Epidemiología Molecular: Genotipificación de Brucella spp., aislada en diferentes reservorios en el Ecuador; resultados preliminares

Elizabeth Minda A. (elizabeth.minda@gmail.com)

Jorge Ron RománPaulina Fernández

Centro Internacional de ZoonosisUNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

Marzo 27, 2013

Brucelosis - Generalidades

La Brucelosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por bacterias del género Brucella spp.

La relación causal entre el organismo y la enfermedad fue establecida por Dr. David Bruce (microbiólogo) en 1887. (Aréstegui et al., 2001)

ESPECIE HEMBRA MACHO

Bovino Aborto en el último tercio de la gestación.

Orquitis uni o bilateral,epididimitis.

Porcino Aborto, esterilidad y aumento de la mortalidad. Parálisis y cojeras.

Ovino Los abortos son raros. Epididimitis uni o bilateral con atrofia testicular.

Canino Los abortos pueden repetirse, metritis.

Orquitis, epididimitis, prostatitis.

Ciclo de TransmisiónANIMALES ENFERMOS CONTACTO

(placenta, abortos, heces, secreciones vaginales)

INGESTIÓN(leche cruda y derivados lácteos)

INOCULACIÓN/INHALACIÓN(vacunas vivas, muestras contaminadas)

Epidemiología - Brucelosis

González (2009) determinó una seroprevalencia de 1.5% en productores pecuarios.

- RB / SAT-EDTA / iELISA

Faz (2011) estableció una seroprevalencia global de 1.2% en trabajadores de catorce camales.

- RB / SAT-EDTA

Fuente: http://www.oie.int

Olmedo (2010) encontró una prevalencia de 11.96% (33/276)- Aislamiento y biotipificación- Brucella abortus

Fuente: Minda-Aluisa, 2010

Mecanismos de transmisión depende de las distintas áreas geográficas, especies de Brucella spp., condiciones climáticas, distribución de la población de riesgo, tipos de producción pecuaria, entre otras.

Cocobacilo Gram negativo

Patógenos intracelulares facultativos

no móviles y no formadores de esporas

Fuente: http://www.cdc.gov/Fuente: http://www.uniprot.org

Clasificación Sistemática

Dominio: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Proteobacteria alfa

Orden: Rhizobiales

Familia: Brucellaceae

Género: Brucella

Fuente: Investigación CIZ

Brucelosis- Agente etiológico

Especies y Biotipos (variedades genéticas)

Especies Biotipos Hospedador natural Referencia

B. mellitensis 1 - 3 Cabra, oveja, bovinos, cánidos, hombre Marston, 1859

B. abortus 1 - 6, 9 Bovinos, cánidos, hombre Bruce, 1866

B. suis 1 - 5 Cerdo, cánidos, hombre Huddleson, 1929

B. ovis Ninguno Ovinos Buddle, 1956

B. canis Ninguno Cánidos, hombre Carmichael & Bruner, 1968

B. neotomae Ninguno Rata del desierto Stoenner & Lackman, 1957

B. pinnipedialis Ninguno Focas, lobos marinos Dawson et al., 2008

B. ceti Ninguno Delfines, ballenas Dawson et al., 2008

B. microti Ninguno Zorros Scholz et al., 2008

B. inopinata Ninguno Humanos Scholz et al., 2010

Brucella spp. – Diagnóstico (identificación)

Indirecto Directo

Rosa de Bengala

SAT-EDTA

ELISA

Skin Test

Anillo Coloreado en leche (MRT)

Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012

Microbiología

Procedimientos laboriosos y de alto riesgo

Fuente: Paulsen et al., 2002

Genética - Cromosomas

Figura 1. Circular representation of the two chromosomes of B. suis strain 1330.

Taxonomía – Brucella spp.

Fuente: http://www.upm.es

Fuente: http://www.bio.davidson.edu

Fuente: Michaux, 1997

Relaciones filogenéticas

Filogenética de Brucella spp.

95% de similitud en el ADN genómico

100% de similitud en fragmentos del gen 16S rRNA

Género Monoespecífico

(Fuente: http://www.wipo.int)

Fuente: Characho et al., 1997

Brucella melitensis biovar abortus 1- Por la relación antigénica- Estudios hibridación ADN-ADN- Secuenciación del genoma y de genes 16S rRNA

Fuente: Orduña, 2001

Epidemiología Molecular: Genotipificación El uso de la biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas es IMPORTANTE para poder establecer patrones epidemiológicos mas precisos.

El hombre es susceptible a la infección B. melitensis, B. suis (excepto por el biovar 2), B. abortus y B. canis

Las diferentes investigaciones y análisis moleculares con los cuales se han estudiado a Brucella spp., sirven para conocer la genética de la especie y biotipos.

Biotipificación: Identificación de biotipos (conjunto de fenotipos que corresponden a un mismo genotipo) de la misma especie (Jones et al., 1982).

Metodología - Generalidades

Suspensiones bacterianas inactivadas

Extracción de ADN(Método fenol/cloroformo)

IS711 PCR

AMOS PCR Convencional

AMOS PCR Modificada

OtrasBrucella spp.

Brucella spp.B. abortus bv 1, 2 o 4 B. melitensis bv 1, 2 o 3 B. suis bv 1

B. ovis

RB51/S19

78

85 3

BovinoCaprinoCaninoHumano

Muestras Biológicas

Especie Muestra Aislados

BovinosLecheÓrganosHemocultivo

37401

Caninos Órganos 5

Caprinos Leche 8

Humanos Hemocultivo 3

TOTAL 94

Método (diagnosis molecular) - PCR IS711

IS Secuencia de Inserción

IS711 o IS6501

El número de copias de IS711 varía en el genoma de las especies de Brucella, van desde las 7 de B. abortus, B. melitensis y B. suis a más de 30 en B. ovis y en las cepas de Brucella aisladas de los mamíferos marinos (Ocampo-Sosa & García Lobo, 2008).

260-bp

MP

MP

Fuente: Investigación Directa CIZ, 2012

Método molecular (diagnosis diferencial): AMOS PCR convencional

Fuente: Bricker et al., 1994

498-bp

731-bp 976-bp

285-bp

Fuente: Bricker et al., 1995

178-bp

364-bp

178-bp

Brucella abortus bv. 1- Cepa Vacunal - Cepa de Campo

498-bp

Método molecular (diagnosis diferencial): AMOS PCR modificada

Resultados

Fuente: Investigación Directa CIZ, 2011

Cepas Vacunales. 9

Cepas de Campo. 31

Otras. 14

Brucella spp., 40

Método Resultado esperado

IS711 PCR Brucella spp.

AMOS PCR Convencional

B. abortus bv 1, 2 o 4B. melitensis bv 1, 2 o 3B. ovisB. suis bv 1

AMOS PCR Modificada

Cepa VacunalCepa de Campo

42.6%Fuente: Bricker et al., 1994; Bricker et al., 1995

MP

MP

498 bp

MP

MP

Especie Muestra IS711 Amos Conv. Amos Mod.

Bovino

Leche35 (+)

B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.

19 (cepa campo)2 (cepa vacunal)14 (n.i.)

2 (-) --- ---

Órganos31 (+)

B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.

3622

9 (-) --- ---

Hemocultivo 1 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 1

Canino Órganos 5 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 5

Caprino Leche5 (+)

B. abortus bv. 1, 2 o 4B. abortus bv 1Brucella spp.

014

3 (-) --- ---

Humano Hemocultivo 3 (+) B. abortus bv. 1, 2 o 4 3

TOTAL 94

Conclusiones• El hallazgo de aislados de Brucella spp., en diferentes especies de

hospedadores animales en el Ecuador, demuestra la importancia que esta zoonosis tiene en el Ecuador.

• La utilización conjunta de técnicas microbiológicas y moleculares, aporta información valiosa en el análisis de la Epidemiología Molecular.• Relación Fenotipo-Genotipo

• Al no identificar un gran número de cepas de Brucella spp., es necesario buscar metodologías alternativas que permitan caracterizarlas: VTNR’s (HOOF- Print)

• Debido a un alto porcentaje de cepas vacunales encontradas en el estudio, se concluye que una mala vacunación es una causa probable de brucelosis en el Ecuador.

Agradecimientos• Centro Internacional de Zoonosis

▫ Washington Benítez▫ Jorge Ron▫ Gustavo Echeverría▫ Paulina Fernández▫ Richar Rodríguez▫ Lisbeth Olmedo▫ Daniela Barzallo

• University of Liege, Belgium. UREAR-ULg▫ Claude Saegerman

• Department of Animal Health, Institute of Tropical Medicine. Anveres-Belgica▫ Jeff Brandt▫ Dirk Berkvens

• Department of Bacteriology and Immunology, Veterinary and Agrochemical Research. Centre, Brussels-Belgium.▫ David Fretin

José Martí

…la ciencia no es …ni misterio de iniciados, ni privilegio de los aristócratas de la mente, sino el medio único que tiene el hombre de explicarse las leyes de la vida…