Ponencia HVB_HCV

Lic. Walter Pinillos Llanos

Metodologas para deteccin de los Virus de Hepatitis B y Hepatitis CLic. Walter Pinillos Llanos

Qu es metologa? Se refiere a los mtodos de investigacin que se siguen para alcanzar una gama de objetivos en una ciencia. Son el conjunto de mtodos que se rigen en una investigacin cientfica o en una exposicin doctrinal. Mtodo es el procedimiento para alcanzar los objetivos y la metodologa es el estudio del mtodo.Lic. Walter Pinillos Llanos

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Mtodo Del griego metha (ms all) y odos (camino), significa literalmente camino o va para llegar ms lejos; hace referencia al medio para llegar a un fin. En su significado original esta palabra nos indica que el camino conduce a un lugar.


Mtodo = Tcnica No, una tcnica es un procedimiento o conjunto de reglas, normas o protocolos, que tienen como objetivo obtener un resultado determinado, ya sea en el campo de la ciencia, de la tecnologa, del arte, de la educacin o en cualquier otra actividad.


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Hablemos de Tcnicas Para hablar de una tcnica a emplear, debemos determinar qu buscamos con esta tcnica. Buscamos evidenciar la presencia de un antgeno o de un anticuerpo va una reaccin Ag-Ac, que a simple vista no es visible.


Hablemos de Tcnicas En resumen, para evidenciar estos Ag o Ac se aplican mtodos que involucran a determinadas tcnicas desarrolladas en muchos casos para su uso comercial, con el fin de poder determinar la probabilidad de que una persona se encuentre sana o enferma, o que sea portador o no de una enfermedad.Lic. Walter Pinillos Llanos

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Qu tcnicas existen para determinar la presencia de VHB o HCV? Se puede hablar de muchas tcnicas, pero las agruparemos de esta manera: Pruebas Rpidas Pruebas de Screening Pruebas de Diagnstico y Seguimiento Pruebas confirmatorias (?)


Pruebas Rpidas Entindase como Prueba Rpida aquella tcnica que nos permita evidenciar en el menor tiempo de trabajo la presencia de un determinado Ag o Ac. Existen muchos formatos en el mercado mundial que se ajustan a esta descripcin.


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Pruebas Rpidas


Pruebas de Screening Son aquellas pruebas que nos permite separar dentro de un grupo de muestras, aquellas que no tienen presencia de estos Ag o Ac, de aquellos que si tienen probablemente estos Ag o Ac.


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Pruebas de Screening

Enzimoinmunoanalisis Inmunoquimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia Fluorescencia polarizada (FPIA)Lic. Walter Pinillos Llanos

Pruebas de Diagnstico y Seguimiento

Podemos considerar a aquellas pruebas que nos permite ayudar a diagnosticar una determinada enfermedad a travs de la identificacin de la presencia de Ag o de Ac y finalmente nos permita realizar seguimiento del tratamiento de las mismas cuando estas las permitan.


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Enzimoinmunoanalisis Inmunoquimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia Fluorescencia polarizadaLic. Walter Pinillos Llanos

Pruebas Confirmatorias (?) Son aquellas pruebas que nos permite determinar la presencia de Ag o de Ac mediante tcnicas de mayor presicin, sensibilidad y especificidad, y que involucra una direccionalidad antignica determinada.


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Pruebas Confirmatorias (?) Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT). Inmunofluorescencia Directa o Indirecta. Pruebas de Western Blot


Pruebas Confirmatorias (?)


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Cmo aplicamos estas tcnicas para la deteccin de los Virus de Hepatitis B y C


Virus de la Hepatitis B El virus de la hepatitis B (VHB), es un virus pequeo (42 nm) de dimetro, de la familia Hepadnaviridae, causante de la Hepatitis B. El virus tiene cuatro serotipos principales (adr, adw, ayr, ayw) basado en los eptopes antignicos de las protenas de su envoltura. En total, existen ocho genotipos del virus (A-H) de acuerdo a la variacin en la secuencia de nucletidos del genoma viral. Los genotipos tienen una distribucin geogrfica distinta y son tiles para rastrear la evolucin y la transmisin del virus. Las diferencias entre los genotipos afectan la severidad y el curso de la enfermedad, as como la probabilidad de complicaciones, la respuesta al tratamiento y las posibles vacunas que se produzcan.Lic. Walter Pinillos Llanos

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Virus de la Hepatitis B: Estructura

HBc Ag

HBs Ag

DNA

DNA polymerase Virion (Dane particles)Lic. Walter Pinillos Llanos

Virus de la Hepatitis C El virus de la hepatitis C (VHC, HCV en ingls) es un virus pequeo (50 nm), con envoltura y con una sola cadena de ARN(+). Pertenece a la familia Flaviviridae. Se replica principalmente en los hepatocitos del hgado causando la hepatitis C, aunque hay controversia de si pueden tambin hacerlo en linfocitos o monocitos. Genotipo: 6 genotipos principales y ms de 50 subtipos La distribucin geogrfica de estos tipos y subtipos d vara considerablemente. Hay que tener en cuenta que esta nomenclatura no puede ser reconocido en ningn CIRCUNSTANCIAS como definitivas.


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Virus de la Hepatitis C


Cmo son estos Kits?


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Pruebas Rpidas: Ltex Se enfrenta una cantidad fija del reactivo ltex a diluciones en serie del analito. Se observa a simple vista hasta qu dilucin hay aglutinacin. Semicuantitativo El lmite de deteccin del reactivo ltex se ajusta previamente por titulacin con standards. Puede haber diferencias entre diferentes operadores.Lic. Walter Pinillos Llanos

Pruebas Rpidas: Ltex


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Pruebas Rpidas: Ltex


Pruebas Rpidas: Ltex Ventajas: Bajo costo Requiere escaso equipamiento No requiere gran destreza del operador

Desventajas: Semicuantitativo a menos que se modifique cambiando el sistema de reaccin de portaobjetos a cubeta (turbidimetra, nefelometra).Lic. Walter Pinillos Llanos

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Pruebas Rpidas:Tiras


Pruebas Rpidas: Soporte


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Pruebas Rpidas


Pruebas Rpidas


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Pruebas de Screening: EIA La prueba ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay), puede ser utilizado tanto cualitativa como cuantitativamente, para detectar la presencia de un antgeno o anticuerpo. Dependiendo de la variante que utilice, se puede detectar el antgeno o anticuerpo en los fluidos corporales o cultivos de celulares.Lic. Walter Pinillos Llanos

Pruebas de Screening: EIAQu necesita este ensayoAntgeno purificado (si se desea detectar o cuantificar anticuerpos). Anticuerpos purificados (si se desea detectar o cuantificar el antgeno). Los controles de las soluciones estndar (positivo y negativo). Muestra a analizar. Placas de microtitulacin: bandejas de plstico con pequeos pozos en la que se lleva a cabo el ensayo. Solucin de lavado (buffer). Anticuerpo marcado con una enzima y el sustrato de la enzima. Lector de ELISA (espectrofotmetro).Lic. Walter Pinillos Llanos

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Pruebas de Screening: EIA


Pruebas de Screening: Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia es la emisin de luz o fotones como resultado de una reaccin qumica. En quimioluminiscencia, el estado de excitacin de un electrn es alterado por el tratamiento qumico de la sustancia luminiscente. Cuando los electrones se "excitan" o salen de su estado relajado natural a un estado de movimiento, esto hace que se libere energa en forma de luz. Esta tcnica utiliza como soporte microparticulas de fase solida.Lic. Walter Pinillos Llanos

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Pruebas de Screening: Quimioluminiscencia


Pruebas de Screening: Quimioluminiscencia Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de molculas, menor lmite de deteccin que en los otros mtodos enzimticos. Se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reaccin quimioluminiscente (luminol, peroxidasa). Se detecta la seal quimioluminiscente, la cual se hace en fase slida, o en tcnicas homogneasLic. Walter Pinillos Llanos

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Pruebas de Screening: Electroquimioluminiscencia Ej.: determinacin de TSH Incubacin a 37anti-TSH-Ru(bipy)3 Anti-TSHbiotina

Partcula magnMuestra con TSHLic. Walter Pinillos Llanos

Streptavidina

Pruebas de Screening: Electroquimioluminiscencia

ELECTRODO

IMN Anal Chim Acta, 378, 1(1999)


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Se aplican las mismas tcnicas que las asociadas como Pruebas de Screening. En qu se diferencian? Sensibilidad y Especificidad


Periodo de Ventana del VHBArticulo de S.L.Bush. Transfusion, Junio 2003

Infection

HBV NAT Detection

HBV Ag HBs Detection

NAT Window Period : 20 days

W. P. HBs Ag neg and NAT pos

0

5

15

20

10

40

50 60

70 Days

HBs Ag Window Period : ? days

ElPeriodo de Ventana est en funsin de la Sensibilidad del ensayo a usar para la deteccin del HBs AgLic. Walter Pinillos Llanos

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Semsibilidad AnalticaLmite de Sensibilidad en un panel EFS: EFS HB Lote 01080222GB : mezclas de HBs Ag y subtipos ad y ay Producto A Producto B Producto C Producto D Producto E Producto F Producto G Producto H

*Lmite de deteccin de Sensivilidad en ng/ml despus de una regresin lineal con 5 diluciones de 0 a 0.45 ng/ml


HBs Ag EIA Kits Versus NAT en 27 Paneles Commerciales de SeroconversionProducto

Producto

B

4.5 days

NAT Dteccion Unidades Simples

A 2.1 daysProducto F

7.6 days

0

1

2

3

4

5

6

7Producto E

8 Days7.4 days

Ranking en promedio de dias para la deteccion tomando como referencia la prueba HBV NAT.

Producto D Producto C

5.9 days

5.0 days


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Analytical Sensitivity on P.E.I. Ad/Ay HBsAg Panel in Milli Unit/ml

Producto A Producto B Producto C Producto D Producto E Producto F

HBsAg Assay Kits

Producto G Producto H Producto I

1

Producto J Producto K Producto L Producto M Producto N Producto O Producto P Producto Q

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

HBsAg Low Limit Detection (mean of P.E.I. Ad/Ay sensitivity data)From JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY 78:S66S70 (2006)


Cul es el algoritmo actual para el diagnstico de la infeccin por VHC en laboratorios de diagnstico


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La primera seleccin se lleva a cabo hasta ahora con ensayo que permitan la deteccin de los anticuerpos del VHC como se especifica en la Conferencia de Consenso de la Asociacin Europea para el Estudio del Hgado (EASL) y en la Declaracin de Consenso del Instituto Nacional de Salud (NIH Consensus Statement) para el VHC.Lic. Walter Pinillos Llanos

EASL Consensus Conference 1999:3. Pruebas de Diagnstico Las pruebas ELISA son fciles de usar y de bajo costo, y son las mejores pruebas para la deteccin inicial. Estas pruebas son fiables en la mayora de los pacientes inmunocompetentes que replican el VHC. Son menos sensibles en hemodializados y en pacientes inmunodeprimidos. En poblaciones de alto riesgo y en contextos clnicos donde la hepatitis C se sospecha, un ELISA positivo debe ser confirmado por una prueba cualitativa de ARN del VHC.Lic. Walter Pinillos Llanos

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NIH Consensus, Junio 2002:Los ensayos serolgicos para VHC: Las pruebas de ELISA son reproducibles, baratos, y aprobado por la FDA para su uso en el diagnstico de la infeccin por el VHC. Son adecuados para la deteccin de las poblaciones en riesgo y se recomiendan como la prueba inicial en pacientes con enfermedad heptica clnica.Lic. Walter Pinillos Llanos

Algoritmo para el diagnstico de la infeccin por VHC en laboratoriosHCV Infection Testing Algorithm for Diagnosis of Asymptomatic PersonsNegative (non-reactive)

EIA for Anti-HCV AntiPositive (repeat reactive)

STOP

ORNegative

RIBA for Anti-HCV AntiNegative Indeterminate

RT-PCR for HCV RNAPositiveMedical Evaluation

Positive

STOP

Additional Laboratory Evaluation (e.g. PCR, ALT) Negative PCR, Normal ALT Positive PCR, Abnormal ALT

Source: MMWR 1998;47 (No. RR 19)


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Patrn serolgico de infeccin aguda por el VHC Con la progresin de la infeccin crnica


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Origen del Periodo de VentanaEl perodo de ventana se debe a la ausencia de marcador en esta etapa de la infeccin en la muestra o la falta de sensibilidad de los ensayos para detectar la presencia de estos marcadores de infeccin. 1. Generalmente los primeros marcadores presentes en la muestra (suero) es el genoma que se pueden detectar con la tcnica de Genmica llamado Nucleic Acid Testing (NAT) como ensayo de PCR o TMA . 2. Despus de la deteccin del genoma, se puede detectar el antgeno del virus. Este marcador Ag se puede detectar muy poco despus de la prueba NAT, por ejemplo, para el VHC en da y medio o dos das despus de la deteccin del genoma del VHC con el ensayo de NAT. Para los antgenos de hepatitis B puede ser en algunos casos ms sensible que la PCR . 3. Y el ltimo marcador en aparecer generalmente es el anticuerpo.


Corriente Terica sobre el Periodo de Ventana para el HCV, HVB y el HIV. Jackson y SLBush. Transfusin, Junio 2003

Antibodies detection Window Period

Nucleic Acid Testing (in single unit) Window Period

HCV HBV HIVLic. Walter Pinillos Llanos

70 Das45 Das

7 Das20 Das

16 Das

7 Das

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Periodo de Ventana SilenciosoEl objetivo para un diagnstico temprano de infeccin por virus es reducir el periodo de ventana silencioso.

Porqu reducirlo ? Para evitar resultados falsos negativos y de diagnstico errneo Para tener un diagnstico temprano a fin de tener un tratamiento ms eficaz Para evitar la contaminacin por sangreLic. Walter Pinillos Llanos

Historia de los Test HCV : Reduccin del Periodo de Ventana en Das

HCV RNA3InfectionHCV Core Ag4

1995 EIA 3.02

1992 EIA 2.02

1989 EIA 1.01

0

12

13/14

70

80

150

Das


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Organizacin Genmica y Biolgica usado para la Deteccin de Anticuerpos del HCV

Mutated core peptide

Rec. Prot. NS3 Genotypes 1 and 3

Rec. Prot. NS4


Qu utilizan los Fabricantes? Core (c-22-3) NS3 (c-33-c) (c200) (HC-34) (HC-31) (HC43) NS4 (c-100-3) NS5 (66, 81, 82)


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Genma del VHC


Pruebas Confirmatorias?


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Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT) El escrutinio genmico para agentes infecciosos utilizando NAT puede ser llevado a cabo con diversas tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccin en cadena de la ligasa, la amplificacin basada en la secuencia de cidos nucleicos y la amplificacin mediada por transcripcin, son tcnicas de amplificacin genmica que usan diferentes mtodos para lograr la amplificacin in vitro de los cidos nucleicos. Todas estas tcnicas detectan la presencia de agentes infecciosos en las muestras, amplificando secuencias especficas de cidos nucleicos del microorganismo.Lic. Walter Pinillos Llanos

Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT) Pruebas Individuales Pruebas en Pooles. Minipool de 6 Minipool de 24 Minipool de 96


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Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT) Cul es el efecto del tamao del pool sobre la sensibilidad? Ejemplo Test con sensibilidad de 30 UI/ml

Muestra Directa (SDNAT): Detecta a partir de 30 UI/ml Deteccin en el Suero ser a partir de 30 UI/mlLic. Walter Pinillos Llanos

Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT)Pool de 24: Si se supone solo 1 muestra positiva del pool, la sensibilidad del ensayo vara (factor X 24) El pool ser detectable a partir de 30 UI/ml La muestra positiva dentro del pool de 24 debe tener ms de 720 UI/ml para poder ser detectada en Pool


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Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT)Pool de 6: Si se supone solo 1 muestra positiva del pool, la sensibilidad del ensayo vara (factor X 6) El pool ser detectable a partir de 30 UI/ml La muestra positiva dentro del pool de 24 debe tener ms de 180 UI/ml para poder ser detectada en Pool


Impacto de la Cintica de HCV en la sensibilidad de los Pooles


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Tcnicas de Amplificacin de Acidos Nucleicos (NAT) Lee y Allain (1998) indican que aproximadamente el 50% de las muestras que son positivas en NAT son falsos positivos (es decir, no hay reacciones individuales positivas que puedan ser identificadas).


En resumenHagmonos las siguientes preguntas: Qu tipo de muestras y/o pacientes tenemos? Que tipo de Laboratorio tenemos y/o necesitamos? Cules son las implicancias sobre la sensibilidad y especificidad que necesitamos? Cul es el costo-beneficio?Lic. Walter Pinillos Llanos

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ANALIZADORES AUTOMTICOS PARA INMUNOANALISISFabicante / Modelo Abbott AxSym Architec 1993 1993 Microparticulas Microparticulas Magnticas FPIA, MEIA Quimioluminiscencia Ao Soporte Mtodo

Bayer Immuno 1 ACS: 180SE Advia Centaur 1993 1997 1998 Particulas Magnticas Particulas Magnticas Particulas Magnticas EIA, Turbidimetria Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia

Beckman Coulter Acces Acces 2 Synchrom Lxi 1993 2001 2002 Particulas Magnticas Particulas Magnticas Particulas Magnticas Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia

Biomerieux Vidas 1989 Recipiente Cubierto EIA de Fluorescencia

BioRad Coda Evolis 1996 2001 Microplaca Microplaca EIA EIA


ANALIZADORES AUTOMTICOS PARA INMUNOANALISISFabicante / Modelo Dade Behring Stratus CS Dimension 1998 2001 Filtro de Fibra Particulas Magnticas EIA de Fluorescencia EIA Ao Soporte Mtodo

DPC Inmulite Inmulite 2000 1993 2000 Perla, Centrifugacin Perla, Centrifugacin Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia

Grifols Triturus 1999 Microplaca EIA

Nichols CL Systems Advantage 1993 1997 Perlas Particulas Magnticas Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia

Olympus AU400 1998 Homogneo EIA

Ortho Vitros ECi 1997 Microplaca Quimioluminiscencia


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ANALIZADORES AUTOMTICOS PARA INMUNOANALISISFabicante / Modelo Roche Elecsys 2010 Modular E170 1996 2001 Particulas Magnticas Particulas Magnticas Electroquimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia Ao Soporte Mtodo

Sigma Aptus 1998 Microplaca EIA

Tosho AIA-Nex AIA-600 1997 2000 Perlas Perlas EIA de Fluorescencia EIA de Fluorescencia

EIA: Enzimoinmunoanalisis; FPIA: Inmunoanalisis por Fluorescencia Polarizada; MEIA: Enzimoinmunoanalisis Microparticulado.



Muchas Gracias

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