Praktikum Proteinchemie SS 19 Modul: 11-BCH-0414 11-111 ... · •das Modul wird mit einer Klausur (Vorlesung/Praktikum) abgeschlossen •voraussichtlich •Schein wird erst ausgestellt

Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger

Leitung: Dr. Kathrin Bellmann-Sickert, [email protected]

Praktikum Proteinchemie SS 19

Modul: 11-BCH-0414

11-111-1164-N (Chemiker)

Organisatorisches

• Ort: Praktikumssaal 7, 3. Etage Brüderstraße 34

• Schloß für Spind mitbringen

• Das Praktikum findet in Zweier- bis Dreiergruppen statt

Praktikumsbeginn Gruppe E: 29.04.2019

Praktikumsbeginn Gruppe D: 03.06.2019

• Praktikumszeiten:

Montag: 11:30 h – 19:30 h

Dienstag: 9:30 h – 16:30 h

Freitag: 10:45 h – 17:45 h

(abhängig vom Seminar,

bitte mit den Betreuern

abstimmen)

Gruppe Mo Di Fr

E 29.04. 30.04. 03.05.

E 06.05. 07.05. 10.05.

E 13.05. 14.05. 17.05.

E 20.05. 21.05. 24.05.

E 27.05. 28.05. 31.05.

D 03.06. 04.06. 07.06.

D frei 11.06. 14.06.

D 17.06. 18.06. 21.06.

D 24.06. 25.06. 28.06.

D 01.07. 02.07. 05.07.

Organisatorisches

• Vor jedem Versuchsblock muss ein Antestat abgelegt werden (i. d. Regel im

Seminarraum 324)

gestaffelte Testattermine:

Block 3: 11.30 Uhr

Block 2: 11.50 Uhr

Block 5: 12:10 Uhr

Block 4: 12.30 Uhr

Block 1: 12:50 Uhr

• Sollte etwas dazwischen kommen (z. B. Arzttermine, Kollisionen mit anderen

Veranstaltungen): bitte vorher mit der Praktikumsbetreuerin abklären!!!

Inhalte des Praktikums

• Ziele des Praktikums: Erlernen verschiedener proteinchemischer

(Expression, Proteinisolierung, -aufreinigung, -modifizierung) und

proteinanalytischer Methoden (SDS-PAGE, Western Blot,

Immunfärbung, CD-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie,

Massenspektrometrie)

• Beispiel: Expression, Isolierung, Aufreinigung, Modifizierung und

Analyse des enhanced Green fluorescent Proteins (eGFP)

• der Versuch zur Enzymkinetik wird an einem anderen Beispielprotein

durchgeführt (Laktatdehydrogenase)

• Skript, Zeitpläne im Netz

Versuchsblöcke

Block 1: Rekombinante Synthese

(Expression von eGFP in E. coli. Zellernte und Zellaufschluss)

Block 2: Reinigung und Modifizierung

(Affinitätschromatographie, Biotinylierung)

Block 3: Proteinanalytik I

(SDS-PAGE, Western-Blot)

Block 4: Proteinanalytik II

(CD-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie)

Block 5: Enzymkinetik

(Michaelis-Menten-Kinetik, Hemmung)

Block Mo, 11:30-19:30 h Di, 10-17 h Fr, 10:45-17:45 h

1Vorbereitung Expression, Animpfen der Vorkultur

Expression, Zellernte Zellaufschluss

2Affinitätschromatographie (Beladung der Chitinsäule)

Affinitätschromatographie

(Elution des EGFP-Thiolesters)

Biotinylierung

Größenausschluss-chromatographie

3SDS-PAGE 1

Western Blot

Immunfärbung

des Western Blots

SDS-PAGE 2

4Fluoreszenzspektroskopie

Massenspektrometrie

Fluoreszenzspektroskopie Massenspektrometrie

CD-Spektroskopie

Fluoreszenzspektroskopie Massenspektrometrie

5 Michaelis-Menten-Kinetik Enzymhemmung

Versuchsblöcke

Block 1

Expression

Block 2

Reinigung/

Modifizierung

Block 3

Proteinanalytik I

Block 4

Proteinanalytik II

Block 5

Enzymkinetik

Block 1-4 bauen aufeinander auf – Beispiel eGFP

Versuchsblöcke

Organisatorisches

• Pro Versuch muss jede Gruppe ein Antestat zum Versuch durchführen.

• Ohne bestandenes Antestat (sprich Vorbereitung) kein Versuch

• Zu jedem Versuchsblock muss ein Protokoll (pro Gruppe) geschrieben werden

(insgesamt 5). Zeitvorgabe: 1 Woche nach Beendigung des Versuchsblocks

Abgabe des ersten Protokolls zu Beginn der 3. Praktikumswoche!

elektronisch an [email protected]

• Gruppe E: 11.06.19 Abgabe des letzten Protokolls

• Gruppe D: 11.07.19 Abgabe des letzten Protokolls

Inhalte des Protokolls: kurze Einleitung (max. 1 DIN A4 Seite)

Methoden (Vergangenheit, Passiv)

Ergebnisse (Textteil nicht vergessen, nicht bloß Abbildungen

aneinanderreihen)

Auswertung/Diskussion

Organisatorisches

• Für Biochemiker:

• das Modul wird mit einer Klausur (Vorlesung/Praktikum) abgeschlossen

• voraussichtlich

•Schein wird erst ausgestellt nach Bearbeitung aller Protokolle +

bestandener Klausur!

• Für Chemiker: Schein wird ausgestellt nach beendeter Protokollabgabe

• Note setzt sich zusammen aus Leistungen aus Testaten,

Versuchsdurchführung und Protokoll (Protokoll am höchsten gewichtet)

Arbeitsschutz

Laborordnung & Haftungsregelung

Universität Leipzig

Institut f. Biochemie

AK Prof. Beck-SickingerRRS Belehrung 2013_14

Seite 10

Fak. f. Biowissenschaften, Pharmazie & Psychologie

Institut für Biochemie

AK Prof. Dr. Annette Beck-Sickinger

Praktikumsleiter: Dr. Kathrin Bellmann-Sickert

Proteinchemie

Arbeitsschutz




Seite 11

Geltende Betriebsanweisung:

Verpflichtung zur Einhaltung der aushängenden Laborordnung

Informationspflicht bei Arbeiten mit Gefahrstoffen über H-und P-Sätze via Intranet o.ä.

GESTIS-Stoffdatenbank

Arbeitsschutz




Seite 12

Tragen von Schutzkleidung und Schutzbrillen sowie Handschuhen

Kennzeichnungspflicht der verwendeten Gefahrstoffe, auch bei kleinen Mengen

Das Berühren von Gegenständen außerhalb der Versuchsanordnung sowie

das Verlassen des Labors mit „kontaminierten“ Handschuhen ist untersagt.

Beim Umgang mit Gefahrstoffen möglichst unter einem Abzug arbeiten

Ordnung & Sauberkeit an den Arbeitsplätzen, Eintrag in Geräte-Kalender sofern

vorhanden

Arbeitsschutz




Seite 13

Pflicht, sich mit der Bedienung der Laboratoriumsgeräte vor deren

Benutzung vertraut zu machen und sorgsam damit umzugehen

sämtliche Defekte an Geräten sind dem Betreuer bzw. im Sekretariat

zu melden

Schlussdienst im Labor (Fenster & Türen verschlossen? ;

nicht benötigte Wasser- und Energiequellen abgestellt?)

Laborräume bei Abwesenheit verschließen

exp. Arbeiten nicht allein ohne weitere fachkundige Person ausführen

Arbeitsschutz




Seite 14

Gasanschlüsse in den Laboratorien nicht unsachgemäß benutzen,

techn. Wirkungsweise bei Bedarf erklären lassen

Anzeigepflicht einer bestehenden Schwangerschaft, damit alle Arbeiten

so organisiert werden können, dass die Gesundheit von Mutter und

Kind bestmöglich geschützt sind

Bei kleineren Verletzungen sollte Eintrag in kleines grünes Buch

(Sekretariat) erfolgen.

Abfallverminderung und – entsorgung (LM-Tonnen, Chemikalienreste

nicht in Schränken lagern, sondern zentraler Entsorgung

(Koll. Strohscheidt) zuführen

Arbeitsschutz




Seite 15

bei Verätzungen und/oder Verbrennungen mindestens 10 min mit

fließendem kalten Wasser, besser mit Kalziumgluconat (fest oder als

Lösung) spülen!!!

Spritzen nicht ohne Schutzhüllen entsorgen!

Essen und Trinken nur in den dafür vorgesehenen Räumen

Nicht unterwiesenen Personen ist das Arbeiten und der Aufenthalt in den

Laboratorien untersagt.

Arbeitsschutz




Seite 16

... In Gefahrensituationen...

Ruhe bewahren, geeignete Maßnahmen einleiten, Vorgesetzten informieren;

Dispatcher- und Notrufnummern an den Telefonen;

Feuerlöscher im Raum oder auf den Gängen sind universell einsetzbar.

Über Standorte & Fluchtwege informieren!

Arbeitsschutz




Seite 17

Praktikum Proteinchemie

Arbeitsschutz




Seite 18

Praktikum Proteinchemie

Die ständig steigenden Reparaturkosten haben zu den folgenden Anweisungen des

Institutsdirektors geführt:

Jeder Student muss für Glasbruch und sonstige selbst verschuldete Sachschäden in

Höhe von einem Drittel des Anschaffungspreises bzw. der Reparaturkosten selbst

aufkommen.

Bei Gruppenpraktika haftet die Praktikumsgruppe, wobei alle Studenten einer Gruppe

für die ausgehändigten Geräte quittieren.

Die Ausgabe der Praktikumsscheine erfolgt erst, wenn keine finanziellen Forderungen

seitens des Institutes mehr bestehen.

Der Abschluss einer Haftpflichtversicherung bzw. Glasbruchversicherung wird

empfohlen.

Haftungsregelungen

Belehrung nach der Gentechnik-

Sicherheits-Verordnung (GenTSV)

Alle in einer gentechnischen Anlage Beschäftigten müssen vor Arbeitsantritt

und dann einmal jährlich über die sicherheits-relevanten Aspekte der Arbeit

belehrt werden.

Was ist ein GVO (Gentechnisch Veränderter Organismus): Organismus, der mit

Hilfe eines Vektors neue DNA erhalten hat; auch gentechnisch veränderte

Viren sind laut Gesetz GVOs (Leitfaden S. 2).

DNA alleine (genomische, virale und Plasmid-DNA) ist kein GVO.

Beispiel: Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus einem GVO ist

gentechnische Arbeit, Arbeit mit isoliertem rekombinanten Plasmid

(Restriktionsspaltung, Sequenzierung) ist keine gentechnische Arbeit.

Gentechnische Anlage = Labore, Flure, Treppenhäuser, Gewächshäuser,

Tierställe

Gentechnische Arbeit = Erzeugung eines GVOs, Verwendung, Vermehrung,

Lagerung, Zerstörung, innerbetrieblicher Transport, Zerstörung und Entsorgung

von GVOs

Belehrung nach der Gentechnik-Sicherheits-Verordnung

(GenTSV)

Sicherheitseinstufung der gentechnischen Arbeiten erfolgt entsprechend

ihrem Gefährdungspotential in 4 Sicherheitsstufen:

Sicherheitsstufe 1: es ist nicht von einem Risiko auszugehen

Sicherheitsstufe 2: geringes Risiko

Sicherheitsstufe 3: mäßiges Risiko

Sicherheitsstufe 4: hohes Risiko

für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt. Bei Sicherheitsstufe 4 reicht

bereits der begründete Verdacht eines hohen Risikos aus.

Belehrung nach der Gentechnik-

Sicherheits-Verordnung (GenTSV)

Alle Räume in denen gentechnisch gearbeitet wird müssen genehmigt und gekennzeichnet sein, der Zutritt ist

nur belehrten Personen erlaubt.

Jacken/Taschen dürfen nicht mit in den S1-Bereich genommen werden.

Essen, Trinken, Schminken, Zigarettenschachteln (mit Inhalt) sind verboten

Es müssen Laborkittel getragen werden (auch von Personen, die sich im S1 Labor aufhalten ohne

gentechnisch zu arbeiten). Die Laborkittel müssen im S1 Bereich bleiben.

Fenster müssen während der Arbeit geschlossen sein

Vorratslagerung in den dafür vorgesehenen Schränken (keine Kisten auf dem Boden!)

Nur auf den dafür vorgesehenen Arbeitsflächen (mit Randerhöhung, Verfugung zu Boden und Wand)

darf experimentell gearbeitet werden. Die Arbeitsflächen sind mindestens einmal täglich zu reinigen

und zu desinfizieren.

Verwendung von Kanülen/Skalpellklingen ist auf ein Minimum zu beschränken, spitze Gegenstände müssen

so entsorgt werden, dass keine Verletzungsgefahr besteht (gilt auch für Glasabfall!)

Bei Arbeiten mit GVOs müssen Handschuhe getragen werden, die im S1-Labor entsorgt werden

müssen.

Arbeiten ohne Aerosolbildung (mit gestopften Pipetten, wenn lebende Zellen)

Autoklavieren von Müll, wenn dieser mit GVOs in Berührung kam

Aufbewahrung von GVOs bruchsicher in Gefäßen mit Schraubdeckel, deutlich entsprechend der

Gentechnikaufzeichnungen beschriftet (Zelle, DNA, evtl. Passagezahl, Name, Datum)

Transport in gekennzeichneten Gefäßen mit Deckel, geschützt vor Bruch und Verschütten

Die Hände sind nach Beendigung der Arbeit zu reinigen und zu desinfizieren. Spülbecken müssen mit

Desinfektionsmittel und Hautschutzcreme versehen sein. Es dürfen keine Stoffhandtücher oder

Putzlappen verwendet werden (nur Einwegmaterialien).

Meldungspflicht bei Unfällen

Aufzeichnungspflicht (S1: 10 Jahre; S2: 30 Jahre)

Zutritt während der Schwangerschaft nur nach Sondergenehmigung

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