BSc Biochemie 4.Semester VL Proteinchemie ... · Posttranslationale Protein-Modifikationen BSc Biochemie 4.Semester – VL Proteinchemie Leipzig, 17.05.2019 Antje Garten

Posttranslationale Protein-

Modifikationen

BSc Biochemie 4.Semester – VL Proteinchemie

Leipzig, 17.05.2019

Antje Garten

Titel der Präsentation | Untertitel

Einrichtungsname

POSTTRANSLATIONALE

MODIFIZIERUNG VON PROTEINEN

2

• Wie kann man PTMs nachweisen?

• Wie kann das Funktionsspektrum von

Proteinen durch PTMs erweitert werden?

• Welche Modifikationen gibt es?

-> permanente Modifizierungen

-> temporäre Modifizierungen

C. T. Walsh, Posttranslational Modification of Proteins


Einrichtungsname

21. AS: SELENOCYSTEIN

3

Translationale Modifikation: Selenocystein wird auf tRNASec gebildet und durch ribosomale Synthese in Proteine eingebaut

selenocysteine insertion sequence


Einrichtungsname

22. AS: PYRROLYSIN

4 Blight, S.K., et al. (2004). Direct charging of tRNA(CUA) with pyrrolysine in vitro and in vivo. Nature 431, 333-335.

H 2 N

H N

O H

O

O

N

H2N

NH2

OH

O

Lysine

Pyrrolysin MmPylRS MbPylRS

CUA

tRNAPyl

CUA

Pyrrolysyl-tRNAPyl

Methanosarcina barkeri fusaro

Translationale Modifikation: Pyrrolysin wird durch pylS (class II aminoacyl-tRNA synthetase) auf pylT tRNA uebertragen


Einrichtungsname

POSTTRANSLATIONALE MODIFIZIERUNG

(PTM)

5

…chemische Modifikationen,

die nach der Translation entstehen

Acetylation

Alkylation

Amidation

Biotinylation

Formylation

Glycosylation

Glycation

Hydroxylation

Iodination

- Faltung

- Lokalisation

- Funktion

Isoprenylation

Lypoylation

Oxidation

Palmitoylation

Phosphorylation

Sulfation

…


Einrichtungsname

PTM: EINLEITUNG I

6

Phosphoramidit-Baustein

• Modifizierung mit chemischen Gruppen

- Phosphorylierung, Lipidisierung,

- Glykosylierung, Methylierung,…

• Chemische Modifizierung der Aminosäuren

- Citrullin aus Arg, Glu aus Gln, Amidierung, GFP

• Modifizierung mit Peptiden/Proteinen

- Ubiquitinylierung, SUMOylierung

• strukturelle Änderungen

- Disulfidbrücken, proteolytische Spaltung


Einrichtungsname

PTM: EINLEITUNG II

7

temporär - permanent • Modifizierung mit chemischen Gruppen

- Phosphorylierung, Lipidisierung,

- Glykosylierung, Methylierung,…

• Chemische Modifizierung der Aminosäuren

- Citrullin aus Arg, Glu aus Gln, Amidierung, GFP

• Modifizierung mit Peptiden/Proteinen

- Ubiquitinylierung, SUMOylierung

• strukturelle Änderungen

- Disulfidbrücken, proteolytische Spaltung

Signale in der Zelle ändern/erweitern die

Eigenschaften der Proteine


Einrichtungsname

KOVALENTE ADDITION

ZU SEITENKETTEN VON AMINOSÄUREN

8

Ausgeführt von Enzymen: > 500 Kinasen, > 150 Protein- phosphatasen, …-> benötigen modifizierbare AS-Reste

Asp

Glu

Ser

Thr

Tyr

His

Cys

Met

Lys

Arg

Asn Gln

Gly Pro

Trp

Nucleophiles

Other modifiable amino acids

Weak nucleophile/electrophile


Einrichtungsname

9

EINTEILUNG NACH DEN AMINOSÄUREN I


Einrichtungsname

EINTEILUNG NACH DEN AMINOSÄUREN II

10


Einrichtungsname

WICHTIGE ÜBERTRÄGER FÜR

MODIFIZIERUNGEN I

11

…benötigen aktivierte (elektrophile) Gruppen

Phosphat-

Sulfat-

Glycosyl-

Isoprenyl-


Einrichtungsname

WICHTIGE ÜBERTRÄGER FÜR

MODIFIZIERUNGEN II

12

Acyl- ADP-ribose

Methyl-


Einrichtungsname

NACHWEIS

13 www.cellsignal.com

• verändertes Laufverhalten im SDS-Gel

-> zu groß (Glykosylierung)/zu klein (Proteolyse)

im Vergleich zur Berechnung

-> verschmierte Banden (Glykosylierung)

• gruppenspezifische

Abspaltung, Unterschied im

SDS-Gel

-> Glykosidasen

PNGase F: Peptide:N-glycosidase F


Einrichtungsname

NACHWEIS

14

• Massenspektrometrie

-> nach tryptischer Spaltung

• spezifische Färbereaktionen im Western-Blot

-> anti-Xaa(PO3)-Antikörper


Einrichtungsname

MASSENDIFFERENZEN DER RESTE BEI

PTM I

15


Einrichtungsname

MASSENDIFFERENZEN DER RESTE BEI

PTM II

16


Einrichtungsname

BEISPIEL MASSENSPEKTROMETRIE

17 Casati P et al. Histone Acetylation and Chromatin Remodeling Are Required for UV-B–Dependent Transcriptional Activation of Regulated Genes in Maize. The Plant Cell, 2008. 20: 827-842.

Spectrum of acylated histone H4 peptide


Einrichtungsname

BEISPIEL MASSENSPEKTROMETRIE

18 Li Y et al. Methods Mol Biol. 2013;1077:81-104. doi: 10.1007/978-1-62703-637-5_6.

Spectrum of acylated histone H4 peptide

• Zellaufschluss (Ultraschall)

• Reduktion, Alkylierung

• Tryptischer Verdau

• Aufreinigung der Peptide

• Immunaffinitätspräzipitation (Acetyl-Lysine Antikörper)

• Auftrennung mittels Flüssigchromatografie (LC)

• Massenspektrometrie (MS/MS) Analyse und

• Datenauswertung


Einrichtungsname

TEMPORÄRE MODIFIZIERUNGEN

19

• Phosphorylierung

• Acetylierung

• Ubiquitinylierung

• Methylierung

Reversible Modifizierungen:

Enzyme 1

Enzyme 2

Donor-

PTM

Protein Protein


Einrichtungsname

Phosphorylierung

20

wichtigste temporäre Modifizierung!

-> ändert Ladung und Raumerfüllung im Protein

-> Strukturänderung!

Nachweis: SDS-PAGE -> Western Blot, spezif. Antikörper

sodium dodecylsulfat – polyacrylamide gel electrophoresis


Einrichtungsname

ja/nein vs Position der Phosphorylierung:

-> Mutagenese oder spezifische AK, u.U.

Massenspektrometrie (MS)

Auswertung:

PhosphoProtein/Protein

WESTERN BLOT

21

AKT

Anti-Totalprotein-Antikörper

Anti-Phosphoprotein-Antikörper

0 0.01 0.1 1 10 100

Insulin (nmol/l)

pAKT(Thr308)

0 0.01 0.1 1 10 100

Insulin (nmol/l)


Einrichtungsname

ACETYLIERUNG

22

ändert Ladung im Protein -> Strukturänderung!

Nachweis: Western Blot, isoelektrische Fokussierung

(IEF), tryptische Spaltung und MS/MS


Einrichtungsname

UBIQUITINYLIERUNG I

23

-> neue Proteinstruktur, neue Interaktion -> Abbau im

Proteasom

Nachweis: Western Blot


Einrichtungsname

UBIQUITINYLIERUNG II

24


Einrichtungsname

UBIQUITINYLIERUNG - NACHWEIS

25

Nachweis: SDS-PAGE -> Western Blot, spezif. Antikörper


Einrichtungsname

N-METHYLIERUNGEN I

26

Substrat

Mechanismus

Vergleiche: -7 kcal/mol for Phosphoryl-Transfer von ATP

O, S, C-Methylierung (Arg and Gln)

thermodynamic driving force

-> verändert nicht die kationische Ladung

-> Hydrophobizität wird erhöht, vor allem

bei Di + Trimethylierung!!


Einrichtungsname

N-METHYLIERUNGEN II

27

Asn Gln

His

Arg

Lys

-> viele verschiedene Methyl-

transferasen

-> unterschiedliche Strukturen

-> alle benutzen SAM


Einrichtungsname

METHYL-TRANSFERASEN

28

SAM

Humane Histon N-Methyltransferase


Einrichtungsname

HISTON-MODIFIZIERUNG I

29


Einrichtungsname 30

HISTON-MODIFIZIERUNG II

3D-Modell eines Histon-DNA-Komplexes

Histon-Modifikationen:

- Stabilisierung Histon-DNA-

Wechselwirkung

- Rekrutierung anderer Proteine


Einrichtungsname

HISTON H3

31


Einrichtungsname

N-TERMINUS DES HISTON H3

32

-> 11/36 Reste sind modifiziert


Einrichtungsname

HISTON H3 –MULTIPLE

MODIFIKATIONEN

33

Wechselwirkung von

verschiedenen PTMs


Einrichtungsname

PERMANENTE MODIFIZIERUNGEN

34

• Glycosylierung • Lipidierung • Kovalente Bindung von Cofaktoren • Carboxylierung • Transglutaminierung • Hydroxylierung

Irreversible Modifizierungen:

Enzym

Donor-

PTM

Protein Protein

• C-Amidierung • Proteolytische Spaltung • Self-modification


Einrichtungsname

GLYCOSYLIERUNG I

35

Funktion: Orientierung in der Membran,

Erhöhung der Hydrophilie, Erkennungsstrukturen


Einrichtungsname

N-GLYCOSYLIERUNG IM ER: CO-

TRANSLATIONAL

36 https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-

center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protein-glycosylation.html

ER: endoplasmatisches Reticulum

OSTase: Oligosaccharid-Transferase

https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protein-glycosylation.html
























Einrichtungsname

GLYCOSYLIERUNG II

37


Einrichtungsname

GLYCOSYLIERUNG IM WESTERN BLOT

38 CRF1R: corticotropin-releasing factor 1 receptor

Mature glycosylated

Mannose-rich glycosylated

Non-glycosylated

Anti-Protein-Antikörper

CRF1R, MW ~45 kDa

5 N-glycosylation sites

PNGaseF


Einrichtungsname

LIPIDANKER

39

Translokation in der Zelle


Einrichtungsname

KOVALENTE VERBRÜCKUNG VON

COFAKTOREN IN ENZYMEN I

40

Pantothensäure vitamin H

vitamin B5

-> Prosthetische Gruppen


Einrichtungsname


COFAKTOREN IN ENZYMEN II

41

Biotin-Carboxylase


Einrichtungsname


COFAKTOREN IN ENZYMEN III

42

-> Einführung neuer

Enzymfunktionen


Einrichtungsname

MODIFIKATIONEN VON GLU UND GLN

43

Carboxylierung γ-Carboxy-Glu

Transglutaminierung

Transglutaminase

Carboxylase

Verfestigung von Fibrin bei der Blutgerinnung

Blutverdünner, inhibieren die Regenerierung von Vitamin K


Einrichtungsname

HYDROXYLIERUNG

44

Prolyl-4- Hydroxylase

Peptidylglycine –α-hydroxylating monooxygenase


Einrichtungsname 45

MODIFIZIERUNGEN DER PROTEINKETTE

C-terminale Amidierung von Peptiden: oxidativ

Peptidylglycine-a-hydroxylating monooxidase (PHM)

PAL - peptidylamidoglycolate

lyase

-> irreversibel

peptidylamidoglycolate


Einrichtungsname

MODIFIZIERUNGEN DER PROTEINKETTE

46

Proteolyse: Hormonbiosynthese, Abbau von Proteinen,

schnelle Signalkaskaden: Blutgerinnung, Immunsystem

-> irreversibel


Einrichtungsname

BIOSYNTHESE VON INSULIN

47


Einrichtungsname

BIOSYNTHESE

VON INSULIN

48


Einrichtungsname

GFP: MODIFIZIERUNG DREIER

AMINOSÄUREN

49

-> irreversibel

Self modification / autocatalyzed reaction


Einrichtungsname

GFP

50


Einrichtungsname

TAKE HOME

51

• Temporäre PTMs

• Phosphorylierung

• Acetylierung

• Ubiquitinylierung

• Methylierung

• Permanente/irreversible PTMs

• Glycosylierung

• Kovalente Bindung von Enzym-Cofaktoren

• Proteolyse

• Enzymsubstrate/Überträger

• Nachweis von PTMs

VIELEN DANK!

Nächstes Mal: Einführung in die

Enzymologie

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