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PRACTICA 2 PARTE 4 (SANGRADO)

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TECNICA DE SANGRADO EN ANIMAtES DE EXPERIMENTACION

PREPARACION DEllUGAR

Es importante mantener una antisepsia completa a 10 largo del muestreo, de

forma que todo pelo 0resto de piel superticial de encima de la vena" sea retirado, EI

metoda paraeliminar el pelo dependera de ta loca:lizad6n de la vena y de la especie

animal. EI pelo se puede eliminar a tirones, con tijeras curvas .0 can esquiladora.

Retirar el pelo a tirones puede realizarse ia;cilmente en los gatos y conejos sin causar

sufrimiento al animal. Las cremas depilatorias quimicas pueden aplicarse en zonasdificiles pero gener:almente no se recomiendan ya que pueden provocar reacciones en

la piel y contaminar las muestras .. Algunos animalestales como los gatos,. pueden

incomodarsecon el ruido produeido por las esquiiadoras electricas, Hay que tener en

cuenta tambiem, que las pieles de algunos animal'as, par ejemplo la de los conejos, son

finas y sensibles. No es recomendable afeitar con cuchiUa, jabon y agua ya que causa

mas dana a fa piel que el esquilar.

Las excepdiones dependeran de la experiencia del operador, de la soltura ala

hora de esquilar y elefecto que pueda causar en los ammales y de Ia calidad de :Ia

muestra requerida.. La zona rasurada 0 de ta que se ha retirado el pelo a tirones

debera ser limpiada con agua templada, a la que se Ie puede anadir un detergente adesinfectaote como la cetrimida. Estos agentes deberan ser posteriormente retirados

con agua para. evitar la contaminaci6n de la muestra. Et alcohol (etanol 70% en agua)

desenqrasaraefectivamente la piel de aquellasespecies en las cualeslasecrecion de

glcfmdulas sebaceas sea pronunciada (par ,ejemploenlas ovejas),.pero puede

contaminar una muestra de sangre 5 1 no se ie deja evaporar. Escasiimposible

producir una superfi.cie esteriJ y una Umpieza excesiva trastornaria el ecosistema

bacteriano natural de, defensa de, la piet La preparacion puede tener emonces et

efecto posterior de causar irritacion, deshidratacian de la prel e incomadidad del

animal. Para disminuir toda molestiaasociada a la puncion venosa, algunos cientfficos

han investigado recientemenieel 'Uscde cremas de anestesia local apJicadas sobre la

piel unos 30-60 minutos antes de tamar la muestra. Parecen ser beneficiosas en la

reduccian de las molestias en especies como conejos, perros y gatos pero no son tan

efectivas en ratas.

TOMA DE MUESTRA:

Habitualmente en losanimales grandes I:apuncion venosa se rea1lizasujetando

fisicamente al animal: y no es necesaria anestesia. A los animal'es pequenos se les.ea

a menudo un anestesjco de aeeien corta para manipularl.es con comodidad. Sin

embargo, se debe recordar que tales a.gentes pueden afectar los parametros29

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hematoloqicos y bioquimicos. A algunos animales tales como los perros y algunos

primates, se les puede entrenar para que presenten una extremidad para toma de

muestra sin recunir a ta anestesia 0 suiectorr flsica, Es importante realizar una

rnanipulacion suave pero firme, as! como tarnbien es importante el tiernpo empleado

en extraer la muestra. Ambos parametres pueden afectar alestres del animal y par

consiguientela calidad de la muestra y la exactitud de la investig.adon. Se podrla

considerar la posibilidad de ofrecer una recompensa despues de cada sangrado,

seguR las especies. EI animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador

experimentado que, siempre que sea posible, debera ser conocido par los animales.

No hay tampoco que sobre valorar el papel clave desempenado por la persona que

sujeta al animal yevidencia lavena. La vena debe localizarse claramente (si se tienen

dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda) y la puncion Uevada a cabo decididamente

mejor que con vacilaciones. Puede que el animal muestre signos de incomodidad

(jcomo nosotros!) par ejemplo, puede chillar, pero se Ie debe tranquilizar, tratandole

con suavidad y habltmdole. Puede que se necesite alguna presion proxima allugar de

oclusion del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de sangre. La

gata de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar 0 con una micropipeta conpunta de plastico.

Despues de haber saeado la sangre, se debe mantener una presion suave pero

firme sobre ellugar durante unos 30 segundos, 1 0 que detendra rapidamente cuatquier

sangrado. Tarnbien hay varios preparados hernostancos de alginato de calcia, fibritlas

de colaqeno y esponja gelatinosa que pueden servir de ayuda si persists el sangrado.

EFECTOS ADVERSOSDE LA . TOMA DE MUESTRA

EI nivel correcto de sujecion, esel que permite tamar una muestra satisfactoria

al primer intento sin causar panico innecesario en el animal, en cuyo easo, otros

animales proxenos pueden atarmarse, 1 0 que Uevarfa a complicaciones tanto crentfficas30

Existen cuatro efectos adversos: hemorragias, hematomas, trombosis y estres

causados par una manipulaci6n inadecuada.. El tratamiento adecuada depende dellugar, de ta causa y del animal en particular.

La hemorragia debida a una hemostasia pobre, no es un problema habitual, a

menos que el animal tenga un defecto de coaqulacion yen algunos casas, una presion

suave continua durante unos minutes, puede ser todo 1 0 que se necesite para parar el

sangrado.

los hematomas se deben al sangrado subcutaneo en el momenta de la pURcien

venosa 0 son provocados por el propio animal al lamerse 0 rasearse una vez devuelto

a su jaula 0 corral .. Se debe controlar a t animal despues de unos 30 minutes y si es

necesario, tomar las medidas adecuadas ..

La trombosis (coagulo) y la flebitis (inflarnaeion de la vena), se producen

habitualmente par tecnicaa incorrectas 0 restos de una sustaneia irritante (por ejemplo

productos quimicos basados en alcohol) alrededer de la vena. Ocasionalmente

pueden ocurrir a consecuencia una auto-mutilaci6n.

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(por ejemplo, elevacion de I'a glucosa en sangre, presion sangulnea) como de

bienestar.

Otros problemas incluyen la infeccion del lugar de entrada de la aguja que

puede despues extenderse slstematicamente. Eli sangrado repetido, puede producir

flebitis y cicatrices que tambien pueden ocurrir, a consecuencia de intentos repetidosde punci6n venosa. La probabilidad de que esto ocurra, puede reducirse mejorando la

tecrnca (utilizando canulas introducidas permanentemente) y allemando las zonas de

muestra.

Es posible extraer sangre de la rnayorla de las especies con una variedad de

agujas de entre 10-50 mm de longitud yentre 15-27 G de calibre ..Asl, la extracci6n d esangre de la vena. yugular degrandes mamlferos,por ejemplo animales de granja"

petros, gatos y algunos primates podria IIevarse a cabo con una variedad de agujas de

entre 14-20 G x 25-40 mm. Para la extracci6n de sangre de la vena del rabo de una

rata a vena de la oreja en el conejo una aguja del orden de 23-26G x 10--20rnm podria

ser la mas apropiada. Cuando se muestrea repetidamente se debe utilizar una agujanueva cada vez. La direcci6n de la aguja es habituaJmente la del flujo sanguineo. Esto

puede variar segun la accesibitidad del fugar.

Tabla. 1: Sitios mas comunes y tamafio de agujas y jeringas para la extracci6n de

sangre por especie.

Es~ie cor ,~I'~t3n \fif3n~ "leFt:] Ve.I"IB v ~ : ~ l : rv:~: :,;;n~eFl Sene; V.:tM Ce:.fa I:)

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VOLUMEN DE SANGRE A EXTRAER

Si se extrae mucha sangre rapidamente, 0 demasiado a menudo sin reponerla,

un animal puede entrar en un shock hipovolernico de corta duraci6n y a largo plazo

sufrir de anemia. La extracci6n de alrededor de 10% del volumen de sangre circulante

inieiara fos mecanismos homeostaticos coligemi,cos. Si seextrae entre el' 1'5-20 % del

volumen, se redueira el gasto cardfaco la presion sanguinea. La extracei6n de 3040%

puede indueir el shock hemomigico y una perdida de 40% puede causar una

mortalidad del 50% en ratas. Volumenes mas pequenos extraidos a intervalos

demasiado frecuentes provoearan anemia. Estos efeetos deberian aparecer raramente

y han de evitarse siempre que sea posible. Sin embargo, es fundamental poder

reeonocer los signos y sintomas de shock y de anemia y poder tamar Jas medidas

adecuadas.

Tabla 2 Vol' umen.'esangre crrcu atona en nlmaes

EspeeiesI,

Volumen de

sangre (mllkg)*

Pallo 60

Gerbo 67

Cabra 70

Cobayo 67-92

Hamster 78

Raton 78-80:

Conejo 44-70Rata 50-70

Oveja 60

d A" deLaboratorio.

* Temenda en cuenta que el ammal es madura, sana y con

una plan de notncron adecuada.

CONEJOS

Los conejos pueden ser sangrados por punci6n intracamiaca, por corte de la

vena marginal de la oreja y venipunci6n de la arteria central de la oreja

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( ( < ~ ~lIustraci6n 19. Localizaci6n de la vena marginal yarteria

central de la oreja en conejo.

VENA MARGINAL DE LA OREJA

Para Uevar a cabo este procedimiento, se debe inmovrlizar correctamente al

conejo, ya sea mediante una caja de sujecion para conejos 0envolverlo en un trozo de

tela 0 sabana, Una de las orejas de conejo se humedece con jabon y agua, y se

precede a rasurar la superfrcie superior del borde posterior, sobre " 8 vena marginal. La

vena debe observarse facilmente, si no esta visible caliente ta oreja coloeandola bajo

una lampara.

EI area rasurada se seca con alqodon, se eubre can vaselina y entonees se

practice una incision diagonal (angulo de 45°) sobre la vena marginal con una hoja de

bisturi. Inmediatamente despues de hacer el corte, se coloca el recipiente para

recolectar la sangre debajo de la misma. AI mismo tiernpo, ublizando los dedos indicey pulgar, se hace presion en la base de la oreja para oduir el retorno venoso. Si

posteriormente la sangre comienza a fluir can fentitud, hay que limpiar vigorosamente

la incision can algod6n para remover la sangre coagulada, 1 0 cual restablecera el flujo.

Generalmente no es necesario hacer un segundo corte. En un solo sangrado se

pueden obtener de 25 a 50 mt de' sangre de un conejo, y cantidades similares se

pueden colectara intervalos de cuatro semanas

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lIustracion 20: Toma de muestra mediante corte y goteo de

Javena marginal de fa.oreja en conejo

ARTERIA CENTRAL DE LA OREJA

EI rnejor rnetodo para extraer mayores cantidades de sangre del conejo es el

uso de la arteria de la oreja y un vacutainer de 50 cc. Con esta tecnica entre 30 a 40

cc de sangre pueden ser colectadas. El conejo debe estar bien sujeto y evitarse tos

hematomas. Una de las orejas de conejo se humedece con jabon yagua, y se procedea rasurar la superficie superior de la zona media, sobre la arteria central. EI area

rasurada se seca con algOO6n. AI, mismo tiempo, utilizando los dedos indice y pulqar,

se hace presion en la punta de la oreja para oeluir el f1ujo sanguineo, al Ifenarse la

arteria se procede a la introducci6n de la aguja en la arteria central de la oreja. La

aguja debe ser introducida dernro de la arteria a traves de la piel" en un angula de 20°.,

en un solo movimiento. Un suave tiron al e m bolo permite que la sangre fluya dentm de

la jeringa. Una vez obtenida la sangre necesaria,. se procede aliberar la presion digital

La aguj,a es retirada rspidarnente y se aplica presion digital allugar de la punci6n, en

forma simuftanea para evitar asi hemorragias 0 la formaci6n de un hematoma.

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Hustracion 21. Toma de muestra de sangre a partir de la arteria central de la oreja.

PUNC fON INTRACARO iACA

Se procede a inmovilizar al conejo en una superficie elevada. EI ayudante tomaal conejo por los miembros traseros con la mano izquierda, mientras sostiene con ta

mana derecha la cabeza y patas delanteras del conejo, deJando expuesta fa region

pectoral, facilitando el acceso al esternon. Se limpia la zona inmediata inferior al

manubrio del estem6ncon un algod6n empapado en alcohol. at 70%, procediendo

posteriormente a inserter una aguja calibre 21 de 3,75 cm en dicha zona, r o . mas cerca

posible del estern6n. Se diri.ge hacia el hombro derecho pudiendose sentir el latido

cuando atraviesa el coraz6n, en ese momento se procede a colectar la sangre

lentamente.

uustracton zz: Tecnlca de sujecion conayudante y punci6n intracardiaca en conejos

uustrecton 23: Tecnlca de sujeclonsln ayudante para realizar puncion intracardiaca en

conejos. Esta tecnica requiere de destreza y experiencia

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TECNICAS DE SANGRADO EN RATAS Y RATONES

PUNC.ON INTRACARDiACA

Mediante esta tecnica se pueden obtener grandes vohimenes de sangre el

animal, debe estar anestesiado y se recomienda utilizar esta tecnica unicamente como

procedimiento tenninaL

Se coloca el raton bien apoyado sobre el dorso, se ubica el apoflsis xifoides y se

inserta ta aguja perpendicular a la columna vertebral. Can una leve presion digital se

localiza el ventricuto; al punzar el corazon se siente el choque cardiaco. EI volumen

extraido de sangre dependera del peso del raton. Las medidas de las agujas son de

20a25G.

• I, l-L -

Uustraci6n 24: Metodo para la extracclon de sangre del

corazon de ratas mediante abordaje del apendice xifoides.

EI latido del corazon es palpado con el dedo y la aguja es

introducida pegada al dedo a traves del pecho en la camara

cardiaca como se muestra en la figura izquierda.

Tambien, previa anestesia inhalatoria, se puede proceder a colocar al roedor

sabre una tabla de trabajo que pennita la sujeci6n de las cuatro patas y faciHte la

exposlcion del esternon. Se limpia la zona costal, izquierda can un al'god6n empapado

en alcohol al 70%. procediendo posterionnente a insertar una aguja calibre 21 de 1,25

em en el costado Izquierdo dell anima.I, a,traves del tercer 0 cuarto espacio intercostal,.

arriba del arco costal, 1 0 mas cerca posible del estemon. Se dirige hacia el hombro

derecho pudiendose sentir el latido cuando atraviesa el corazon, en ese momenta se

precede a col.ectar la sangre lentamente. Mediante esta tecruca puede obtenerse

aproximadamente 5 ml de sangre de una rata de 250 9 a intervalos de dos semanas.

La extracci6n debe ser lenta y la cantidad limitada a menos que se decida la eutanasia

del animal.

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Itustracion 25: Metodo para la extracci6n de sangre del coraz6n en rata a traves del tercer 0

cuarto espacio intercostal, arriba del arco costal. La aguja es introducida 10mas cerca posible

del estern6n. Se dirige hacia el hombro derecho pudlendose sentir el latido cuando atraviesa el

corazon,

PLEXO RETRO-ORBITAL

Esta tacrnca aunque es muy usada no esta recomendada y requiere una particular

justificacion dado 10 agresivo de la misma. Implica pinchar el sena venasa orbital

detras del globa del ojo y se conoce de diferentes maneras como retro-orbital,. peri-

orbital, orbital posterior y sangrado del plexo venoso orbital.. En manos expertas

puede ser un metoda util para obtener vohimenes mayo res de los que se pueden

obtener de la vena de la cola. Es una tecnica que puede tener severas consecuencias

para el anhnal par 1 0 que no se recornienda et usa del sangrado del seno orbital can

recuperacion del animal mas que en circunstancias excepcionales cuando no haya

ning;(m otro metodo disponible.. Esta tecnica no es aceptable mas que como

procedimiento terminal baio anestesla.

Cuando se extraiga sangre del raton, la rata y el hamster de la peri6rbital del

oio, el tuba capitar se coloca en la mayor de las estructuras venosas arbitales. La

extraecion de sangre en el sena orbital del ra ton requiere que et tubo capilar entre

directamente en el sinus orbital. Los animates se anestesian antes de realizar este

procedimiento. La sangre se colecta insertando un tubo capilar heparinizado 0 la punta

de una pipeta Pasteur en el angula anterior del ojo, girando suavemente para que los

capilares sean rotos contra el hueso. Empleando este metodo pueden obtenerse entre

0,.4rnl y 0,6 rnl de sangre a rntervalos de una ados semanas

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llustraeten 26: Puncion retroorbitat en roedores empleando el extremo

ca,pilar de una pipeta Pasteur

Cuando se usa en hamster, el tubo capilar es colocado en el caudal del sinus

orbital. En la rata. se faciHta cuando el tubo capilar se coloca encima del globo ocular y

se alcanza la vena mayor entre la mas profunda y la vena superfi:ci'at de la orbita EI

conocer la ubicacion de las estructuras venosas del raton, la rata y el hamster ayuda al

exito de la tecnica. Es obligatoria la anestesia en toda tecniea de extraccicn de sangre

periorbital,

VENA DE LA COLA

Los rnetodos que impliquen el cortar la eolia repetidamente deben evitarse, ya

que actualmente es posible obtener canulas y agujas del tarnano correcto para

practicarnente todas las especies. Para obtener muestras de sangre de la vena de la

cola se utifiza et mismo metoda que para la administraci6n intravenosa mencionadaanteriormente.

Enel raton la toma de muestra de sangre de la cola esUtiI para hematocrlto,

conteos celulares y hemoglobina. La cola debe ser calentada en agua a 40 - 50°C. EI

animal debe ser anestesiado antes. Despues de la desinfeccien de la cola, 1 a 2 mm

de la punta de la cota pueden cortarse y la sangre recogida. Sf la sangre no sale, se

puede "ordenar" la cola.

llustraclon 27: Sangrado mediante abordaje de la vena

lateral de la cola en roedores

La utilizacion de las almohadfllas plantares para la obtencion de sangre no es

aceptable debido a la sensibilidad de la zona y el riesgo de infeccion, ya que los

Animales de Laboratorio habitualmente se guardan cerca, a en techos contaminados

por orina y heces. La infeccion puede causar cojera y sufrimiento innecesario.

TECNrCAS DE SANGRADO EN AVES

EI volumen de sangre que tiene cada ave varia mucho en funcion de la especie.

Cuanda tratamos con especies de pequeno tamano, debemos de catcular que el

volumen total de sangre supone entre un 7 y un 10% del peso del animal. En un pajaro

sano, que no este anernico, la cantidad maxima de sangre que podemos extraer

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oscsara entre el 7-10% del volumen sanguineo, 1 0 que supone un 0,5-1% del peso

total del animal (Tabla 3).

Tabla 3: Ejemplo practice paracalcular el volumen de

sangre que podemos extraer a un loro sano.

- P e.so dellorb: 400 9

-Volumen total de sangr~ = = 7-10%, de 400 9 ~ 28-40 ml

- Volumen de sangre:a exrraer no excedera eI7-1O%

d'e 2B-t IO ml = 2-4 mI de sangre

VENA MEDIAL METATARSAL

Cuando queremos obtener un volumen pequeno de sangre, 1 0 podemos obtener

de, fa vena medial metatarsal en aves de tamano media 0 grande. Esta vena se

localiza facilmente en fa parte medial dela articulaci6n metatarsal (Uustracion 28). A

pesar de que la vena esta protegida por los musculos adyacentes, 1 0 que minimiza la

formacion de grandes hematomas, hay que ejercer cierta presion sabre Lazona para

evitar que sangre.

lIustraci6n 28: Punci6n de la vena medial metatarsal

VENA YUGULAR

Cuanda queremos obtener un volumen grande de sangre as preferible utHizar la

vena yugular. En la mayoria de las especies la yugular derecha es mayor que laizquierda y se visualiza facilmente par debajo de la piel. En especies pequefias, una

misma persona puede sujetar ai' animal y extraer la sang're. En aves de mayor tamano

seran neeesarias dos personas, una inrnovilizara al animal y Ie estirara el cuello,

estabilizando la vena y ejerciendo presion con at dedo para ingurgitarla (Uustraci6n

29).

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___ ~ __ ./ A. or "

Fig. 2. Puncion de la vena yuqu lar.

Uustraci6n 29: Punci6n de la vena yugular

VENAS MEDIAL METATARSAL Y CUTANEA CUBITAL

La apllcacion de alcohol sobre la zona de puncion perrmtira visualizar mejor la

vena. Tras la extracci6n de la sangre, el ayudante ejercera presion sobre ta zona para

evitar la formaci6n de hematomas, que suponen un gran riesgo sobre todo en aves de

pequeno tarnano. No esta indicada la punci6n en vena yugular cuando el buche esta

muy neno 0 su contenido es muy ftuido, para evitar que el anima.1regurgtte y pueda

pasar eli alimento a vias respiratonas. En aves de tarnano medio y grande' se pueden

utilizar otras dos venas para abtener sangre, la vena medial metatarsal y la eutanea

cubital. Esta ultima discurre par la cara ventral del codo y es muy superficial.por 1 0 que

su localizacron es sencilla (Uustraci6n 30).

lfustraci6n 30: Punci6n de la vena cutanea cubital.

La vena braquial del ala es aceptable para extraer la muestra de sangre de las

aves de mas de cuatro semanas de edad. En las aves mas j6venes las venas son

demasiado pequenas para una extraccron de sangre eficiente. Ef punto de penetracion

de la aguja debe ser cabal en medio entre el coda y las coyunturas del hombro. La

punta de fa aguja debe apuntar hacia la punta del, ala para tamar ventaja del hecho

que la sangre corre de regreso hacia et corazon, 1 0 cual facitita la extracci6n de sangre

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en la jeringa. Es cornun que se forme un hematoma 0 un coagulo de sangre en el area

de la inyeccion. Cuando se saque la aguja de la vena, la presion can eJdedo sobre eli

sitio de la inyeccion promovera una coagula cion rapida.

~~

I/\.

~~ ~~ ~ ~ B

llustraclon 31: Sujecion y abordaje de la vena braquial del ala en aves. A.- Sujecion de

la cabeza del ave entre las alas. B.- Obtenclon de la muestra sanguinea por abordaje

de la vena. braquial

La punci6n de la vena del ala con una navaja de escarapelo es un metoda muy

facil y probablemente el mas rapido para obtener sangre de la vena del ala. Se debe

cortar la vena braeuial justamente arriba de la coyuntura del codo. Se debe usar un

tubo para guardar la sangre mientras esta sale par la cortada. La utilizacion de este

metoda puede resultar en una muestra contaminada con bacteria 0 con moho. Se

puede correr el riesgo de daf'iar fa vena braquiat y el nervio.

PUNcrON INTRACAROiACA

Para una punci6n intracardiaca se necesitan agujas de calibre 18 a 20 de 1 ~

pulgadas.

Puncion cardiaca - metoda anterior. Es un metodo efectivo y rapido para

extraer sangre. Se corre el riesgo de causar una hemorragia. fatal. Se usa para obtener

un gran volumen de muestras de sangre (4 a 10 rnt.). Este rnetodo es aceptable para

aves j6venes y adultas. La posicion apropiada del ave es recostada con la cabeza

extendida. Usando el dedo indice como guia, la aguja es introducida en la cavidad

toracica en el punto mas alto de la V invertida que se forma par la clavicula ..La aguja

se mantiene en el mismo plano que el esternon y con un angulo hacia atras de la cola.Normalmente seintroduce la aguja completa (1 % pulgadas) antes de 11egaral corazon

mientras se introduce la aguja se apUea una presion negativa ligera. Cuando ta aguja

esta en mala posicion, sin estar en el mismo plano del esternon, entonces entra en el

tracto respiratorio del ave y entra aire en la jeringa, resultando en fa muerte por

hemorragia en el tracto respiratorio.

Punci6n cardiaca - rnetodo lateral. Un rnetodo alternativo a la punci6n

intracardiaca es par media de la pared izquierda del torax, Se debe acostar el ave

sabre su costado derecho, tornando las dos patas con una sofa mana y las dos alas

can la otra. Las marcas son sefialadas por los canales que se forman a la orilla del

musculo pectoral. EI punta para introducir ta aguja es de aproximadamente 2 pulgadas41

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verticales del punta del esternon. Se sastiene la aguja a un cingula de 90° del plano del

esternon, La posicion adecuada del ave es esencial para obtener resultadoscansistentes can este metodo,

lIustraci6n 32: Punci6n intra.cadiaca: A.- Metodo anterior. B.- Metodo lateral

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