PRACTICA 2 PARTE 5 (HIPERINMUNIZACIÓN)

8/3/2019 PRACTICA 2 PARTE 5 (HIPERINMUNIZACIN)

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INOCULACION DE ANTiGENOS SOLUBLES PROTElCOS-PREPARACION DE ANTICUERPOS POLIClONALES.

rNTRODUCCIONEI term ina "Anticuerpo Policlonal" se define como la poblacion total de anticuerpospresentes en el suero de un animal. Esta compleja pobtaclon esta constituida por dtferentesclases de inmunogtobulinas incluyendo: tgG, IgM, tgE, IgA, e IgO. Cada antIcuerpo va arepresentar el producto de secreciOn de un cion particular de linfocitos B estimulados por unantigeno especifico.Recordemos, que un material antigEmco complejo como es el caso de las proteinas,pueden contener muchos detenninantes antigenicos 0 "epitopos!! cada uno de tos cuales serareconocido especiticamente por un clan individual de tinfocitos B. Estos "epttopos" pueden estar

constituidos por secuencias de armnoacldos, determinantes conformacionales 0 estructurasmoleculares derhladas de modfficaciones post-traduccionates tates como glicosilaciones,fosfnrilacienes y acetiJaciones.El termino "Inmunogeno" se refiere a cualquier rnolecula que es capaz de " inducir unarespuesta inmunot6gica", por 10tanto, la inmunogenicidad de un antigeno se retiere al grado 0nivel de' respuesta inmune inducida.

PRODuce.6N DE ANTICUERPOS POLIClONALESLa produocion de anticuerpos polidonales depende devarios factores entre los cuales se

pueden considerar los siguientes: Factores que dependen del organismo inoculado

8') Especie y numero de animates a inocularb) Estadoftslologico del animalc) Edad del organismo inocuJadod) Experiencia previa def animal Factores que dependen del antigeno inoculadoa) Dosisb) Calidadc) Via de inoculaci6n

EI antisuero que se desea obtener Potencializaci6n del antigeno.

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FACTORES QUE DEPENDEN DEL ORGANISMO INOCULADOESPECIE Y NUMERO DE ANI MALES

La eleccion del animal es de gran importancia, puesto que algunas especies ydeterminados animales denim de la misma especie pueden ser buenos 0 malosproductores de anticuerpos.

EI conejo (Orictolagus cuniculus) es la especie de laboratorio mas comunmenteutilizada para la produccion de anticuerpos. policlonates, pero tambien suelen utilizarsecobayos, roedores, cabras etc.Es importante considerar tamoien que para tenerla seguridad de obtener u buen

antisuero a un antigeno determinado, es necesario inmunizar cierto numero dearnmales, para poder descartara los que no responden bien.Otra cosa muy importante que hay que recordar es que: cuanto mas separada

este la fuente del: antigeno. desde el punto de vista filogenetico de' animal. mayor serala respuesta del animal inmunizado.ESTADO FISIOLOG.CO DEL ORGANISMO

La importancia de utilizar animates sanos y bien alimentados es obvia, ya que lapresencia de procesos infecciosos intemeren oon ia respuesta de anticuerpos esperada,aSI rnisrno, las deficiencias nutricionales determinan un estado hipoproteioo queprovoca un descenso en el nivel de formacion de anticuerpos.EDAD OEL ORGANISMO INOCULADO

La edad del animal es un factor importante en fa respuesta de arnlcuerpos, Lacapa.cidad de sintetizar anticuerpos esta relacionada con el estado de madurez 0inmadurez del sistema inmunol6gico. Para la obtencien de anticuerpos se recomiendautilizar animales jovenes-adultos,EXPER'IENCIA PREVIA OEL ANIMAL CON EL ANTiGENO AlcNOCUlAR

Cuando se inocula un antigeno por primera vez se va a producir 10que se conacecomo Respuesta Primaria. Las inocutaciones subsiguientes con el mismo antigenoconducen a que el animal presente una respuesta mejorada lIamada RespuestaSecundaria 0Anamnesica, dondeel nivel de anticuerpos producidos es mucho mas altoque en la respuesta prim aria. Esto es una caracteristica muy importante que hay queconsiderar a la hora de seieccionar un animal para la produccion de anticuerpos, enotras palabras, es recomendable utilizar animates que no hayan sido previamenteinocul!ados con ningun antigeno.

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FACTORES QUE DEPENDEN DEL ANTiGENO INOCULADO.DOSIS

Es muy dificiJ establecer una dosis (mica optima, capaz de inducir la mejorrespuesta inmune, pues esta depende del antigeno mismo y de fa especie milizada. Esposible determinar una dosis minima y otra maxima, par debajo y par encima de lascuales no se induce respuesta inmune. Tambien es posible obtener una dosis media enque la intensidad de la respuesta inmune es satisfactoria,

SE HA OBSERVADO QUE LAS DOSIS MUY PEQUENAS Y LAS MUYELEVADAS DE ANTiGENO, NO PRODUCEN TITUlOS APRECIABLES DEANTIGUERPOS, SINO QUE MAs BIEN INDUCEN TOLERANCIA.

CAUDAD DEL ANTjGENOEs neeesario obtener suficientes cantidades delantigeno altamente purificadoque sirva parainmunizar el animal. En una preparaciOn proteicaque contenga tanto

como 1% de contammantes, la rnayoria de los anticuerpos pueden reconocer a esecontaminante si es altamente inmunogenico, de aUi que se prefieran preparacionesantigimicas 1 0 mas puras posible.La naturaleza qulmlca del antigeno tamoien es importante, asl tenemos que son

mas inmunoqemcas 0 estimulan mejorel sistema mononuclear fagocitario, los antigen osde moleoulas grandes, de PM elevado y de estructura compleja.los antigenos vivos son mejores que los antigenos muertos, ya Que se multiplicanen el organismo provocando inmunidad humoral y 10 relular, los germenes muertos soloprovocan inmunidad humoral, Asi mismo los antigenos particulados estimulan mejor alsistema mononuclear fagocitario ya que los solubles son eliminados mas rapidamente del

organismo.ViAS DE INOCUlACION.La via de inoculaci6n debe ser escogida de acuerdo a la calidad del antigenoque se va a inocular; asi tenemos que los antigenos particulados suelen ser mas

efectivos por via endovenosa. y los antigenos solubles suelen ser inocutados por viaintramuscular 0sub-cutanea, ya que si se inoculan por via endovenosa difunden yson el.iminados rapidamente del organismo por 10 Que no estimulan suficientemente atsistema inmunol6gico.

ANTISUEROQUE SE DESEA OBTENER:ANTISUERO: Suero de cualquier animali que comiene anticuerpos especificoscontra un antigeno determinado.

ANTISUERO MONOESPECiFICO: Antisuero contra un solodeterminante antigenico ..50


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ANTlSUERO POLIVAlENTE: Antisuero que contiene anticuerpos contramuchos determinantes antigenicos 0antigenos.

SUERO HIPERINMUNE: Suero con elevado titulo de Anticuerpos especificoscontra un deterrninado antigeno.Si purificamos un antigeno y 1 0 inoculamos repetidas veces a un animal,obtendremos un antisuero hiperinmune (de titulo alto) y monovalente porque va dirigidocontra un sofo antig"eno.

POTENCIAUZACION DEL ANTiGENOEntre los procedimientos usados para mejorar la respuesta de anticuerpos a una

dosis dada de aotigeno, podemos destacar:I. Variar la forma 0via de inoculaci6nU . Mejorar la respuesta con el usa de adyuvantesltI. Modificar el inmunogeno por si mismoI.~ARIAR LA FORMA 0 ViA DE fNOCULAC'ON

Se logra una mejor estimulaci6n y par 1 0 tanto una mejor respuesta, dividiendola dosis de ant1geno que se va a inocular en vanas dosis menores e inyectadas ensitios diferentes del animal', as! la respuesta de anticuerpos obtenfda es mayor que siinoculamos una dosis (mica.11.-ADYUVANTESUno de los metodos mas comunmente utiIizados para incrementar la respuestainmune al antigena consiste en combinarel inmun6geno can un adyuvante. Losadyuvantes son sustancias que al ser admrnistradas junto con los antigenosamplifican de manera inespecifica la respuesta inmune general.

MECANISMO DE ACC.ON DE LOS ADYUVANTESa) Retrasa la destrucci6n del antigeno enel organismo.b) Permite el mantenimienta relativamente protongado de va.tores bajos del

antigeno en los tejidosc) Provoca respuestas inflamatorias en los sibos de la inoculacion, 1 0 que retrasa laabsorcion del antigeno y promueve la interacci6n de las celulas del procesoinflamatorio (maerotaqos) en los tejidosque rodean all antigeno, favoreciendo el

incremento en la respuesta inmunof6gi.ca.Algunos ejemplos de adyuvantes incluyen: dextran-sulfata, aniones polimericos,

adyuvantes de aluminio, etc. Uno de los mas efectivos consiste en las emulsiones oteosas51


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desarrolladas por "Freund", EI mmunoqeno es tiberado lentamente del aceite provocandouna inflamacion local y provocando una respuesta. inmune mas prolonqaca. Cuando a estasemulsiones ofeosas se Ie adiciona antigenos bacteria nos (Adyuvante completo deFreund) se favorece, adernas, la infiltracion de linfocitos T.111.-MODIFICACION DEL ANTiGENOLos inmun6genos pueden simplemente ser polimerizados 0 conjugados a otrasproteinas transportadoras 0 antigenos sinteticos. Estas modificaciones son particularmentemiles para proteinas aJtamente conservadas 0 inusualmente con pequefios inmun6genos

(ej: esteroides, prostaglandinas, nucleotidos ciclicos).PROTOCOLO DE INMUNIZACIONES CON PROTEiNAS SOlUBLES

EI animal que se utifiza general mente es el conejo; el cual puede inyectarsesiguiendo diferentes protocolos de inmunizaciOn_ Se puede, par ejemplo, aplicar variasdosis por via endovenosa con soluciones del antigeno en suero fisiot6gico, 0 puedeaplicarse una sola inyeccion de antigeno mas adyuvante por via subeutanea, con esteultimo metodo se obtiene un mayor titulo de anticuerpos y duran un tiempo mayor en elorganismo.

EI mejor protocolo de inmunizacion para un inmunoqeno en particular solo puede serestabtecido por ensayo y error, es decir probar dnerentes protocolos y quedarse con aquelque penntte obtener mejores respuestas de anticuerpos.

INMUNIZACION CON SUSPENS10N DE PROTEiNA EN ADYUVANTEUna buena respuesta de anticuerpos generalmente se obtiene utilizando un

adyuvante en la primera inmunizaci6n. Normalmente el inmun6geno se prepara en unaemulsion que contiene aceite mineral y Mycobacterium inactivados por calor (AdyuvanteCompleto de Freund-FCA). Esta emulsion asegura que elantlgeno se libere lentamente enla circulaci6n del animal y las bacterias inactivadas esttmulen la respuesta. inmune.

MATERIALES Y EQUIPOSCada equipo de trabajo reeibira un conejo para experimentacien

1. lnmunoqeno, en esta practica cada equipo recibira un tubo de ensayo conteniendo unasuspension proteica de una especie animal diferenteai conejo.2. Adyuvante completo de Freund (FCA)

3. Adyuvante incompleto de Freund (FIA)4. Jeringas de tuberculina5. Soludan salina fisiot6gica (0,15 M) 0 tampon fosfato salino (PBS).6. Tubos de ensayo.7_ Agitador vortex.

METODOLOGiA52

II'


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Recuerde que antes de proceder a la inrnunizacion del animal cada equipo deberaobtener una muestra de sangre de su respective conejo, con el fin de obtener el suem pre-inmune.SECUENCIA EXPERIMENTAL:

1. Preparacion del mmunogeno,2. Obtencion del suero pre-inmune.3. Primo Inmuruzacion4. Primer sanqrarniento post inmuruzacion5. Inmunizaci6n secundaria.6. segundo sangramiento post inmunizacion7. rnmunizaci6n terciaria8. Tercer sangramiento post inmunizacion

PREPARACI'ON DE LA SUSPENSION ANTrGENrCA1. Con una jeringa de tuberculina tome un volumen de 0,5 ml de la suspension proteicaasignada al equipo. Coloque el volumen de suero en un tubo ensayo.2. Tome igual volumen (0.5 ml) de FCA can una jeringa de tuberculina sin aguja. (Agitar

previamenteel adyuvante en el vortex can el fin de resuspender las bacterias en elaceite minerai).3. Deposite el volumen de adyuvante en el tuba de ensayo que contiene el suero yean la

misma jeringa (sin aguja) aspirar y expeler el contenido varias veces hasta que se formeuna suspension cremosa y espesa entre el suero y el adyuvante. (Volumen final: 1ml )4. Cargar la jeringa con la suspension antigimica preparada, despues de esto coloque ta

aguja a rajeringa y proceda a inocular el animal.SANGRAMIENTO DEL CONEJO:ANTES DE PROCEDER A LA INMUNlZAGI6N DEL ANIMAL GADA EQUrpO DEBERAOBTENER UNA MUESTRA DE SANGRE DE SU RESPECTtVO CONEJO, CON EL FIN DEOBTENER El SUERO PRE-fNMUNE.

a. Afeite alconejo en la areja izquierda y asegurese de que no quede pelo en Is zona.b. Limpie. bien la zona afeitada con un algodon impregnado en alcohol y cubrata conuna capa m uy fina de vasel~ina.c. Tomela oreja y de unos golpecitos sabre la arteria central hasta observar que lamisma se Uena de sangre.d. Tome la aguja y con el bisel hacia arriba introduzcala suavemente en fa arteria ycamience a recoger la sangre por goteo en un tuba de ensayo sin anticoagulante.e. Una vez recogida la sangre, proceda a detener el sangramiento presionando taherida con un algod6n limpio y seco hasta que no sangre.

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f. Limpiar el resto de la oreja can agua y jab6n azul a fin de eliminar todo residua desangre. Impregnar can vaselina y asequrese de que no sangra antes de retomarla ala jaina.g_ ldentificar el animal y su jaula. En el cuademo de practices tome nota de la fecha delsangramiento pre-inrmme e rn


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lIustraci6n 34: llustracten 10: tnoculacion subcutanea en conejo

3. Una vez inoculada la suspension antiqenica, haqa unos pequenos masajes can losdedos en los puntos de inoculaci6n can el fin de permitir una mejor distribucion delantigeno en el tejido.Can esto ya habra hecho la primo-inmunizaci6n.

HIPERJNMUNIZACION'Los anticuerpos policlonales frecuentemente se obtienen mediantehiperinmunizaci6n de los animates. La hiperinmunizacion se refiere a aquellos esquemasen los cuates los animales reeiben repetidas inoculaciones con el' mismo inmun6geno

(booster). Los anticuerpos asl producidos poseen propiedades particulares como parejemplo el cambia de clase de l,gMa JgGy la maduraci6n dela afinidadESQUEMA DE HIPERIN'MUNIZACION,ES Realizar 2 nuevas inoculadones can unintervala de 2 semanas entre cadainmunizaci6n (dia 15 y dia30 post moculacion inicial). Esta vez se haran per via

subcutanea yean adyuvante incompleto de Freund 0 en su defecto solucionsalina fisiologica.Nota: Antes de cada nueva inmuntzacion se debera sangrar el animal para laobtenclen de suero, en cada una de estas fases.

Fecha Actividad a realizarSemana del Sangrado y obtenci6n de suero pre-inmune10al 12 junio Pnrnera inoculaci6n del antfgeno (primo-inmunizaci6nJSemana del.24 Sangrado y obtenci6n de sueroinmune (sangrad0 1)

I al 26 de junio Segunda inoculaci6n del anUg.enoSemana del 08 Sangrado y obtencion de suero inmune (sanqrado 2)al 10 de julio Tercera inoculaci6n del antigeno.

! Semana del 22 Sangrado y obienci6n de suero hiper-inmune (sangrado 3)Jl 24 de julio


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PROTOCOLO DE HIPERINMUNIZA.CION

Antfgenosoluble 6particulado

Mazelaantigenoyadyuvantede Freunds

Diao_s.c~.~Antigeno .~Z ; . . . . . . .+ .. .\Adyuvante'" t")Completo . __ -!ideFreund

Dia15-S';JC~. . .Antigeno( .+ .. .Adyuvante~ ~ '1incompleto > - - ~ " , .de Freund

~...... II~Dia30-S'C'~./ ~ : r m

geno..Adyuvante~ ~Incompl~ ~.

de Freund ~ ~

Sangrado pre inmune dia 0

Sangrado post inmune dia 15

Sangradopost Inmune dis 30

Sangrado post inmune dia 45

i l l ~h AlicuolareJ suero ,

identif icar. - - yguardarIncubar sangn "etoda Sepal ' lf cOIgulo 2 .000 r.p.m. a-we3PCx2 hOllis lanoch . depandes Durlme 1 5 'lIustraci6n 35: Protocolo de Hiperinmunizaci6n

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G IEHTOPOST IZACIDN:1.. A los 15 dlas de la prirnera inoculacron, sangre de nuevo el conejo de acuerdo a lametodologiaya descrita. Puede utilizar la otra oreja.

2.. Obtenga ell suero de esa fecha en igual forma a como lohizo para 1 8 1 obtencion delos sueros anteriores.INMUNIZACION SECUNDARIA:

1. Realice una nueva inmunizaci6n a los 15 dias de la primo-inmunizacion. Prepare elinmun6geno de igual forma a como 1 0 hizo 1 8 1 primera vez pero en esta oportunidadutilizara adyuvante incompleto de Freund 0en su defecto solucion salina fisfofogica.2. Proceda a inocular el conejo de igual forma a como 1 0 hizo con la inmunizaci6n

primaria. Todo el inmunOgeno debe colocarse en la zona supra-escapular en variaspartes. Aseqerese de lirnpiar la aguja con un atgodon empapado en alcohol antes decada inoculacion.SEGUNDO SANGRAMIENTO POST INMUNIZACION:

1.. A los 30 dias de 1 8 1 . primo-inmunizaci6n, sangre de nuevo el conejo de acuerdo a tametodologia ya descrita.2. Obtenga el suero de esa fecha en igual forma a como 10 hizo para la obtention delos sueros anteriores.

INMUNIZACICN TERCIARIA:3. Realice una nueva inrnunizacion a los 30 dias de la prirno-inmunizaclen. Prepare elinmun6geno deigual forma a como 1 0 hizo la primera. vez pero en esta oportunidadutilizara adyuvante incompleto de Freund oen su defecto saludan saUna fisial6gica.4. Proceda a inocular el conejo de igual forma a como 10 hizo con la inmunizaci6nprimaria. Todo el inmun6geno debe cotocarse en ta zona supra-escapular en variaspartes. Asegurese de limpiar la aguja con un algOO6n empapado en alcohol antes de

cada inoculacion.TERCER SANGRAMIENTOPOST INMUNIZACION:

3. A los.45 dias de la primo-inmunizaci6n, sangr.e de nuevo, el conejo de acuerdo a lametodologia ya descrita.

4. Obtenga el suero de esa fecha en igual forma a como 10 hizo para ta obtenci6n delos sueros anteriores.RECOMENDACIONES

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Gada equipo de trabajo debera respansabilizarse del conejo que se Ie asigna, el.mismodebera ser identiflcado con el nurnero del equipo y el dla de practicas, Recuerde que es importante darle un trato adecuado a tos animates, par 10 que laquietud y el sitencio en ellugar de trabajo facilitara la obtencion de muestras de sangre. Las muestras de sangre se procesaran el mismo dla con la finalidad de obtener elsuero. Este es el rea,ctivo biologico mas irnportante. a ser usado en las pra,cticas

posteriores ya que constituye la fuente de anticuerpos. Los sueros obtenidos se conservaran a -70 G O en tubos de ensayos tapados ydebidamente identificadosque deberan ser entregados al personal tecnico-oocente dela Galedra.

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