Aislamiento de DNA plasmdico.Guzmn Neri Kevin Alberto, Jimnez Chvez Ivn; Equipo: 4 Seccin 2; 4QM2

Introduccin:El cido desoxirribonucleico presenta una estructura espacial en forma de doble hlice, con las dos hebras unidas por medio de enlaces qumicos. La funcin principal del ADN consiste en transmitir los genes, es decir los caracteres biolgicos de un individuo determinado. En los genes del ADN estn grabadas las instrucciones necesarias para la construccin de un individuo completo. Siguiendo estas instrucciones, cada clula es capaz de sintetizar sus protenas y de adoptar la forma y funcin que le corresponden dentro del organismo.El DNA est compuesto por una larga cadena de 2-desoxirribosa unidas por enlaces fosfodiester, se realiza mediante un grupo fosfato unido al hidroxilo del carbono 5 de una unidad y al hidroxilo 3 de la siguiente. Estos constituyen el armazn pero son incapaces de codificar y transmitir informacin, lo que le confiere esta propiedad es que cada monmero de la cadena est unido por enlace glucosidico a una base heterocclica exisitiendo dos tipos de bases: Pricas: Adenina(A) y Guanina(G) Pirimidnicas: Citosina(C) Timina(T) y Uracilo(U).Finalmente las cadenas opuestas (5-3 y 3-5) se unirn ya que cada base A-T y G-C interaccionan y forman enlaces de hidrogeno fuertes.Plsmidos:Los plsmidos son molculas de DNA extracromosomal presentes en algunas bacterias. Los plsmidos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero tambin los hay lineales. La replicacin de los plsmidos es independiente de la replicacin de los cromosomas del husped.Los plsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la clula, pero proveen una ventaja metablica, dado que le confieren a su husped caractersticas selectivas como resistencia a antibiticos, nuevas habilidades metablicas, factores de virulencia produccin de toxinas etc.

La serie de plsmidos pUC son tratados en un medio con IPTG (inductor de la sntesis de -galactosidasa en E.coli), ampicilina y X-gal, lo que les hace dar lugar a colonias resistentes al antibitico y de color azul (se rompe el X-gal) pues producen -galactosidasa funcional. El ms representativo es el pUC19, que lleva un origen de replicacin en Escherichia coli y el gen de resistencia a la ampicilina.

Electroforesis:La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. Es una tcnica consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una placa de gel.Las propiedades de una molcula determinan la velocidad con que un campo elctrico puede desplazarla a travs de un medio gelatinoso. Segn la naturaleza de la carga neta, las partculas cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo.La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una tcnica sencilla y rpida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante. La separacin de las macromolculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando el ADN, se mezcla en una solucin tampn y se aplica a un gel, esas dos variables actan conjuntamente. La corriente elctrica de un electrodo repele las molculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae, Al aplicar un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harn migrar hacia el nodo. La fuerza de friccin del material de gel acta como tamiz molecular, separando las molculas en funcin de su tamao. Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros, dependiendo su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores: Fuerza del campo Tamao y forma de las molculas Hidrofobicidad relativa de las muestras Fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas. Objetivos:Aislar DNA plasmdico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante electroforesis en gel agarosa.Anlisis de la tcnica: Solucin:I. Solucin GTEII. SDS 1%-NaOH 0.2 NIII. Acetato de potasio 5MIV. IsopropanolV. Regulador Tris-EDTA (TE)

1. Se usan bacterias transformadas con un plsmido.2. Crecer las bacterias en medio Luria-ampicilina en fase logartmica.3. Centrifugar 1.5 mL del crecimiento bacteriano en un tubo eppendorf 13,000/54. Desechar el sobrenadante y agregar 100L de la solucin I, resuspender con vortex e incubar 5 en hielo.La solucin I contiene Tris-EDTA, glucosa, y RNasa. La glucosa est al 18% lo que aumenta la presin osmtica debilitando la pared celular. El Tris-EDTA quela iones Ca1+ Mg2+ cofactores de enzimas que es necesario para cuando se lisen las bacterias el ADN plasmidico no sea lisado por las enzimas contenidos en otras partes de la clula. Esta solucin tambin contiene RNasa para evitar interferencias y las enzimas degraden al RNA.5. Agregar 200 L de la solucin II y mezclar invirtiendo el tubo 3 o 4 veces. Incubar 5 en hielo.La solucin II contiene SDS al 1 % y NaOH al 0.2 N. La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura superenrollada sin embargo en este paso la estructura de doble hebra se desenrolla dando a paso a una estructura relajada.

6. Agregar 150 L de la solucin III, y mezclar invirtiendo 3 o 4 veces e incubar 10 en hielo.La solucin III contiene acetato de sodio 5M, esta funciona para dos cosas, la primera es neutralizar el medio y generar el efecto de Salting Out haciendo que los lpidos, protenas o los hidrolizados grandes que se generaron con la lisis de las bacterias precipiten. Adems provoca nuevamente el cierre de las cadenas del DNA plasmdico generando de nuevo la estructura superenrollada.7. Centrifugar 13,000/5 y pasar el sobrenadante a otro tubo con eppendorf y agregar 500 L de la solucin IV, mezclar suavemente e incubar 5 en hielo.La solucin IV contiene Isopropanol, esto reducir la constante dielctrica de la solucin favoreciendo que precipite el DNA plasmdico.8. Centrifugar 13,000/5 y desechar el sobrenadante. Secar el tubo con aire y agregar 10 L de la solucin V.La centrifugacin generar un pequeo botn que se resuspender con la solucin V contiene Tris-EDTA.9. Resuspender suavemente con la micropipeta.10. Pesar 1 g de agarosa y suspender en 100 mL de regulador TB 1X. Calentar en bao mara o microondas hasta la licuefaccin11. Verter la agarosa al 1% en el portageles de la cmara de electroforesis y colocar el peine y esperar a que se solidifique.12. Retirar el peine y verificar que los pozos se encuentren bien delimitados.Del paso 10 al 12 son para preparar el gel en el que se correr la electroforesis.13. Tomar 5 -10 L del DNA plasmdico obtenido y adicionar 5 -6 L de colorante de carga mezclar.La solucin del colorante contiene azul de bromotimol, ya que este corre de forma muy similar al plsmido y funciona como indicador de frente en el gel ya que el plsmido no tiene color. Adems contiene glicerol para disminuir la densidad y se vaya al fondo del pozo en la placa.14. Colocar en el pozo del gel agarosa al 1% y realizar la electroforesis a 80 volts durante 30. Revelar con bromuro de etidio (10g/mL) durante 1.15. Sumergir en agua bidestilada para eliminar el exceso de bromuro y observar en trasiluminador.El ADN que corre en el gel debido a sus caractersticas puede localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante y se revela con UV. Referencias:http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com/file/view/PRACTICA_No_4_EXTRACCION_DNA_PLASMIDICO.pdfhttp://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf