris (Chlorophyta, Volvocales) microalga L Gouveia 1 , G Choubert 2 , N Pereira 1 , J Santinha 3 , J Empis 4 & E Gomes 5 1 Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial-INETI, Estrada do Pac Ëo do Lumiar, N822, Edifõ Âcio G, 1649±038 Lisboa, Portugal 2 Laboratoire de Nutrition des Poissons, Unite  Mixte INRA-IFREMER, F-64310 Saint-Pe Âe-sur-Nivelle, France 3 Aquamarim, Apartado 191, 8702 Olha Äo Codex, Portugal 4 Laboratorio de Engenharia Bioquõ Âmica, Secc Ëa Äo de Biotecnologia, Instituto Superior Te Âcnico, Avenida, Rovisco Pais, P-1096 Lisboa Codex, Portugal 5 CIIMAR, Universidade of Porto, Rua do Campo Alegre, 823, 4150±180 Porto, Portugal Correspondence: Dr Luisa Gouveia, Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial-INETI. Estrada do Pac Ëo do Lumiar, N822, Edifõ Âcio G, 1649±038-Lisboa, Portugal. E-mail: [email protected] Abstract A feeding experiment was conducted over 9 weeks with seven groups of 30 (fish per group) unpigmen- ted gilthead seabream, Sparus aurata (L. 1875) (initial mean weight 145.2 + 12.3 g). Three ex- perimental diets were prepared by adding to a basal diet free of carotenoid (final pigment content of around 40 mg per kg feed): (i) a biomass of the carotenogenic Chlorella vulgaris (Chlorophyta, Vol- vocales); (ii) a synthetic astaxanthin; and (iii) a mixture (1:1) of microalgal biomass and synthetic astaxanthin. At 3-week intervals, five fish were sampled from each tank for total carotenoids analy- sis in skin and muscle. The carotenoid pigments (total amount 0.4%) identified in the caroteno- genic alga were lutein (0.3%), b-carotene (1.2%), canthaxanthin (36.2%), astaxanthin, free and es- terified forms (55.0%), and other pigments (7.3%). Carotenoid pigments were significantly deposited in the four skin zones studied during the feeding trial: the forefront between the eyes, the opercule, along the dorsal fin and in the abdominal area. In the muscle, regardless of the astaxanthin source, the amount of carotenoids measured was very low (less than 1 mg kg 1 ) and differences not significant. More- over, no muscle pigmentation was evident, and there was no variation in the amount of carotenoid analysed in skin tissue, through the trial, for each treatment. It was concluded that supplementing the feed with C. vulgaris would be an acceptable practice in aquaculture to improve the market appeal of the gilthead seabream. Keywords: carotenoids, pigmentation, microalga, Chlorella vulgaris (Chlorophyta, Volvocales), gilthead seabream, Sparus aurata (L. 1875) Introduction The gilthead seabream, Sparus aurata (L. 1875) has been cultured for many years in brackish lagoons along the South European coast because of its rela- tive ease of adaptation to environmental conditions, its fast growth, and low mortality rates (Kalifedas 1991). Its market value increases with increasing skin pigmentation, especially in the forefront area between the eyes, without any apparent consumer concern about the reddish hue developing over the operculum. Fish are not able to perform de novo the synthesis of carotenoids (Goodwin 1984), especially astax- anthin, and they must obtain them via their diet. This is well known for wild salmonids, which obtain carotenoids by consuming their prey, whereas car- otenoids must be provided in the diets of cultured Aquaculture Research, 2002, 33, 987±993 ß 2002 Blackwell Science Ltd 987

Pigmentation of gilthead seabream, Sparus aurata (L. 1875), using Chlorella vulgaris (Chlorophyta, Volvocales) microalga

Embed Size (px)

Citation preview

����������� ������� ��������� ������ ������

��� ������ ����� ����� ������ �����������

��� ����� �� �����

� ������� � ���� ���� � ������� � ��������� � ������ � � ������

���������� ����� � �������� � ��������� �� ������������ ���� � ���� � ������ ���� � ������� �� �� !"#$%

���&�� ���������&������� � �������� �� ��������� '����� (�)�� �*+��,*�(�*� ,�� $�# -��������������.����� ,����$+/������ +0�� � �!�� %1#� 2��3� 4� �)� ������� �&������� � �������� 5��/������� -����3� � 5������������ ��������� -�0����� ��������� +.��� � *�.���� ����

���#!� ���&� 4� �)� �������64��(+*� '��.���� � �� ������ *� � 4�0� +������ %�$� �6#"�%# ������ �������

�������������� 7� ���� ���.��� ��������� ����� � �������� � ��������� �� �����������8 ���� � ���� � ������ ����

� ������� �� �� !"#$%����&�� �������8 �����9 ����8���.��:�����80�

!����� �

+ ��� ��� �)0������� ;� ��� ���� �.�� !;��<�

;��� ��.�� ����0� �� $# =���� 0�� ����0> ��0������

�� ������ ��&���� ������ ������ =�8 �%16>

=������ ��� ;������� 68����8$ �>8 ����� �)�

0�������� ���� ;��� 0��0�� &? ��� ��

&�� ��� ���� �� �������� =���� 0������ �������

�� ���� #�� 0�� <� ��� >9 =�> &����� �� ���

������������ ����� ������ =4�����0�?�� @���

.�����>A =��> �?������� ��)�����A � =���>

��)���� =�9�> �� �������� &����� � �?�������

��)�����8 +� $�;��< �����.��� ��.� ���� ;���

��0�� ���� ��� ��< ��� ���� �������� � ��?�

��� �� �<�� � ������8 ��� �������� 0�������

=���� ������#8 B> � ������� �� ��� ��������

����� �� ;��� ������ =#8$B>� ��������� =�8�B>�

����)����� =$�8�B>� ��)������ ���� � ���

������� ����� =668#B>� � ����� 0������� =18$B>8

4������� 0������� ;��� �����������? �0����� ��

��� ���� �<�� C���� ��� �� ����� ��� ��� ��� ����9

��� ��������� &��;��� ��� �?��� ����0������� ���� ���

���� ��� � �� ��� & ����� ��8 �� ��� �������

���� ���� �� ��� ��)����� ������� ��� ����� ��

�������� � ������ ;� .��? ��; =���� ���

��� <���> � ���������� ��� ����������8 (����

�.��� �� ������ 0���������� ;� �.� ���� �

����� ;� �� .������ �� ��� ����� �� ��������

��?�� �� �<�� ������� ������� ��� ����� ��� ���

��������8 �� ;� ������ � ��� ��00��������� ���

��� ;��� �� ������ ;��� &� � ���0�&�� 0������

�� /�������� �� ��0��.� ��� ��<�� 00�� �� ���

������ ��&���8

!�"#���� �������� �� 0����������� ��������

����� ������ =4�����0�?�� @��.�����>� ������

��&���� ������ ������ =�8 �%16>

"��� � ���

��� ������ ��&���� ������ ������ =�8 �%16> ��

&��� ������� ��� ��? ?��� �� &��<��� ������

���� ��� -���� ����0�� ���� &����� �� ��� ����

��.� ��� �� 0����� �� ��.��������� ��� �������

��� ��� ���;��� � ��; �������? ���� =D���� �

�!!�>8 ��� ��<�� .��� �������� ;��� ���������

�<�� 0����������� ��0�����? �� ��� ��������� ��

&��;��� ��� �?��� ;������ �? 00���� ��������

������� &��� ��� �� ��� ��� �.���0��� �.�� ���

�0�������8

,��� �� ��� &�� �� 0������ �� �� � ��� �?�������

�� �������� � =��� ;�� �!% >� ��0�����? ��)�

������ � ���? ���� �&��� ���� .� ����� ���8

���� �� ;��� <��;� ��� ;�� ������ �� ;���� �&���

�������� � &? ��������� ����� 0��?� ;����� ���

������ � ���� &� 0��.� � �� ��� ���� �� �������

+/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$

� �##� 5��<;��� -������ �� !%1

���� �� ������ ��� ������������ 0���������� ��

����� �����8 �� ������ ����� ���� ���������

�?������� ��)����� �0 �� �##�� �� ��)�����

<��� �� ��� =����0�� *������� ����>8

�� ������� ;��� ������ �� ���� ���������� ��

.��&�� ��� ������� ��&���8 -��� ��� ��� �)�

0�������� ;��� �������� ���� �.� &��� ��� ����

�� ��� 0�� �� ��� ������� �� ��&���� ������

����� =�������< E -�������� �% $> =D�?�

�� �8 �!1 A ��< �� �8 �!1�>8 ��� ������ ��� ?

���;� ��� ������� ��� �� ��&��� �����

���.��� ��������� �� ��)������ ����� ���� ��

�)���� ��)����� ���� ��� ��� � �0���� ��

���� ��� �����8 ��� ����� ��� ? ��0���� ��� ��

��&��� ����� ���.��� ����)����� �� C�)�

����� ���� ��)�����8 ����� �;� �������� �

;��� �0����� �� ��� ����� �� ��� ���� ;������ �� ��

�������8 (��� �������?� �� ;� �������� ��� 0�� ��

��� ��)����� ������ ������� &? ��� ���� �� ���

�&���C� �� ���)����� =,�F�� �� �8 �!%$>8 2� ���

����� �� � ��� ��� �� �����0������ ��� ��00���

����� ;��� �������� �������� � �������� ��� ��

�� �� �� ��0��.� ��� �<�� ������ �� ��� ������� ��

��&���� �� �� �������? �� ��� ���� ���� ��00���

����� ;��� ��)����� ������� &����� ��� ���� ;���

��� ���.��� ��� ����� �������� � ���� ��)�����

=<C�� �� �8 �!% >8

+���� ��� �����;��� ��������� ����� ��

����� =4�����0�?�� @��.�����> �� &��� ��������

����? ����� ��� ��0��.��� ��� 0���������� ��

���&�; ������ ���������� ������ =G�&��>

=���.�� �� �8 �!!�� �!!1� �!!%>8 �� 0��.����

��� ? =���.�� �� �8 �!!�&>� �� ������ ;�

��0���� �� ������ �������� � 0������� �� �������

������� �0 �� #8 B &? ;����� =������� �? ;�����>�

�� ;���� %#B ;� 0������� �� ������ ����� 0���

����� =����)����� � ��)������ ���� �

����� �����>8

5�� �0�� ���� &�<����� � ��� 0��0��� �� ����

;��< ;� �� �.���� ��� 0������� �� ��� ��������

����� �� �� ������ � 0���������� ������ ���

��� ������ ��&��� �� ������ �� ���0����� ;���

�?������� ��)������

#�������� �� ���� �

�$���������% ����������

��� �)0������� ;� 0������� � ���� ��� �����

� 2��3� �� ��� ����� �� ������� ����� !�;��<

0���� 8 �� ����� ��# ��0������� ������ ��&�

���� �� ������� ;��� � ������ ��� ;����� ��

� 68����8$ �� ;��� �� ���? �����&��� ����

��.�� �/��� �##�� �������&�� �� ��� ��<� =�����

�)0�������� �� �0����� � �������>8 7����� ���

�)0�������� ��� ;��� ���0������ ���� ����

�! �4 �� �6 �48 ��� ���� ;��� 0�� �� ��� ��<

��� % ?� &����� ������� ��� �)0�������8

+� $�;��< �����.��� ��� ����0 ;� ;����� ��

&��< � ��� ��? ����� ;� F���� ���� ����?8

,�.� ���� ;��� ����.� ���� ��� ��< ��� ��?���

� ;��� ��������� ���� &���� ��������C�

����� ���?���� ��?��� ����0���?� ����� =#8% � ���>8,��� C���� �� ��� �<�� =,��8 �> ;��� �������� 9 ���

��������� &��;��� ��� �?�� =C��� �>� ��� �0������

=C��� �>� ���� ��� ���� ��� =C��� $>� � ���

& ����� �� =C��� > ���� ;��� ��� ����

������8 -�0��� ;��� ����� ���C�� � =��% �4>����� ��?���8

���������� ������� ����� ��� &�����'

����'�����

��� ������� �� ������;� ������ ���� �&���

���? ������� �� ������������ ������ ='4 6%>� ;���� ��

00��� � ���������� � ;� �����.�� ��

-���<�� � D���� ���;�� �� ��� =@����<

�!%�>8 4������������� ;� 0������� ���� ���

�� ���.�� �� �8 =�!!�&>8

-?������� ��)����� ;� ��� � ;��� ��0����

�&�� &� ���� =4��0�?�� 0��<�� ,8 H��������

*����� 5���� -;��C���� > �� %B =;I;> ��)�����

�������8 ��� &� ��� ���������� �������� �� �����

����� ��0���� �� ��)����� �� 0���� ��� �����

�� ����) �� ������� ������� � ��� ������ �

;� ��&���C� &? ��� ����� �� ����&?� 0������

� ������������0����� � ����)� ��� =D��J � E

5�������� �!%�>8

(�'��� ��� ���� C���� �� ��� �<�� ��� �� ��������

�������� ������������8

����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8 +/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$

!%% � �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$

+ &�� ��� ���� �� �������� � =�&�� �> ;�

�������� ���� ��� �� ��� �������� ��/���������

���&����� ��� ��&��� =-����� �� �8 �!!6>8

,��� �)0�������� ���� ;��� 0��0�� � �����;�9

=�> &�� ��� ;������ �������� � � = ����� �

42�>A =��> &�� ��� ��00������� ;��� �� ������

&����� �� 0��.� � #�� �� ���� 0�������I<� ���

= ����� � +��>A =���> &�� ��� ��00������� ;���

�?������� ��)����� �� 0��.� � #�� �� ��)�

�����I<� ��� = ����� � +-�>A � =�.> &�� ���

��00������� ;��� ��)���� =�9�> �� ��������

&����� � �?������� ��)����� �� 0��.� �

���� �� #�� �� 0�������I<� ��� = ����� � (�K>8

,�� ����� ����� ;��� ��)� �� � ����C����

����) ��&&�� ��)�� =�� 8 (��� �## � �0���?�

4�(� -� ,�������� '-+> ��� �6��� � 0������

����� �������� 0�������� ������ =�� 8 $###�

4�(� -� ,�������� '-+> ����� ;��� 86���

��8 7����� ��� �? 0�������� 0������� ��� ���0���

���� �� ��� ��� ��)���� .��� &��;��� 6# �4 �

�# �48 7���� ;��� ��&��/�����? ����� � � �4

����� ���8 ,��� ;��� �� ��� �;��� ? � ���

�� �B &� ? ;����� 0�� ? ���������� ��� �)0����

����� ��� ��� 0���� 8 ��� ��? ����� ;� �.� �

���� �/�� 0������� � �� � ;� � ��� �����

���� �� ���� ��� ;��� ��� ����� 0����0���� 8

��� ��< ;� ��.��?��� ;��� �� �������� ��

;��� =$% � ���> � ��� �� �## ����8

!������ �� ���� �

L���������� 0������� ���� � ;����� ��� =�>�

-0������ ���;�� *�� =-�*>� M=�� ���� ;������ ��

������ ;�����>I ?�N��##� � ,�� ���������?

*��� =,4*>� M;����� ��� =�>I��� ���<� =� 7(>N

;��� ����� � �� ��00��� ��� ����� ��� ������ ��

��� �)0�������8

+��?��� �� ��� ���� � ���� ��0��� ;��� �����

��� �� �0����� ���� ��� �� ��� �����;��� 0���� �

����9 �? ����� &? �?��� �� � �.�� � �#6 �4 ���

� �A 0������ =��8�6> &? ��� DF�� �� ����� ����

�� ��������A ��0� � &? 0�������� ����� = #"�# �4>

�)������� �� ���������� ������� ��)���� 00��

��� =��4+�2*� -;� ��> M+��������� �� 2������

+��?���� 4������� =�!16>NA �� &? ����������� ��

� �.�� � 66# �4 ��� ��� =+2+4 �!16>8 +��?��� ��

�������� �������� &����� ;� 0�������

���� ��� �� ���.�� �� �8 =�!!�&>A ���� �������� �

�� ��� ���� �<�� � ������ &? �)������� ;��� ����

��� � �0�����0���������� =�� 8 �###� H��+4H��

��<?�� O0�> /����������� =4���&��� E

-����&<<�� �!%!>8 4������� � ;��� �)0����� ��

�? &��� ����� ��� �)�������� ������������ =��B���>

�� ��## ��� ��)����� � ��6# ��� ��� 0�������

� ����� &���0���� �)���� �� �������������

=���.�� �� �8 �!!1>8

7� ���� ��� �������� ��?��� �� ��� �<�� �

������ ;��� ��&F���� �� ����;? ��?��� �� .���

��� =�����> � ��� ���������� &��;��� ���

.���� ;��� �.���� ����� ��<�?P� �����0�� ����

0������ ���� ��� ����������� =L� �!% >8

$������

��� �������� ���0������� �� �� ������ �������

�� ��.�� �� �&�� �8 ��� ���� ����� �� ��������

0������� ;� #8 B �� �? &���8 ��� ����� ��

��)����� =���� � ����� �����> ;� 668#B8

,��� �� �� �)0�������� ����0� ���; ������?

=�&�� $> � �������? ;� ���� ��� �B8 2��

0��&��� ;��� ��� ������� ��< =;������ 0������>

���� �;��<� ������� &�� ;������ ������������ ��

� .�� ����8 7����� ��� !�;��< ��� ��� �����

���� ���� �� ��<� ������� �� ;����� &? 00��)��

����? �868 ����� ;��� �� ���������� ����������

=��#8#6> �� ���� ;����� ���� ��� ����8 ���

-�* ���� ���� #8!� ��� ��� +-� ����0 �� �8��

)� %� ����� ����� � ������� ���0������� �� ���

&�� ���

���������� ��

���� ����

����� ���� �

����� ��

���� ��� ��

������� ������Q �

������� ������R ���

������� �������� ��

������� ����������

�! ������ " �# "$# %���

������� "$ �# &��

��� "$ �# �'��

(�� "$ �# %��

������� �����������()* '�'

(�+ �

�,- '&�

S,��������&�� 0������ ����������8 Q=�� <��� ���>9 .����� �� �#A

.����� D� $6A .����� 5�� 6A .����� 5�� 6A .����� 5$� �#A .���

��� 56� �##A .����� 5�� 6A .����� 5!� �A .����� 5��� #8#6A

.����� H =&�����>� #86A ����&�� �� � �##A ������&��C��� �� �

6#A ��������� 6##A ='� <��� ���>9 .����� +� �# ###A .�����

7$� �###8 R=�� <��� ���>9 4���� #8 A 4���� 68#A ,���� #A ,����8#A ���� #8�A (���� �##A (���� �#8

+/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$ ����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8

� �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$ !%!

��� ��� (�K ����0 �� ����8 ����� ;��� �� ����������

����������8 ��� ��� ���������? ���� ���� ����

#8�$ ��� ��� 42� ����0 �� #8�� ��� (�K ����08

����� ������� ������� ��� ��� �)0������� ;�

����� ��� �� ����� ��� ��� ������ ��� ��&���

���;��8

��� 0����� �� ��� �������� 0������ ���������

���� �� ��� ���� �<�� C���� ����� ��� ��� ��� ���� ��

���;� �� ,��8 �8

)� %� � ������ �� ��00������� ��)����� �� ��� ��� �� ��� ���;�� ��� �� ���� � ��� ���.������ ���

����� ���� �� � ���

������� ���������� ��

(� ����� �'��� �'� �'��� �'� �'��� �'� �'��� �'�

(.��� /��0� ����'� ���� ����� � � ����� �� ��%� � ���

(.��� �/��0� �&%�&� � ��� � %�� �%�&� &�' �&%��� � ��

(.��� %/��0� 1 '�&�'� ���' '���� ��% ''��� �&

�������� ������ ���� �������Q(.��� /��0� ���� ���& ���� ��&'

(.��� �/��0� ���% ��&� ��% ���%

(.��� %/��0� 1 ��%& ��% ���'

�������������������R

(.��� /��0� ��' ��'% ��& �� �

(.��� �/��0� ��' �� �� ��

(.��� %/��0� 1 ���' ���� ����

S4���� ��� ;��� �� ��)����� � A +��� ��� ������� �������� &�����A +-�� ��� ������� �?������� ��)�����A (�K� ���

������� ��)���� �� �������� &����� � �?������� ��)����� =�9�>8 Q-0������ ���;�� ���� M=�� ���� ;������ �� ������ ;�����>I

?�N��##8 R,�� ���������? *���� M���� ;����� =�>� ������ ;�����=�>NI��� ������0���� =� 7(> ��� ������ ���&�� �� ���� =�> ;� �#A �

$;��<� ��6#A � �;��<� �� # � � ��� �� =!;��<�> ��$#8 7� �� 0������� � ����� -7� ��68

0

Zone 1

ALG

AST

MIX

Cont.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

TO

TA

L C

AR

OT

EN

OID

S(m

g/kg

dry

wei

ght)

3 6

TIME (weeks)

9

0

Zone 2

ALG

AST

MIX

Cont.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

TO

TA

L C

AR

OT

EN

OID

S(m

g/kg

dry

wei

ght)

3 6

TIME (weeks)

9

0

Zone 3

ALG

AST

MIX

Cont.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

TO

TA

L C

AR

OT

EN

OID

S(m

g/kg

dry

wei

ght)

3 6

TIME (weeks)

9

0

Zone 4

ALG

AST

MIX

Cont.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

TO

TA

L C

AR

OT

EN

OID

S(m

g/kg

dry

wei

ght)

3 6

TIME (weeks)

9

(�'��� � ���� �������� �0������� �� ��� �<�� ��� �� ��� ���� =+��� ��� ������� �������� &�����A +-�� ���

������� �?������� ��)�����A (�K� ��� ������� ��)���� �� �������� &����� � �?������� ��)����� =�9�>A

4���� ��� ;������ 0������ ��00������>8

)� %� � 4������� ���0������� �� ��� ������������

��� ����� ������ =4�����0�?�� @��.�����>

���������� �

)2���� ��

�3�������� ��'

������������� ��'

(���������� ".��� ��� ����� .����# ����

4���� ��5����� &�

����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8 +/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$

!!# � �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$

�� C��� �� ���������� =��#8#6> ���� �� ����

0������� ;� �&���.� ��� �� ��������� �����

;��< �8 ���� ;� ���� �.�� ��� ���� ��� ;��� ��

��� 42� ���� ;���� ������� �� � ������

��� �8 ��� �������� ������������� �� ���� C���

;��� ������� &? �8$� �8 � �81 � �8� ������ ���

���� �� ���� 42�� +��� +-� � (�K ���0����.��?8

+���� ;��< �� ��� �������� ������������� �� ���

��������� �� ��� ���� ������ =���� ��B> ��� ��

���������8 ��� �������� ������������ �� ����

C��� ;� ��;�� ��� ���� �� +��� �)��0� � ;��< $8

��� ���� �� (�K �)��&��� ��� ������� ��������

������������ � �;��<�8

�� C��� �� ��� �������� ������ ;��� ��;��

=�6#B> ��� ����� ���� �� C��� �8 + ����������

=��#8#6> ���� �� ��� ���� �������� � ;� ����

&��;��� ��� &�������� �� ��� ��� ? � ;��< $ ���

�� ���������8 ��� �������� ������������� �

;��< � ;��� �� ��� ��� ������ � � ����� �&�

���.� � ;��< $8 ��� ���� �� ��� +-� �;?�

�)��&��� ��� ������� �������� �������������

�.�� � ��� �� �� ��� �)0�������� ;����� ��� ����

�� ��� ����� ���� ���;� ������ �� ��������

�������������8

��� ���� �� �������� ������������� �� C��� $

;� ������� ��� ���� �� +�� ��� � ��� ��;��� ���

���� �� (�K ��� � ;��< $8 ��� �������� �������

������� �������� �� ������� ����� ;��< �� � ����

������ ������� �� ;��< !8 ��� ���� ��������

������������� ;��� �� ��� ��� ������ � � �����

���� ��� ��� C��� �8 ��� ���� �� ��� +�� ������

��� ���� �������� � �� C��� $ ��� � ���� ����

��� ����� ����0� �� ��0���� ���8

4��0�� ;��� ��� ����� C����� ��� ��������

������������� ���� �� C��� ;��� ��; =���� ���

�#��<��� 7G>8 +� ;��< $� ���� �� ��� +-� �)�

��&��� ��� ��;��� ������������8 +� ;��<� � � !�

��� �������� ������������� ���� ����� ���� ;���

��� �������8 ��� ���� �� ��� +�� � ��� ��;���

�������� ������������� � ��� ��0���� ���8

���� �������� ������������� �� ��� ������ ��

0������� �� �&�� 8 ��� ����� �� �������� �

����� � �� ��� ������ ;� .��? ��; ��� �� ����

=���� ��� ��� <���> � ����� ;��� �� �������������� ���������8 (����.�� ����� ;� �� .������

�� ��� ����� �� �������� ���������� ��� !;��<�

����8

%�� �����

'� �� ��� ������ �� ������� ��� ������� �� ������

��������� ����������� ����)����� � ��)�

����� � ��� �F�� �������� 0������ =���.��

�� �8 �!!�&>8 ��� ��)����� ������� ���� �� ��

����� �.� ��� &��� ��0���� � &�� �� "������������

�� ����� ������ ��� &�������� �� 4�����0�?�

=�� �� @��.�����>� �� ;� ��0���� �� &� ���

=$*�$�*>��0���� ������ =����� �� �8 �!!�>8 ���

�?������� ��)����� =4��0�?�� 0��<�> ��� ��

���� �)0������� �������� �� � �0�����? �����.�

��)���� =�9�9�> �� ��� ����� =$-�$�-> =$*�$�-�����>

� =$*�$�*> ������� ���0����.��? =,��� �� �8 �!% >8

�� ���� �)0�������� ������ ��&��� ;��� ��

��.�� �� ��� �0 �� �B �� ��� ��� ;������ �? ������

�� ���;�� ������� �? �����������8 ���� ������ ��

�� ���� ��� ;��� 0��.���� ���� ���� ��� ������

��&��� � ���&�; ������ ���;��� ��� ���� ��

������� ���� ��������� .����&�� 0������� �� �0 ��

$#B �� ��� ��� =(��? E -���� �!1%A D����< E

��/��� �!%#A ���� E O�<��� �!%6A ���� �� �8

�!!�>8

+��)����� �� &��� �������� �� ������

���� ���;�� �;��� �� ��� ����� �� 0���.�����

)� %� � (����� �������� ������� ����� ��� �)0������� =���� -7� ��6>

����

�������

�����

�� � ��� ����

��%'� ���%Q�6� ��%�� ��� �6� ��� ���& �6� ��%�� ��� �6�

� ��%� ���& �6� ��%� ���� �6� ��%�� ���� �6� ��&�� ���� �6�

% ��% � ���% �6� ��%�� ��� �6� ��%� ��� �6� 1

S4���� ��� ;��� �� ��)����� � A +��� ��� ������� �������� &�����A +-�� ��� ������� �?������� ��)�����A (�K� ���

������� ��)���� �� �������� &����� � �?������� ��)����� =�9�>8 Q�&��� � �� ��� ��� ������ ������ ��� ��� ������ ��

��� �����������? ��������A )�?�C� � �� ��� ��� ��; ������ ��� ��� ������ �� ��� �����������? ��������8 ��� ������ ���&�� �� ���� =�> ;�

�#A � $;��<� ��6#A � �;��<� �� # � � ��� �� =!;��<�> ��$#8

+/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$ ����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8

� �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$ !!�

+ =���� �!1�>8 2�� �)0�������� � ;��� � 0��.����

;��< �� ���&�; ����� =4���&��� �� �8 �!!%> �

��� ���; &�������� ������ �� ��� ���;�� �� ���

��&��� &? ��)�����8

��� ���� �<�� C���� ;��� ������ ��� ����� ��<��

�������8 (� �������� ��������� �����? 0�������

���� 0������� �� ����� C����� ����� �� ;�� �����

;����� ������ ��&��� 0������� ;��� 0���

����� �� &��;��� ��� �?��� �� �0������� �

������� ����� ����8 2�� ������� ���;� ��� ��� �

��� ������ ��&��� ;��� �������� � ��0��.�

��� 0������ ������� �� ����� ���� C����8 2���� �)�

0�������� �.� ���;� ������ ���� ��� ��� �������

�� ��&��� =D�?� �� �8 �!1 A ��< �� �8

�!1�>8 G������ ��� �������� ������ 0��.� ��

&����� ������� ;� �0�� ��� �0�� ��� C��� �� /����

����8 �� ������ �������� ������ �.� ������ 0���

�������� ��� C���� � � $� ;����� �?�������

��)����� ?��� � &����� ������� ��� C���� � �

8 ��� ��� ���&������ (�K �.� ��� ��;��� �����

���� ������������� ���� ���� �� C���8 ���� ����

����� ���0������� &��;��� �������� � ��� �����

&���0���� � �� ;� ���;� �� ���&�; ������

;���� &���& ���� ����? �������� � ;��� �? ��)?

� <��� ��������� =�8�8 ��)�����> ��� �����

;��� <��� ��������� ���? =�8�8 ����)�����>� �

��� ����� �� ���� �� ��? &���&� ��� ������

��� � 0��������� ���? �? ��)? ��������� =�8�8 C�)�

����� � ������> =������� �� �8 �!!�>8

5�� �� ��� �������� �� ;� ��� 0����&�� �� ��&���

�� 0����&�� �������� ���.������ 0��;?8 H�;�

�.��� ���� ������ �� ������ ;��� ������ �� C����

�� $ � ����� ��� ;���� �)0�������� ;����� ��

00��� �� C��� � ���? � ��� ;��<�$ ��0����8 ��

�� ����� ��0��� ���� C��� � =;��<� � � !>�

������ ;� ��� ������ 8 �� �� ������ �� ��)�����

���� �� ����� ���� C���� ��� ���� ��� ��� �� �� ���

������ ��&��� ���.���� ������ ��������

���� ��)�����8 �� �� &��� ���;� ��� �������

�� ��&��� ����� ���.��� ����� �������� � ����

��)����� =<C�� �� �8 �!% >8 ��� ��&���C����

=0�������<�> �� ��� �������� � �� ��� �������� 0���

�� ��� �<�� ���� �;��<� �? �.� &��� �� ��

�������� �� �������� � �� ��� �������8 ���� 0���

������� ;� �&���.� ������ �� ��� ?��<� =���.��

�� �8 �!!��>8

�� ��� �)0�������� �� �������� � ;��� ������

�� ��� ������ �� ��� ���� �� ���� +��� +-� �� (�K8

��� �������� �0������� �������� �� ��� �����

�� ��&��� ����� �� &� �������� ���� ��� ��

��� �� ��&��� � �� ;� ��0���� �� ��� ���

�)0������� ����� ����)����� � C�)�����

��� �� ��&��� ;��� &�� �� �0���� ����� 0���

����� �� ��� ����� ;������ �� �������� =��<

�� �8 �!1�>8 �� �� 0��.�����? &��� ���;� ��� ����

����� �� ���� ����� �)� �C� ��� $� $� � � �

0�������� �� ��� �������� ���� =��< �� �8 �!1�>8

'� ����� ��� �� ���� �������� ��/����� �������

��� ?8

�� ����������� ��00��������� ��� ��� ;��� ��

������ ;��� &� � ���0�&�� 0������ �� /�����

���� �� ��0��.� ��� ��<�� 00�� �� ��� ������

��&���8

! &�'�� ������

G� ���< ,8 H������� *���� � 4�� ���&���

�������� ��� 0��.� ��� �� ;��� 4��0�?�� 0��< �

�?������� ��)�����8 ���� �)0������� ;� � �

0����&�� ������� ��� ��������,���� -���������

� �������� 4��0������ �)����� ������

=O�4��,����� ��&��? � ���&��� �������� 0��F���

�!!�I#����$>8

$����� ��

+2+4 =+��������� �� 2������ +��?���� 4�������> =�!16>

�##���� $����� �# �������� ���� � �8 +��������� ��

2������ +��?��� 4�������� ���8� G��������� 74� '-+8

4���&��� �8 E -����&<<�� �8 =�!%!> 7���"���0���� ��

��)����� � ����)����� 0���������� �� ����

&�; ����� �� .����� ����? �������� � ���������

�����8 � �������� *� �!"118

4���&��� �8� 5��� O8�(8 E ������� H8 =�!!%> ������� ��

����? <������������ � =����)����� � ��)�

�����> �� ��� ��0�� ����.� 0��������� �� ����� ����

&�; ����� ���������� ������ =G�&��>8 � ��������

%�������� �� � !"�6 8

,��� �8� -����&<<�� �8� -���� � D8� �����O����� -8�

+������� �8 E -������ D8 =�!% > 4������� � �� ���� ���

������ �8 �8 ����������� �� ���&�; ����� ;��� ���

�� �.� �� �0���� ������� �� ��)����� �� ���0�����

;��� ����)�����8 � �������� �� ��$"���8

,�F�� �8� -�<� (8� G��&� �8� D��F�� 48� (�<� G8�

T������ D8 E D����� -8 =�!%$> ����������� ��

������� �� �� &��� ;��� ��)����� ������ 0������

���� <���� ���8 ������ �# �� �# �� &������� ������� �#

�������#�� '������� �+� �%66"�%��8

��� ;�� �8G8 =�!% > (� ����������� �# ������������

,�%- ..8 4�0�� E H��� ��� ��� 'D8

���.�� �8� ����� �8 E ��0�� O8 =�!!�> �������� ��� ��

�������� =����� ������> �� ��� 0���������� ��

���&�; ����� =���������� ������> ������8 &����� �#

�����������)*���������� ��� '������� �/�� 16"1!8

���.�� �8� @����� @8� *��� +8� ,���� �� H8�8� ��0�� O8 E

�.�� O8(8 =�!!�&> �.������� �� ��� 0������� ��

����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8 +/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$

!!� � �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$

����� ������ ����� ��������������8 ������������

(������� �0� �61"��$8

���.�� �8� @����� @8� *��� +8� ,���� �� H8�8� ��0�� O8 E

�.�� O8(8 =�!!��> ����� ������ ��� �� ������

��� ?��<8 &����� �# '��� ������� ��� (������� 0/�

��1"�1�8

���.�� �8� ����� �8 E ��0�� O8 =�!!1> '�� �� �����

������ �� ���&�; ������ ���������� ������� ���� ��

������ ������ 0����������8 &����� �# ������ � ���

������ 0� ��"1#8

���.�� �8� 4���&��� �8� ����� �8� *�� �8 E ��0�� O8

=�!!%> '�� �� ����� ������ � �������� ������ ���

������ �9 ������ �� ����? ��0� ������� �� 0�������

����� ������&����? � ������� ���������8 � ��������

+����������� 1� �"��8

����� (8� 7P-��C ,8� 5���;��C< (8 E �����O����� -8

=�!!�> +��� �������� � �8 -���� �? �������� � �8

"������������ �� ���� 0����0���� � ������ �� =$-�

$�->���)����� ������8 &����� �# ������ ������� ��

��6"�1�8

������� +8� 4���&��� �8 E 7� � ��� O8 =�!!�> +&���0����

� &��� ������� �� �&���� �������� � =M� 4N��)�

������ M$HN����)����� � M$HNC�)�����> ��

����� ����� ���&�; ����� =���������� ������>8

��������� � ����������� ��� �������� /�2 =�>�

$#�"$#�8

D���� � �8 =�!!�> +/��������9 �.���0����� 0������

��������� 0��&����� ��� ������8 '����� %�,� -������.

��� �"6�8

D�?� �8� (�?�� �8� ��< T8� -������ (8�

-��0��� D8�8 E 4��������� 4828 =�!1 > ��� &���?�������

�� ��)������K@8 ��� �������� � �� ��� �� �� ��

&���� / ����� �������� (����� � ��� �����0������ ��

�&���� ��)����� ���� ��� ��� �� ��� �� �� &��� ��

����� &� ? ��)�����8 ������ �# �� �# �� &�������

������� �# �������#�� '������� �/� !1"�#$8

D����< -8O8 E ��/��� �8 =�!%#> ��������� �� &������

0������ �����0������ � �� ���0��� ���� ��

��00���������� �� ���� ���� �� ���;�� �� ���&�;

������ ���� ���������� *���� ���8 � �������� +�

��$"�168

D��J � H8 E 5�������� O848 =�!%�> 4������� ��?����

����� �8 ��9 ����������� �� �������� ��� 0������ �

��������� =� 8 &? O848 5�������� >� 008 1"$�18

+� ���� ������ �; T��<� '-+8

(�C '8 =�!%$> ���������� �����������1 �������� �������

,8 H�������� *���� �� � 5���� -;��C���� 8

(��? +8O8 E -���� �8 =�!1%> �.������ �� ?����

&������� � � �� � 0������ ������ ��� ���&�;

�����8 �8 ������ �� 0������ ��.�� �� ���;��� ����� ���.���

���� ���������? � 0������ ���.������ ���������?8 � ���

������ �� �$6"� �8

<C�� O8�8� ����� -8� D������ H8 E �<����� (8 =�!% >

������� �� ��00������� �������� 0������� �� ������

��� � ���������� �� ?���� �� �� &��� =����

������ �����>8 ������ �# �� (���� !������ '�������

!������ ���������� �� �!" �8

���� �8� +��)�� (88 E 7.��� -8O8 =�!!�> ����� ��&����

������ �� ������� ;��� ��?&�� ��� 0�� ���� � ��

��.��.�� �� ���� ��� ��� ������ �� &��� ������ ������

=�8>8 � �������� !������ �0� � 1"�6�8

���� �8+8O8 =�!1�> @����� +8 ��9 ����������� =� 8 &?

28 �����>� 008 1�1"1 �8 5��<�J����8 @���� 5����

-;��C���� 8

-����� �8� ����� �8,8 E 4���&� O8 =�!!6> ������� ��

0������ ��.�� �� ��� ��� �� ������&����? � ���;�� ��

������ ��&��� =������ ������ �8>8 � �������� %�����

���� �� %�"%18

���� +8�8O8 E O�<��� +8O8 =�!%6> '����C���� �� ���.���

����� � �����.������� 0������ ������� �� 0������

���� ��� 8 ��9 %�������� ��� '������ �� '�� =� 8 &? 4858

4�;�?� +8(8 (�<�� E O8�8 5���>� 008 ��!"� 68

+� ���� 0����� ��� ��� 'D8

��< T8� D�?� �8� -��0��� D8�8 E 4��������� 4828

=�!1�> ��� &���?������� �� ��)������KK8 ��� ������

��� � �� ����� �� ���� � ��� ���&����� �� ���

�������� � �� �� &���� ��������� ����� (�������

��� �����8 ������ �# �� &������� ������� �# �������#��

'������� ��� ��11"��%�8

@����< +8 =�!%�> �&�����? ������/��� ��� ��� �����.�

���� �� ��������8 ��9 "������� �# $������� $��� ���

���� =� 8 &? +8 *������ >� 008 ��1"� 68 4*4 ������

5�� *���� '-+8

L� O8H8 =�!% > ������������� �������8 �������� H��� ������

;�� 4������ O� '-+8

+/�������� *������� �##�� �� !%1"!!$ ����������� �� ��� ������ ��&��� � ��� ��� �� �8

� �##� 5��<;��� -������ �� � � �������� !������� �� !%1"!!$ !!$