CAPíTULO 16 Gluc6Hsis

Iniciaremos ahora el estudio de los sistemas multienzimAticos que catalizan la degradación . de las moléculas combustibles y la recuperación de parte de su energía química en forma de ATP. 'Examinaremos. en primer lugar. la glucólisis. 'de­gradación.anatt60ica. de la glucosa que produce Acido láctico; La glucó1isis es una deJas diversas rutas mabólicas. conoci­dasgenerahnmte como fermentacionéSaniJerÓbicMí mediante las cuales 'muchos organismos obtienen energiaquimica de varios combustibles orgánkos en ausencia de oxigeno mole­cular. Dado que' los organismos vivos surgieron inidatmerite en una atmósfera que carecia cle oxigeno (pág. 25). la fer­mentación. anaerébica es el tipo de mecanismobiotógíco más primitivode$tinado a·la obtención de 'Ia energía de las molé­culas nutrienles. La mayor parte de los organismos superiores han conservado la capacidad de eÉectuar la degradación anaeróbica de la glucosa a lactato. que se ha convertido así en una etapa' de preparación del catabolismo aeróbico de la glucosa. Además, en la mayor parte de los animales la glu­cólisis desempeña un papel de mecanismo de emergencia capaz de producir energía durante períodos cortos en los que no se d~pone de oxígeno.

La .ruta glucolítica ha constituido el primer sistema enzimA­ticoprincipal que ha sido aclarado: atrajo la atención de algunos de los bioquímicos más importantes de la primera mitad del s. xx. La experiencia adquirida en el estudio de la glucólisis ofreció una nueva visión y abrió nuevos caminos para el estudio de la enzimología y metabolismo intermedia­rio. Estudiaremos ahora la glucólisis con detalle. puesto que servirá como prototipo para el estudio de otros sistemas mul. tienzimáticos y de otras rutas metabólicas.

Fermentación y respiración

Todos los organismos heterótrofos obtienen fundamentalmente su energía de las reacciones de oxidación-reducción. es decir. aquéllas en las que los electrones son transferidos desde un compuesto. el dado" electrónico. o agente reductor. a un aceptor electrónico. el agente oxidante. Los organismos aeróbicos obtie­nen la mayor parte de su energía de la respiración, que se define como la oxidación de los combustibles orgAnicos por el oxígeno molecular: el oxígeno actúa. por tanto. como el acep­tar electrónico final en la respiración. Los heterótrofos anaeró-

427

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE fOSfATO

bicos obtienen también la mayor parte de su energía de las reacciones de oxidación~reducción, pero en este caso, en el proceso de fermentación, los electrones pasan desde un inter~ mediario orgánico producido en la degradación del azúcar, el dador electrónico, hasta otro intermediario orgánico, que actúa como aceptar electrónico. En los procesos de fermenta~ ción anaeróbica, sin embargo, no se produce una oxidación neta del combustible.

Los organismos que pueden vivir anaeróbicamente y em~ plean, por tanto, la fermentación como fuente de energía, se dividen en dos clases. Los anaerobios estrictos u obligados, que no pueden emplear el oxígeno en absoluto y en realidad casi no pueden ni tolerarlo. Comprenden estos las bacterias que viven en los lódos marinos, las bacterias desnitrificantes del suelo, responsables de la reducción del nitrato a nitrógeno, las bacterias productoras de metano, que producen el gas de¡ los pantanos, y algunos organismos patógenos del hombre, tales como la bacteria Clostridium perfringens que produce la gangrena gaseosa en las heridas infectadas, y el Clostridium botulinum. que es el responsable de una forma mortal de in~ toxicación alimentaria. Los anaerobios facultativos. por otra parte, pueden vivir bien, tanto en ausencia como en presencia de oxígeno. Cuando viven anaeróbicamente, obtienen energía de un proceso de fermentación. Cuando 10 hacen aeróbic~ mente, continúan degradando su combustible mediante la ruta anaeróbica, pero después oxidan los· productos de aquélla a expensas del oxígeno molecular (fig. 16~1).

Los combustibles más corrientes para la fermentación ana~ eróbica son los azúcares, particularmente la D-glucosa, pero algunas bacterias pueden obtener su energía metabólica efec~ ttiando la fermentación anaeróbica de moléculas combustibles tales como los ácid6s grasos, los aminoácidos, las purinas o las pirimidinas, según las especies. De hecho, la clasificación taxonómica de Jos microorganismos se basa, en parte, en sus combustibles orgánicos característicos y en sus productos de fermentación.

Entre las muchas clases de fermentación de la glucosa, predominan dos tipos íntimamente relacionados (fig. 16 .. 2). En la glucólisis,. llamada a veces fermentación homoláctica, la molécula de la glucosa de seis átomos de carbono se degrada y forma dos moléculas de ácido láctico de tres átomos de carbono, como único producto final. Este tipo de escisión de la glucosa se produce en muchos microorganismos. y en las células de la mayor parte de los animales superiores y de los vegetales. En la fermentación alcohólica. característica de mu~ chas levaduras, la molécula de la glucosa se escinde y rinde dos moléculas de etanol compuesto de dos átomos de car~ bono (C2HsOH) y dos moléculas de CO2• La fermentación alcohólica se produce por las mismas transformaciones enzi~ máticas que laglucólisis, pero precisa de dos etapas enzimá~ ticas diferentes al final de la ruta (Hg. 16-2). La mayor parte de los demás tipos de fermentación de la glucosa son variaciones de la ruta fundamental de la glucólisis (pág. 448).

Balances de la glucólisis y de la fermentación alcohólica

Las rutas de la glucólisis y de la fermentación alcohólica, es~ quematizadas en la figura 16~2, describen únicamente la suerte

428

FIGURA 16-1 Utilización de la glucosa por los organismos facultativos, incluidos la mayoría de plantas y animales superiores. La ruta de la fermentación es común tanto en la utilización anaeróbica (A) como en la aeróbica. (B) de la glucosa.

A. En condiciones anaeróbicas. ~

Glucosa

[fermentaCión

Productos de fermentación

B. En condiciones aeróbicas.

Glucosa

[fermentación

[productos de lal L fermentadón J

D.t [reSPiración

CD.t+ litO

FIGURA 16*2 Curso de los átomos de carbono en la glucólisis (A) y en la fermentación alcohólica (B). Los números entre parén* tesis, indican los átomos de carbono de la D*glucosa, de los que proceden los átomos de carbono de los productos.

A. Glucólisis.

Glucosa -- 2 ácido láctico

1 234 5 6 C-C-C-C-C-C Glucosa

1 1 2 3 C-C-C Triosa

+ 4 5 6 C-C-C Triosa

1 rra (1)

CHOH (2) Ácido láctico I

COOH(3)

+. ~ (6)

CHOH (5) Ácido láctico I

COOH(4)

B. Fermentación alcohólica.

Glucosa -- 2 etanol + 2COt

1 2 3 4 5 6 C-C-C-C-C-C Glucosa

1 123 C-C-C

+ 4 5 6 C~C-C

1 rra (1)

CH,OH(2)

+ COt (3)

+ ~ (6)

CH,OH(s)

+ COt (4)

Triosa

Triosa

Etanol

Etanol

Capítulo 16 Glue61iai6

que siguen los átomos de carbono de la glucosa, pero no nos dicen nada acerca de la energética de este proceso. En reali~ dad. tanto durante la glucólisis como en la fermentación alcohólica, se genera ATP a partir del ADP y del fosfato. Las ecuaciones igualadas de la glucólisis y de la fermentación alcohólica, incluidas las etapas de conservación de la energía, son las siguientes:

Glucólisis:

CsHI20 e + 2P. + 2ADP --+ 2CHaCHOHCOOH 4- 2A TP + 2litO Acido láctico

Fermentación alcohólica:

CsHlllOe + 2P. + 2ADP --+ 2CHaCH20H + 2CO, + 2ATP + 2litO

Etanol

Para analizar la energética de la glucólisis en condiciones es~ tándar, debemos resolver la ecuación global en dos procesos, la . conversión de la glucosa en lactato,. que es un proceso exergónico. y la formación de ATP a partir de ADP y de fosfato. que es endergónico:

Proceso exergónico:

Glucosa ---+ 2 lactato ~G~' = -47,0 kcal mol-1

Proceso endergónico:

Suma:

2P. + 2ADP ---+ 2ATP + 2H,O ~G;' = 2 x 7,30 = +14,6 kcal mol-1

Glucosa + 2P. + 2ADP ---+ 2 lactato + 2ATP + 2litO ~G:' = ~G~' + ~G;'

= -47,0 + 14;6 = -32,4 kcal moI-l

Teniendo en cuenta las variaciones de energía libre están~ dar mostradas, está claro que la degradación de la glucosa hasta lactato (AG>' = -47,0 kcal mol-I ) proporciona energía más que sufic::iente para provocar la fosforilación de dos molé~ culas de ADPa ATP (AGo = + 14,6 kcal mol-I ). Por tanto, 14.6/47,0 X 100, o sea que aproximadamente el 31 % del descenso de energía. libre que se produce durante la escisión de la glucosa hasta lactato se conserva en forma de A TP. En realidad, si ajustamos tales cálculos, que están basados sobre las concentraciones estándar 1 M, y tomamos las con~ centraciones intracelulares reales de los reaccionan tes y de los productos, resulta que la eficacia real de la glucólisis es mucho mayor del 31 % (pág. 442).

El proceso global de la glucólisis, aun después de descon~ tar la formación acoplada del A TP, se realiza todavía, con un descenso neto muy grande de energía libre, -32,4 kcal mol-l. La glucólisis es, por tanto, una reac~ión esencialmente «irreversible:., cuyo equilibrio está abrumadoramente despla~ zado en la dirección de la formación del lactato. Sin embargo, veremos más adelante que la mayor parte de sus etapas de

429

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DB LA BNBRGfA DBL ENLACB FOSFATO

reacción poseen una variación de energía libre estándar pe~ queña, y se emplean también en la dirección inversa para la biosíntesis de la glucosa a partir de) lactato y de otros pre~ cursores (pág. 636).

Historia experimental

La ruta enzimática de )a g)ucólisis y de )a fermentación alco~ hóJica fue aclarada en el transcurso de muchos años' de íIlves~ tigación. Algunos hitos importantes ilustrarán los' métodos experimentales y conceptuales aplicados en la investigación de esta ruta metabólica fundamental.

Recordemos el descubrimiento de E.Buchner (pág. 389) en 1897 de que un extracto de levadura del que'Sehabían.~itnina~ do las células intactas por Iiltración conservaba la capacidad de fermentar la glucosa a etanol. Esta observación demostraba que los enzimas de la fermentación pueden actuar indepen~ dientemente de )a estructlil'a celular, enalntraposición con la anterior afirmación de Pasteur (pág. 1.89). Un segundo hito importante )0' constit~yó el descubrúniento efectuado :en·1905 por Jos ingleses A. Harden y W. J. Young. de qUEda fermen .. tación alcohólica en los extractos de levadura necesita la presencia de fosfato, y que se acumula un difosfato dehexoSá en los extractos en fermentación en ciertas condiciones. pero que es utilizado en otras, lo cual sugiere que se trata de un intermediario del proceso global de la· fermentación. El inter­mediario fue posteriormente identificado como la fructosa-l,6-difosfato (pág. 434). Harden y Youngdescubrierón también que se precisan dos fracciones de los extractos de levadura para que se produzca la fermentación aléohólica: una frac­ción termolábil llamada zimasa y que . contiene, probablemente, los enzimas necesarios para el proceso, y otra fracción termo­estable (cozimJsa), necesaria para la actividad de la zimasa. Más tarde se demostró que la fracCión teriDoestabh/t6nteriía dos componentes esenciales, el coénzima de oxidadón-reduc­ción nicotinamida-adenín-dinuc1eótido, o NAD (pág. 346), que se estudia más adelante, y uná mezcla de losnucleótittos de adenina ADP y ATP (págs. 321 y 399).

Otro conjunto importante de'obseJ:vaciohes·'tIeveró que' en presencia del inhibidor fluoture; lbs extractos 'deléVédura en fermentación mostraban la ·lcumumción d'~. dos· ésteres· fos­fóricos; el 3-fosfoglicerato y eI2;:'fóSfogticerato;'Porotiá par .. te, ·el inhibidor·. iodoacetato. prodüdal'a'· acámuladóñ'·· qe fructosá~ 1 ,6;;.difosfáto. tInávezjderitificado~; estoS mfenne~ diarios, se hizo posible el eSfudio dtdas read:iohes enzimá­ticas mediante las que Sé formaban y seutdñabán¡

Las ob~rvaciones fundamentales efectuadas ton los eXt_~ac­tos de levadura y el descubrinliertto pos~erior de que los ex­ttactos musculares pueden catalizar:1aglúcólisis' de la glucosa a lactato, sirvieron como punto de partida para realitar fnves .. tigaciones más intensas, por parte de Íos bioquímicos alema~ nes de los·afios 30; Entre los que contn'buyefon de modo más importante en esta fase figura GustavEnibden, que postuló cómo se escindía la fructosa:..l,6.;.difosfato y el modelo global de las etapas subsiguientes, yOttoMeyerhO'f. que comprobó los rasgos principales de la hipótésis 'de Embden y estudió además la energética de la glucolisis. La secuencia de reac­dones entre la glucosa y el piruvato se coÍloce generalmente

430

Capítulo 16 Glucólisis

por el nombre de ruta de Embden-Meyerhof. Contribuciones muy importantes fueron también las efectuadas por Otto Warburg en Berlin, C; F. Cori y G. T. Cori en los Estados Unidos, y J. Paroas énPolonia. '

Aunque las etapas individuales de la glucólisis son cono­cidas desde. 1940, de ninguna manera podemos decir que ha cesado la investigación de esta ruta. De hecho, la investiga­ción intensiva sobre los enzimas de la glucólisis está mostrando en la actualidad alauno de los mecanismos mediante los cuales ciertos enzimas de la secuencia participan en la regulación de la gluc61isis~ la célula intacta. Aunque la mayor parte de la investigación clásica sobre el mecanismo de la fermentación y de la glucóli.$is fue realizada con extractos de levadura y de músculo, estas rutas ,se producen en la mayor parte de las for .. mas de vida, aunq\te con sólo variaciones de menor impor ... tancia; ello constituye una indicación del valor de la super­vivencia .evolucionista de esta ruta primitiva productora de energía. '

A veces, existen diferencias en las propiedades de los enzi ... mas ho~logos de la secuencia glucolítica de una u otra es­pecie o tipo de célula. Es posible que estas variaciones puedan relacionarse con las diferencias de regulación de la ruta, que constituyen un, reflejo de la diferenciación de las especies o de los tejidos.

Fases de la glucólisÍ8

La glucólisis es catalizada, por la aCClon consecutiva de un grqpo <de 11 enzimas, la mayor parte de los cuales han sido cristalizados y. estudiados completamente. Dado que pueden extraerse-·con facilidad yen forma soluble de las' células, se cree que están localizados, en la porción soluble del citoplasma. Se cree ig:ualmente que loS enzimas individuales que catalizan las etapas de la glucóJisis no dependen físicamente unos de otros; es decir, que no se hallan asociados formándo complejos multienziÍnáticOi(eitables.Parece sin embargo evidente que eridifereíites ti"osde células algunos enzimas individuales de la glucólisiS pueden llalla'rse débilmente asociados a la mem­brana plasmática, a las miofibril1as o a las mitocondrias.

Todos los intermediarias de la glucólisis entre la glucosa y el piruvato son compuestos fosforilados. Sus grupos fosfatos parecen desempefiar tres funciones. Proveen a cada interme­diario de'un grupo polar, c;argado negativamente que le impide pasar a través de la membrana celular la cual. generalmente, no permite el paso de las moléculas muy polares (págs. 321 y 786). De h~ho, la mayor parte de los intermediarios del metabolismo son compuestos iónicos a pH 7, cosa que les im­pide escapar Juera. de las células por simple difusión. Los grupos fosfato de los intermediarios glucoliticos actúan tam­bién como grupos enlazantes o de reconocimiento en la for­mación de los complejos enzima-sustrato. Sin embargo, lo más importante es la función de los grupos fosfato de los inter ... mediarios glucolíticos en la conservación de la energía, ya que al final se transforman en el grupo fosfato terminal del A TP en el transcurso de la glucólisis.'

En la glucólisis anaer6bica se distinguen dos fases princi ... pales (fig. 16-3). En la primera fase, la glucosa se «ceba:. o prepara para su catabolismo mediante su fosforilación, escin-

431

PARTE 2 CATABOLISMO '{ PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE fOSfATO

FIGURA 16-3 Las dos fases de la glucólisis. Las incorporaciones al sistema aparecen en color, y las salidas en los recuadros coloreados. La ruta de la gluc0sa-6-fosfato es idéntica tanto en la glucólisis como en la fermentación alcohólica (pág. 448). Aunque el término glucólisis se refería, inicialmente, a la degradación de la glucosa a lactato. y a que con esta acepción se emplea en este capitulo, se usa más libremente para referirse a la ruta hasta la fase de piruvato.

Glucosa Glucógeno, almidón

Pase 1

Congregación de azúcares sencillos y su conversión en gliceraldehído-3-fosfato; incorporación de los A TPs cebadores

Fase 11

~ión del gliceraldehído-3-foafato en lactato y conservación de la energía en forma de ATP; el rendimiento neto de la fase 1 más la fase 11 es de 2ATP por molécula de glucosa

432

Fructosa Galactosa Manosa Pentosas Glucosa-l-fosfato

Glucosa-6-fosfato

! Fructosa-6-fosfato

ATP--~------------__ I

ADP

Fructosa-l,6-difosfato

! Gliceraldehído-3-fosfato. (2)

2NAD+-----1 2P,---~--------~----~1

3-fosfogliceril fosfato (2)

2ADP-----

3-fosfoglicerato (2)

1 2-fosfoglicerato (2)

1 Fosfoenolpiruvato (2)

2ADP -------......

p¡I'llv",tn (2)

2NADH

FIGURA 16-4 Estructura y modelo éspacial compacto de la a-D-g/ucosa-6-fosfato.

1OCHtOPOa~ H

OH H HO OH

H OH

Capítulo 16 Glucótisis

diéndose después para formar el gliceraldehído-3-fosfato, azú­car de tres átomos de carbono; en la segunda fase el mencio­nado compuesto se convierte en lactato. La primera fase de la glucólisis es la fase preparatoria o de recogida; en ella se incorporan a la secuencia glucolítica cierto número de hexosas diferentes después de haber sido fosforiladas por el ATP, y se convierten en un producto común, el Igliceraldehído-3-fos ... fato. En esta fase se consumen dos moléculas de A TP para fosforilar las posidones 1 y 6 de la hexosa, de forma parecida a cómo se ceba una bomba. La segunda fase de la glucólisis es la ruta común para todos los azúcares; se producen en ella las etapas de la óxido-reducción, actuando los mecanismos de conservación de la energía mediante los cuales el ADP se fos­forila a A TP. En la segunda fase se forman cuatro moléculas de A TP, de modo que el rendimiento neto después de restar los A TI? empleados en el cebado de la secuencia es de dos moléculas de ATP por molécula de glucosa degrada a lactato.

Durante la glucólisis tienen lugar tres tipos diferentes de transformaciones químicas 'cuyos . caminos se hallan interco­nectados:

l. La secuencia de reacciones, mediante las cuales el esque .. leto carbonado de la glucosa se degrada y forma lactato, es decir. la ruta de los átomos de carbono.

2. La secúencia de reacciones mediante las que el fosfato inorgánico se transforma en el grupo fosfato terminal del ATP, es decir, la ruta del fosfato.

3. La secuencia de las óxido-reducciones, o sea, la ruta de los electrones.

-Etapas en.zimáticas de la primera fase de la glucólisis

Fosforilación de la: D-glucosa por .el ATP

Constituye ésta la primera de las dos etapas de cebado de la glucólisis, en las .que se consume A TP. En ella, la molécula neutra de D-glucosa se prepara para las etapas enzimáticas subsiguientes al fosforilarse por el A TP y formar una molé-­cula con carga negativa. En las células hay relativamente poca o .. glucosa libre y la mayor parte de la glucosa intracelular existe en forma fosforilada. La fosforilación de la o-glucosa en la posición 6 por el A TP para transformarse en o.:.glucosa .. 6-fosfato (lig. 16-4), es catalizada por dos tipos de enzimas, la hexoquinasa y la glucoquinasa, que difieren en su especifi .. cidád para el azúcar y en su afinidad para la o .. glucosa. La reacción catalizada por ambos enzimas es la siguiente:

ATP + a-o-glucosa Mg+\ ADP + a-o ... glucosa-6-fosfato aGo' = -4,0 kcal mol-l

La hexoquinasa es el más difundido de ambos y es el que emplean, normalmente, la mayor parte de las células. Cataliza la fosforilación no solamente de la o-glucosa, sino también de otras muchas hexosas y derivados de hexosa, entre ellos la o-fructosa, la o-manosa y la D-glucosamina; su afinidad para las aldohexosas es superior a la que exhibe para las cetohe­xosas. Las hexoquinasas se encuentran en las levaduras y en las bacterias, así como en muchos tejidos animales y vegetales. La

433

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE fOSFATO

hexoquinasa de levadura ha sido ya cristalizada (Pm 96 000). La hexoquinasa de los tejidos animales aparece en forma de tres isozimas (pág. 250) que difieren en su afinidad por la glucosa. Es un enzima regulador que es inhibido por su pro­pio producto de reacción. la glucosa-6~fosfato (pág~ 240) ~ Cuando la célula tiene una concentración elevada de glucosa~ 6-fosfato y no precisa de ella para atender a sus necesidades energéticas. se inhibe la hexoquinasa. impidiendo de este modo la formación de cantidades ulteriores del metabolito.

El segundo tipo de enzima fosforilante de la glucosa es la glucoquinasa. que solamente fosforila a la, o.-glucosa y no actúa sobre otras hexosas. La glucoquinasa pOSee una KM mucho más alta para la D-glucosa (KM = 10 mM) y necesita. por tanto. una concentración de glucosa muy superior a la hexoquinasa para mostrarse plenamente activa (KM= 100 p;M). Difiere de la hexoquinasa en otro aspecto: no es inhibida por la glucosa~6~fosfato. La glucoquinasa' sehana presente en' el higado. en donde predomina sobre la hexoquinasa. pero está ausente de los músculos. Actúa normalmente cuando la con­centración de glucosa en sangre es temporalmente elevada. como ocurre después de la ingestión de una comida rica en azúcar (fig. 16~5). Sin embargo. la carencia de este enzima se re.gistraen pacientes que sufren de diabet~smellitus; en ellos la concentración de azúcar en la sangre es' elevada como consecuencia de una defectuosa secreción. de ·la hormona pan­creática insulina (pág. 860). Tanto la hexoquinasa como la glucoquinasa necesitan ·la presencia de un. catión divalente (Mg2+ o Mn2+) que se combina primero con el A TP para for­mar el verdadero sustrato, MgATP2- o MnATP2-. La hexo~ quinasa es inhibida por ciertos reactivos sulfhidrilo. La fos~ forilación de la glucosa. ya sea por la hexoquinasao por la glucosamina. no es reversible en las condiciones Intracelúlares.

La desfosforilación enzimática· de la J>..glucosa-6.-iosfato para regenerar D~glucosa libre (reacción que reviste gran im­portancia en el hígado ya que permite el paso de glucoSa a la sangre), se produce mediante la acción de unenzimá com~ pletamente diferente. la glucosa..6~fostat8$a. (pig. 640):

. D-glucosa~6-fosfato + H20 ~ J>..glucosa + fosfato AG" = - 3.30 kcal mol-1

Conversión de la glucosa..6~fosfato en fructosa..6~fosfato

El enzima que cataliza laisomerización de la glucosa~~fosfato a fructosa~~fosfato es la glucosa"fosfat~isomerasa. que ha sido aislada del tejido muscular en forma muy purificada (figura 16~6):

a~D~glucosa~~fosfato ~ D-fructosa~6~fosfato AGo' = +0,4 kcal mol-I

La reacción se realiza fácilmente en ambas direcciones, y e;; irreversible en la célula. La glucosa~fosfato~isomerasa es espe~ cHica para la glucosa~6~fosfato yla fructosa~~fosfato.

Fosforilación de la D~fructosa~6;'losfato a fructosa~I,6~difosfato

Constituye ésta la segunda de las dos reacciones de «cebado» de la glucólisis: en ella se necesita el consumo de una segunda

434

FIGURA 16-5 Comparación de la hexoquinasa y de la glucoquinasa. A las concentraciones normales de glucosa sanguínea (alrededor de 5 mM), la hexoquinasa eStá completamente saturada. Cuando la concentración de glucosa sanguínea se eleva mucho, la glucoquinasa del hígado se vuelve mucho más activa.

100

Concentración normal de glucosa en

sangre

-HexoquinélSa

KII = 100 pM

Concentración de glucosa, mM ...

FIGURA 16-6 Estructura de la a-o-fructosa-6-fosfato.

6 "". --.

CRtOPQ¡"-

5~.C.t~ .. OH H H HO_ ....

4 .

OHH

10

FIGURA 16-7 Estructurag ~ "~, compacto de la ,a-D-fructosa-1.6-difO«ato.Una ' comisión de nomenclatura (ntemacúmal harec()~ la, ~iQntkJ p~jo di por 1?is; el compuesto -deberla, '. desillnarse por(lt-D-fru.ct.osa~l.64Jistostato.

8 <;:H,OPü:ts-

~' ",CH", OP~'-

5 ,2c

HH HO OH 4 3

OH H·,

Capitulo 16 Glucólisis

molécu!aqeATP para fosforilar a la fructosa-&..fosfato en la poSición .l.traalSformá~dola "en '. fructosa-l.6-difosfato (figu­ra 16--1}~r~ción catali~ada por la 6-1Qljofcucto-'luinasai

ATP + o-fructosa-6-fosfato ~ ADP + o-fructosa-l.6 .. difosfato

I1Go' = -3.40 kcal mol-1

El ,~gl+, es. p~abletPente necesario porque el, sustrato ver­dtld~o e~ el~g~Tp2:-. Aunque la fructosa-6-fosEato es el

, "aCq)tot. dé JosÉ{lto ~pecifico en la reacción. tanto el UTP y como el ITP pueden SlJstituir al A TP como dadores de fosfato. ' , 'u,: Jostoln.~o .. quinasaes un enzima alostérko: la losfori­

lad.{nj:de la l6!ctóSa+fosfato constituye el punto de control ~kJ', ¡ippº~e' d~ .Ía 's~~cia glucpUtica,(p(l,gs. 547 a 550). Como jn1l;Ch,Qjenzimas, 'alostéricos posee un peso m91ecular ~~te d~. ~3~0 OOOJ;,~t1tiene cierto número de subuni­qad~'yit~~stra 'upa dependencia compleja' de su velocidad d'é~!,~ciQ~cOÍl, la, ~n.centraci6n de sus sustratQs. La fosEo­frlict.~q1lÍÍl~ posee' IDúltjpl~~oduladores alostéricos. Resul .. t~;in~@aa,~¡)or '9>~entraQones elevadas de ATP. d~ citrato yde'1icidos g1:asOs,.Qe cadeIlilJarga. pero es estimulada por el APP"ó-Po'r eFA.~P.Pordlo. cuandQse produce en la célula u~'éóncentradóll ,elevada de ATP. o cuando se dispone de ~,'. cmnbqs~kS'ta1es ~U1O los ácidos grasos o el citrato. 1~6-f9SfofrUctO-C¡1.lillasa se, inhibe; interrumpiéndose laglucó­lisis. 'Inversamente. sr la concentración de Al'P desciende y predop:¡inaIl.. Por tanto. las de AMP y ADP. o cuando la concentrad6ll.c:le.otrils cODlQústibles comQ el citrato o los ácidos g~asos es~l>a~, ~tollCes se~stimula la actividad de la 6-fosfo­frtÍcto-quinasa., Así, el coinpQttamiento cinético de, la 6 .. fos­fo~t:to..q1.liriasa." ~lUnqUe mUy cOn:J.plejo,se halla extraordina~ riaJnente bien adapta<1o a la reiJulación de esta importante etapa de_lagl1.lCólisis. Los moduÍadores alostéricos positivos ynegatívos de este enzima varian de un tipo de célula a otra. El. papel. de la 6~losfofructo-quinasa en la regulación de la VelOci4adde la glucólisisse,describirá detalladamente más adelante, (pags. 443 y 547). La reacción de la 6-fosfofructo­quinasaes, esencialinerite' irreversible en la célula: se recordará que la mayor ¡)arte de los'enzimas reguladores catalizan reac­ciones-irieversihleS(pág. 240). , ,Mediante una rutaenzimática separada puede convertirse

nuevamente la o--fructosa~1.6-difosfato en fructosa-6-fosfato atr~vés de, una' reacción hidrolitica catalizada por, la hexosa­diloStatasa •. otro enzima alostérico cuyo papel en la regulación de la' biosíntesis de la glucosa se estudiará más adelante (pág. 639):

Fructosa-l.6 .. diEosfato + H20 ~ fructosa-6-fosfato + Pi 11G'>' = -4.0 kcal mol-1

Escisión de la fructosa-l.6-difosfato en fosfato de dihid~etona y, glicera1dehído-3~fQSfato

La reacción es catalizada por el enzima lructosa-difosfato~ aldQlasa. que ha sido bien estudiado y ha sido fácilmente

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PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

aislado en forma cristalina a partir de los extractos de músculo de conejo. La reacción catalizada es una condensación aldó~ líca reversible que produce dos fosfatos de triosa diferentes:

D~Fructosa~l,6~difosfato ~ fosfato de dihidroxiacetona + D~gliceraldehído~3~fosfato

AGOI = + 5,73 kcal mol-1

Las estructuras de los productos aparecen en la figura 16~8. Aunque el AGoI de esta reacción es fuertemente positivo, en

condiciones intracelulares se desplaza fácilmente en el sentido directo (véanse los problemas 9 y 10 de este capítulo).

De entre las fructosa~difosfato~aldolasas halladas en los animales superiores y en los vegetales, y que frecuentemente reciben el nombre de aJdolastas de la clase J, es típica la que se ha aislado del músculo esquelético, cuyo peso molecular es de 160 000 Y contiene cuatro subunidades. Contiene además cierto número de grupos - SH libres, algunos de lós cuales son esenciales para la actividad catalítica. La incubación de la aldolasa de músculo cristalizada con fosfato de dihidroxiace~ tona en presencia del reductor borohidruro sódico, determina el establecimiento de un enlace coválente entre la moléCula del enzima y la del fosfato de diílidróxiacetona. La hidrólisis del compuesto enzima~sustrato atrapado, que es catalíticámente inactivo, rinde un gliceril~derivado del grupo € ~amino de un resto de lisina del enzima (pág. 216). Estos hechos han cori~ ducido a l~ conclusión de que la aldolasa del músculo forma un compuesto covalente entima-sústrato, que es una base de Schiff o cetimina (pág. 88) entre el grupo e~amino de un resto de lisina del enzima y el grupo carbonilo del fosfato de dihidroxiacetona (fig. 16~9). La base de Schiff pierde un protón para formar un carbanión, el cual ataca al átomo de carbono aldehídico del gliceraldehído-3~fosfato para rendir fructosa~ l,6~difosfato y enzima libre, después dé la incorpo~ ración de un proton. Todos estos hechos son reversibles.

Las fructosa~difosfato~ald6Iasas de la Clase 1 se encuen~ tran en diversas formas isoenzimáticas. En los tejidos del conejo existen tres formas principales: la aldolasa A, que predomina en el músculo; la aldolasa B, en el hígado, y la aIdolása C, en el cerebro. Contienen todas cuatro subunidades polipepttdicas que difieren en su composición en aminoácidos.

Las fructosa~difosfato-aldolasas halladas en las bácterias, en las levaduras y en los hongos. (aldolasas de la· clase JI) difieren de las formas de la clase 1 en que contienen un ion metálico divalente específico, generalmente Zn2+ Ca2+ o Fe2+; también necesitan K+. Su peso molecular es de alrededor de 65 000, o sea menos de la mitad que el de los enzimas de procedencia animal. Actúan por un mecanismo diferente que las aldolasas de la clase 1 y no forman bases de Schiff como intermediarios.

Jnterconversión de los fosfatos de triosa

Sólo uno de los dos fosfatos de triosa, el gliceraldehído~3~ fosfato, puede degradarse directamente en las reacciones ulte~ riores de la glucólisis. Sin embargo, el otro, el fosfato de dihidroxiacetona, se convierte reversiblemente en gliceraldehí#

436

FIGURA 16-8 Fosfatos de triosa. Los números a la izquierda de las estructuras se refieren' a los átomos de carbono de los fosfatos de triosa. Los números entre paréntesis de la derecha se refieren a los átomos de carbono de la molécula de fructosa-l,6-difosfato, de los que derivan directamente los átomos de carbono de la triosa.

3 CH20PQ¡2- (1)

I 2C=O (2)

I 1CH.OH (3)

FosEato de díbídroxíacetona

1HC=O (4)

I 2HCOH (5)

I 3 CH20PQ¡2- (6)

D-gliceraldehído-3-fosfato

FIGURA 16-9 Complejo enzima-sustrato de la aldolasa.

Estruct~ra de la bjJSe de Schiff entre el fosfato de dihiJroxiacetona (color) y un resto lisilo específico de la proteína enzimática.

HOCH -e-CH opn 2-2

11 2'-J3

N I ~ YH. C,H.

~ CH

Resto lisilo

~'c~ U Cadena polipeptídica O de .la aldolasa

Derivado lisinico de la' dihidroxiacetona (color) aislado del hidrolizado del complejo aldolasa-sustrato reducido.

H I

HOCHz-C-CHzOH , NH , ~ ~

-CHt , ... H~ ,

COOH

Capítulo 16 Glucólisis

d~3~fosfato por acción del enzima triosa~fosfato~isomerasa:

Fosfato de dihidroxiacetona ~ D~gliceraldehído~3~fosfato AGo' = + 1,83 kcal mol-1

Obsérvese que en esta reacción los átomos de carbono 1 y 6 de la glucosa inicial se convierten ahora en el carbono 3 del D~gliceraldehído~3~fosfatb. Análogamente, los átomos de car~ bono 2 y 5 de la glucosa se transforman en los carbonos 2, mientras que los átomos de carbono 3 y 4 se transforman en el átomo de carbono 1 del gliceraldehído~3~fosfato. El fosfato de dihidroxiacetona constituye alrededor del 90 % de la mez~ cla en equilibrio de 'los dos fosfatos de triosa.

Esta reacciÓn completa la primera fase de la glucólisis, en la éual la molécula de glucosa se ha' preparado para la segunda fase mediante dos etapas de fosforílación iniciadoras y la es~ cisión posterior. Las reacciones de «recogida», mediante las que se introducen en la primera fase el glucógeno, el almidón y otros azúcares distintos de la glucosa, se describirán más adelante.

Segunda fase de la glucólisis

Esta fase (Hg. 16~3) comprende las distintas etapas de oxidorreducción, así como las de fosEorilación en las que se regenera el ATP a partir del AOP. Dado que una sola mo~ lécula de glucosa forma dos de gliceraldehído~3~fosfato, las dos mitades de la molécula de glucosa siguen la misma ruta.

Oxidación del gliceraldehído-<3 .. fosfato a 3~fosfoglic.eril~fosfato

Constituye ésta una de las etapas más importantes de la se~ cuencia glucolítica, ya que conserva la energía de la oxidación del g~po aldehído delgliceraldehído~3~fosfato en el producto de su oxidación, el 3~fosfogliceril fosfato (pág. 415). El esta~ blecimiento claro, de ,la ruta de esta reacción y de la siguiente. por parte de Warburg y colaboradores en 1938~1939, se con~ sidera como uno de los triunfos más importantes de la biolo~ gía moderna, ya que fue la primera demostración de un meca~ nismo enzimático y químico mediante el cual la energía pro~ ducida por la oxidación de una molécula orgánica podía con~ servarse en forma de A TP.

En este punto debemos aclarar algo de lo que pueden parecer inconsistencias de nomenclatura entre los diversos in~ termediarios de tres átomos de carbono fosforilados de la glucólisis. Aunque hemos utilizado el nombre oficial de glice~ raldehído~3~fosfato hasta este momento, en adelante podrá constituir una ayuda el empleo alternativo de la designación 3~fosfoglicera[dehído, igualmente correcta, que destaca que el enlace éster entre el fosfato y el átomo de carbono 3 del 3~fosfogliceraldehído permanece inalterado en los dos inter~ mediarios próximos de la glucólisis, es decir, en el 3~fosfo~ gliceril~fosfato (en el que el otro fosfato se halla situado sobre el átomo de carbono 1) Y en el 3~fosfoglicerato.

El enzima que cataliza la oxidación del 3~fosfogliceral~ dehido, llamado habitualmente gliceraldehído~fosfato~deshidro~ genasa (3~fosfogliceraldehído~deshidrogenasa es también co~

437

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

rrecto). puede aislarse fácilmente en forma cristalina. (pesó molecular 140 000) a partir del músculo de conejo y de la levadura. Contiene cuatro subunidades idéntic-as. cada una de ellas constituida por una sola cadena polipeptídica de unos 330 restos. cuya secuencia amino~ácida ha sido establecida. La reac~ ción global catalizada por el enzima es la siguiente:

D~3~Fosfogliceraldehído + NAO+ + PI ;: D~3~fosfogliceril~fosfato + NAOH + H+

AGo' = + 1.5kcal mol-1

En esta reacción el grupo aldehído del D~3~fosfogliceraldehído se oxida a grupo carboxilo. Sin embargo, en lugar de un ácido carboxílico libre. la reacción da lugar a la formación de un anhídrido mixto del grupo carboxilo del ácido 3~fosfoglicérico y del ácido fosfórico, a saber. el 3~loslo911ceril~fosfato (fi­gura 16~10) que. como hémos visto (pág. 408). es un fQsfáto dé elevado contenido energético, con una energía libre eStán­dar de hidrólisis más negativaqueladelATP. .

El otro componente importante de esta reacción es el NAO+. forma oxidada del dinudeótido de nicotinamida y de adenina, que acepta electrones del grupo aldehído del D~3"fosfoglice­raldehído. La estructura, propiedades -y reacclones del· NAD se. describen de forma más completa en otro lugar (págs. 346 y 491). Sabemos en la actualidad que el NAO es uno de los cOmponentes de la cozimasa. la fracción termoestable· que se necesitaba para la fermentación alcohólica y que fue hállada én los experimentos iniciales de Harden y Young (pág. 430). El NAO desempeña el papel de transportador de electrones desde el D-3~fosfogliceraldehído. que los cede. hasta el piru~ vato. que se forma más tarde en la secuencia glucolítica.

La reacción global posee un pequeño valor _positivo de AGo' y transcurre fácilmente en ambas direcciones. dependiendo de la concentración de los reaccionantes y. de . los . próductós. 'La reacción directa puede descomponerse ahora en' dos procesos separados para efectuar el análisis de los cambios de energía: el 3;.fosfogliceraldehído se representará por RCHO. el ácido 3~fOsfoglicérico por RCOOH. y el 3:..;fos fogliceril"; fosfato por RCOOP03H2:

Reacción parcial exergónica:

RCHO + HaO + N.AI)+ ~ RCOOH + NADH + 11+ .:1G:' =--10,3kcal mol-1

Reacción parcial enderg6nica:

RCOOH + MaPO. ~ RCOOPOaHs + HaO .:1G;' == +11;8 kcal mor1

Suma:

RCHO + HIPO. + NAD+ ~ RCOOPOaHs + NADH +- H+ AG:' = AG:' + AG;'

=-10,3 + 11,8 = +1,5 kcal mol-1

La oxidación del RCHO por el NAO+ es un proceso muy exergónico. que avanzada normalmente muy hacia adelante hacia su cumplimiento. a partir de concentraciones 1 M de

438

FIGURA 16-10 Estructura del 3-fosfoglicenl-fosfato.

o 0-1 n I C-O-P~(F

J A H-rOH

3ClizOP0a2-

FIGURA 16-11 Mecanismo propuesto para la acción de la .gltceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa. Este enzima cataliza una reacción de 3 sustratos, en la que estos deben unirse al centro activo según una secuencia ordenada obligada, tal como aparece en la figura. El NADH unido que se forma es desplazado del centro activo por el NAD· libre del medio.

rRCHO

NAD+

-~ S-C-R 1

OH

l==-«::NADH

S-C-R 11

... O

N·A~H .f NAD'

NAn+

__ Acil-

S-C-R enzima

+

11

O

lR-<;:-O-PO,,'

()

Capitulo 16 Glucólisis

los reaccionantes. mientras que ·la formación del 3~fosfogli~ ceril .. fosfato a partir del 3~fosfog1iceratoy del fosfato. es muy endergónica y no se realizaría en el sentido en que se ha escrito. Sin embargo. en la reacción enzimática global, el proceso endergónico se halla obligatoriamente acoplado al proceso exergónico. de modo que la energía liberada· en la oxidación del aldehído se conserva en forma del grupo acil~ fosfato. de elevada energía, del fosfogliceril~fosfato.

El mecanismo de esta importante óxido~reducción ha sido ya estudiado con detalle (fig.16-11). Cada una de las cuatro subunidades idénticas del. enzima contiene un centro activo catalítico al que se halla unida una molécula de NAD+. La 3~fosfogliceraldehído~deshidrogenasa es inhibida por metales pesados, así como por agentes de alquilación, tales como el iodoacetato. Por esta razón, además de otras, se ha llegado a la conclusión de que un grupo sulfhidrilo del centro activo es esencial para la actividad catalítica. El enzima se une, en primer lugar, a la forma oxidada del coenzima NAD+, en una reacción en la que el grupo sulfhidrilo esencial se halla esté~ ricamente enmascarado (Hg. 16~ 11 ). En la siguiente etapa el grupo aldehído del sustrato forma un enlace tiohemiacetal con dicho grupo suIfhidrilo. El enzima cataliza después lá transferencia desde el 3~fosfogliceraldehído, unido covalen~ temente. al NAO+ unido, formando un tioéster entre el grupo sulfhidrilo del enzima. y el grupo carboxilo del sustrato: esta'; forma de enzima se llama acil~enzima. El NAOH abandona entonces el centro activo del enzima, al intercambiarse con una molécula de NAO+ libre procedente del medio. El grupo acilo es transferido después desde el grupo sulfhidrilo del enzima al fosfato inorgánico para formar 3~fosfogliceril~fosfato. el producto de oxidación. La forma oxidada libre del enzima se halla entonces disponible para otro ciclo catalítico.

El enzima necesita NAO+ como oxidante especifico. Aunque es más activo con el D~3~fosfogliceraldehído. oxida también al o.. .y L .. gliceraldehído eíncluso al acetaldehido. pero a velo~ cidades muy bajas. El enzima puede utilizar también arseniato en lugar de fosfato. probablemente formando 3~fosfa91iceril~· arseniato (Hg. 16 .. 12). compuesto muy inestable que se des~ compone inmediata y espontáneamente en 3~fosfoglicerato y arseniato en sistemas acuosos. Obsérvese que en presencia de arseniato no se produce ningún compuesto fosfato de energía elevada por la acción de la deshidl'ogenasa. aunque la óxido~ reducción global tenga lugar. Oe esta manera se puede desa~ copiar la oxidación de la fosforilación.

La gliceraldehído-3~fosfato~deshidrogenasa es un enzima alostérico; su efector principal es el NAO+ que es también uno de sus sustratos; este enzima posee cuatro centros de unión para el NAO+. La unión de la primera molécula de NAO+ disminuye la afinidad de las otras subunidades por el NAO. pero aumenta su actividad intrínseca. Constituye un ejemplo de enzima alostérico que muestra cooperatividad négativa (pág. 243).

Transferencia. de fosfato desde el 3~fosfogliceril~fosfato al ADP

Warburg y sus colaboradores demostraron que el 3~fosfo~ gliceril~fosfato formado en la reacción precedente reacciona.

439

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGIA DEL ENLACE POSPATO

entonces enzimáticamente con el ADP. con transferencia del grupo acil-fosfato al ADP y formación de 3-fosfoglicerato (fig. 16-B) en reacción catalizada por la fosfoglicerato.­ceinasa:

3-fosfogliceril fosfato + ADP ~ 3-fosfoglicerato + ATP t:.G<>' = - 4.50 kcal mol-1

Esta reacción es muy exergónica y actúa «impulsando» la reacción precedente hacia su completa realización. El enzima

,que interviene en la transferencia de fosfato posee una afíni­~ad muy alta para el 3-fosfogliceril-fosfato. La ecuación global '~.. ara las dos reacciones la primera de las cuales implica la

•. xidación del gliceraldehído-3-fosfato a 3-fosfogliceril fosfato ! r la acción de la 3-fosfogliceraldehído-deshidrogenasa, y la \ltgunda que efectúa la transferencia del grupo acil-fosfato \lll ADP catalizada por la fosfoglicerato-quinasa, es la ~~l.J.iente:

:Gliceraldehído-3-fosfato + Pi + ADP + NAD+ ~ 3-fosfoglicerato + ATP + NADH + H+

t:.Go' =-3.0 kcal mol-1

A. . t.ravés de estas. dos reacciones consecutivas la energía de oxidación de un grupo aldehído a un grupo carboxilato se ha conservado en forma de ATP.

Conversión del 3-fosfoglicerato en 2-fosfoglicerato

La reacción es catalizada por el enzima fosfoglicero.-mutasa

3-Fosfoglicerato. ~ 2-fosfoglicerato t:.Go' = + 1.06 kcal mol-1

El Mg2+ es esencial para esta reacción, la cual comprende la transferencia del grupo fosfato desde la posición 3 a la posi­ción 2 del ácido glicérico (lig. 16-13). Esta reacción posee solamente una pequeña variación de energía libre estándar y es libremente reversible en la célula. Existen dos formas del enzima: la forma presente en los tejidos animales parece precisar del 2,3-difosfoglicerato como intermediario (véase pág. 446), de acuerdo con la ecuación

2,3-difosfoglicerato + 3-fosfoglicerato ~ 2-fosfoglicerato + 2,3-difosfoglicerato

Deshidratación del 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato

La conversión del 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato (pá­gina 415) es la segunda reacción de la secuencia glucolítica en la que se produce un fosfato de alto contenido energético (fig. 16-14). La reacción es catalizada por la enolasa:

2-fosfoglicerato ~ fosfoenolpiruvato -f HaO t:.Go' = + 0,44 kcal mol-1

La enolasa se ha obtenido en forma pura. cristalizada, de di­versas procedencias (Pm 85000). Muestra una necesidad

440

FIGURA 16-12 Acción .desacoplante del arseniato.·

o O-1 11 I C-O-As-o-

J A H-C-OH

lOPo,~ +

litO

3-Fosfog liceril­fosfato

1 no enzimática

O 11 C-O-I

H-C-OH I ClitOP0a2-

+

3-Fosfoglicerato

Arseni~o

FIGURA 16-13

Estructura 9 modelos espaciales compactos de las formas fosforiladas del o-glicerato.

COO-I

H-C-OH I ~OPO,¡'-

3-Fosfoglicerato

COO-I

H-C-OPO,¡2-I ~OH

, 2;Fosfoglicerato

coo­I

H-C-OPO,¡'-I CH.OPO,¡·-

2.3-Difosfoglicerato

FIGURA 16-14

Estructura !! modelo espacial compacto del fosfoenolpiruvato.

CH. 11 C-O-PO,¡I-11 COa-

Capítulo 16 Glucólisis

absoluta de la presencia un catión divalente (Mg2+ o Mnl+) que forma un complejo con el enzima con anterioridad a la unión del sustrato. El enzima es inhibido fuertemente por el fluoruro, particularmente si se halla presente un fosfato; la especie inhibidora es el ion fosfofIuoridato, que forma un complejo con el Mg2+. Aunque la reacción catalizada por la enolasa es, formalmente, una eliminación de una molécula de agua de los átomos de carbono 2 y 3 del 2~fosfoglicerato, puede considerarse también como una oxidorreducción intra~ molecular, ya que la eliminación de agua provoca que el átomo de carbono 2 resulte más oxidado y 'el átomo de carbono 3, más reducido. A pesar de la relativamente pequeña variación de energía liare estándar de esta reacción, hay una gran varia~ ción de la energía libre estándar de hidrólisis del grupo fosfato reaccionante . y del producto; la del 2~fosfoglicerato es de alrededor de ..,...4,2 kcal mol-l , y la del fosfoenolpiruvato de -14,8 kcal mol-l. Evidentemente existe una gran variatión en la distribución de la energía dentro de la molécula del 2~fosfo­glicerato cuando se deshidrata a fosfoenolpiruvato (pág. 416).

Transferencia de"fosfato desde el fosfoenolpiruvato al ADP

La transferencia del grupo fosfato desde el fosfoenol~piruvato hastad ATP, produce piruvato libre (fig. 16~15): la reacción es catalizadapor )a piruvato~quinasa.

Fosfoenolpiruvato + ADP ~ piruvato + ATP .t:..G'" = - 7,5 kcal mol-1

que ha sido obtenida pura en forma cristalizada (Pm 250 000) . La reacción es muy exergónica, y se ha visto que es irrever~ sible en las condiciones intracelulares. El enzima precisa de Mg2+ o Mn2+, con los que debe formar un complejo antes de unirse al sustrato. El Ca2+ compite con los iones anteriormente citados formando· un complejo inactivo. El enzima precisa también de un catión de metal alcalino, que puede ser K+, Rb+ o Cs+; el primero es el activador fisiológico. Se cree que la unión del K+ produce un cambio de conformación del enzi~ ma, transformándolo en una forma más activa. La piruvato~ quinasa de los mamíferos es un enzima regulador que se· pre~ senta con diferentes formas en diversos tejidos. La forma L, o hepática, es activada tanto por la fructosa~ l,6~difosfato como por concentraciones elevadas de fosfoenolpiruvato, pero es inhibida por el ATP, AMP, citrato y alanina. También es inhibida por los ácidos grasos de cadena larga y por el acetil~CoA. La forma M, muscular, no es activada por la fruc~ tosa~ 1,6~difosfato, pero es inhibida por la fenilalanina. Al igual que la hexoquinasa (pág. 433) y la 6~fosfoEructo~quinasa (pág. 435) la piruvato~quinasa «interrumpe» su actuación cuando la concentración celular de A TP es relativamente ele~ vada o cuando son asequibles otros combustibles, tales como los ácidos grasos, el citrato, el acetil~CoA o la alanina. Inicia de nuevo su actuación en cuanto se produce un incremento de los intermediarios glucolíticos precedentes, sobre todo de fruc~ tosa~ l,6~difosfato y de fosfoenolpiruvato.

+41

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGfA DEL ENLACE POSPATO

Reducción del pirovato a lactato

En la última etapa de la glucólisis, el piruvato se reduce a lactato. (fig. 16~15) a expensas de las electranes cedidos ini~ cialmente par el 3~fasfagliceraldehída. Estas electranes san transpartadas par el NADH. La reacción es catalizada por la lactato~deshidrogenasa:

Piruvato + NADH + H+ ~ lactato. + NAD+ t::.GOI = - 6,0 kcal mal-1

El equilibrio. glabal de esta reacción, está muy desplazada hacia la derecha, tal camo nas da a entender el gran valar negativa de t::.Go'. La lactat~deshidragenasa existe, al menas, en cinca formas maleculares distintas, a isazimas en los ani­males superiares (pág. 250), las cuales difieren en la velo­cidad con que catalizan la reducción del piruvato cuando las cancentraciones de éste san bajas. Supapelreguladar en la glucólisis se describe detalladamente en otro lugar (págs. 250 y 642). Esta reacción completa el cicla de oxidorreducción interna de la glucólisis.

El lactato., praducta final de la secuencia glucalítica en con­diciones anaeróbicas, se difunde a través de la membrana celu~ lar hacia el entarna farmando un producto de desecho. Cuando. las músculas de las animales superiores se ven forzados a funcianar anaeróbicamente en súbitos arranques de excepcio­nal actividad, el lactato. que sale de las células musculares va a parar a la sangre, siendo recuperada por <el hígado, y desti~ nado a formar glucosa sanguínea (págs. 636 y 775).

Balance global

Podemas establecer ahora un balance de la giucólisis, en el que se han de tener en cuenta la suerte de los átomos de car­bono del esqueleto de la glucasa, las reacciones de oxidorre­duc:ción y la incorporación y salida del ·fosfato, del ADp·y del ATP. La parte izquierda de la ecuación siguiente muestra todas las incarporaciones a la secuencia grucolitic:a, y la dere ... cha todas las salidas, reguladas por el hecho' de que cada. molécula de glucosa produce dos motéculas de gliceraldehído-3~fosfato:

Glucasa + 2ATP + 2NAD+ + 2P¡ + ~ADP + 2NADH + + 2H+ ~ 2 lactato + ADP. + NA.oH + 2H+ +

+ -tATP + 2NAD+ + 2H:¿O

Anulando. las términas camunes de ambos miembros de la ecuación, abtenemas .

Glucosa + 2P¡ + 2ADP ~ 2 lactato + 2ATP + 2H20

En el procesa global. la D-glucosa se convierte en das molé­culas de lactato, dos moléculas de ADP y de fosfato se con~ vierten en ATP, y cuatro. electranes han sido transferidas desde el gliceraldehído-3-fasfata al piruvataa través de 2NADH + + 2H+. Dos maléculas de ATP deben ser aportadas al es­quema para «cebarla» (pág. -t31), con 10 que producen cuatro maléculas de A TP, can el resultado de un rendimiento. neta de dos moléculas de A TP par malécula de glucosa trans­formada.

#2

FIGURA 16.15 Estructuras g modelos espaciales compactos del piruvato g del lactato.

coo­I C=O I

CHa

coa­I

HO-C-H

~

TABLA 16.1. Concentraciones en el estado estacionario de los intermediarios de la glucóllsls en el eritrocito humano.

Intermediario

Glucosa Glucosa-6-fosfato (G69) Fructosa-6.fosfato (F6P) Fructosa-l,6.difosfato (FDP) Fosfato de dihidroxiacetona (DHP) Gliceraldehído-3.fosfato. (GAP) 3.fosfoglicerato (3PG) 2.fosfoglicerato (2PG) Fosfoenolpiruvato (PEP) Piruvato (Pyr) Lactato (Lact) ATP ADP Fosfato

Concen· tración

p.M

5000 83 14 31

138 18.5

I 118 29.5 23 51

2900 /1850

138 1000

FIGURA 16-16 Perlü de la energía libre. de la glucólisis en el mtrocitc humano. Todas las reacciones l/e hallan en el equilibrio o cercanBII a él, excepto las cata1izadas por la hexoquinasa, la fosfofructo~ quinasa /y. la piruvato~uinasa, en las que se producen grandes descensos de AG. En la célula, t.odas· las etapas de la glucólisis deben producine sin variación o con disminución·· de energía libre. Los ligerol/ incrementol/ cdeenergía libre que se muestranaqur par. varias de las etapas de la gtucól4ü~ deben considerarse como errores derivados de las medidBII experimentales.

CapítulQ 16 Glucólisis

Energética de la.glueólisis en.la célula intacta.

~espierta muchó. interés la· manera cómo se produ~ebr ener­gética de la 91uc6lisis en las célulás intactas. Se ha éonseguiOo urt anA,lisis de este tipo para los eritrocitos de la sangre hu­mana. que difieteri."de lá i:nayor parte de las células corporales en que· obtienen toda sú energía de la glucólisis. Se han podido . determinar (tabla 16:'l) las concentraciones reales en el eStado eStacionario de tOdos lOs intermediarios de la glucólisis en los glóbulos rojos de la sangre. A partir de estos valores y -ele las constantes de equilibrio conocidas para las reacciones gluco­líticas!~se hacalculadp la variación de energía libre (AG, no tlGo' rde cada etapa en los eritrocitos intactos mediante la ecuación general (pág. 401)

.0' . [ele [D}" b.G = b.G + RT ln[A]/I [B]b

ajustada para tener en cuenta la estequiometría de la reacción. A partir de estos resultados. se haeonstruidoun perfil de la ener9ía ·libre (lig; 16.,.16) en el eritrocito intacto en estado estacipnario •. Puedeverse que ocho de las reacciones de la gluc6üsis se hallan en estado de equilibrio o muy próximo a él. ya que sUS valore!Lde tlG se hallan cercanos a cero, míen­tras:'lue'-tresde las reacciones se producen con un gran des­censo de· AG y están. por tanto. lejos· del equilibrio; se trata de las reacciones catalizadas poi' .la hexoquinasa. por la fosEo­fructo-quinasa _y por la .piruvato-quinasa. A partir de estos datos se ha:cakulado también que la energía libtede hid('Ó.i. lisis del A TP en: el eritrocito es aproximadamente -13,3 kcal mol-l ; la eficacia real de la recuperación de energía en la glucólisis delos eritrocitos es de cerca del 53 %. o sea mucho mayor que la eficacia teórica del 31 % calculada mediante los datos de la energía libre estándar (pág. 429 ).En el múscu­lo. la eficacia real es aun mayor.

Tenemos actualmente pruebas suficientes de que la reacción de la fosfofructo-quinasa es la principal reacción limitante dé la velocidad en la glucólisis. Pero existen por lo menos dos puntos de control sécundario que pueden llegar a ser limitan­tes de la velocidad. en circunstancias especiales: son las reac­ciones catalizadas por la hexoquiriasa (pág. 433) y la piruvato­quinasa (pág. 441). que son .enZimas alostéricos. La gliceral­dehído-3-fosfato-deshidrogenasa tiene también las caracterís­ticas de un enzima regulador. pero no está claro todavía el papel que desempeña en la regulación de la glucólisis «in vivo». La regulación de la yelocidad de utilización de la glu­cosa será objeto de mayor estudio eIllos capitulos 19.29 y 30.

Incorporación de otros glúcidos a la secuencia glucolítica

Los polisacáridos de reserva. el almidón y el glucógeno. así como los azúcares simples distintos de la D~glucosa. son cana­lizados hacia la primera fase de la glucólisis a través de rutas alimentad~ras catalizadas por enzimas auxiliares cuya acción se describe a continuación.

Gluc6geno y almidón

Las unidades de D-glucosa del glucógeno y del almidón pe­netran en la secuencia glucolítica a través de la acción conse-

443

PARTE 2 CATABOUSMO y PRODUCCiÓN DE LA ENERGíA DEL ENLACE FOSFATO

cutiva de dos enzimas; la HlucóHeno~fosforilasa (o la almidón­fosfotilasa, en los vegetales) y la fosfofJluco~mutasa. La glu­cógell9-fosforilasa y la fosforilasa del almidón son miembros de. una clase general de enzimas denominad.a a{1 ~ 4) ~gluca­no-fosforilasas. Se hallan muy difundidas en las células aní,. males, vegetales y microbianas, y catalizan la reacción general que se muestra más abajo, en la que (glucosa)" representa la cadena del glucano y (glucosa) "-1 la cadena del glucano acortada:

(Glucosa )n+ HPOl- ~ (glucosa)n-1 + glucosa-l-fosfato I:J.GOI = + 0,73 kcal mol-1

En esta reacción, el enlace glucosídico terminal a(1 ~ 4) en el extremo no reductor de una cadena lateral del glucógeno experimenta la fosforólisis. Al igual que la hidrólisis provoca la escisión de una molécula por introducción de los elementos del agua, en la fosforólisis ia escisión de la molécula se produce por la introducción de los componentes del ácido fosfórico. La escisión del enlace glucosídico terminal origina la separa­ción de la glucosa terminal en forma de glucosa-l-fosfato, quedando una cadena de glucógeno con una unidaddegh,lcosa ¡¡Denos (lig. 16-17). El enzima actúa de modo repetido. sobre los extremos no reductores de las cadenas de glucógeno hasta encontrar los puntos de ramificación con enlace a(1 ~ 6), a los que no puede atacar. La acción exhaustiva de la glucó­geno-fosforilasa puede producir, de esta manera, una dextrina l;mite (pág. 271) que puede ser degradada ulteriormente por la glucógeno-fosforilasa, después de que haya actuado un enzima desramificador, la amilo-l,6-glucosidasa hidrolítica (pág. 271), que hidroliza el enlace 1 ~6 en el punto de rami­fjcación, permitiendo así que otro fragmento de la cadena

FIGURA!6-17

Eliminación fosforolítica de un resto de glucosa (en color) del extremo no reductor de una cadena de glucógeno por [a fosforilasa.

. . pl....I glucógeno-1 fooforilasa

tf:CH2~H 0-

4 1 1 2 O-P-O-

3 1I O

+

Glucógeno

Glucosa-l-fosfato

Extremo no Jeductor de la cadena de glucógeno.

acortada en un resto

FIGURA 16~ 18 Conversión de la fosforilssa a en fosforillisa b por la fosforilasa~fosfatasa y reactivación de la fosforilasa b por la fosforil8Sa~quin8Sa.

fesforilasa .. quinasa

+

p

Fosforilasa a (activa)

p

fosEorilasa .. fosfatasa

Moléculas de fosforilasa b

(menos activa)

Capitulo 16 Glucólisis

polisacaridica sea accesible a la acción de la glucógeno~f()Sfo~ rilasa.

Aunque el enzima citado, descubierto y estudiado detalla~ damente por Cori, Cori y colaboradores, parecía en principio ser el responsable tanto de la degradación como de la forma­ción del glucógeno en la célula, se ha descubierto después que su función primordial es la de catalizar la escisión del glucógeno. En condiciones intracelulares, en las que la con­centración de fosfato inorgánico es relativamente elevada y la de glucosa~l-fosfato relativamente baja, el equilibrio de la fosforilasa favorece en gran manera la formación de gluco­sa-l~fosfato. La formación del glucógeno a partir de las uni­dades de fosfato de glucosa se debe a la intervención de un enzima diferente, la glucágeno-sintasa (pág. 657).

La fosforilasa está situada en un punto estratégico impor~ tante entre el depósito de combustible (gJucógeno o almidón) y la secuencia glucolítica utilizada por el combustible. Su acti­vidad en los músculos y en el hígado se halla sometida a regu­lación por un elaborado conjunto de controles. La glucógeno fosforilasa del músculo esquelético aparece en dos formas, la forma activa (fosforilasa a), y una forma mucho menos activa (fosforilasa b), (cap. 9, pág. 249): ambas han sido cristalizadas. La fosforilasa a posee un peso molecular de 380 000 Y está constituida por cuatro subunidades idénticas. Cada subunidad contiene un resto de fosfoserina que es esencial para la acti­vidad catalítica, y una molécula de fosfato de piridoxal (pág. 350) covalenteménte unida a un resto de lisina. La fun~ ción del fosfato de piridoxal, es todavía desconocida. La forma activa de la fosforilasa a, puede ser atacada por el enzima hidrolítico fosforilasa-fosfata3a que elimina los grupos fosfato de los restos de serma (flg. 16-18). Esta reacción provoca que la fosforilasa· a se disocie en dos moléculas de f{)sforilasa b, que es la forma menos activa. La fosforilasa b no se convierte nuevamente en fosforilasa a activa por una simple inversión de la reacción anterior que es irreversible, sino mediante otra ruta alternativa en la que cuatro moléculas de A TP actúan sobre dos moléculas de fosforilasa b en presencia del enzima fosforila3~quina3atpág. 249) . Las acciones de la fosforilasa­fostatasa y de la fosforilasa-quinasa permiten el control de la relación entre la fosforilasa a activa y la fosforilasa b menos activa, en la célula, variando, de este modo, la velocidad de conversión del glucógeno en glucosa~ 1 ~fosfato. En realidad, la actividad de la fosforilasa-quinasa se halla también sometida a regulación, ya que, a su vez, aparece en formas activas e inactivas, cuya relación está controlada por ciertas hormonas (pág. 659 Y 821).

El hígado contiene también formas tanto activas como inac­tivas de la fosforilasa, cuya relación puede ser controlada, asimismo, por la velocidad de interconversión entre las formas activa e inactiva. Sin embargo, los enzimas que se hallan en el hígado poseen una arquitectura diferente, muy distinta de la de los enzimas musculares, y están controlados de manera diferente, en armonía con las diferencias de la dinámica del metabolismo de la glucosa hepática y muscular (pág. 823).

La glucosa:l-fosfato, producto final de las reacciones cata­liza das por la fosforilasa del glucógeno y del almidón, se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfogluco-mutasa, inte­resante enzima que ha sido obtenido en forma pura de muchas

445

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

procedencias. Cataliza la reacción fácilmente reversible ..

Glucosa~ 1 ~fosfato ;:;t glucosa-6,fosfato . AG<>' = - 1,74 kcahnol-1

Aunque puede catalizar también la conversión de lao~manosa~ l~fosfato en o~manosa~6~fosfato, la velocidad de esta reacción es solamente la centésima parte de la de conversión de la o~glucosa~l~fosfato.

La fosfogluco~mutasa contiene un resto de serinaque es esencial para la actividad catalítica;. durante el ciclo catalítico, el grupo hidroxilo de la serina se esterifica con ácido fosfó .. rico, que pasa desde la posición 1 a la posición 6 de la glucosa (véase más adelante). El grupo hidroxilo del resto de serina puede también esterificarse mediante el inhibidor fosfofluori­dato de diisopropilo (pág. 226) para dar una. forma inactiva del enzima. La fosfogluco-mutasa es uno de los componen .. tes de los enzimas de la clase serina (pág. 226). Precisa no solamente. de Mg2+, sino también de un cofactor orgánico, la glucosa .. l.6~ifosfato. Parece bastante claro que este último es un intermediario en la acción del enzima. como indican las etapas de la secuencia siguiente y la ligura 16~19~

Fosfoenzima + glucosa~l;..fosfato ~ desfosfoenzima + glucosa~ l,6~ifosfato

Desfosfoenzima + glucosa~ l,6~difosfato ~ fosfoenzima. + glucosa~6 .. fosfato

Suma: Glucosa~ 1 ~fosfato ~ glucosa-6-fosfato '

El papel de laglucosa .. 1.6~difosfato en la reacción de la f~ foglucomutasa es, por tanto, semejante al que desempeña el 2,3 .. dif.osfoglicerato en Ja reacción de la fosfoglicero~mutasa (pág. 440).

La glucosa~ 1.6~difosfato puede producirse también mediante otra reacción. Glucosa .. l~fosfato + ATP --+ glucosa-l,6 .. difosfato + ADP

catalizada por el enzima fosfogluco.-quinasa. La glucosa-6-di­fosfato formada como producto de la reacción de la fosfogluco­mutasa, puede incorporarse entonces·al cicla glucolítico.

Incorporad6n de disacáridos

Los disacáridos ingeridos por los animales superiores, son generalmente hidrolizados dando sus componentes monosacá~ ridos antes de ser absorbidos en el intestino. Las reacciones más importantes son:

Sacarosa + H;20 ~-fructo(uranosidasa) o-glucosa +. o .. fructosa

M 1 H O «-glucoaldasa 2 t a tosa + ;2 -..;;...-...;...~) o~g ucosa

Lactosa + H;20 fl-galactosldasa~ o~glucosa + o-galactosa

El enzima lactasa, una ,8~gaIactosidasa secretada al intestino delgado. muestra una actividad pequeña o nula, en muchos adultos árabes. judíos, bantúes, japoneses. indios americanos

FIGURA 16-19 Representación esquemática del papel de la glucosa-I.6-difosfato en la reacción de la fosfogluconwtasa.

lr E-® + 6 -==E <c E + 1¡® ==E-®+l,

6~ 6Lcv

FIGURA 1()..20 Epimerización de la o-galactosa-1-fosfato.

H~~OH ~ D~_ 4 OH H 1 l-fosfato H O~

H OH

l~

1 1

.~:OH ~ ·H ~I-

H OH

o-glucosa­l-fosfato

Capítulo 16 Glucóli&is

y filipinos. Tales individuos son normalmente incapaces de absorber la la~tosa. lo cual recibe el nombre de intolerancia a la lactosa. Los monosacáridos formados en estas reacciones se incorporan a la glucólisis mediante las reacciones que se 'describen a continuación.

Incorporación de monosacáridos distintos de la glucosa

En el hígado de los vertebrados. la fructosa (pág. 257) pe~ netra en la rutaglucolítica por acción de la fructoquinasa. que c~taliza la fosforilación de la glucosa en el átoroode car~ bono 1: .

D~Fructosa + ATP ~ D~fructosa~l~fosfato + ADP

La fructosa~l~fosfato resultante se escinde, a continuación. en D~gliceraldehído y fosfato de dihidroxiacetona,

Fructosa~l~fosfato ~ D~g1iceraldehído + fosfato de dihidroxiacetona

pot acción de la aldolasa. El D-gliceraldehído libre así formado se fosferila. transformándose en gliceraldehído-3-fosfato en la reacción

" .. , D-gliceraldehído + ATP ~

D~gliceraldehído-3~fosfato + ADP

El fosfato de dihidroxiacetona y el gliceraldehíd~3-fosfato así formados sOn. desde luego, intermediarios en la glucólisis, y se degradan finalmente a piruvato.

La hexosa D-galáctosa (pág~ 256). un componente del azú~ car dé laleéhe (o;.lactosa), se incorpora al ciclo de la glucólisis despUés de su fosforilación a expensas del A TP en reacción catálizada porta' galacto~qainasa.

ATP + D~galactosa ~ ADP + D~galactosa~l-fosfato La 'o.:.galaetosa-l-fosfato se convierte después en su epímero en el Atomo"de'carDoito 4; es decir, en D~glucosa~l-fosfato (figura 16.:.20), a través de una' secuencia de reacciones, que necesitan el trifosfato de uridina (UTP) como coenzima.' Los detalles de esta transformación que precisan de UTP, y otras más, se d~scriben en otro lugar (págs. 652 a 663).

La D~manosa (pág. 256 se fosforila en la posición 6 por la hex:oquinasa; que es relativamente no específica:

D-manosa + ATP ~ D~manosa-6-fosfato + ADP

La D-manosa-6-fosfato se isomeriza reversiblemente a o-fruc­to~a-6~fosfat~ por ae<;:ióÍl de la manosa fosfato isomerasa

D-manosa-6-fosfato ~ o-fructosa-6-fosfato

Las pentosas pueden incorporarse también al ciclo gluco~ lítico después de su fosforilación y conversión en hexosa y triosa-fosfatos mediante los mecanismos descritos en las pá~ ginas 478 a 482. La glicerina y el L~glicerín;.3-fosfato, deri­vados de los triacilglicéridos y de los fosfoglicéridos, respec­tivamente (págs. 290 y 293), pueden también ser utilizados. La glicerina libre se fosforila a expensas del A TP por la ~ cerinqainasa

ATP + glicerina ~ ADP + 'L~glicerín-3;.fosfato

+47

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

El L~glicerín~3~fosfato experimenta después la oxidación a fos~ fato de dihidroxiacetona, bien por acción de la glicerín~3~ fosfato~deshidrogenasa citoplasmática, enzima que precisa de NAD+ como aceptor electrónico,

L~glicerín~3~fosfato + NAD+ ~ fosfato de dihidroxiacetona + NADH + H+

o por la glicerín.-3~fosfato~deshidrogenasa mitocondrial. que es una flavoproteína (pág. 545). El fosfato de dihidroxiacetona formado en estas reacciones puede convertirse enzimáticamente en gliceraldehído~3~fosfato para incorporarse a la segunda fase de la glucólisis.

Fermentación alcohólica

En organismos como la levadura de cerveza, que fermenta la glucosa a etanol y COl, en lugar de hacerlo a ácido láctico, la ruta de fermentación es idéntica a la descrita para la glu~ cólisis excepto en la etapa final. catalizada por la lactato~ deshidrogenasa, que es sustituida por otras dos etapasenzi~ máticas (lig. 16~21).

En la primera etapa, el piruvato se descarboxila a acetal~ dehído y COz por medio del enzima piruvato~desciJrboxilasa, que no se encuentra en los tejidos animales

Piruvato ---+ acetaldehido + COl

La descarboxilación del piruvato para formar acetaldehído y CO2 es esencialmente irreversible. La piruvato~descarboxilasa precisa de Mg2+ y posee un coenzima unido íntimamente, el pirolosfato de tiamina (pág. 343). La descarboxilación delpi~ ruvato se produce a través de una serie de intermediarios unidos covalentemente al pírofosfato de tiamina (fig. 16~22). En la etapa final de la fermentación alcohólica, el acetaldehído se reduce a etanol, el NADH + H+ aporta el potencial de re~ ducción y la reacción es catalizada por el enzima alcohol~des~ hidrogenasa:

Acetaldehído + NADH + H+ ~ etanol + NAD+

El etanol y el CO2 son, por tanto, los productos finales de la fermentación alcohólica, cuya ecuación global puede escribirse del modo siguiente:

Glucosa+ 2P¡ + 2ADP ~ 2 etanol + 2C02 + 2ATP + 2H20

Las etapas de conservación de la energía que conducen a la formación de A TP, son idénticas tanto en la glucólisis como en la fermentación alcohólica.

Otros tipos de fermentación anaeróbica

Las fermentaciones homoláctica y alcohólica son los mecanis~ mos de fermentación más corrientes y sencillos. Se conocen otras rutas, algunas de las cuales son simples variaciones del esquema de Embden~Meyerhof. En las fermentaciones heter~

448

FIGURA 16-21 Comparación de las etapas finales de la glucólisis (A) Y de la fermentación alcohólica (B).

A. Glucólisis.

1 1

Fosfoenol piruvato

1 PiruvaI<>'

H+ + NADH "'llactato­NAD+ ..-¡deshidrogenasa

Lactato

B. Fermentación alcohólica.

1 1

Fosfoenolpiruvato

1 Piruvato

Jpiruvato-CÜt ~l descarboxilasa

Acetaldehido ,

H+ + NADH ---¡alcohol­NAD+ -1 deshidrogenasa

Etanol

FIGURA 16-22 Etapas de la acción del pirofosfato de tiamina unido al enzima en la descarbo­xilación del piruvato.

H I . +~C-SI

R-N 1 "-

C=C-Rt - I CHa

Anillo tiazólico del piro fosfato

de tiamina

1~CH3-~-COOH Piruvato

COOH I

CH,-C-OH . I c-s

+.~ I R-N 1 "-

C=C-Rt

tHa 1,

H I c-s

+~ I R-N 1 "-

C=C-Rt I CHa

a-Hidroxietil. derivado

Acetaldehido

Capitulo 16 Glucólisis

tácticas mixtas. que se producen predominantemente en micro­organismos, los productos finales son una molécula de cada uno de los siguientes productos: ácido láctico, etanol y CO2•

Otros tipos de fermentaciones bacterianas tienen como pro­ducto final el ácido propiónico, el ácido butírico, el ácido succínico o la acetona. Los microorganismos son frecuentemen­te utilizados en la industria química para la obtención de pro­ductos tales como la acetona, el etanol, el butanol y muchos más, mediante fermentación de los azúcares, o de otras fuentes naturales de glúcidos.

Resumen

La fermentación anaeróbica es la ruta más primitiva p'ara la obtención de energía de combustibles tales como la glucosa. En las células anaeróbicas constituye el único proceso productor de energia. En la mayor parte de las células facultativas. constituye una primera etapa obligada del cata­bolismo de la glucosa. que Va seguida de la oxidación aeróbica de los productos de la fermentación. Los dos tipos más corrientes de fermentación son la glucólisis y la fermentación alcohólica. Ambas utilizan idénticos mecanismos de conservación de la energía difiriendo solamente en sus etapas terminales. La ecuación global para la glucólisis es glucosa + 2ADP + 2P¡ ~ 2 ácido láctico + 2ATP + 2H20. y la de la fermentación alcohóVca es glucosa + 2ADP + 2P¡ ~ 2 etanol + 2C02 + 2ATP +. 2H20. Ambas fermentaciones son esencialmente irreversibles.

La glucólisis se produce en dos fases. En la primera. la D-glucosa es enzimáticamente fosforilada por el ATP. escindiéndose al final en dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato. Otras hexosas. las pentosas y la glicerina. se incorporan también. transformándose después de su fosforila­ción en gliceraldehido-3~fosfato.

En la segunda fase de la glucólisis. el gliceraldehído-3-fosfato es oxidado por el NAD+. consumiendo fosfato inorgánico por acción de la gllceraldehído-fosfato-deshidrogenasa. y formando 3-fosfogliceril-fosfato. Este último cede su grupo acil-fosfato al ADP. rindiendo ATP y 3-fosfo­glicerato. que se isomeriza después a 2-fosfoglicerato. Después de la des­hidratación de este último por la enolasa, el fosfoenol-piruvato formado cede su grupo fosfato al ADP. El otro producto. el piruvato libre. es reducido a 'lactato por el NADH formado en la deshidrogenación del gliceraldehído-3-fosfato. Dos moléculas de ATP entran en la primera fase de la glucólisis y en la segunda se forman cuatro a partir del ADP. con una ganancia neta de dos ATP por cada motécula de glucosa. La eficacia de la recuperación de energía mediante la· glucólisis en el eritrocito intacto es de cerca del 50 %. En la glucólisis existen tres etapas esencialmente irreversibles; son las catalizadas por la hexoquinasa. la 6-fosfofructoquinasa y la piruvato-quinasa. La reacción catalizada por la fosfofructo-quinasa. un enzima regulador, es la principal etapa limitante de velocidad en la glucólisis. La incorporación de restos de glucosa pro­cedentes del glucógeno y del almidón a la glucólisis resulta posible gracias a la intervención de la glucógeno-{aImidón)-fosforilasa y de la fosfogluco­mutasa. La glucógeno-fosforilasa. que cataliza la conversión del glucógeno en glucosa-l-fosfato. es un enzima regulador que existe en forma activa (fosforilasa a) y en forma menos activa (fosforilasa b). Otras hexosas distintas de la glucosa. tales como la fructosa y la galactosa. se convier­ten enzimáticamente en intermediarios de la ruta glucolítica. igual que algunas pentosas. En la fermentación alcohólica. la secuencia de reacciones es idéntica hasta la fase del piruvato. pero éste. en lugar de reducirse a lactato. se descarboxila y produce acetaldehído. que posteriormente se reduce a etanol.

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449

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Problemas

l. Predecir si la adición de cantidades. significativas de los compuestos que se especifican a continuación a un extracto de levadura que fermenta glucosa podrían provocar un incremento (+). o un decre~ mento (-), o no inducir ningún cambio (O), en la velocidad de conversión de la glucosa en etanol: a) iodoacetato, b) ATP, e) AOP. d) AMP, e) fosfato, f) fluoruro, g) bis\llfito (reacciona con los al~ dehidos). h) citrato, i) arseniato.

450

Capítulo 16 Glucólisis

2. Escríbase una ecuación igualada para la conversión de la D-fructosa en ácido láctico en el hígado. a) suponiendo que la fructosa es fosforilada por la hexoquinasa. y b) suponiendo que la fructosa es fosforilada por la fructo-quinasa. Inclúyanse en la ecuación global todas las etapas de fosforilación asociadas.

3. Escríbanse ecuaciones igualadas para los siguientes procesos. inclu­yendo todas las etapas de fosforilación asociadas. a) Conversión de glicerina en ácido láctico. b) Conversión de L-gliceril-3-fosfato en etanol y COz. e) Conversión de D-manosaen fosfoenolpiruvato. d) Fermentación de la sacarosa a etanol y COz. e) Fermentación del gliceraldehído a etanol y COI.

4. Escribase la ecuación global para la conversión de la fructosa-1.6-d¡­fosfato en fosfoenolpiruvato en presencia de NAO+, fosfato. AOP y arseniato.

5. Un extracto de levadura que contiene todos los enzimas necesarios para la fermentación alcohólica de la glucosa se incuba con D-glucosa 200 mM, A TP 20 mM, NAIY 2.0 mM y fosfato 20 mM. La incuba­ción se continúa hasta que el siStema alcanza el equilibrio.

a) Predecir la concentración de glucosa y la de etanol en el equilibrio.

b) ¿De qué modo puede lograrse que la fermentación se realice por completo. y que esencialmente toda la glucosa se convierta en etanol?

6. Designar los compuestos presentes en el equilibrio cuando la aldolasa de músculo pura actúa sobre una mezcla de fructosa-1.6-difosfato. D-gliceraldehido y acetaldehído.

7. a) Calcúlese la variación de energía libre global cuando se produce la glucólisis bajO el siguiente conjunto de condiciones. que son seme­jantes a las existentes en la célula intacta: glucosa = 5 mM, fos­fato = 1.0 mM, AOP = 0.5 mM, ATP = 3.0 mM y lactato = 3.0 mM. b) ¿Cuál será la variación de energía libre cuando la concentración de lactato se eleve a 100 mM?

Ir" 8. La concentraci6n de 3-fosfoglicerato en el fluido intracelular del

tejido cortical cerebral es 0.283 mM, mientras que la de 2-fosfogli­cerato es 0.026 mM. Calcúlese la variación de energía libre !J..G a 25 oC para la reacción de la fosfoglicero-mutasa en estas condiciones.

9. Calcúlese el porcentaje de la concentración inicial de fructosa-l.6-di­fosfato que es escindido por la aldolasa pura cuando se ha alcan­zado el equilibrio. si la concentración inicial de aquél fuera: a) 1.0 M, b) 0.1 M, c) 0.01 M, d) 0.001 M, e) 0.0001 M. Supóngase que !J..G" para la reacción de la aldolasa es + 5.73 kcal mol-l.

10. La concentración de fructosa-1.6-difosfato en el fluido intracelular del tejido cortical cerebral es de 0.146 M, mientras que la concentra­ción total de los dos fosfatos de triosa es de 0.0942 mM. Calcúlese la variación de energía libre a 25 oC para la reacción de la aldolasa en estas condiciones. suponiendo que la reacción catalizada por la triosa-fosfato-isomerasa se halla en el equilibrio.

11. La gluco-quinasa de higado de rata posee una K." de 1 O mM y un máximo aproximado de actividad . catalítica de 1.5 ¡.tmol min-I g-I de tejicjo fresco. mientras que la he~oquinasa de higado de rata. posee una KM de aproximadamente 0.1 mM y una actividad catalítica máxima de 0.1 J.IlIlol min-I g-I. ¿Cuáles serán las relaciones de las actividades de glucoquinasa a hexoquinnsa. a las siguientes concen­traciones de glucosa: a) 0,1 mM, b) LO mM, c) 5,0 mM (normal). d) 10 mM, e) 30 mM (nivel diabético).

451

CAPíTULO 17 Ciclo de los ácidos triearboxflicos y ruta del fosfogluconato

Comenzamos ahora por considerar el proceso de la respira,­ción mediante el cual, las células aeróbicas obtienen energía a partir de la oxidaci6n de las moléculas combustibles por el oxígeno molecular. Estudiaremos en este capítulo el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que es la ruta central común para la degradaci6n de los restos acetilo de dos átomos de car­bono, que derivan no solamente de los glúcidos sino también de los ácidoS grasos y de los aminoácidos. El capítulo siguiente describirá la fase final de la respiraci6n, es decir, el transporte electrónico y la fosforilaci6n oxidativa.

El ciélo de los ácidos tricarboxílicos es una secuencia de reacciones que tiene efecto de un modo· prácticamente univer­sal en los organismos aeróbicos. Está catalizada por un sis­tema multienzimático que acepta el grupo acetilo del acetil"" coenzima A como combustible, degradándolo hasta dióxido de carbono y átomos de hidrógeno. Estos últimos son condu­cidos á través de una secuencia de proteínas transportadoras de electrones hasta el oxígeno molecular, que se reduce para formar agua.

Esbozaremos también en este capítulo una segunda ruta de oxidación de la . glucosa, la del fosfogluconato, que actúa' como una de las fuentes de potencial de reducci6n para las reacciones biosintéticas y es responsable de la síntesis y de la degradaci6n de las pentosas y de otros azúcares.

Enugitica de la fermentación y de la respiración

En la glucólisis se libera solamente una fracci6n muy pequeña de la energía química potencialmente asequible en la estruc­tura de la molécula de glucosa. Se libera mucha más energía cuando ésta se oxida completamente a COl y H;zO, como se pone de manifiesto al comparar las variaciones de energía libre estándar de la gluc61isis anaeróbica (pág. 429) Y de la oxidaci6n completa de la glucosa: Gluc6lisis:

Glucosa ---+ 2 lactato A~' = - 47,0 kcal mol-1

Oxidaci6n completa:

Glucosa + 60z ---+ 6COz + 6H20 A~' = - 686,0 kcal mol-1

453

PARTE 2 q.TABOLlSMO y PRODUCaÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

Cuando las células degradan a la glucosa anaeróbicamente a través de la secuencia glucolítica. el lactato formado que no puede ser posteriormente utilizado. contiene to.davía la mayor parte de la energía de la glucosa original. Por otra parte. en condiciones aeróbicas. la degradación de la glucosa no se detiene en la etapa del lactato. sino que continúa más allá. de modo que los propuctos de la glucólisis * oxidan por ,c~J>leto a C~ y H20. liberando de esta maneraeJ remanente de energía disponible de la molécula dé glucosa.- .

Organigrama respiratorio

En la figura 17 ~ 1 se muestra el diagrama de la respira~ ción. El acetil~CoA que proviene de la oxidación de los glúcidos. de los ácidos grasos y de los aminoácidos en la Fase II del catabolismo (cap. 14. pág. 381). se incorpora en la Fase III al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. que en las células aeróbicas constituye la J;Uta común final de la ox~daci6n de todas las moléculas combustibles. En estedclo. los. grupos acetilo del acetil~CoA son enzimáticamepte degracJa~.para formar dos moléculas de C~ y cuatro. pares de áto~· de hidrógeno (en forma enlazada). Estos últimos (o los~orres~ pondientes electrones) se incorporan entonces a la cadena respiratoria.. constituida por una serie de transpprtadores elec~ trónicos. El proceso $Ubsiguiente de transporte. electrónico hasta el oxígeno molecular se reali.zcJcon. un -descenso enC?OJle de energía libre. gran parte de la cual se conserva gracias a la f~forilación del ADP para dar ATf en el proceso llamado loston/ación oxidativa.. .

La naturaleza cíclica del ciclo d.e los ácidos tricarboxílicos contrasta con la secuencia de. reacción lineal de la. glucólisis. En cada vuelta del ciclo de los ácidos tdcarboxílicqs (fig_ 17 .. 2) se incorpora una molécula de ácido acético . (dos átomos de carbóno) en forma de acetil~CoA.cond~ándose con una molécula del compuesto tetracarbonado ácido. oxalacético para formar el ácido cítrico. compuesto tricarboxilico de seis átomos de carbono. El ácido cítrico se degradaseg¡.Udamente a través de una secuencia de reacciones que produce dos moléculas de C~ y regenera el ácido oxalacético. tetracarbonad,o. Puede comenzar entonces. otra vuelta del ciclo por reactión del á<;ido oxalacético con otra molécula de acetil~CoA.De,este modo. en cada una de las vueltas del ciclo se incorpora una molécula de ácido acético. se forman dos moléculas de C~ y s~ utiliza una molécula de oxalacetato para formar citrato; pero esta se regenera al final del ciclo. Por tanto. cuando.el ciclo funciona. no hay pérdida neta de oxalacetato. Basta una.molécula de oxalacetato. si no se elimina por reacciones laterales, para llevar a cabo .la oxidación de un nÍlmero ilimitado de moleeu:, las de acetato. Resulta así que el c.clo de Jos ácidos tricar~ boxílicos es catalítico en dos sentidos. Cada una de las etapas del ciclo es catalizada. por supuesto. por un enziUla específico. tal como ocurre en todos los sistemas enzimáticos. pero ~uper~ puesto a este nivel dE! catálisis está el efecto catalítico de los propios intermediarios del ciclo: una sola molécula de oxala~ cetato. o de cualquiera de sus precursores en el ciclo. puede promover la oxidación de muchas moléculas de· acetato.

454

Capítulo 17 Ciclo de los ácidos. tricarboxIltcos y ruta del fosfogluconato

FIGURA 17-1 Or~nigrama respiratorio. El acetil-CoA es movilizado y reunido en la fase 11 del catabolismo (pág. 381). Entonces penetra en la fase 111, constituida por el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y el transporte electrónico, que se halla acoplado con las fosforilaciones oxidatWas. 1.0& productos finales de la respiración están indicados en color.

Aminoácidos' Glucosa

\.2~:J MovUización del acetil-CoA

Ciclo de los ácidos tricarboxilicos

TraÍlsporte electrónico " y fodotilación oxi4@tiva

;=c Oxalacetato Citrat\

[cis-Aconitato]

\ Isocitrato

/::--§] a..c>xoglutarato

455

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

FIGURA 17·2 Ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Los intermediarios se representan como ácidos libres. Los productos finales (dos ec,. cuatro pares de átomos de H y GTP) se hallan en recuadros. Los átomos de carbono que se incorporan en forma de acetil.coA están coloreados; sus posiciones en los intermediarios del ciclo se muestran hasta la fase de succinil·CoA. El succinato formado. debido a su simetría. rendirá fumarato. malato y oxalacetato. que contienen carbono procedente del acetil.CoA en cantidades iguales en todas las posiciones. suponiendo que no haya reacciones laterales. En la parte inferior de la figura se muestran los modelos espaciales de los intermediarios.

e Hí: O-S-CoA + RtO Acetil-CoA

COOH I H20

CRt

HO-¿-COO;:( (jOOH I CRt CH! aconitasa I ¿OOH T-COOH

~ roH

~ ~~ cj.uat~

, 11."2 smtasa

COOH . COOH

Citrico CH I COOH

I malato- Oxalacétlco Ho-é-H eshidrogenasa

I rRt

COOH L-málico

cis.Aconíti~o/ RtO

RtO ---1umarasa

COOH I

CH 11

HC I COOH

. Fumárico r:}il~succinato-~. esbidrogenasa

COOH I CRt I succinil .. CoA .. CRt I COOH

COOH I

CRt I (t'-oxoglutarato

deshidrogenasa

~ CO-S-::CoA Succinil-CoA,

aconi tasa '(

COOH I

CRt I

HC-COOH I

HO-C-H I COOH

Isocítrico isocitrato- Á

deshidrogenasa.¡. ~

(¡OOH ~ CRt I

COOH HC-COOH

l~Rt ¡sodtrato- ¿-O I deshidrogenasa I -CH2:{ COOH f Oxalosuccínico

COOH I COt I a.oxoglutárico

Ácido cítrico Ácído isocitrico Ácido a-oxoglutárico Ácido succinico Ácido fumárico

456

FIGURA 17-3 Eormas oxidada y reducida del azul de metüeno. Puesto que la forma reducida .se reoxida rápidamente por acción del oxigeno molecular, la reducción del azul de metileno por las suspensiones de téjido debe seguirse en condiciones anaeróbicas, con objeto de determinar el cambio de color que acompaña a la reducción.

T~LA 17-1. Efecto catalitico del malato sobre la respiración de la papilla de / músculo pectoral de paloma.

Consumo de oxigeno

calculado para Consumo la oxidación total

Malato del malato de oxigeno añadido añadido observado

pmol pátomos pátomos

1.0 6.0 47.2 2.0 12.0 69.4

Acido L-málico Acido oxalacético

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y ruta del fosfogluconato

Descubrimiento del ciclo de los ácidos tricarboxílicos

El ciclo de los ácid~s tricarboxílicos fue postulado por vez primera por H. A. Krebs. en 1937. con su denominación ori;" ginal de «ciclo del ácido citrico». Fue la culminación de un brillante conjunto de razonamiento y de trabajo experimental que figura entre las' investigaciones clásicas de la pióÍogía moderna. Reconstruiremos brevemente. las líneas ge'netal~ de las investigaciones que condujeron al ciclo. puesto lJUe constituyen Un modelo' instructivo para el análisis deotra& rutas metabólicas.

En primer lugar. habrá que esbozar algunos antecedent~ Desde los trabajos de T. Thunberg. de F. Battelli y de L. S; Stern. en el período comprendido entre 1910-20. se sabía que las suspensiones de tejidos animales triturados en anaero­biosis, contenían enzimas capaces de transferir átomos de hi­drógeno desde ciertos ácidos orgánicos cuya presencia en las células era previamente conocida en especial los ácidos succí­nico, fumárico. málico y cítrico al colorante reducible azul de metileno. transformándolo en su forma reducida o incolora (fig. 17-3). Los enzimas que catalizan tales reacciones se de­nominaron de:shidrogelJ.asas. Posteriormente. al comienzo de los años 30. mediante determinaciones manométricas de la velocidad de utilización' del oxígeno por parte de suspensiones de tejidos triturados (pág. 386), varios investigadores descu­brieron que el succinato, el fumarato, el malato y el citrato son oxidados rápidamente a CO2 y H20 por el oxígeno mo­lecular.

En 1935, el húngaro Szent-Gyorgyi reunió éstas y otras observaciones en una secuencia de reacciones enzimáticas para la oxidación del succinato:

Succinato ~ fumarato ~ malato ~ oxalacetato

La observación efectuada por Szent-Gyorgyi de que la adición de cantidades. pequeñas de oxalacetato, o de malato, a sus­pensiones de papilla muscular, inducían el consumo de una cantidad de oxígeno mucho mayor que la necesaria para oxidar el ácido .dicarboxílico añadido hasta CO2 y H20, resultó ser de la mayor importancia (tabla 17-1). Este experimento y otros más permitieron concluir a este investigador, que estos ácidos estimulan la oxidación de algún sustrato endógeno del tejido, probablemente el glucógeno y que una molécula de malato o de oxalacetato promueve la oxidación de muchas moléculas del sustrato endógeno.

Algo más tarde los alemanes C. Martius y F. Knoop descu­brieron que el citrato es oxidado enzimáticamente a succinato por los tejidos animales, con la secuencia siguiente:

Citrato ~ a-oxoglutarato ~ succinato

Basándose en estas observaciones, en 1936 Krebs comenzó a est~diar las interrelaciones en el metabolismo oxidante de diversos ácidos dicarboxílicos y tricarboxílicos en suspensiones de papillas de músculo pectoral de paloma, que poseen un ritmo respiratorio muy elevado. De modo especial intentó descifrar la importancia biológica de estos ácidos en la oxida­ción de la glucosa. Las observaciones y razonamientos que

457

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCaÓN DB LA BNERGfA DBL J!NLACB FOSFATO

condujeron a Krebs a postular el ciclo de los ácidos tricar~ boxilicos quedan resumidos en los párrafos siguientes.

1. Krebs señaló. en primer lugar. que las suspensiones de músculo sólo oxidaban a velocidad muy eleVada a algunos ácidos dicarboxilicos. a saber. los ácidos succ:íriico. fumá~ rico. málico, oxalacético y a.-oxoglutárico. y Ünicamente a algunos ácidos tricarboxilicos. a saber. los ácidos cítrico, isocitrico y cis~aconítico (A pH neutro estos ácidos se hallan, por supuesto, en forma" de sus aniones). Otros ácidos orgánicos. por ejemplo el ácido tartárico y el ma~ leico. no son fácilmente oxidados, por el músculo.

2. La oxidación de los glúcidos endógenos o del' piru ... vato añadido por parte de las suspensiones de múscu~ lo, era estimulada catalíticamente no sólo por cantidades pequeñas de succinato, de fumarato, de malato y de oxal .. cetato, según las conclusiones de Szent~Gyorgyi. sino también por el citrato, el ds~aconitato. el isocitrato y el a.-oxoglutarato. '

3. El malonato (lig. 17-4; pág. 204) inhibía completamente la estimulación de la oxidación del piruvato por cualqúiera de los ácidos dicarboxílicos y tricarboxíÍicos catalíticamen~ te activos. citados anteriormente. Dadoque'eJ malonato es un inhibidor competitivo específico' de la sucd,nato~ deshidrogenasa (pág. 204 ) Y no inhibe a las déshidiogena~ sasque atacan a los otros ácidos dicarboxjlicos y tricarb9~ xilicós. Krebs lleg6a la conclusión de que la oxidación del succinato a fumarato por la succinato~deshidrogenasa d~ bia constituir un eslabón esencial en una cadena de reac~ ciones qUe implica a todos 'los ácidos tricarboxílicos y dicarboxiliCoscapaces de 'estimularla oxidación del piru~ vato. (En este punto resulta conveniente acudir a la figu~ ra 17~5).

4. Al incubarse oxalacetato y piruvaio con una suspenSión de músculo en condiciones anaeróbicas. se formaba citrato. Krebs postuló que la condensadóndel pi1'llvato y del oxalaCétato para formar citrato, era el eslabón de unión q"e faltaba. mediante el cual las diversas rtacctOtlesenzi~ mAticas conocidas de los ácidos tricarboxilicos ydicaJ:~ boxílicos podíátl disponerse formando una secuencia dcJica (fig. 17;.5). Los siguientes expmmerttossometieron ésta hipótesis a una comprobación crítica.

5. Al añadir malonato a las suspensiones de músculo para bloquear la succinat~deshidrogenasa,' Krebs vio que se acumulaba succinato cuantitativamente como' consecuencia de la oxidación del citrato. del isocitrato, del cis~aconitato o del a.-oxoglutarato. añadidos. tal como podría esperarse de la formulación ctclica que aparece en la figma 17 ~5.

6. Además. en el músculo intoxicado por malonato, la ()xf ... dación del fumarato, del malato o del oxalacetato, amdu~ da también a la acumulaciÓll, cuantitativa de sUCéinato. Esta importante observaciÓllestableció claramente que

. d~ exiStir una ruta para la conversión medianteoxida~ ción del fumarato en succinato yen la que no intemene la Sll(dnato-deshidrogenasa. Esta. observaciones "propor .. doQaban, por tanto, una sólida,base a la hipótesisdeXrebs ;, -'''H,.l. existenciiuie una !Uta desde el fumarato al8UC.c::i~ ,nat(), pasando por el oxalacetato yel citrato. estableciendo que- la secuencia.global de: la reacción era clclica.

458

FIGURA 17-4 El malonato, inhibidor competitivo de la &uccinato-cleslúchogenua (vilue también fig. 8~11, pág. 206). Obséwe&e la semejanza de estructura entre el malonato 9 el succinato.

FIGURA 17~S

coo­I ?Hz eco-

Malonato

rOO­?Hz rHt coo-

Succinato

Posición tkl bloqueo por malonato. Cuando la &uccinato-dahidrogena&a, se halla bloqueada la oxidación del citrato, del cis-aconitato, del iIocitrato o del a-oxoglutarato conduce a la acumulación de &UCcinato. La inhibición por malonato' bloquea también la acción inver.sa de la &UC~~idtogena.sa. Dado que el fumarato' se convierte, en .sucCtnato en presencia de malonato. Kreb.s po.stuló que "el oxalacetato. producto final de oxidación del fll17UU"ato. reacciona con el piravato para formar citrato, que es ún precUl'~r del succinato.

._--Citrato

1 ci.s~Aconitato

ea. 1 Isocitrato

Piruvato 1 a..oxoglutarato

1 SucclaáfO','

'," ,,~i:¡'lnatn- + ,.~:<l"',~,, " '-:~idí<igcnasa 'fnliibldon, pot

,,' ~ ,'" el~nat<>

I

Malato '

1 OxaJacetato

7. ~- ~:b.h'_)"_I,,~_ del piruvat~-~d .• __ gada o superada alelevát En estas c:ondkiones,por cada sumida desaparecía uoa molécula . este descubrimiento del modo SiguieJlltei1' inhibido. una molécula de oxalaeetato separación por oxidación de muchas de tal· comO podl'íaesperal'Se si el oxalacetato se re'laJc cada vuelta .·da· <:ido.Sin embargo. cuando el ciclo esU en~ por dmalonato. el oxalacetato ya no puede tege:nerarse •. Ea :;estas-circtmstancias se necesita una mo.­lécula de oxalacetato para eliminar a cada una de las mo.­léculasde. piruvatolormando . citrato. el cuales oxidado . a sticcinato. Bn el músculo intoxicado por el malonato tiwea lugar la siguiwe reacción global:

Fumarato + piruvato + 202 --+> succinato + 3_C~ + 2H¡O

8; Krebs demostró que. todas las reacciones enzimáticas indi~ viduales.del,ciclo~tulado tKnen lugar:a una velocidad lo . suficientemente ele\'ada-como para dar cuenta ·de la

'velocidad-totaldelempleodelpiruvato y deloxígeoo por , ¡ parte del tejido. Por tanto. llegó a la conclusión de que

esta· serie ,deJreacciones es·la principal. si no la única ruta de oxidáción del piruvato en el músculo; .

A partir . de· todos . estos . .experimentos. y < r&Zonamien~

tos;~Krebs postuló 10 que él denominó ciclo del ácido dtl'ico como la principal ,ruta de ox«lación,de los: glúcidos. en el músculo. Debido a que durante algunos años existió la incer~ tidumbre acerca de si era el ácido cítrico. el' primer ácido tricitrboxilico·formaao en la condensación del piruvato y del oxalaeeto elnomlll'e del. ciclo se cambió por el de ciclo del ácido tricarboxílico. Luego resultó que el ácido dtrico es en realidad elp.l'im.et» ,que Se forma, pero hubieron de. transcurrir más;de.<Uez4ñ(,)S·Qtfs' de que se pudiera probar. de modo concluyente. Actqalmentese emple,anindistintaraente.1as deno.­minaciouescle «ciclo. de los ácidos tricarboxílicos:. y «ciclo del ácido cítrico:..

tOCalizacl6n· Ílit.-ácetular de los· enzimas defdclo 'de b ácld08tticarboXílícos

En 1948.B. P. K-ennedy y A.L.Lehningerdescubrieron que lasmitocondrias aisladas (pág. 524)., obtenidas de homogenei .. zados d~ hígado . de. rata por centrifugaci6n ·diferencial (pági .. na.39O) y suspwdidas en un medio tamponado de fosfatos que conteníanucleótidos- de adenina. y Mg2+. catalizaban la oxidación del piruvato y. todos los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos a expensas del oxígeno molecular. Las velocidades globales de consumo del oxígeno y de utili .. zación del piruvato por. parte de las mitocondrias hepáticas aisladas respondía a la velocidad de respiración de la célula hepática intacta. Por otra parte, los núcleos. los microsomas y la fracción soluble del citoplasma (pág. 390) se mostraban inactivos. Las mitocondrias hepáticas contienen. por tanto.

459

iWtTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA BNBRGfA DBLBNLACE POSPATO

todos los enzimas necesarios para el cido de los ácidos tricar~ ooxílicos, así como todos los componentes necesarios para el transporte electrónico. En todas las células animales y vege~ tales examinadas hasta la fecha, las mitocondrias son preci~ samente el lugar donde se localizan las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Las reacciones enzimáticas del ciclo de los ácidos triearbo~ xílicos tienen lugar dentro del compartimiento interno de la mitocondria (págs. 521 y 539). Algunos de los enzimas del ciclo aparecen en la matriz soluble del compartimiento interno, mientras que otros se hallan ligados a la membrana mitocon~ drial .interna (págs. 500 y 521) Y no se extraen con facilidad en forma soluble. Algunos de los enzimas del cido de los ácidos tricarboxílicos, en particular la aconitasa~hidratasa, la isocitrato~deshidrogenasa específica para el NADP, la fuma~ rasa y la malat~deshidrogenasa (págs. 492) se encuentran también en el citosol de algunos tejidos.

Oxidación del piruvato a aceti1~CoA

Después de la postulación del ciclo en 1931, la ruta precisa de formación del citrato a partirdelpiruvatoy del oxalacetato se convirtió en el principal objeto de toda investigación. Pero hasta los años 1948~1950 no se resolvió el·problema. En pri~ mer lugar, elpiruvato se oxida, con pérdida de C~ a acetil~ CoA, que reacciona después enzimáticamente. con el oxalace~ tato para formar citrato.

La oxidación del piruvato a acetil~CoA, catalizada por el complejo de Z. pimpatCMJeshidrogenasa es un proceso muy complicado .ctlyJN.detalles fueron desvelados por L. J. Reed y sus colaboradores. La ecuación global es:

Piruvato + NAO+ + CoA---+ acetil~CoA + NADH + H+ + CO2

AG'" = - 8,0 kcal mol-1

Esta reacción, que es irreversible en los tejidos animales; no fotnla parte por sí misma del ciclo de los 6<:idos tricarboxilicos, pero constitu~ un paso obligado para la incorporación de todos los glúcidos (por la vía del piruvato)al ciclo de los 6cidos tricarboxilicos.

La descarboxilación oxidante del piruvato a acetil~CoA y CCh precisa de tres enzimas diferentes y de cinco coenzimas distintos, que se hallan organizados en un complejo multieli .. zimático. Las etapas de reacción promovidas por este complejo están esquematizadas en la figura 16 .. 1. La etapa les Ia'cat~ lizada por la piruvato-deshidmgenasa. cuyo grupo prostético, es el coenzima pirofosfato de tiamina (pág. 343). El piruvato experimenta descarboxilaciÓD para dar -C0:z y el a .. hidroxietil~ derivado del anillo tiazólico del pirof.osfato de tiamina (pági .. na 344), según una reacción que es idéntica o semejante a la implicada en la descarboxilación no oxidante . del piruvato. durante la fermentación alcohólica (pág. 448). En; la etapa 11,

. el grupohidroxietilo es deshidrogenadomientras 1Jue el grupo acetilo resultante es transferido al átomo de azufre situado sobre el átomo de carbono 6 del ácido lipoico (pág. 353), que constituye el grupo prostético unido covalentemente del segun .. do. enzima del co~plejo, la dihidrolipoil~ .. tratUacetilasa (nom~

FIGURA 17-6 Etapas en la oxidación del piruvato a acetil..coA por el complejo de la piruvsto. deshidrogenasa; las transformaciones del piruvato se señalan en color. La estructura dél pirofosfato de tiamina y de su derivado hidroxietilico aparecen en la figura 13·1 (pág. 344).

Etapa 1

E¡-TPP

+ CHaCOCOOH

f-.Co, . E¡-TPP-CHOH--GIi:J

EtapaJl E¡-TPP-GHOlf-'--CHa

+

Ea-('¡ s-s

1 E,-TPP

+

Capitúlo17 Ciclo de los· ácidos tricarboxilicos y ruta del fos/ogluconato

Clave: E¡ = Piru"at~idrogenasa

TPP = Pirofosfato de tiamina TPP-CHOH-CH. = Pir%sEato ele a.hidroxietil.tiamina

E. "" Dihidrolipoil.transacetilasa Ea = Dihidrolipoil.deshidrogenasa

Etapa III Etapa IV

Ea-('¡ E¡-('¡ S SH SH SH I

C-CHa 11

+ O Ea-FAD

+ 1 CoA-SH

.Ea-('¡ 1 s-s

Ea-('¡ +

SH SH Ea-FADH•

+

CHaCO- S-CoA Etapa V

E,-FADH.

+

NAD+

1 Ea-FAD

+

NADH+H+

bre oficial, lipoato.-ácetü~transferasa). La transferencia de un par de átomos de hidrógeno (o de los electrones equivalentes) desde el grupo hidroxietil del piro fosfato de tiamina al. enlace disulfuro del ácido lipoico convierte a éste en su forma redu~ cida, o ditiol, que es el ácido dihidrolipoico (pág. 353). En la etapa 111, el grupo acetilo es transferido enzimáticamente des~ de el grupo lipoilo del ácido dihidrolipoico al grupo tiol del coenzima A; el acetíl coenzima A, así formado abandona en~ tonces el complejo enzimático en forma libre. En la etapa IV, la formaditiol del grupo lipoilo de la dihidrolipoil ... transace~ tilasa se reoxida a su forma disulfuro por transferencia de átomos de hidrógeno al tercer enzima del complejo, conocido habitualmente como dihidrolipoil.-deshidrogenasa (nombre ofi~ cíal, lipoamida...aeshidrogenasli), cuyo grupo prostético redu~ cible se halla estrechamente unido al f1avín-adenín~dinucleó~ tido (FAD) (pág. 346). El FADH2 resultante, que permanece unido al enzima es reoxidado en la etapa V, por el NAD+ con formación de NADH (fig. 17~6).

El complejo de la piruvato-deshidrogenasa de las mitocon~ drias de corazón y de riñón posee un peso de partícula de unos 7 millones, y está constituido por un icosaedro, poliedro de 20 caras. Contiene un núcleo de dihidrolipoiI~transacetilasa,

461

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGlA DBL ENLACE FosPATO

al que se hallan ligadas moléculas de piruvato~deshidrogenasa y de dihidrolipoil~deshidrogenasa. El núcleo (Pm 3,1 millones) está constituido por 60 cadenas polipeptidicas idénticas,· cada una de las cuales contiene una molécula de áciclo lipoico uni4a covalentemente. Ligadas al núcleo se hallan 20 moléculas de piruvat~deshidrogenasa· (Pm 154000) í así couío cinco o seis moléculas de dihidrolipoil~eshidrogenasa (Pm 110000). Tam .. bién se hallan firmemente unidas al núcleo de la dihidrolipoil .. transacetilasa cinco moléculas de pimvato-<lesbidrggenasa .. quinasa (Pm ::::::: 62000). Y más débilmente unidas hay varias moléculas de piruvato..cJeshidrogenasa .. fosfatasa ~Pm lOO.ooo). Los últimos dos enzimas desempeiian un papel regulador; su función se describirá más adelante. El complejo de la piruva~ deshidrogenasa· se halla localizado eJi la matriz mitocondrial.

En las células de E. coli el complejo de la piruvato.-deshi~ drogenasa puede tener una composición algo· diferente; en la figura 17 .. 7 puede verse una microfotograEia electrónica del complejo enzimático en E. coli. .

En el· complejo de la piruvato~deshidrogenasa, la prolonga~ da cadena lateral lipoil~lisilo de la dihidrolipoil~transacetilasa actúa como un ebrazo oscilante:. para transferir el grupo hidro;.. xietilo desde el pirofosfato de tiamina unido·a la" piruvato­deshidrogenasa hasta el centro activo de ladihidrolipoil .. transacetilasa, en donde se oxida -el grupo hidrexietilo. El grupo acetilo tesultante es transferido" después de nuevo por intervención del brazo oscilante al centro activo de la dihifho.. lipoil~deshidrogenasa (fig. 17 .. 8).

El complejo de la piruvat~deshidrogenasa es caracteristi~

FIGURA 17~8 Papel del grupo lipoil-li&ilo en el complejo de la piruvato-dahidrogena&a. La prolongada cadena lateral de lipoil~li&üo de la dihidrolipÓil-traTl&acetUB&tJ (&) actúa como brazo OlICUante para transferir electrones desde la piruvato-deshidrogena&a (El) a la dihidrolipoil-deshidrogena&a (E,) así como para traTl&ferir el grupo acetilo desde El al coenzima A. "

462

Vista superior

Vista lateral

FIGURA 17~9

Reacción de la citrst~sintua. 1.0& álomos de carbono que proceden del Bcetil-CoA se muestran en colot.

O=C-S-CoA I Acetil-CoA ~

+

O n C-COOH

Ácido oxalacético I ~ COOH

1l O=C-S-CoA

I F Citroil-CoA

HO-C-COOH (intermediario ligado I al enzima)

~ COOH

lr~o yOOH

yR. HO-C-COOH Ácido cítrico

I ~ COOH

+ CoASH

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricatboxilicos y ruta del fosfogluconsto

camente inhibido por "los arsenicales trivalentes tales como el arsenito. que reacciona con amboa grupos tiol del grupo dihi~ drolipoil de la transacetilasa formando derivados arsenicales ciclicos inactivos.

La actividad del complejo de la piruvato deshidrogenasa viene regulada por el nivel de ATP y de iones Ca2+. La incu~ bación del complejo muy purificado con A TP provoca una inhibición que es el resultado de una modificación covalente del complejo por acción de la pif'Uvato-áeshidrogenasa~quin8Sa. Este enzimacataliza la fosforilación dependiente del A TP de una de-las subunidades de la piruvato deshidrogenasa. una reacción que precisa de Mg2+. La deshid~ogenasa fosforilada. resultante ~" catalit-icamente inactiva; se reactiva de nuevo por acción de la pitUríato-desñidrogenasa~fosfatasa, que cataliza la eliminación bidrolíticade los grupos fosfato inhibidores en preseIídade M~. Esta reacción es profundamente estimulada pOr elCA2+. Tantó la [osfstasa como la quinasa se hallan pre~ sentes en el compkjo completo de la piruvato~deshidrogenasa y fURcionaní por tanto. ctomo subunidades reguladoras (pági~ na Z.8:).

-La ·regulatión.·dela -actividad del cómplejo de la piruvato~ deshidrogenasapuedePeS'ttmirsedel modo siguiente. Cuando se acumúlan niveleS elevados de ATP. que es el producto final. de eJevadocontenido energético. del ciclo de los ácidos tricar~ boxílicos y de la fosforilación oxidativa. el complejo de la piruvat~deshidrogenasa interrumpe su actuación al fosfori .... larse por la quinasa. haciendo más lenta la velocidad de for~ mación del acetil~CoA. que es el combustible del ciclo. y por tanto, la subsiguiente formación de A TP. Sin embargo. cuando la concentración d~ AD P es elevada y se dispone de piruvato abundante. el complejo de la piruvato~deshidrogenasa vuelve a actuar, al desfosforilarse la deshidrogenasa inactiva. según una reacción que resulta aumentada por el ion Ca2+.

Ahora podemos proceder yaa describir cuál es el destino del acetil~CoA formado como producto final de la descarboxi~ lación oxidante del piruvato.

Reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos . El ciclo delos·icidos tricarboxílicos. tal como se postuló origi~ nalmente en 1937. constituía sólo un bosquejo; desde entonces­se ha completado con muchos detalles aportados por el estudio de preparaciones muy purificadas de los enzimas que catalizan sus etapas individuales. Además. se ha prestado mucha aten~ ción a la estereoquímica de las reacciones del ciclo. La figura 17 ~2 muestra el ciclo tal como se conoce en la actualidad.

Citrato~sintasa

El ácido cítrico. primer intermediario del ciclo. se forma por condensación del acetil~CoA con el oxalcetato:

Acetil~CoA + oxalacetato + H20 --+ citrato + CoA .o.(]o' = - 7.7 kcal mol-1

La reacción es catalizada por la citrat~sintasa, que fue des~ cubierta y designada por primera vez por S. Ochoa como enzima condensante. Este enzima (Pm 100 000) cataliza una

463

PARTB 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DB LA BNBRGfA DBL BNLACE FOSFATO

condensación aldólica entre el grupo metilo del acetil-CoA y el grupo carbonilo del oxalacetato. con hidrólisis del enlace tioéster y formación de CoA-SH libre (fig. 17-9). Se tiene la impresión de que se forma citroil-CoA como intermediario no disociado en el centro activo: el citroil-CoA sintético es hidro­lizado por el enzima. liberando citrato y CoA.

La reacción de la citrato-sintasa se desplaza mucho en la dirección de formación de citrato debido a la hidrólisis exer­gónica del enlace tioéster. de elevada energía. del citroil-CoA ~Go' = - 7.7 kcal mol-1). La,citrato-sintasa cataliza también la formación de mono{luorocitrato a partir del monofluoro­acetil-CoA. Constituye éste un ejemplo de síntesis letal. ya que el fIuoroacetato no es. por sí mismo tóxico. mientras que el fIuorocitrato es un potente inhibidor de la aconitasa. el siguiente enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

La reacción de la citrato-sintasa es la primera etapa con­dicionante del ritmo del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (pá­gina 475): su velocidad resulta en gran manera determinada por la disponibilidad de acetu-CoA y de oxalacetato. así como por la concentración de succinil-CoA (véase más adelante). que compite con el acetil-CoA. inhibiendo a la citrato-sintasa. Aunque el enzima es también inhibido por el A TP. por el NADH y por los ésteres del CoA y ácidos grasos de cadena larga. no se sabe con certeza si estos efectos poseen alguna significación fisiológica.

Conversión del citrato en isocitrato

El enzima aconitato-hidratasa. llamado más corrientemente aconitasa. cataliza la interconversión reversible del citrato y

PIGURA 17-11 Adición estereoespecifica, en posición transo de los elementos del agua (en color) al ácido cls-aconítico. Los seis átomos centrales de la molécula de ácido cls-aconítico, forman un plano (en color). Los elementos del agua aifadidos lo hacen frente al plano 9 detrás del plano, por dos caminos diferentes, tal como se muestra, para formar ácido cítrico o ácido .fsocítrico. [Adaptado de ,. P. Glusker, en P. [J. &yer (ed.), The Enzymes. vol. 5, pág. 421, Academic Press Inc., Nueva York, 1971J.

I COOH

1 C;:OOH

H,~/OH C

HO--­

(Detrás del plano) I

COOH

1 COOH

H,~"H C

FIGURA 17-10 Reacción de la aconitasa. Los átomos de carb¿no que proceden del acetil-CoA aparecen en color.

COOH I

CH2

I HO-C-COOH

I ~ COOH

~o+~o

COOH

¿H2

I HC-COOH

I HO-CH

I COOH

Ácido cítrico

Acido cis-aconítico (intermediario

ligado al enzima)

Ácido isocítrlCo

I Acido lsocítrico .C.

I Ácido cítrico

H .... i ····COOH

r COOH

464

.C. HO .... l····cOOH

CH,

I COOH

FIGURA 17-12 Mecanismo de la «rueda fetTOsa~, postulada para la aconitasa. Se supone que el cls~accmitlfto se halla unido al enzima, designado por E. por tres puntos y al átomo esencial de Fe(I1) (en color) en el mismo centro activo. El plano del doble enlace del cis~aconitato (véase fig. 17~11)

se muestra mediante líneas de trazos que circundan el área coloreada. La adición de OH por la parte superior por un giro parcial de la rueda ferrosa, y de H de la parte inferior, conduce al citrato, mientras que la adición de OH por la parte

" inferior (flecha punteada) y de H por la parte superior, después de un giro parcial de la rueda en dirección opuesta, conduce a la formación de isocitrato. La hipótesis deriva de los resultados obtenidos por análisis de rayos X de los complejos de Fe(II) de los ácidos tricarboxílicos. [Adaptado de l. P. Glus/cer, en P. D. Boyer (ed~), The Enzymes. vol. 5, pág. 434, Academic Press Inc" Nueva York, 1971].

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y ruta del fosfogluconato

Complejo citrato~Fe(II) ~

enzima

cis-Aconitato

II

II cis~Aconitato

E

} Grupo ~ de hidrógeno

II Complejo

isocitrat~Fe(II) -enzima

E"--GrUpo separador de hidrógeno

465

PARTE 2 CATABOLISMO y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSPATO

del isocitrato, pasando por el intermediario cis~aconitato unido al enzima (fig. 17~1O):

Citrato ~ [cis~aconitato] ~ isocitrato

La mezcla en equilibrio, a pH 7,4 Y 25 oC, contiene aproxi~ madamente un 93 % de citrato y solamente un 7.% de isoci~ trato. Sin embargo, el isocitrato se oxida muy rápidamente en la etapa siguiente del ciclo, impulsando de este modo la reac~ ción de la aconitasa hacia la formación de isocitrato. La aco~ nitasa contiene Fe (11) y precisa de un tiol como la cisteína o el glutatión reducido (pág. 726). El enzima cataliza la adi~ ción reversible de H20 al doble enlace del ácido cis~aconítico, en dos direcciones, una conducente al ácido cítrico, y la otra hacia el ácido isocítrico. El cis~aconitato actúa, normalmente, como un intermediario ligado al enzima: abandona el centro activo, con mucha lentitud. 'M~diante experimentos inteligen~ temente planteados ~ediante ,susUcúOs marcados con deuterio, ha podido deducirse que el H~ y el OH- siempre verifican su adición al doble enlace del cis~aconitato en posición trans uno respecto del otro (fig. 17~11), tanto en la formación del citrato como en la del isocitrato. La estereOc:júfmica:'de la acción de la aconitasa se detalla ulteriormente' en la' fi9iÜ:a mencionada.

El mecanismo de la reacción de ·la aconitasa ha átraído mucho la atención debido a que el ion Fe(II), del que se sabe que forma un quelato complejo estable con el ácido cítrico, es necesario para la acción del enzima. En la figura 17 ~ 12 se muestra gráficamente la hipótesis de la «rueda ferrosa» para la acción de la aconitasa.

La aconitasa se halla presente en los tejidos animales en dos formas isoenzimáticas,yna en las mitocondrias y la otra en la fracción citosol. .

Oxidación del isocitrato a a~oxoglutarato

La oxidación del isocitrato a «..oxoglutarato (fig. 1 7 ~ 13 ), re~ viste especial interés debido a s,! Poco corriente historia expe~ rimentaI. La mayor parte de los' microorganismos y de los tejidos de los animales y plantas superioreS, contienen dos. tipos de isocitrato~deshidrogenasa. Durante muchos años ha existido controversia' sobre cuál ~. ellos es el responsable de la oxidación del isocitrato a a~oxoglutarato en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Uno de los tipos de isocitrato~deshi~ drogenasa depende del NAO+ como aceptor electrónico, y el otro del NAOP+ (págs. 348 y 491). Las reacciones globales catalizadas por ambos tipos de isocitrat()~deshidrogenasa son idénticas:

Isocitrato + NAO+ (NAOP+) ~ a~oxoglutarato + CO;z + NAOH (NAOPH) + H+

AGo' = - 5,0 kcal mol-1

Tanto las isocitrato~deshidrogenasas dependientes del NAD+ como las que dependén del NAOP+, se encuentran en las mitocondrias de los tejidos animales, pero ras primeras se hallan, solamente" en las mitocondrias, mientras que las últi~ nÍas están presentes tanto en las mitocondrias como en el citosol. Todo 10 que sabemos hasta ahora parece indicar que

466

FIGURA 17-13 Oxidación del isocitrato a a-oxoglutarato. Se cree que el oxalsuccinafo (entre corchetes) es un intermediario unido al enzima.

e 00-I

GH. I

HG-GOO-I

HO-GH j coa-y-NAD+

Isocitrato

t--NADH+ H+

GOO­I f2

liC-COO­I

O=C I COO-

. COO­I

CH. I C~ I

O=C I COO-

Oxalsucclnato (I,gado al enzima)

a-Oxoglutarato

FIGURA~ 17-14 Bstimulación· alostéríca de la i&ocitrato­deshidrogenasa por el ADP. El incremento de las concentraciones de ADP provoca la disminución del valor de la K" aparente. sin que varíe la V -. activando así al 1nzima cuando la concentración del sustrato es baja.

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tticarboxílicos y ruta del fosfogluconato

Isocltrato

I I Las lineas perpendicu~ I lares muestran las I concentraciones de, r Isocitrato que prodliéeft Ila mitad de la·' I veloctdad máxima

la isocitrato~deshidrogenáSa NAD ... dependiente es el cátalÍ; za.,dor' pr~jpal para la o~idaci<ln del 'isocitrato en el ~. los· áctdos,tricarboJl:ílicos. Esta distinción entre las isoci~, deshickogénasas eSpecincaspara el NAO y para el.N~ permaneció oScura durante mucho tiempo debido a que el enzima NAD~dependiente es un enzima alostérico quepr~, de AOP como modulador activamente específico. Hasta 'el descubriu;tiento. del ekct,o estimulante del AOP se creyó que la déshidrogenaSa NAD~dependiente. tal como se medía ~ los- exttá~tos Dlitocondriales. poseía una actividad débil y., explicaba. la, elevéilda velocidad a la que se sabía que se oxb <W>a el iIoc~'ªto. .

I..a. .isocitrato-deshidrogenasa .especifica del NAD de las , ~ tocondrias: p~~de Mg2+. para su as,:tividad: ~ . subun¡d~ ¡dén~, y ,un ,p~ molecular de alrededor~,., 380.000. f.a. . r. eacc. i6nt~a~.· curre ~on un gran decrement~1i AG"" . debido a la pérdida . 8imultá~a del gntpo ~~carbo4 al f()J:~ ae C(4 qtte es un proceso muyexergónico • .,· po$ible que el oxa19succinato sea un intermediario ligado' ~nzima en esta reaccit)n (Hg. 17~13). Cuando la isocit. deshidrogenasa NAD~específica de los tejidos animales.« estimulada por el ADP. este qltimo no experimenta alteraci1l enzim.ática y puede recuperarse de nuevo al final de la re" ción .. El. enzima· no es activado por ningún otro nudeósidi 5'",difosfato (aexéepción dd dADP). ni por el AMP 0«: ATP. 4 naturaleza.alosiérica del enzima se deduce tambUí~ de su cinética de reacción característica. La figura 17 ~ 14 muesl; tra una representación de la velocidad frente a la concentr'¡ ción de. isocitrato . del enzima de hígado de rata en función la ',concentración de ADP. En experiencias análogas se encontrado que al aumentar la concentración de ADP. se i Crementa también la afinidad aparente del enzima por . NAD+. Por otra parte, la isocitratodeshidrogenasa es fuert . mente inhibida por los moduladores negativos NADH y AT . En cualquier condición metabólica en la que aumente la co centración del ADPen la célula. probablemente debido velocidad de. degradación excesivamente elevada del A TP las reacciones que consumen energía. se produce un incr . mento de lavelqcidad de oxidación del isocitrato. A medid~ que aumenta d~ nuevo la concentración de ATP en la célula~ la de AOP debe disminuir. cambio que tiende a interrumpir la actuación de la isocitrato~deshidrogenasa. Además. cualquier

467

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSPATO

acumulación de NADH en las mitocondrias interrumpe tam~ bién la oxidación del isocitrato. La isocitrato~deshidrogenasa no es la etapa primaria limitante de la velocidad en el ciclo, en la mayoría de condiciones; sin embargo, puede estar impli~ cada en un papel regulador secundario.

La reacción de la isocitrato~deshidrogenasa NAD~depen~ diente es estereoespecífica para uno de los cuatro estereoisó~ meros posibles del isocitrato, a saber, el treo~D.-isocitrato, así como para el NAD+, ya que el enzima transfiere un átomo de hidrógeno desde el isocitrato a uno de los lados del anillo de nicotinamida del NAD+, es decir, al lado A (pág. 493).

La isocitrato~deshidrogenasa ligada al NADP puede en ciertas circunstancias, participar en la oxidación del isocitrato en las mitocondrias; no se trata de un enzima alostérico.

Oxidación del a~oxoglutarato a succinil~CoA

La o:Jtidación del a~xoglutarato a succinil-CoA, que es biol6~ gicamente irreversible en las células animales, es efectuada por el complejo de la a~oxoglutarato..cIeshidrogenasa:

a~Oxo9lutarato + NAD+ + CoA ~ succinil~CoA + COz + NADH + H+

AGo' = - 8,0 kcal mor!

Esta reacción es análoga a la oxidación del piruvato a acetil­CoA (pág. 460) y se produce por el mismo mecanismo; parti~ cipan como coenzimas el piro fosfato de tiamina, el ácido lipoico, el CoA. el PAD y el NAD+. El complejo de la a~oxoglutarato- . deshidrogenasa es muy semejante en estructura y propiedades al comp~ de la piruvato~deshidrogenasa (pág. 460); se ha aislado de tejidos animales y de E. coli: el de eSta última procedencia posee un peso de partícula de 2,1 X 10' daltons.

El producto de la etapa de oxidación dela~xoglutarato es el succinil~CoA, tioéster de uno de los earhoxilos del ácido succínieo, de elevado contenido energético.

Desacilación del succinil~CoA

El succinil~CoA experimenta la pérdida de su grupo CoA. no por una simple hidrólisis sino en una reacción de conser~ vación de la energía, con el difosfato de guanosina (GDP) yel fosfato:

Succinil~CoA + Pi + GDP ~ suconato + GTP + CoA~SH AGo' = - 0,7 kcal mol-J

El enzima que cata liza esta reacción, la succinil~CoA~sinteta~ sa, provoca la formación de un enlace fosfato de elevado con~ teIlido energético en el GTP, él partir del GDP y del Pi ya expensas del enlace tioéster de elevada energía del succinil~ CoA (Hg. 17~15). El enzima de los tejidos animales es espe~ cífico para el GDP como aceptor de fosfato; el procedente de E. coli utiliza al ADP. Los estudios efectuados por P. D. Boyer y sus colaboradores han demostrado que se for.­ma un fosfoenzima covalente como etapa intermedia de la reacción. Un resto de histidina de la proteína enzimática se fosforila al incubar el enzima con 32p¡, succinil~CoA y Mg2+

468

FIGURA 17-15 Desacilación del succinil-CoA.

coo-I rH,

~ Succinil-CoA

o=c I S-CoA

+ PI

+ GDP

1l yoo-F Succinato CH, I

Coa--

+ GTP

+ CoA-SH

\

FIGURA 17-16 &tructura de la J-Iosfohistidina.

?OOH litN-CH

~ I H F

0- C=C I /4 5 \

0-P-N~2).N I c 0- H

FlGUJ¡A 17-17 Deshidrogenación del succinBto. E repre­senta a la proteína succinBto­deshidrogenasa.

coa-I F Succinato

~ Coa-

+ E-FAD

1l Coa-I CH

11 Fumarato HC

I coa-+ E-FADlit

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y ruta del losfogluconato

en ausencia de, GDP O con GTP marcado con .up en ausen .. cia de succinato. Se cree que el resto J;.fosfohistidina (figu .. ra 17 .. 16) cede su grupo fosfato al GDP en la última etapa de la reacción global. J!stos y otros datos sugieren la se .. cuencia siguiente, en la que E representa a la proteína enzi .. mática:

Succinil .. CoA + Pi + E ~ E-succinil .. fosfato + CoA E .. succinil .. fosfato ~ E ¡ooJ P + succinato

E--- P + GDP ~ GTP

En esta formulación se postula que el fosfato de succioilo, anhídrido mixto de los ácidos succinico y fosfórico se forma sobre el centro activo, transfiriendo su grupo fosfato a la posición 3 del anillo imidazólico de un resto de histidina del enzima. El fosfatóde succinilo unido al enzima no se inter .. cambia con facilidad con el fosfato de succinilo libre adi .. cionadó.

El GTP formado en esta reacción: cede a continuación su grupo fosfato terminal 'al ADP para formar ATP en la reac .. ción de la nucleósido .. difosEato .. quinasa (pág. 420):

GTP + ADP ~ GDP + ATP

El GTP y el ADP poseen, aproximadamente, la misma ener .. gía libre estándar de hidrólisis.

La formación de GTP (o de A TP) acoplada a la desaci1a .. ción delsuccinil .. CoA recibe el nombre de fosforoación a nivel de sustrato, para distinguirla de la fosforilacián ligada a la cadena respiratoria (pág. 525). La formación de ATP acoplada a la oxidación del 3 .. fosfogliceraldehído durante la glucólisis constituye otro ejemplo de fosforilacióna' .nivel de sustrato. La formación .de GTP durante la oxidación del a.-oxoglutaratoa $uccinato no es inhibida por el 2,4-dinitrofe .. nol, agente desacoplante característico de, la fosforilación oxi .. dativa (pág. 529).

El succinil .. CoA puede desacilarse a succinato mediante ottas reacciones importantes en funciones auxiliares del ciclo de los ácidostricarboxílicos, que 'Se describen en otros luga .. res (págs. 567 y 731). Obsérvese en la figura 17 .. 2 que el succinato resultante de la reacción de la a .. oxoglutarato .. des .. hidrogenasa contiene átomos de carbono procedentes del ace .. til .. CoA in<:orporado al ciclo.

Succinato .. deshidrogenasa

El succinato es oxidado a fumarato (fig. 17 .. 17) por la succi .. nato-deshidrogenasa. una flavoproteína que contiene flavín .. adenín .. dinucle6tidounido covalentemente (pág. 346). Este enzima, que se halla unido íntimamente a la membrana mito .. condrial interna, es muy difícil de extraer de la membrana en forma soluble. Se han necesitado muchos años de investiga .. ción intensa para analizar su composición, sus propiedades y su mecanismo. Su coenzima reducible, el FAD, actúa como un aceptor de hidrógeno en la reacción

Succinato + E-FAD ~ fumarato + E-FADH2

El enzima reducido puede ceder electrones a diversos acepto .. res electrónicos artificiales, por ejemplo colorantes reducibles:

PÁRTE 2 CATABOUSMO y PROOUCClÓN Da LA ENERGiA-DIIL' ENLACE POSPATO

no se conoce con certidumbre' el aceptor- electroruconormal. Más adelante se describen otras propiedades debta y otras flavín-deshidrogenasas (págs .. 496 y 499).

Tal como aparece después de extraída de las' mitocondrias de corazón de buey con disoluciones de percloratosódico, q\le altera la estructura de los enlaces de hidrógeno·· del agua •. la succinato-deshidrogenasa posee un peso molecular de alre­dedor de 100 000, Y contiene una molécula dePAD,ocho átomos de hierro y ocho átomos de azufre lábiles frente a los ácidos. El enzima muy purificado posee dos subunidades, cuyos pesos moleculares son 30 000 y 70 000, respectivamente. La subunidad mayor de la succinato-deshidrogenasa contiene PAD (págs. 346. y 196), cuatro ·átomos de hierro y.cuatro átomos de azufre ácido-lábiles. La subunidad menor es una suIfo-ferro-proteína (pág. 499) que contiene cuatro átomos de hierro y cuatro átomos de azufre ácido-lábiles. El F AD está unido covalentemente. pudiendo liberarse pordigesti6n triptiCa de la subunidad mayor. El PAD se halla unido a través ~el grupo metilo ~ posición 8 de la riboflavin,a al nitrógeno en Posici6n 3 del anillo imidazólico de un r~todehisudlna de la proteína. Se ha establecido la secuencia aminoacida . de un péptido tríptico de 23 restos que contiene el PAD. Probable­mente los átomos de hierro de ambas subunidades de la succi­nato<-deshidtogenasa experimentan cambios· de'~IendaEe(1I) .. Fe(III) durante la transferencia el«tr6nicadesde ·e}-sueéinato aJa cadena respiratoria. Se sabe. q\ie derto nútnero-de ferro­sulfo--proteinas ~ actúan en las reacciottes de -transferencia eleci­tr6nica (pág. 499).

La estereoquímica de la eliminación delos"átomos- de hidró­geno del-succinato por la suc:cinato-dtshidrogenasa. kasidó detalladamente. estudiada. Una clave importante ,ha ~ del análisis de la acción del enzima sobre.el veloresucdnato. al .que deshidrogena.ydel D-clorosucciAato,queno' ,resulta afectado por él. A partir ·deeste hecho.~áSi como de experi­mentos isotópicos con deuterio eH) como trazador. se ha lltgado a la . conclusión de que la- deshidtogenasa .separ-aáto­mos de hidrógeno que se haUan en posición trans- de los átomos de carbono metilénkos del sU€cinatotfig.-17-J8).

La succinato-deshidrogenasa posee algunos d~closatributos de un enzima aIOstéric<r.· esaétivada 'por elsucanato; el fas..; fato, elATP y el ~oenzima Q teducld&.(pig¡:50-3)¡Ye&inhi .. bida por concentraciones muy bajas de oxa1~-etato:(pág.2()7). Sin embargo. no es cierto que estos efectos intervengan en el establecimiento de la velocidad global del.ciclo de lqs 4cidos tricarboxílicos. ya que la actividad de la sucdnato-deshidro .. genasa mitocondrial es. generalmente, mucho mayor que la actividad de los demás enzimas del odo.·· y mayor también que la actividad de lácadena de transporte ekctrónico. -Este problema Se estudia de nuevo más adeJante{pág. 475). ',.

Hidratación del. fr¡,marato

La hidratación reversible del fumaratos L-málato 'es catali­zada por el enzima fumarato-hidratasa. conocido'máS corrien­temente por fumarasá:

Fumuat-o-+H~ ;:: v-ma1ato

FIGURA 17-18

Bstereoquímica de la reacción de la succinato-deshidrogenasa.

Fórmula de proyeéción del ácido succínico. Los carbonos equivalentes van señalados con asteriscos y círculos. La succinato deshidrogenasa separa bien los dos átomos de hidrógeno [B] • o los dos señalados por (jj a velocidades iguales. (Modificado de W. L. Alworth. Stereochemistry and its Application in Biochemistry. pág. 13. Interscience Publishers. a division 01 'ohn Wiley éJ Sonso Inc. Nueva York. 1973).

ti

COOH

. COOH *

Vista desde un extremo del ácido succínico. La deshidrogenasa separa. bien los dos fE! o los dos <3 . para producir las dos formas del ácido lumárico que aparecen más abajo. Los cuatro enlaces simples que se extienden desde el doble enlace central carbono-carbono. descansan en un mismo plano.

:$! COOH

Ácido sticcinloo (conformé;lción

alternada)

1 deshidrogenaci6n 'trans .

COOH COOH

I \ Acido fumá.ricO (vista de perfil

. de las dos formas H resultantes)

COOH COOH

Vista frontal que muestra la planarldad del ácido fumárico

,. FIGURA 17-19 Bstereoquímica de la reacción de la fum8la8a. Ú>$ grupos 0- g 00- del óxido de deuterio (~o) ae a¡xoximan al doble enlace del ácülo fumárico, cugO& cuatro &U&títuyentu ae hallan en el plano de la página: la aproJRmlición Be efectúa por 1&1 partu pa&terior Y delantera del plano. rapectivamente. Dado que '&0· se forma un. utereoUómero, el grupo.-OO puede adicionarse solamente a uno de 10& lados del doble enlace para dar el estereoisómero mostrado.

" Vista frontal. El plano de la molécula de ácido fumárico es perpendicular a la . línea de visión.

Vista de perfil, ~n el plano de la molécula de ácido fumárlco casi paralelo a la línea . ~ visión.

Britro-3-monodeutero-L-malato. BI deuterio entrante, en forma de -oo. se intercambia con los iones hidrógeno del medio; el deuterio unido al carbono es estable.

HO-C-H

I D_C_H

COO-

EBteenzima se ha obtenido ..al. fotma cristalizada a partir de corazón. c!e;eerdo •. La reacción el libremente reversible in vivo. La fumarasa posee un 'peso molecular de alrededor de 200 000, y coatiene cuatro subunidades,.cadenas polipeptídicas. que soa inactivas 'Separadamente: no precisa de niniJún coenzima .. SI A TP disminuye la·afinidad aparente del alzima por el (uro. rato. ·A1Suaos.importantes métodoaexperimentales y matelJlá,. ticQS .. ~ .el anAlisis de la cinética enzimática surgieron del estudio· de los factores que afectan a la velocidad de la adil­vidad de la fumarasa. ~.

La fumar~ actdatambién estereoespecificamente,ya qu f.ol'lXl8 (y deshidrata) únicamente al L-estereoisómero del ma!" lato. Los estudios estereoquímicos sobre el mecanismo, utiJi.. ~and(), agua marcada con deuterio, han revelado que la f~ rasa cata1i.zala adición en trans de H - y de - OH al doble enlace del, fumarato. Aunque el fumarato, es una molécula simétr4ca .. el grupo -OH puede adicionarse solamente a un lado del doble enlace, para rendir el L~estereoisómero del m .... 1atQ,(fig.17~19).

Oxid8k:iÓfi fkli malSto a oxalacetato

E1'1ta ultima reacci6n del ciclo, la L-malato deshidrogenasa NA,J) ... dependiénte clitaliza la oxidación del L-malato a oxa~ lacttato: " .

. I; .. matato'+NAD+ ~ oxátacetato '+ NADH + H+ ~Go' = + 7, 1 kcal Diol-l

AtUlque t.. reacción 'es endergónica, tal como se halla formu­lada (pAg.-i04).puede'kanscurrir con mucha facilidad. en el aentido diredo; ddlidQC& la ripida elimmación delos productos de rea~,.rel.o~alacetato· y el NADH, en las ·etapas. sub .. siguientes.·El.NADP+ es~ débilmente- re4uddopor el,en .. zi.tGa. :La~ciónde la malato-deshidrogenasa es estrictamen­te este~Bca ~a.él z.-.estereoisóme{O· del malato' y para el lado A..,del ~i1lo de piridina del NAD+ (pág. -i9J). Las céhdas de·l08 animales superiores contienen dos formas de L-¡nalatQ-deshidrogtnasa, . lUla en las mitocondrias y la otra en el .cit.o~a. exU:amitocondrial. Pod~s1lumar'ahora Jos productos de salida de una vuelta

alrededor .del. ciclo de Jos ácidos tricarboxílicos. Por cada grupo acetilo entrante, aparecen en forma de· dióxido de caI'­

bono dos átomos de carbono; sin embargo" estos dos átomos de.cari>ono 1lO son los mismos que se incorporaron en forma de grupos acetilo. La deshidrogenaciónenzimática rinde cuatro pares de átomos de hidrógeno; tres de los pares se han em­pleado en reducir al NAD+ y el otro para reducir al FAD unido de .1asqccU¡ato-deshick.ogenasa. Estos cuatro pares de átomos de hidrógeno se transforman en iones H+; los corres­pondientes e1ectronesse c.ombinan con el oxigeno continuando su transporte a lo largo de la cadena respiratoria.

Comprobaciones isot6picas del ciclo de los ácidos tric:arboxílicos

Se ha comprobado. mediante ensayos isotópicos rigurosos em­pleando precursores e intermediarios del ciclo, marcados con uno de los isótopos CU Ó C14 que ~ste se realiza verdaderamen-

471

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

te en las células intactas. Dichos experimentos permiten ade~ más interpretar cuantitativamente la oxidación de los glúcidos, de los ácidos grasos y de los aminoácidos. Sin embargo algu~ nos de los primeros experimentos isotópicos realizados produjo un resultado inesperado, que suscitó grandes controversias acerca del camino seguido y del mecanismo mismo de las reac~ ciones del ciclo. Por ejemplo, se incubó acetato marcado con carbono isotópico (indicado por un' asterisco) en el grupo carbo~ . xilo (CH3~COOH), con una suspensión de tejido que llevaba a cabo las oxidaciones del ciclo. Puesto que el acetato puede convertirse enzimáticamente en . acetil~oA en los tejidos ani~ males (pág. 558), podía seguirse la ruta del carbono car~ xílico del acetil-CoA en las reacciones del ciclo. Se aislaron varios intermediarios del ciclo de Jos ácidos tncarboxílícos de Ja suspensión de tejido después de un período en el que se estuvo verificando la oxidación 4el acetato. Después se de­gradaron los intermediarios con objeto de .establecer las posiciones del carbono isotópito en . cada uno de ellos. La condensación del oxaloacetato no marcado con el acetato mar­cado en su grupo carboxilo podía esperarse que produjese citrato marcado en un grupo catboxilo (lig. 17¡¡;.20). Debido a que el ácido cítrico parece ser una molécula simétrica, sin que posea ningún átomo de (:atbono asimétrico, se esperaba que los dos grupos carboxilo terminales del citrato no podrlan distinguirse químicamente. Por ello, se esperaba que la mitad de lasmoléculasde,Qb:ato marcadas,f.onnaclasa partir del acetato marcado, rindieran a-oxoglutarato con el isótopo en el grupo a<arboxilo, y la otra ,mitad a-oxoglutarato con el isétopD_~ grupo 'Y~carboxilo (fig. 17-20). Sin embargo, con­trariamente a lo que se suponía,.d análisis isotépico del a-oXO­glutarato marcado aislado de la suspensión del tejido mostraba que el isótopo introducido originalmente como carbono caroo.. xilicodel acetato, se encontraba solamente, en el grupo 'Y<ar~ boxilo dtl a-oxoglutarato, yenf7lKJdo alguno en ambos carbo­nos carboxilicos, a y 'Y (lig. 17 ... 20). Se lleg6ala conclusión, por tanto, de que el propio ácido cítrico, o cualquier otra molécula aparentemente simétrica, no podía ser uninterDJe­diario en la ruta de la transformación del acetato al a-oxoglu­tarato. Ello indujo postular ·que ·un ácido asimétrico tricar .. boxilico, . probablemente el ácido cis-aconíticoo el ácido iso .. cítrico, debían ser el primer producto de condensación·· for .. mado entre el acetato y el oxalacetato.

En 1948, Ogston señaló que aunque el· áCido cítrico no posee ningún átomo de carbono asimétrico, los centroS aétivos de .la citrato~sintasa y de la aconitasa podian ser asimétricos. De manera específica indicó que e1·centro activo de la aconi­tasa puede poseer tres lugares de unión pata el citrato dispues­tos asimétricamente· de modo· tal que el citrato tuviera que efectuar un caterrizaje:sobre tres puntos:. en eltentrOadivo. Tres grupos funcionales diferentes del citrato podrían actuar, de ~odo especifico, con tres grupos complementarios situados en el centro activo (lig. 17-21). En la actualidad reconocemos que la utilización asimétrica del citrato por la .. aconitasa es sólo la consecuencia de una propiedad estereoquunica de la propia molécula de ácido cítrico.

Hemos visto que las moléculas que poseen un átomo de carbono asimétrico son moléculas quira/es (pág. 83), ya· que: existen en formas sinestrosum y dextrosum. Sin embargo, la

472

FIGURA 17-20 Incorporación de átomos de carbono (en color) del grupo acetilo del acetil-CoA al ácido a-oxoglutárico. El átomo de carbono carboxilico del acetil-CoA está marcado con una estrella. Debido a que el carbono carboxUico se encuentra solamente en el grupo y-carboxilo del a-oxoglutarato, el citrato debe rendir solamente ácido a-oxoglutárico, de acuerdo con la ruta A.

Ácido

. CHaCOOH

+

HOOCCOCH2COOH

1 'COOH I

C,Ha Ácido citrico HO-C-COOH ,

CH2 , COOH

R;V~B 'COOH I ... *COOH

I r HC 11

cis-aconitico CCOOH 11

CCOOH ,

Acido isocitrico

HC , COOH

Jf ·COOH , ~

HCCOOH , HOCH

Ácido a-oxoglutárico

booo Jr

*CXX>H I

-r CHt I p~ aC=O ,

COOH Producto hallado

CH2 , .

COOH

Jf *COOH I

HOCH I

HCCOOH I

~ COOH

Ir *COOH I

aC=O , pCRa

I . -rCHa ,

COOH No hallado

\

FiGURA 17-21

Explicación de Ogston de la acción asimétrica de la aconitasa sobre el citrato. Sin embargo. no es necesario un anclaje sobre tres puntos del citrato para explicar la acción de la aconitasa sobre el citrato. Véase figura 17-22.

FIGURA 17-22

Proquiralidad de la molécula de ácido cítrico. En la parte superior se muestra una fórmula estructural de proyección del ácido cítrico. que no posee carbono asimétrico. A continuación se muestra el orden de los tres grupos sustituyentes en la mitad superior de la molécula; es decir. cuando el enlace b) es perpendicular al plano y se extiende por detrás del plano de la página. En la parle inferior se muestra el orden de los grupos sustitugentes en la mitad inferior de la molécula; es decir. cuando a) es perpen­dicular al plano de la página y se extiende detrás del mismo. Puede apreciarse que los grupos sustituyentes

,

en las dos mitades de la molécula de ácido cítrico se hallan en orden opuesto. tal como muestran la dirección de las flechas siendo. por tanto. imágenu especulares entre sí. Modificado de W. L. Alworlh. Stereochemistry and its Application in Biochemistry. página 114. Interscience Publi.shers. división de lohn Wiley and Sonso Inc .• Nueva York. 1973.

CH2COOH : (o)

Ho-é-cOOH : (b)

CH2COOH Fórmula de proyección del ácido cítrico

CHoCOOH

(b(O)) HO/0 COOH

Vista de arriba abajo

HO'7COOH

\.T(b/ CHoCOOH

Vista de la mitad inferior de la molécula de ácido cítrico

Capítulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxilicos y ruta del fosfogluconato

Unión del ácido cítrico por trel! puntos

Este enlace no puede Z situarse _1 correcta- /C..c.

X ¡ Z mente. y no: I :.

Este enlace puede situarse adecuadamente y resulta atacado

es atacado ! r !

/ X' 'Í:} Centro

~, activo con '--___ --.J. puntos de

enlace complementarios

CH.COOH

I Enlace

/C¡ < susceptible HO CH.COOH

COOH Ácido citrico

Representación esquemática del ácido citrico

moderna estereoquímica reconoce otra clase de moléculas en las que no existen átomos de carbono asimétricos, pero que son potencialmente capaces de reaccionar asimétricamente; son las llamadas moléculas proquirales. El ácido cítrico es una molécula proquiral debido a que sus dos mitades (véase figu~ ra 17~22) no se hallan en la relación de superposición objeto~ imagen en el espejo, y son, por tanto, estereoquímicamente diferentes. Al igual que algunos enzimas pueden diferenciar entre molécul~senatiméricas separadas, tales como el D~ Y L-Iaetato'(pig.A:42) o los:n .. y L .. aminoácidos (pág. 578), algu~ nOS fllzimaspueden distinguir entre partes enantioméricamente diferentes de una misma molécula proquiral. La aCOflitasa es uno de estos enzimas; puede combinarse y transformar sola~ mente una de las dos mitades de la molécula proquirál del citrató, Esta es la· raZ6n por la 'cual, cuando actúa sobre el citrato formado a partir del acetato marcado. la aconitasa rinde un isocitrato.en el cual solamente est~ marcado uno de Jos geuposcarboxilo. El hecho de que las dos mitades de fa molécula de citratoeft el ciclo no son equivalentes lia sido confirmado de modo inequívoco por diversos tipos de experi~ mentos con trazadores isotópicos. Sin embargo, el modo pre~ cisoyla g'tometría por la cual el centro activo de la aconitasa reconoce y une de modo específico una de las dos mitades de la. molécula de ácido cítrico, no se conocen todavía, y debe esperarse a que pueda establecerse la ·localización del centro activo (pág. 226). No se excluy.ela posibilidad del anclaje de la molécula de citrato por tres puntos en el centro activo, pero esta supOsición no ha sido confirmada por ningún hecho.

El succinato que se produce a partir del y~carboxilo mar~ cado dei a~xoglutarato rinde finalmente malato marcado, en el que la mitad de las moléculas se hallan marcadas en el grupo a-carboxilo y la otra mitad en el grupo p-carboxilo. En esta reacción la propia molécula de succinato está actuando simétricamente. Sin embargo. debe recordarse (pág. 469) que tanto la succinato-deshidrogenasa como la fumarasa son este,. reoespecíficas en su actuación.

Experimentos efectuados en el ciclo d~ los ácidos tri~ carboxílicos 'ion otros precursores marcados, tales como éH3COOH. CHaCOCOOH y H<::03- (véase más adelante), mostraron que se formaban intermediarios del ciclo marcados con los isótopos en posiciones que eran compatibles no sola~ mente con la ruta postulada para las reacciones del ciclo, sino también con las reacciones asimétricas mediante las que se forma el citrato y se convierte en a-oxoglutarato.

473

PUTE 2 CATABOLISMO Y PROOUCCÓN DB LA ENERGÍA DBL BNLACE POSPATO

Cuando se incorpora una molécula de ácido acético al ciclo, las dos moléculas de dióxido de carbono que se desprenden duraate una vuelta del ciclo no proceden de los mismos dos átomos de carbono introducidos en forma de acetato: este último permanece, en realidad, en los ácidos dicarboxílicos de cuatro átomos de carbono (fig. 11~2).

Naturaleza anfibólica del ciclo: Reacciones anapleróticas

Recordemos del capítulo 14 (pág. 319) que el ciclo de los ácidos tricarboxílicos es una ruta anfibólica y actúa no sola~ mente en ,el catabolismo, sino también en la generación de precursores para las rutas anabólicas. Algunos intermediarios del ciclo, sobre todo el a~xoglutarato y el oxalacetató; sirven Como precursores de los aminoácidos; en los cuales se trans~ fórman por reacciones enzimáticas de transaminación (pági~ .514):

a~Oxoglutarato + alanina ~ glutamato + piruvato Oxalacetato + alanina ~ aspartatb + piruvato

~}.:citrato puede también apartarse del ciclo para actuar' de ~rsor del acetil-CoA;·,destinado a la biosíntesis de' los faidosgrasos (pág. 613), a través de' la.reacción de la ATP~ flitr.ato~a:

&rato + ATP + CoA --+ .;: . acetil ... CoA +. oxalacetato. + ,APP + Pi

¡demás, el succinil~CoA puede salirse 'taID,bié~, del ciclo ~op. :rtJ.no a la biosin~eSis del hemo, (pág. 131). De esta manera .,"~roduce un drenaje de los intermediario~ d~ ciclo de los ~os tricarboxílicos destinados a las reacciones biosintética.s. "~!Los intermediarios del ciclo de los . áCidos tricarboxílicos fren, a su vez, reponerse medianter.eac~on~, en~m.áticas '~eciales, llamadas reacciones anap1rrótrcas (<<4e relten,?:' ). La liiés importante es la carboxilación eniimática del piruvato ~a fOrmar oxalacetato, que fue descubiertap()J¡,H. G.W()()d ·.~C. Werkman en las bacterias. La ruta de esta carboxilación ? ,,' l~ tejidos animales, y la Úientidád (ÍeI enzima im~i~ado, . traron ser problemascl~ excepciona1 dificultad, que preci~ , n de muchos años de investigación para s~ claríficación. ;,_almente, M. F. Utter y sus colaboradores, hallaron que la ]'~rmación de oxalacetato en ~l hígado a partir, del piruvató ;W catalizada por la pítUvato~carboxl1aSa. enzima mito~ eondrial:

.~.~.t.:; "

Piruvato + CO2 + ATP + H20 :MA2+ ~ o.xalacetato +APP + Pi

Il.GÓI _ 0,5 kcalmol-1

En ciertos tejidos animales, el piruvato' puede así converUrse en o.xalacetato siempre que lo.S intermediarios del ciclo deJo.s flddos tricarboxílicos estén en déficit. La formación de piru~ ,~a partir del oxalacetato por reversión de este proceso. en _~'C:élulas es improbable puesto que la concentraciÓft intrace~

>"Warde o.xalacetato es muy pequeña. Al contrario, se sigue Gtratuta (pág. 631).

414

CapítulQ 17 Ciclo de los ácidos triclU'boxílkos 9 ruta del fosIogluconato

La piruvato~carboxilasaposee un peso molecular de 650 000. Se inactiva a O oC, a cuya temperatura se disocia en cuatro suhunidades. El enzima nativo contiene cuatro moléculas de biatina (pAg. 351), unida c~valentemente a las cuatro sub­unidades mediante enlaces amida con el grupo E ~amino de restos especificos de lisina del centro activo (pág. 231). Cada subunidad se une también a un ion Mn2+. El grupo prostético de la biotina, situado sobre el centro activo, actúa como trans~ portador intermediario del grupo carboxilo, el cual transfiere el piruvato para formar oxalacetato. La reacción se produce en dos etapas:

E~hiotina + ATP + CO2 + H20 :;:: E~carboxibiotina + AOP + Pi

E~carboxibiotiná + piruvato :;:: E~biotina + oxalacetato

Suma:

ATP + CO2 + piruvato + H:zO:;:: oxalacetato + AOP + Pi

La piruvatO~tarboxilasa es un enzima alostérico. La veloci~ dad de tti reacción directa. que conduce a la formación de oxalac:etatQ;· esdtspreciable. a· menos que se halle presente el acetil~CoA~ que es su modulador positivo. Así, cuan~o se acuunda el acetil~CoA. combustible del dclo de los ácidos tri­é:arboxUic~ estiq,.ulála reacción de la pi~vat().-carboxilasa pará·p:odudt .mAs oxalacetato. permitiendQ así que .el ~c10 oxide más cántidad de acetil~CoA. . .

AunqueJa reacciOÍtde la píruvélto~arboxilasa es la reacción anapterotlcamás:hnportanteen . el hígado y en el riñón de los -artímales·superiores •. pueden partiéipar tampién otras reac~ ciones. Una de ellas es la que cataliza el enzima málico, cuyo ltombrenfidales malato.-déshidrogenasa. (fescarlX>zilp¡te; NADP): .

P'.ruvato+ COZ + NADPH + H.¡..~ L~malato + NAOP. . 1l.(Jo' = - 0.36 kcal mol-1

Pueden también i)riginarse intermediarios del ciclo a partir del aspartato y'detglútamato. que' se convierten en los ácidos oxalacético y a~xogIutárico, respectivamente. gracias a reac~ cioÍlesae la transáininasa (Pág. 574):

GlutañüitÓ + piruvato· ~ a~oxoglutarato +alanina Aspartato. '-1- piruvato :;:: oxalacetato + alanina

En las. plantas y en muchos microorganismos. el ciclo del ácido glioxílico (véase más adelante) constituye un medio importante para la .. reposición de los intermediarios del ciclo de los ácidos 'trlcarhoxílicós. .

Regulación del ciclo de loa ácidos tricarboxílicos

ResumiremQs hrevemellte las principales reacciones regulado~ ra$ de la oxidadQn del piruvatoa través del ciclo (fig. 17~23). La actividad del complejo de la piruvato~deshidrogenasa. que aporta la porción principal del .. acetil~CoA que se incorpora al cieJo. resulta' disminuida por la fosforilación ATP~dependiente

475

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE fOSfATO

Plruvato

ca'"!''' ATP

~c~ AcetU-CoA

~ Oxalacetato ,.. Citrato

I \ / \ \ ! Isocitrato

Matto ,,) [¡", ADP 1 ~ c~ \ a-Oxoglutarato

Fumarato / ' j / \ /~

P" ,>-< \, coz succinato," Succinato SuccmU-CoA

etc. ~

del componente deshidrogenásico, y es activada por la desfos~ (orilación del fosfoenzima. La condensación del acetil~CoA con el oxalacetato para rendir citrato, es el punto de control primario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en la mayoría de los tejidos (pág. 463). Sin embargo, existen otras reaccio~ nes en el ciclo que se hallan bajo regulélción alostérica, al menos en algunos tejidos. La primera de ellas es la reacción de la isocitrato~deshidrogenasa dependiente del NAO, qu~ precisa de ADP como modulador alostérico estimulante o positivo (pág. 241). En algunos tejidos, por ejemplo el músculo volador de los insectos, el Ca%+actúa también como un modu~ lador positivo de .esta reacción.

La otra reacción que está regulada es la deshidrogenación del succinato. que es inducida por concentraciones elevadas de succinato. de fosfato. de A TP y de ubiquinona reducida (pág. 503). y que es potentemente inhibida por el oxalacetato. Aunque esta reacción no es. por lo general. la etapa que determina la velocidad en el ciclo. compite con las reacciones dependientes de NAO en la cesión de electrones a la cadena de transporte electrónico (pág. 5(4). pudiendo afectar así a la integración de las reacciones de deshidrogenación del ciclo.

El ciclo de los ácidos tricarboxílicosse halla regulado tam~ bién por la concentración de sus varios intermediarios. Debido a que algunas de las reacciones del ciclo intervienen también en la biosintesis (págs. 637 y 731). una compleja red de cori~ troles regula la velocidad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Ciclo del glioxilato

El ciclo del glioxilato. que es una forma modificada del ciclo de los ácidos tricarbOxílicos. tiene lugar en· la mayor parte de las plantas y microorganismos. pero no ocurre en los animales superiores. El objetiVo primordial del ciclo del glioxilató.que fue delineado en primer lugar por Krebs y H. R. Kornberg. es el de permitir a las plantas y a los microorganismos. la uti~ lización de los áCidos grasos o del acetato. en forma de acetil~ CoA. como única fuente carbonada. sobre todo para la biosín~ tesis de glúcidos a partir de los ácidos grasos. Los animales no son capaces de efectuar la síntesis neta de la glucosa a

476

FIGURA 17-23 Regulación de la oxidación del piruvato por la ruta del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

FIGURA 17-24 Ciclo del glioxílato. Las reacciones mostradas por flechas coloreadas son las cat41izadas por la isocitrato-liasa y la malato-sintasa; las demás son las reaccioneR del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Citrato

1 cis~Aconitato

1 Isocitrato

Isocltrato l ~ , Iiasa 1 ~ Succmato

GlioxUato

malato L.- Acetil-CoA sintasa r

Malato

1 Oxalacetato

\

FIGURA 17·25 Reacción de la isocitrato-liasa.

COOH I

HOCH I

HC-COOH Ácido isocítrico I . CHz I COOH

1l COOH &. I z

CHz I COOH

+ CHO I COOH

FIGURA 17-26

Ácido 8uccínico

Ácido glioxílico

Reacción de la malato-sint888.

CH·, I . c=o Acetil.CoA I S-CoA

+

CHO I Ácido glioxílico COOH

+

H.O

1 COOH I CH2

I Ácido málico HCOH

I COOH

+

CoA-SH

Capítulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxilicos y ruta del foslogluconato

partir del acetato o de los ácidos grasos, ya que los dos átomos de carbono se pierden en form~ de C~ en las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que conducen desde elace~ til~CoA al oxalacetato. El ciclo del glioxilato elude mediante un rodeo, las etapas de desprendimiento de C~ del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Sin embargo, la escisión del isoci~ trato se produce a través de una ruta en la que se eluden tres de las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. El isocitrato es escindido en primer lugar por la isocitrato-liasa, para formar succinato y glioxilato (Hg. 17 ~25). La malato­sin tasa (fig. 17 ~26) cataliza a continuación la condensación del glioxilato con otra molécula de acetil~CoA para formar malato (fig. 17~26). El malato se oxida entonces, a oxalace­tato, que puede condensarse de nuevo con el acetil~CoA e iniciar otra vuelta del ciclo del glioxilato. A cada vuelta del ciclo se incorporan dos moléculas de acetil-CoA y se forma una molécula de succinato. Este último se emplea con fines biosintéticos, particularmente como precursor en la gluconeo­génesis. es decir, en la biosíntesis de «nuevo:. azúcar (pág. 636). La ecuación global del ciclo es la siguiente:

2 Acetil-CoA + NAD+ + 2HP ~ succinato + 2CoA + NADH + H+

En I~ plantas ~up.eriores y en los microorganismos, pueden actuar simultáneamente tanto el ciclo de los ácidos tricarboxí­licos como el del glioxilato; el primero para proporcionar ener~ gíamediante la fosforilación oxidativa {pág. 524), y el se­gundo para proporcionar succinato destinado a la formación de nuevo glúcido procedente de las grasas.

AunqueJas reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en las plantas superiores se hallan localizadas en las mitocon­drias, los dos enzimas caractetísticos del ciclo del glioxilato, la isocitrato-liasa y la malat~sintasa se encuentran en otra clase de orgánulos citoplásm,icos, 10sglioxisomas.Estos orgá­nulos, rodeados de membrana, carecen de la mayor parte de los enzimas del ciclo de los ácidos tricarbÓxílicos y no poseen sistema citoclÓmico. Se encuentran solamente en las células vegetales capaces de convertir a los ácidos grasos en azúcar. Puesto que también son ricos en catalasa, los glioxisomas pue­den estar relacionados con los microcuerpos o peroxisomas o ser derivados de ellos (pág. 35).

El ciclo del glioxilato se halla bajo regulación alostérica. La isocitrato-liasa es fuertemente inhibida por el fosfoenol~ piruvato, un intermediario clave en la biosíntesis de la glucosa a partir de precursores que no son azúcares (pág. 637). La isocitrato-liasa y la malato-sintasa son enzimas inducibles (pág. 392): son sintetizados por las células de las plantas solamente cuando se necesitan.

El ciclo del glioxilato reviste especial importancia en las. semíllas de las plantas, las cuales pueden convertir los restos acetilo derivados de la oxidación de las grasas en glúcidos, pasando por el ácido succínico (pág. 640). Los animales su­periores carecen de isocitrato-liasa y de malato~sintasa, y son, por tanto, incapaces de convertir el acetil~CoA en nueva glq­cosa (pág. 642), aunque los átomos de carbono de los grupos acetilo marcados aparezcan en los restos de glucosa.

477

PARTE 2 CATABOUSMO Y, PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍ.\ ,i)EL ENLACE FOSfATO

Ruta del fosfogluconato

Muchas células- disponen de otra ruta para la degradación de la glucosa.euya primera etapa es l~ deshidrogenaciónenzi~ mática de'ki glucosa~6~fosfato a 6 .. fosfoglucomlto. La ruta del fosfogluconato. tambiénconoeida cómo rutaae losfóS--¡a: tos de iJHmtosa. o desviación del mono/oslato de hexosa~ no es la 'níta principal paril la obtención de energíá de la oxida..; ci6n'de la glucosa en los tejidos ánimatés. En véz de ello. se.;!rata de una ruta multifundonal. especializada para efectuar cuatro actividades principales. en dependenciácon 'el orgailis~ mer y su estado metabólico; En la mayorí~de las 'células,'.su objetivo primordial es el de' generar Potencial dé' r~u~ción en' el citoplasma extramitocondriál; en' forllla de NADPH (págs. 348 y 491 ). Esta fundóries especlaluienté destacada éh los tejidos. por' ejemplo. en' el hígado; en la' glándula'lDá~ maria y en la corteza adrerlal.que' realizan activámente. la síntesis reductora de los ácidos "grasos y de' Jos' estéroides a partir del acetil .. CóA(pág. 673). El mÍlsculo 'esquelético. que no muestra actividad' en la síntesis de ácidos 'grasos. e:arece, virtualmente. de esta ruta. La segunda fúIldanéspéciatdé la ruta del fosfogluconato es la conversión de h~xosas en' pen~ tosas. particularmente en fao.-ribosa~5~fós1áto;'rié<:&ariá para la síntesis de los ácidos nucIeicóS -(pág. 740). La tercera ftm;. ción. consiste en la degradación oXidante completa de las ptntosas. mediante SU conversión: en ,hixosas. -laseualeS pue­((en entonces ingjesaren la secuenCia' gtÚéoJitiCá; En 'la cuárta fünción. que seftscl'ibirá en el capituJo23' (pág; 644). la Tilta ,~fosfo9Iuconáto semodinca de modo· qúe partiCipe en la :~ de glucosa a partir de-e(h¿erihireacciónés os<:u¡' :¡is de la fotosíntesis {pág. 600~. , -',,:Las reacciones de la ruté del'fosfógluconato se Producen en .' porción soluble del :cltoplasuiaex-tramitOcóndrlalde' las '~lasanimales. Todos lós enzimas qué sepreciSárien esta ~encia han sido muy purifiCados yampliamente'estudiados lfArticularmente por '8. L." Horecker y' R:Rackery sus eóla~ ,twadores~ La primera rtaceión de la ruta delfosrogmconatCt .jSladeshidrogenaCión eI'lzimitica de la Qhkosa...6~foSfato.parir }fbtmar 6~fosfoglucbnato (fig-. t 1 .. 21} • por lamterVtnciÓil " de ~la glucosa~6-fosfato--deshicfrOgenaslí. éonodrlátarilbién ''Como Zwischenferment:, ' '

Glucosa...6~fosfato + NADP+~ 6-fosfogluconólactona + .NADPH +' H+

liGo' = '';'" 0.1 kcaI moti

&te enzima, descubierto por O. Warburg, fue la primera ~idrogenasa que se halló que ,era específica'para elNADP+ ~ aceptor electrónico. Efectúa, la deshidrogenación ,del 'átomo de carbono 1 de la forma pUanósica deja gJucosa.¡6¡..io.. •• para producir la correspondient~ "'fosfogh1Cono.-a.,lacto~ .. ~ue se hidroliza por una lactonau especifica (fig. 11.;.21):

<"-e 6~Fosfogluconolactona + HP ,----.+ 6-fosfogluconato AGo' =. -5.0 kca1 mol-I

'Bl'eqWh'brio global. de las dos reaccion.es. t$tá muy ,desplazado ;o';-~di~n de la~~dd NADPH. " ,

En ]aetapa~iguiente.el &'fosfasluconato experimenta oxi~

178

FIGURA 17-27 Btapas iniciales de l~ ruta del foslo­gluconato.

H?OH I HCOH

I O

HOY:J HCOH

I HC

I CH20POl-

NADP+ ~9IUCOSa-6-fosfato-

NADPH + H+ deshidrogenasa

r=ol HtOH I

I O

H,OY:J

H

HCOH t

HC I CH.OPQ,2-

-H OL l- +HsO 2 lllactonasa

coo­I

HCOH I

HOCH I

HCOH I

HCOH I CH20PQ,'-

Glucosa-6-fosfato

6-fosfoglucono-8-lactona

6-Fosfo­gluconato

NADJ>+ 1 tfr>sfogluconafo­

NADPH + W ." ~:ogenasa

- CHe.DH f C==O I

HCOH I

HCOH I CH.OPQ,'-

1 ~ibosafosfato ... Jsomerasa

CHO I

HCOH

o-Ribulosa­S-fosfato

HtOH o~Ribosa-I S-fosfato

HCOH j CH20POa2-

FIGURA 17-28 Bpimerización de la ~bu1o.sa-s..fo8/ato.

CHzOH I C=O

H60H D-Ribulosa-I S-fosfato

HCOH I CHzOPOaI

-

II ~t."'"'...:!:w CHaOH I " C=O

H~ D-Xilulosa-I S-fosfato

HCOH I CH.OPOal-

FIGURA 17-29 Reacción de la transcetolasa.

CH. OH I C=O I o-Xilulosa-

HOCH S-fosfato I HCOH"

I CHzOPOaI -

+ CHO I

HCOH I D-Ribosa-

HCOH S-fosfato I HCOH

I CHz°POaI

-

1l CH. OH I C=O I

HOCH I D-Sedoheptulosa-

HCOH 7-fosfato I HCOH

I HCOH

I CHzOP0a2-

+ CHO I D-Gliceraldehído-

HCOH 3-fosfato I CH2OP0a2-

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricarboxilicos y ruta del fosfoglucoifllilO

dadón y descarboxiladónpor acción" de la Q" ~~~~~I~ deshidrogenasa. enzima d~iente "del" , para o.-ribulosa~5;.fosfafo (fig. 11 ... 21), reacció~" que produce segunda molécula de NADPH. A contimfáci.ón, por de la ribosa~IO$fato..;somerasª, laD~ribulosa~5~sfato se forma réversiblemente en o.-ribosa~5 .. fosfato. En algunas diciones metabQlicas, la ruta del fosEogluconato finaliza en punto y puede escribirse su ecuación global como

Glucosa.-6 .. fosfato + 2N'ADP+ + H;zÜ ~ D~ribosa~5 .. fosfato + C~ + 2NADPH+ 2FP

El resultado neto es la producción de NADPH, para las reael dones biosíntttlcas en el citosal, y la producción de D .. ribo~ 5~fosfato como precursor para la síntesis de nucleótidos. " :

Bn otras circunstancias, kt ruta del fosfogluconato pueci proseguir, ya que las pentosa-S .. fosfatos pueden experimeniílf otras transformaciones," qUe resultan posibles,· gracias a ttá enzimas adicionales; ·Ia tibalosafosfato-3 .. epimerasa, la trans ... c~tolasay.latFansaldolas.a. El primero de ellos cataliza ·.14 conversión de 1a I).-ribulósa~5~fosfato en su epímero en eA átomo de carbono 3, la o.-xilulosa.;.5~fosfato (fig. 17 .. 28). lií,t transcetolasa, que contiene piro fosfato de tiamina estrechti@ mente unido (pág. 343) y Mg2+, efectúa la transferencia de' un grupo gliceraldehído desde laD .. xilulosa .. 5 .. fosfato ail D .. tibosa ... 5 .. fosfato para rendir D~sedoh~ptulósa .. 7 ~fosfato, f~ fato de un azúcar de siete átomos de carbono, y D~glicerat.:., dehído~3 .. fosfato¡. un intermediario de la'glucólisis (fig. 17;..29i En esta "reacción, el grupo glicolaldehido (CH20H-CO-J: es transferido en primer lugar desde la D~xilulosa~5~fosfato al piro fosfato de tiamina ligado al enzima. para formar el-ti:. p .. dihidroxietilderivado del último, que es análogo al a .. hid~ xietil-derivado del pisofosfato de tiamina -formado durante ~>, acción de la pirúv&to4eshidrogenasa descrita anteriormeat! (págs. 343 y 460). El pirofosfato de tiamina actúa comoUl transportador intermediario de este grupo glicolaldehído, q. esttansIerido a" la molécula del aceptor D .. ribosa~5~fosfafét La transcetoiasa cataliza también la transferencia de un grupO glicolaldehído desde cierto número de otros fosfatos de 1~ceto azúcares, al átomo de carbono 1 de cualquiera de diverso$ fosfatos de aldosa: Durante estas transformaciones no aparece glicoladehído libre. di

La tran.s.aldolaka es el tercer enzima que participa en Id u.lteriores reaccionés de la ruta del fosfogluconato. Actúa líO' bre los productos de la reacción de la transcetolasa, un azúcM de siete y otro de tres átomos de carbono, para transformarloil en un azúcar de seis y otro de cuatro átomos de carbono: -'-

D~Sedoheptulosa~7 ~fosfato + D~9liceraldehído .. 3~fosfato ;= o~Eructosa~6~fosfato + D .. eritrosa.-4~fosfato

El grupo dihidroxiacetona correspondiente a los átomos de carbono 1.2 y 3 de la sedoheptulosa~7 ~fosfato es transferido al D~gliceraldehído-J..fosfato para formar D-fructosa~6 .. fosfato quedando D~eritrosa .. 4~fosfato (Eig. 17 ~30). Esta reacción es formalmente parecida 'a la catalizada por la fructosa~d¡fosfato­aldolasa y procede por un mecanismo similar (pág. 216), pero la transaldolasa no puede __ J.:eaccionar con la dihidroxiacetona

479

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCClQN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSPATO

libre ni con su fosfato, y tampoco puede formarlos. Las reac .. ciones de la transcetolasa y de la transaldolasa intervienen no solamente en la conversión de las pentosas en hexQSaS para su degradación subsiguiente por la glucólisis y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, sino que también hacen posible, con la colaboración de los enzimas de la secuencia glucolítica, la interconversión de los azúcares de tres, cuatro, ciuco, seis y siete átomos de carbono, por transferencia reversible de frag .. mentos ya sea de dos átomos de carbono (glicolaldehído) o de tres carbonos (dihidroxiacetona). Otra reacción importante catalizada por la transcetolasa es

D .. Xilulosa .. 5 .. fosfato + D.-eritrosa .. 4 .. fosfato ~ D .. fructosa .. 6 .. fosfato + o..gliceraldehído .. 3 .. fosfato

en la que dos de los intermediarios de la ruta del fosfoglu­conato pueden convértirse reversiblemente en dos intermedia­rios de la ruta glucolítica (fig. 17 .. 31).

En ciertos microorganismos, por ejemplo los lactobacilos. la ruta del fosfogluconato se utiliza de otra manera para efectuar la degradación fermentativa de las pentosas. Horecker ha des .. cubiertº que esta ruta comienza con el enzima fosfocetolasa, que cataliza la reacción

Xilulosa..5 .. fosfato + fosfato ~ gliéeraldehído .. 3 .. fosfato + acetil .. fosfato + H20

El gliceraldehído .. 3 .. fosfato se convierte después en lactato, y el acetil-fo$fato en acetato.

Pueden producirse de este modo diversas reacciones oxi~ dantes y no oxidantes de los fosfatos de los azúcareS sencillos, mediante la acción de los enzimas de la ruta del fosfogluco~ nato, ya sea actuaado ind~endientemente o bien concertados con los eAzimas de la secueada glucolitica. La ruta del fosf~ gluconata no es, por tanto, una ruta bien definida que con~ duzca a un único producto final,. sino que está integrada por un conjunto de rutas divergentes capaces de una gran flexi~ bilidad metabólica.

La· ruta del fosfogluconato puede servir también para efec­tuar la oxidación completa de la glucosa .. 6 .. fosfato a CÚJ. con reducción simultánea del NAOP+ a NADPH, mediante una secuencia compleja de reacciones (Hg. 17 .. 32) en laque seis moléculas de glucosa-6-fosfato se oxidan para dar seis moléculas de ribulosa-5 .. fosfato y de CO2, respectivamente: después, cinco moléculas de glucosa .. 6 .. fosfato se regeneran, a partir de las seis moléculas de ribulosa .. 5 .. fosfato. La ecua .. ción global es

6 Glucosa .. 6 .. fosfato + 12NADP+ + 7HP--+ 5 .. glucosa.-6 .. fosfato + 6C02 + 12NADPH + 12H+ + Pi

Si se anulan los términos comunes, se tiene

Glucosa .. 6 .. fosfato + 12NAOP+ + 7H20 --+ 6C02 + 12NADPH + 12H+ + PI

La dirección del flujo y el camino tomado por la glucosa .. 6 .. fosfato después de penetrar en las reacciones de la ruta del

480

FIGURA 17 .. 30 Reacción de la transaldolasa.

CH20H \ c=o I

HOCH I

HCOH I

HCOH I

HCOH I CH,OPQ,'-

+ CHO I

HCOH

6r.OPOsJ-

11 CH20H \ c=o \

HOyH

HCOH I

HCOH I

CHs°POsJ-

+ CHO 1,

HCOH I

H?OH CH,OPOsJ-

D .. SedoheptuJosa .. 7 .. fosfato

D-Gliceraldehído .. 3 .. fosfato

D .. Fructosa .. 6 .. fosfato

D .. EritroSa .. 4 .. fosfato

FIGURA 17~31

Otra reacción catalizada por la transcetolasa.

CH,OH I c=o I

HOCH I

HCOH I CH:,OPQ¡2-

+

D~Xilulosa~

5~fosfato

CHO I

HCOH D~Eritrosa~ I 4~fosfato

HCOH I CH2 0PQ¡2-

1l transcelotas8.

CH. OH I ' C=O I

HOCH D~Fructosa~

, H¿OH 6~fosfato I

HCOH I CH20PQ¡2-

+

CHO I D~Gliceraldehído~

CHOH 3~fosfato I CH:,OPQ¡2-

FIGURA 17~32

Representación esquemática de la oxidación completa de una molécula de glucosa~ 6~fosfato (G6P) a CQ, con los equivalentes de reducción del NADP+ mediante la ruta del fosfogluconato. La ecuación completa aparece en el texto. Los productos finales aparecen en color.

Cl~ve: 6PG = 6~fosfogluconato

Ru5P = ribulosa~54osfato R5P = ribosa~5~fosfato

X5P = xilulosa~5-fosfato S7P = sedoheptulosa~7~fosfato G3P = gliceraldehído~3-fosfato G6P = glucosa..6-fosfato E4P = eritrosa~-fosfato

DHAP = fosfato de dihidroxiacetona FDP = fructosa~ 1.6-difosfato F6P = fructosa-6-fosfato

Capitulo 17 Ciclo de 10$ ácidos tricarboxílicos y ruta del fosfoglucotuJto

fosfogluconato, estin determinados, en gran manera, por las necesidades relativas de la célúla en NADPH. y en ribosa.-5-fosfato. Si las necesidades de NADPH son superiores alas de ribosa-5-fosfato, el fosfato depentosa sobrante puede con­vertirse de nuevo' en fosfato de hexosa. Si predominan las necesidades de ribosa-S-fosfato el flujo procederá, a través de las reacciones de la transcetolasa y la transaldolasa, desde la flilctosa~6-fosfato hasta la producción de fosfatos de pentosa. Únicamente en ciertas células y tejidos tales' como los mk~ organismos activos en la biosíntesis de grasas, o en la 91án~ dula mamaria durante el período de lactancia, es cuando pre­valece la ruta oxidativa completa que conduce exclusivamente al NADPH (lig. 11~32).

Puede emplearse un método isotópico para establecer en qué proporción el .catabolismo de la glucosa en una célula o en un tejido determinados, se efectúa por la vía gluto1itica

,,.--------7 6 Glucosa..6~fosfato I I I I f 1 ....--__ ---,

I 6NADPH I I I 1 I

~----

: ,-----, 1'----+1 6C02 I : 6NADPH ~--~~L--,' . I I I I t 1 I I

I 1 1 I I I I 1 I I , t I I I I I t 1 I I I I

\ I I 1 t I

481

PARTE 2 CATABOUSMO y PRODUCCIÓN DE LA ENERGfA DEL ENLACEPOSl'ATO

y cuál ·10 hace por la ruta del fosfogluconato~ Se divide las células en dos grupos. uno de ellos se incuba c:pn glucosa;P4C. y el otro con glucosa..6-MC. Se CODlparan las velocidades ini­ciales a las que aparece MC en· el C~ focmado por oxidaéión de la glucosa. La acción combinada de la secuencia gluc:olítica y del. ciclo de los ácidos tricarboxílicos rinde 1"<:0,. proce­dente de ambos tipos de glucosa marcada con velocidades iniciales iguales. mientras que la tota del fosfogluconato li­bera 14CO, sólo de la glucosa-l-MC en los momentos -iniclales. Se han efectuado este tipo de experimentos utilizando muchos tejidos diferentes. En el hígado de rata. hasta un 20 % del 14COz puede provenir de la ruta del. ~sfogluconato. según sea el estado metabólico. Una proporción mucho mayor de glu­cosa se incorpora a la ruta del fosfogluconato en la glándula mamaria. en la que la síntesis de ácidos grasos, .fj\te requiere NADPH. constituye una activid.ad metabóliCa principal. Sin embargo. en el corazón y en el músculo esquelético. se produce relativamente poca oxidación de la glucosa a través de la ruta del fosfogluconato.

Una ruta interesante. atrnque Secundaria. de la degradación de la glucosa es la ruta del' gluéuronato-ascorbato que se des­cribe en el capitulo 23 (pág. 653).

Resumen

La respiración se efectúa en tres fases: formación oxidante de acetil-CoA a partir del piruvato. de los ácidos grasos. y de 'los aminoácidos (fase 1); degradaciÓll de los restos acetjlo del acetU-CoA. por el ciclo de los 6c:idos tricarboxilicos. para producir CÚJ y átomos de hidrógeno (fase 11); y transporte de _trones equivalentes a esos átomos de hidrógeno hasta el oxigeno molecular (fase 111). proceso éste, que va acompaftado de la fosforilaclÓll acoplada del ADP. El acetU-CoA procede de los glúcidos. a través de la oxidación del pf1:uvato. El ciclo de los ácidos tricarboxilicos. que tiene lugar en las mitocol1drias. comienza cuando la citrato1intasa c:atallza la condensación del acetil-CoA con ~Lácido oxalacétlco para formar ácido cftrico. La aconltasa cataliza después la formación reversible del Isocltrato a partir del citrato. reacción en la que el citrato. molécula proquiral. es manipulada asimétrkamente. El isocltrato es oxidado después a «-oxoglutarato y CÚJ por la isOdtrato-deshidrogenasa NAD-dependiente. enzima alostfrko que es activado por el ADP. El a-oxoglutarato experi~ menta posteriormente la oxidación a lIuccinil-CoA. según una secuencia de reacciones semejante a la oxidación del piruvato a acetll-CoA. El succinil-CoA reacciona con el GDP y: el fosfato_ para formar succinato libre y GTP; el grupo fosfato terminal del GTP es transferido al ADP. Después. el succinato se oxida a fumarato .P!»' lasuccinato-deshidrogenasa. enzima . flavlnico. El fumarato es hidratado por la fumarasa a L-malato. el cual es oxidado por la L.malato-deshidrogenasa ligada al NAD para regenerar una molécula de oxalacetato. Este último puede combinarse entonces con otra molécula de acetil-CoA para iniciar así otra vuelta del ciclo. Los experimentos con trazadores isotópicos. mediante intermediarios marcados en el carbono. han establecido que el ciclo de los ácidos tricar~ boxilicos es. en las células intactas. el mecanismo principal de la degradación oxidativa de los glúcidos. así como de otros combustibles. La velocidad global del ciclo se halla controlada por la reacción de la cltrato-sintasa.

Los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxilicos se emplean también como precursores en la biosíntesis. Los intermediarios del ciclo que se consumen, se reponen. entonces. mediante las reacciones anapleró~ ticas. la más importante de las cuales es la carboxilación reversible del piruvato a oxalacetato a expensas del ATP. En los organismos capaces de vivir utilizando el acetato como única fuente carbonada. entra en juego una variante del ciclo del ácido cítrico: el ciclo del glioxUato. Este hace posible la formación neta de succinato a partir del acetato para efectuar la bioslntesis neta de glucosa a ~ir de los ácidos grasos.

La glucosa-6~fosfato puede catábolizarse' por una ruta alternativa. la ruta del fosfogluconato. Esta ruta permite la fOrmación del NADPH ne~

482

Capitulo 17 Ciclo de los ácidos tricuboxílicos y ruta del fosf~

cesarlo en ,la biosill~ rec:luctor:ade,. ácidos grasos y de los ~. Y la prÓd~ióÍlder~::S-fosfat(,} ,~, a la biosintesis de los iddos nucleicos. Posibilita además' la fonnácl6Ú. fotosintétlca de la glUca,8 a partir del COz ~n algunas plantas. Esta ruta permite también la inlerc:oa­versión de' varios azúcares de tres, cuatro, cinco, seis y siete átom6$ .de carbono. conectándolos metabólicamente con' la secuencia glucolítica.

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Probl~mas

1. ¿Cuántas vueltas del ciclo del ácido citrico deben efectuarse para que se verifique la oxidación completa a dióxido de carbono yagua de los siguientes compuestos: a) glucosa. b) gliWaldehldo. e) ácido citrico, d) 6cido sucdnicQ?

2. Supóngase que se aflade acetato marcado con 14C en el grupo metilo. a cada una de las siguientes preparaciones celulares que respiran: a) células hepáticas. b) célulaS hepáticas a las que se ha adicionado malonato. e) plántulas de jUdla. A continuación se aisla ácido succlnico de cada una de las preparaciones. l. Cuáles serán los átomos de carbono del ácido succinico que se espera que han de estar marcados?

3. Se incubaron sustratos marcados isotópicamente con suspensiones de músculo en respiración envenenadas con malonato. y se aislaron los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxllicos que se relacionan. Predecir en cada caso. cuáles serian los átomos de carbono de los productos aislados que se creerla que estuvieran marcados.

a) El sustrato es "CH3COCOOH y un exceso de oxalacetato no marcado. El producto aislado es 1) ácido isocitrico. 2) ácido a-oxoglutárko. 3) ácido succlnico.

b) El sustrato es "CH3COCOOH. El producto es 1) ácido isocí· trico. 2) ácido a-oxoglutárico. 3) ácido succlnico.

e) El sustrato es HI4COJ-. El producto es 1) ácido isocltrico. 2) ácido a-oxoglutárico. 3) ácido succlnlco. 4) ácido málico.

d) El sustrato es 5~ICfructosa. El producto es 1) ácido isocitrico. 2) ácido succlnico.

4. En el ciclo de los ácidos tricarboxllicos del hígado. se introduce un piruvato marcado isotópicamente en el átomo de carbono 2 (CHl4COCOO-). Suponiendo que todo el piruvato marcado se con· vierta inmediatamente en citrato por la via del acetil..GoA. determí~ nese la fracción de la radiactividad inici;11 que se pierde en forma de 14C02 : a) durante la primera vuelta del ciclo. b) durante la segunda vuelta. e) durante la tercera vuelta.

5. Supóngase que en las mismas condiciones enunciadas en el proble. ma 4 el piruvato se hallase marcado en el· átomo de carbono 3 (I4CH3COCOOH). Determínese la fracción de la radiactividad ini. cial que se pierde en forma de 14C~. a) durante la primera vuelta del ciclo. b) durante la segunda vuelta. e) durante la tercera vueltá. d) durante la cuarta vuelta. e) durante la quinta vuelta.

Capítulo 17 Ciclo de los ácidos tricatboxílicos y ruta del foslogluconato

6. Los sustratos indicados más adelante se afiadieron a suspensiones de hígado de rata triturado. en las que la succinico-deshidrogenasa se hallaba completamente inhibida por la adición de malonato •. Su~ poniendo que el suministro de glucógeno es abundante. escríbanse las ecuaciones igualadas para la conversión a ácido succinico. dé! a) ácido citrico. b) ácido plrúvico. y c) ácido fumárico. (La con~ sulta de la página 563 puede ayudar a la resolución de éste y de los subsiguientes problemas del mismo tipo).

7. Repítase el problema 6 suponiendo unas condiciones en las que la producción de piruvato en el citosol sea despreciable.

8. Escríbase una ecuación igualada para la conversión de la 3_14Cglu~ cosa en o-ribosa-5-fosfato en el hígado por una ruta que implique el empleo de nucleótidos de piridina. ¿Qué átomos de carbono del producto se espera que resulten marcados?

9. Escribase una ecuación igualada para la conversión de la glucosa-6~ fosfato en ribosa-5-fosfato por una ruta que no precise de la inter~ vención de nucleótidos de piridina.

10. Escríbase una ecuación igualada para la conversión de la D-glucosa en ácido pirúvico por una ruta que no precise de la intervención de la fosfofructo-quinasa como enzima esencial.

11. Escribase una ecuación igualada para la conversión de la D-ribosa-5-fosfato en ácido láctico en el higado. Si la ribosa-5-fosfato se halla marcada con 14(: en el átomo de carbono 1 ¿cuál será el átomo. o los átomos. de carbono del ácido láctico que resultarán marcados?

12. A partir de los datos del texto. calcúlese la constante de equUibrio y la variación de energía libre estándar para la conversión del malato en citrato. de acuerdo con la ecuación

Malato + NAD+ + acetU-CoA + H20 ---+ citrato + CoA + NAOH + H+

13. La concentración intramitocondrial de malato en ciertas condiciones es 0.22 mM, y la relación NAO/NADH es 20. Calcúlese la concen­tración intramitocondrial máxima de oxalacetato en esas condiciones. (Supóngase una temperatura de 25 oC). .

485

CAPíTULO 20 Oxidación de los ácidos grasos

Los ácidos grasos desempeñan un papel sumamente impor~ tante en los animales superiores y en las plantas como com~ bustibles ricos en energía ya que pueden almacenarse en cantidades grandes en las células en forma de triacilglicéridos. Estos están especialmente bien adaptados para este papel, debido a que poseen un elevado contenido energético (alrede~ dar de 9 kcal g-I), y a que pueden acumularse, en forma casi anhidra, como gotitas de grasa intracelulares. En contraste con ello, el glucógeno y el almidón solamente rinden alrededor de 4 kcal g-l; además, por estar muy hidratados; no pueden almacenarse en forma tan concentrada. Los ácidos grasos cubren hasta el 40 % de las necesidades totales de combus~ tibIe en el hombre en una dieta normal. En los períodos de ayuno, o en 16s de hibernación en ciertos animales, los ácidos grasos constituyen, por así decirlo la única fuente de energía.

Estudiaremos en este capítulo la ruta enzbná,ti<;a· de oxida~ ción de los ácidos grasos para rendir acetil~CoA,qu~se in~ corpora después al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. EsbClza~ remos también la formación y utilización de los cuerpos cetónicos, intermediarios importantes en la oxidación de los ácidos grasos.

Procedencias de los ácidos grasos

Los tejidos de los mamíferos contienen normalmente cantida~ des ínfimas de ácidos grasos libres, que en realidad son algo tóxicos. Los ácidos grasos libres proceden en las grasas o en el tejido, adiposo de los triacilglicéridos que han sido escin~ didos por acción de las lipasas controladas por hormonas (pág. 826). Los ácidos grasos libres se eliminan después del tejido, uniéndose íntimamente a la seroalbúmina y siendo transportados a través de la sangre a otros tejidos, en los que se oxidan. Los ácidos grasos liberados de este modo, son previamente «activados» enzimáticamente en el citoplas~ ma, penetrando después, en las mitocondrias para su oxidación.

Los ácidos grasos de cadena larga se oxidan a CO2 y H20 en casi todos los tejidos de los vertebrados, excepto en el cerebro. Sin embargo, en ciertas condiciones el cerebro puede oxidar al p~hidroxibutirato, un intermediario del catabolismo de los ácidos grasos. Algunos tejidos tales como el músculo

555

PARTB 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DB LA BNBRGÍA"DBL BNLACB POSPATO

cardiaco, obtienen la mayor parte de su energía de la oxida~ ción de los ácidos grasos. La movilización, distribución y oxidación de los ácidos grasos se hallan integradas con la utilización de los combustibles glúcidos: ambas se hallan so~ metidas a una regulación endocrina compleja (pág. 849).

Ruta de la oxidación de los ácidos grasos

Ya antes de fines del siglo XlX se sospechaba que los ácidos grasos son sintetizados y degradados en la célula, por la adición o sustracción de fragmentos de dos átomos de carbono, puesto que la mayor parte de los ácidos grasos. naturales poseen un número par de átomos de carbono. ~staidea estaba basada también en la temprana observación de que los ácidos grasos de los mamíferos en período de ayuno o de individuos aquejados de diabetes mellitus son oxidados de modo incom~ pleto, lo que conduce a la acumulación de los ácidos de cuatro átomos de carbono ácido acetoacético y ácido D~{3~hidroxibutíri~ co (fig. 20~1) en la sangre yen la orina. Por otro lado, según los experimentos clásicos efectuados por el bioquímico alemán F. Knoop en 1904, se observó que en los conejos de labora~ torio a los que se administraba un ácido graso de número par de átomos de carbono, marcado con un grupo fenilo en el grupo metilo terminal (carbono (ti), se producía excreción de ácido fenil~acético en la orina, independientemente de la lon~ gitud de la cadena carbonada del ácido suministrado. Por otra parte, al administrarse derivados (r)~fenílicos de ácidos grasos con número impar de átomos de carbono, se excretaba .~ benzoico (fig. 20~2). Debemos recordar que los ácidos ben~ zoico y fenilacético aparecen en la orina en forma de ésteres del ácido D~glucurónico. Estos resultados dan a entender que los ácidos grasos (tI~fenílicos se degradan por eliminación oxidativa de fragmentos sucesivos de dos átomos de carbono a partir del extremo carboxílico.

Basándose en estos experimentos, seguramente los prime~ ros que se efectuaron CQn trazadores metabólicos, descri~ tos, Knoop postuló que los ácidos grasos se oxidan por Il.~oxidación; es decir, que se oxidan en el átomo de carbono f3 para dar un fl~oxoácido, el cual se supuso que experimenta su escisión para dar ácido acético y un ácido graso con dos átomos de carbono menos.

Sin embargo, durante muchos años, los esfuerzos por de~ mostrar que la oxidaciÓn de los ácidos grasos podía producirse en extractos de tejidos animales exentos de células resultaron infructuosos: se creyó que los enzimas implicados precisaban la estructura celular intacta. En 1943 L. F. Leloir y J. M. Muñoz, en la Argentina, consiguieron demostrar que la oxi~ dación de los ácidos grasos tenía lugar en un sistema exento de células, observándose que el sistema era sumamente lábil. Poco tiempo después, A. L. Lehninger, en los Estados Unidos, demostró que se precisaba A TP para la oxidación de los ácidos grasos, manifestando que el ácido graso es enzimá~ ticamente activado en su grupo carboxilo. Descubrió también que los ácidos grasos se oxidan para dar unidades dedos átomos de carbono, que pueden incorporarse al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. En 1948, E. P. Kennedy y Lehninger demostraron que la oxidación de los ácidos grasos tiene lugar exclusivamente en las mitocondrias.

556

FIGURA 20-1 Cuel'pos cetónicos.

CH$-C-C~COOH

11 O

Ácido acetoacético

CHa

~COOH HO H

Ácido D-,8-hidroxibutírico

FIGURA 20-2

Experimentos de Knoop de oxidación de ácidos gl'asos <»-fenílicos en conejos. Los ácidos con un número pal' de átomos de cal'bono l'inden siempl'e ácido fenilacético. y los de númel'O impal' siempre producen ácido benzoico. como pl'oducto de excl'eción final. A partir de estos resultados dedujo que el ataque oxidante comienza en el cal'bono ,8 y va seguido' de la escisión de sucesivos fl'agmentos de dos cal'bonos de la cadena. donde indican las flechas. probablemente. en fOl'ma de ácido acético.

Ácidos de número par de carbonos

Q ., CH.

1

1-CH. 1 CH. 1-CH. 1

f3CH. 1-

CH.

aCH. 1

COOH

~ ! ! ~

Q CH. I COOH

Ácido fenilacético

Acidos de número impar de carbonos

Q ., CH. 1-CH. I CH. 1-CH. I CH. 1-CH. I

f3CH. 1-

aCH. 1 COOH

! ! ~ ~

Q COOH

Ácido benzoico

FIGURA 20-3 Espiral de la oxidación del ácido graso. En cada vuelta se separa un acetil-CoA a lo largo de la secuencia. Una molécula de ácido palmítico (Cl')' después de ser activada a palmitoil-CoA, rinde ocho moléculas de acetil-CoA.

R-CH2-CH2-CH2 -COCoA (C",)

~FAD t FADH2

R-CH2-CH=CH-COCoA

H20-j H I

R-CH2-C-CH2-COCoA I

OH

~NAD+

t NADH

R-CH2-C-CH,-COCoA 11 O

CoA 1 R-CH2-COCoA + acetil-CoA

----+ acetil-CoA

----+ acetil-CoA

----+ acetil-CoA

----+ acetil-CoA

----+ acetil-CoA

----+ acetil-CoA

Acetil-CoA

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

La nueva pista que condujo rápidamente al reconocimiento de la naturaleza de las etapas enzimáticas de la oxidación de los ácidos grasos provino del trabajo de F. Lynen y cohIbo;' radores en Alemania, quienes descubrieron que la activación, dependiente del A TP, de los ácidos grasos, implica su este­rificación con el grupo tiol del coenzima A (pág. 348) para rendir un derivado acil-CoA, y que todas las subsiguientes etapas oxidativas tienen lugar con el ácido graso en forma de su tioéster con el CoA. Los diversos enzimas que catalizan las sucesivas etapas de la oxidación de los ácidos grasos se han aislado, a partir de entonces y en forma muy purificada, en los laboratorios de Lynen, D. E. Green, S. Ochoa y otros investigadores.

Esbozo del ciclo de oxidación de los ácidos grasos

Antes de experimentar su oxidación, los ácidos grasos de cadena larga presentes en el citosol deben sufrir una activa­ción enzimática muy compleja, seguida del transporte a través de las membranas mitocondriales hasta el compartimiento prin­cipal. Allí, el grupo acilo-graso es transferido al coenzima A intramitocondrial, rindiendo un tioéster del acil(graso) -CoA. La subsiguiente oxidación de este último, esbozada en la fi­gura 20;..3, se verifica por completo en la matriz mitocondrial (pág. 521). El acil(graso) -CoA, se deshidrogena por elimina­ción de un par de átomos de hidrógeno procedentes de los átomos de carbono a y {3 (átomos 2 y 3) para dar el a, {3, oÁ2-acilo-insaturado-CoA. Este se hidroliza después enzimá­ticamente para formar un ,8-hidroxiacil-CoA, que a su vez se deshidrogena en la etapa siguiente para dar el {3-cetoacil­CoA. ~ste experimenta después una escisión enzimática por reacción con una segunda molécula de CoA. Uno de los pro­ductos es el acetil-CoA, derivado de los átomos de 1 y 2 de la cadena de ácido graso original, y el otro es un acil-CoA de ácido graso saturado de cadena larga, con dos átomos de carbono menos que el ácido graso original. que se convierte entonces en el sustrato de otra ronda de reacciones que co­mienza en la primera etapa de deshidrogenación y finaliza con la eliminación de un segundo fragmento de dos átomos de carbono en forma de acetil-CoA (fig. 20-3). A cada vuel­ta de esta espiral. la cadena de ácido graso pierde un frag­mento de dos carbonos en forma de acetil-CoA. Por tanto, el ácido palmítico, de 16 átomos de carbono, experimenta así un total de siete de tales ciclos, para rendir en total 8 molé­culas· de acetil-CoA y 14 pares de átomos de hidrógeno. El palmitato debe «cebarse» o activarse solamente una vez, ya qúe al final de cada vuelta aparece el ácido graso acortado. en forma de tióster del CoA.

Los átomos de hidrógeno eliminados durante la deshidro­genación del ácido graso se incorporan a la cadena respira­toria; a medida que los electrones pasan al oxígeno molecular a través del sistema citocrómico, se va produciendo la fosfo­rilación oxidativa del ADP a ATP. El acetil-CoA formado como producto del sistema de oxidación del ácido graso se incorpora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Estudiaremos ahora detalladamente las etapas enzimáticas individuales de la activación y de la oxidación del ácido graso.

557

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

Activación y penetración de los ácidos grasos en las mitocondrias

Existen tres fases en la entrada de los ácidos grasos proce.;. dentes del citoplasma extramitocondrial en el interior de las mitocondrias: 1) la esterificación enzimática del ácido graso libre con el CoA extramitocondrial, impulsada por el A TP, para dar el acil-(graso) -CoA, etapa designada frecuentemente como de activaciÓn del ácido graso, 2) la transferencia del grupo acilo del acil-(graso) -CoA a la molécula transportadora de carnitina. seguida del transporte de la acil-carnitina a tra­vés de la membrana interna y 3) la transferencia del grupo ac:ilo desde la acil-(graso) -carnitina al CoA intramitocondrial, que se produce en la superficie interior de la membrana in­terna.

Activación de los ácidos grasos

Tres enzimas diferentes, por lo menos, catalizan la formación de tioésteres del acil-CoA, siendo cada uno de ellos específico para un intervalo determinado de longitud de cadena de ácido graso. Estos enzimas reciben el nombre de acil-CoA-sinteta­SM... La acetil-CoA-sintetasa activa al ácido acético, al ácido propiónico y el ácido acrílico; la adZo de cadena intermedia­CoA-sinteta,sa activa a los ácidos grasos con 4 a 12 átomos de carbono, mientras que la aciZo de cadena larga-CoA-sinte­~ activa a los ácidos grasos con 12 a 32 o incluso más átomos de carbono. Los dos últimos enzimas activan tanto a los ácidos grasos saturados como a los insaturados, así como a los hidroxiácidos en las posiciones 2- y 3-. Por otra parte, tanto las propiedades como los mecanismos de las tres sintetasas que han sido aisladas eJi forma muy purificada son casi idénticas. La reacción global catalizada por las acil-CoA­sintetasas dependientes del A TP es la siguiente:

RCOOH + ATP + CoA-SH ;::::: RCO-S-CoA + AMP + pp¡ Ácido graso

Acil­(gr.so)-CoA

En esta reacción se forma un enlace tioéster entre el grupo carboxilo del ácido graso y el grupo tiol del CoA; el ATP ex­perimenta una escisión pirotostatolítica (pág. 421) para rendir AMP y pirofosfato inorgánico (PP i ). El equilibrio favorece significativamente la formación del acil-CoA, ya que la ener­gía libre estándar de la hidrólisis de ATP a AMP y PP i es de alrededor de -10,0. kcal, mientras que la del acil-CoA es de alrededor de -7,52 kcal.

En la actuación de la acil-CoA sintetasa está implicado un intermediario unido al enzima; se trata de un anhídrido mixto del ácido graso y del grupo fosfato del AMP, un acil-adeni­l.am (fig. 20A). Se forma sobre el centro activo, descargán­dose piro fosfato al medio. El acil-adenilato ligado, reacciona, a continuación, con el CoA y da como productos acil-CoA y AMP libre. Las acil-CoA-sintetasas se encuentran en la mem­brana mitocondrial externa y en el retículo endoplasmático.

El piro fosfato formado en la reacción de activación puede ser hidrolizado a orto fas fato inorgánico por la pirofosfatasa inorgánica;

558

FIGURA 20-4 Estructura del intermediario adenilato de acilo graso. El grupo acilo aparece en color; R es una cadena alquílica.

0-1

R-C-O-P-O-CH

11 11 ~2 O O O Adenina

HH HH

OH OH

FIGURA 20.5 Transferencia del grupo acilo a la carnitina.

R-C-S-CoA 11

CHa +1

O

+

Ac~-CoA

ru -N-CI-I -CH-CH -COOH u.o.'3 1 "2 1 2

CHa OH Carnitina

1 carnitín-acil .. transferasa

CHa +1

CHa-N-CH2-CH-CH2-COOH 1 1

CHa O 1 c=o 1 R AcU-camitina

+ CoA-SH

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

El efecto neto es la utilización de dos enlaces de contenido energético elevado del A TP para activar una molécula de ácido graso. El AMP formado coo;o el otro producto de la reacción de la acil~CoA~sintetasa se refosforila a ADP por la adenilato~quinasa (pág. 421):

ATP+AMP~ 2ADP

Transferencia a la carnitina

La capacidad de los ácidos grasos saturados de cadena larga para atravesar la membrana mitocondrial interna en forma de tioésteres del CoA es limitada, pero su entrada se ve estimu~ lada, en gran manera, por la carnitina. Se sabía desde hace tiempo que esta sustancia estaba presente en los tejidos ani~ males, pero su importancia no fue reconocida hasta que se descubrió que constituía un factor de crecimiento para el gu~ sano de la harina T enebrio motitor.

1. B. Fritz y otros demostraron que la estimulación de la oxidación de los ácidos grasos por la carnitina se debe a la acción de un enzima, la carnitin~acil~transferasa, que cata~ liza la transferencia del grupo acHo graso desde su enlace tioéster con el CoA a un enlace éster (con oxígeno) con el grupo hidroxilo de la carnitina (fig. 20~5). Como la variación de energía libre estándar de esta reacción es muy pequeña, el enlace acil~carnitinarepresenta, evidentemente, un enlace de alto contenido de energía. El éster O~acílico de la carnitina así formado atraviesa después la membrana mitocondrial in~ terna y llega a la matriz, probablemente mediante un sistema de transporte específico.

Transferencia al CoA intramitocondrial

En la última etapa del proceso de entrada, el grupo acilo es transferido desde la carnitina al CoA intramitocondrial por la acción de un segundo tipo de carnitin~acil~transferasa loca~ lizado en la superficie interior de la membrana interna:

Acil~carnitina + CoA ~ acil~CoA + carnitina

Este complejo mecanismo de entrada, que recibe el nombre de lanzadera del ácido graso (pág. 540), surte el efecto de mantener separados los «pools» extramitocondrial e intra~ mitocondrial de CoA y de ácidos grasos. El aciHgraso)~CoA intramitocondrial se comporta como el sustrato del sistema de oxidación del ácido graso, que está situado en el compar~ timiento interno de la matriz.

Activación de los ácidos grasos por otros mecanismos

Las mitocondrias contienen un segundo tipo de acil~CoA~sin~ tetasa que participa en la activación del ácido graso y que se halla localizado en la matriz mitocondrial. Est~ enzima pre~ cisa GTP en lugar de A TP y provoca una escisión ortofos.­fatolítica del GTP. La reacción global está catalizada por el enzima acil .. CoA .. sintetasa (formadora de GDP):

Ácido graso + GTP + CoA ~ acil .. CoA + GDP + Pi

559

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

Dicho enzima puede utilizar, por tanto, el GTP producido en la matriz mitocondrial durante la fosforilación a nivel del sustrato que se halla asociada a la oxidación del a~oxogluta~ rato (pág. 466) para activar los ácidos grasos libres que se forman en el interior de las mitocondrias.

En algunos microorganismos ·fermentadores de ácidos gra~ sos de cadena corta, por ejemplo el anaerobio estricto Clostri~ dium kluyveri, la formación de los tioésteres acil~CoA se produce por una ruta indirecta. En la primera etapa se forma un acil~fosfato de alto contenido energético del acetato o del butirato por fosforilación directa del grupo carboxilo por el A TP, catalizada por la acetato~quinasa o la butirato~quinasa, respectivamente:

ATP + acetato ~ ADP + acetil~fosfato ATP + butirato ~ ADP + butiril~fosfato

Los acilfosfatos así formados son anhídridos mixtos de un ácido carboxílico y del ácido fosfórico (fig. 20~6), y presen~ tan una estructura análoga al 3~fosfogliceril fosfato forma~ do durante la glucólisis (págs. 415 y 427). Las reacciones descritas anteriormente son endergónicaspero están impulsa~ das hacia la derecha, por la subsiguiente reacción exergónica con el coenzima A, catalizada por la fosfato~acil~transferasa:

Acil fosfato + CoA ~ acil~CoA + fosfato

Primera etapa de deshidrogenación en la oxidación del ácido graso

Después de la formación del acil~CoA intramitocondrial, todas las subsiguientes reacciones del ciclo de la oxidación del ácido graso tienen lugar en el compartimiento interno. En la primera etapa, el tioéster del aciHgraso) ~CoA experimenta una deshidrogenación enzimática por acción de la acn~CoA~ deshidroflenasa en los átomos de carbono en posiciones a y ,(3 (carbonos 2 y 3) para formar A2~enoil~CoA (Hg. 20~7) como producto: la posición del doble enlace se representa por A (pá~ gina 286). El doble enlace A2 formado en esta reacción posee la configuración geométrica transo Recuérdese, sin embargo, que los dobles enlaces de los ácidos grasos no saturados de las grasas naturales tienen casi siempre la configuración c.is (pág. 287). Volveremos más adelante a insistir sobre este interesante tema.

Existen cuatro acil~CoA~deshidrogenasas diferentes, cada una de ellas específica para un intervalo de longitud de ca~ dena del ácido graso determinado. Todas ellas contienen el dinucleótido de adenina y de flavina (F AD) íntimamente uni~ do como grupo prostético. El F AD es reducido a expen~ sas del sustrato, proceso que ocurre, probablemente, a través de distintas etapas monoelectrónicas (pág. 496).

El FADH2 de la acil~CoA~deshidrogenasa reducida no pue~ de reaccionar directamente con el oxígeno, pero cede sus electrones a la cadena respiratoria (fig. 20~8) a través de una segunda flavoproteína, la flavoproteína transferidora de elec~ trones, la cual, a su vez, cede los electrones a algún trans~ portador de la cadena respiratoria todavía no identificado con certeza, pero que probablemente se trata del coenzima Q.

560

FIGURA 20-6 Fosfato de acetilo.

0-1

CH -c-o-P-O-3 11 11

O O

FIGURA 20-7 Reacción de la acil-CoA deshidrogenasa. La proteína enzimática (E) y_su grupo prostético flavínico íntimamente unido funcionan como una unidad.

fJ a 3 2 1

R-CH -CH -C-S-CoA 2 2 11

O

+

@-FAD

1 H

1 R-C=C-C-S-CoA

1 11 H O .12-trans-enoil-CoA

+

@-FADH.

FIGURA 20-8 Transporte electrónico desde el acil-CoA hasta el oxígeno (véase también fig. 18-14, pág. 504).

Acil-(graso) -CoA .

1 e-

Acil-(graso) -CoA­-deshidrogenasa

Flavoproteina de transferencia

electrónica

Citocromo b

t t ! ! !

Oxigeno

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

FIGURA 20-9 Acción de la a2-enoil-CoA-hidratasa.

A. Sobre sustrato transo B. Sobre sustratos cis

H H H 1 1 1

R-CI-I.-C=C-C-S-CoA a2 -trans-Enoil-CoA R-CH. -C=C-C-S-CoA 2 11

a2-cis-Enoil-CoA 1 11

H O O

- H20 II + H20 enoil-CoA-hidratasa - H20 II + H20 enoil-CoA-hidratasa

R~C-S-COA . HOH 11

L-3-Hidroxiacil-CoA R~C-S-COA D-3-Hidroxiacil-CoA

FIGURA 20-10

3-Cetoacil-CoA.

O

4 3 2 1

R-CH -C-CH -C-S-CoA 2 11 2 11

O O

HO H 11 O

Etapa de hidratación

A continuación el doble enlace del éster A2~trans~enoil~CoA se hidrata para formar el 3~hidroxiacil~CoA por acción del enzima enoil~CoA~hidratasa, que ha sido aislado en estado cristalino. La reacción catalizada aparece en la figura 20~9. La adición de agua al doble enlace A2~trans es estereoespecí~ fica y da por resultado la formación del L~estereoisómero del 3~hidroxiacil~CoA. La enoil~toA~hidratasa hidrata también a los ésteres de los acilos A3~insaturados del CoA (véase más adelante), así como a los tioésteres acil A2~cis~insaturados~ CoA, produciendo en este último ~aso el correspondiente D~este¡:eoisómero del 3~hidroxiacil~CoA (fig. 20~9). Esta apa~ rente falta de especificidad puede parecer desconcertante, ya que el siguiente enzima en el ciclo de oxidación del ácido graso es absolutamente específico para el L~estereoisómero del 3~hidroxiacil~CoA. Veremos más adelante, sin embargo, que tanto los L~ como los D~estereoisómeros del 3~hidroxiacil~CoA desempeñan su papel en el metabolismo de los ácidos grasos, aunque difieran en su origen y función (pág. 676).

Segunda etapa de deshidrogenación

En la siguiente etapa del ciclo de oxidación del ácido graso se deshidrogena el L~3~hidroxiacil~CoA para formar 3~oxoacil~ CoA (véase fig. -20~10) por acción de la 3~hidroxiacil~CoA­deshidrogenasa. El NAD+ és el aceptor de electrones especí~ fico. La reacción es

L~3~hidroxiacil~CoA + NAD+ ;;:>!:

3~oxoacil~CoA + NADH + H+

Este enzima es relativamente no específico con respecto a la longitud de cadena del ácido graso, pero es absolutamente específico para el L~estereoisómero. El NADH formado en la reacción cede sus equivalentes electrónicos a la NADH~des~ hidrogenasa de la cadena respiratoria mitocondrial (pág. 496).

Etapa de escisión

En la última etapa del ciclo de oxidación del ácido graso, que es catalizada por la acetil~CoA~acetiltransferasa, conocida más corrientemente por tiolasa,' el 3~oxoacil~CoA experimenta una ruptura por interacción con una molécula de CoA libre,

561

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

para producir en forma de acetil~CoA el fragmento de dos carbonos del carboxilo terminal del ácido graso. El ácido graso restante, que se ha acortado en dos átomos de carbono, aparece en forma de tioéster del coenzima A (fig. 20~ 11 ) .

Esta reacción de escisión, conocida también como tiólisis o escisión tiolítica, es análoga a una hidrólisis; dado que la reac~ ción es muy exergónica, se favorece la ruptura. Existen dos (o quizás tres) formas del enzima, cada una de ellas específica para ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena.

Balance de la oxidación

. Hemos descrito una vuelta del ciclo de la oxidación del. ácido graso en la que se han separado una molécula de acetil~CoA y dos pares de átomos de hidrógeno del compuesto inicial. el aciHgraso de cadena larga)~CoA. La ecuación global de una vuelta del ciclo partiendo del palmitoil~CoA. es

Palmitoil~CoA + CoA + FAD + NAD+ + HlO ~ miristoil~CoA + acetil~CoA + FADHl + NADH + H+

Podemos ahora escribir la ecuación para las siete vueltas del ciclo necesarias para convertir una molécula de palmitoil~CoA en ocho moléculas de acetil~CoA:

Palmitoil~CoA + 7CoA + 7FAD + 7NAD+ + 7HlO ~ 8 Acetil~CoA + 7FADHl + 7NADH + 7H+

Cada molécula de FADH2 cede un par de equivalentes elec~ trónicos a la cadena respiratoria a nivel ~el coenzima Q; dos moléculas de A TP son generadas, por tanto, durante el con~ siguiente transporte electrónico hasta el oxígeno_ (pág. 505). Análogamente, la oxidación de cada molécula de NADH por la cadena respiratoria da por resultado la formación de tres moléculas de ATP (pág. 505). De aquí que se forme un total de cinco moléculas de ATP, por fosforilación oxidativa; por cada molécula de acetil~CoA escindida. Podemos por tanto escribir la ecuación siguiente, que comprende también las fos~ forilaciones oxidativas:

Palmitoil~CoA + 7CoA + 702 + 35P¡ + 35ADP ~ 8 acetil~CoA + 35A TP + 42H-z0 (1 )

Las ocho moléculas de acetil~CoA formadas en el ciclo del ácido graso pueden incorporarse ahora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La ecuación siguiente representa el balance de su oxidaci6n y de las fosforilaciones acopladas (véase pá9i~ na 526):

8 Acetil~CoA + 1602 + 96P¡ + 96ADP ~ 8CoA + 96ATP + 104H20 + 16CÜz (2)

Combinando las ecuaciones (1) y (2) obtenemos la ecuación global

Palmitoil~CoA + 2302 + 131Pi + 131ADP ~ CoA + 16C02 + 146H20 + 131ATP (3)

562

FIGURA 20~ 11 Escisión tiolítica del 3~xoacil~CoA.

R I C~ I C=Q I r~ C=Q I S-CoA

+ CoA-SH

acetil-transferasa II acetil-CoA

R I C~ I C=Q I S-CoA

+

CRa I C=Q I S-CoA

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

Como en realidad se emplean dos moléculas de ATP para formar el palmitoil~CoA a partir del palmitato (véase pági~ na 558), el rendimiento neto de A TP por molécula de palmi~ tato es de 129. La ecuación global para la oxidación del pal~ mitato es, por tanto,

Palmitato + 2302 + 129P¡ + 129ADP ~ 16C02 + 145H20 + 129ATP (4)

Las ecuaciones parciales para los procesos exergónicos y en~ dergónicos son

Ácido palmítico + 2302 -- 16C02 + 16H20 ACo, = -2340 kcal mol-1

129ADP + 129Pi -- 129ATP + 129~0 ACo, = 129 x 7,30 = +942 kcal mol-1

Por tanto, cerca del 942/2340 X 100 = 40 % de la energía libre estándar de la oxidación del ácido palmítico se recupera en forma de fosfato de alta energía.

Igualación de ecuaciones metabólicas globales

Gran parte de la bioquímica puede resumirse en una ecuación global igualada para un proceso metabólico determinado. La suma de las ecuaciones equilibradas de cada una de las etapas componentes de una secuencia metabólica puede resultar abu~ rrida y larga. Existe otro método, que daremos aquí, que proporciona en muchos casos un ahorro de tiempo.

Supóngase que se desea escribir la ecuación global inclu~ yendo las reacciones de fosforilación asociadas para la com~ bustión completa del ácido láurico, un ácido graso saturado de 12 átomos de carbono, a CO2 y H20, tal como ocurre en una célula típica. Comenzaremos por escribir e igualar la ecua~ ción química para la combustión del ácido láurico tal como ocurriría, por ejemplo, en una bomba calorimétrica en ausencia de las reacciones de fosforilación acopladas:

CllH23COOH + 1702 -- 12C02 + 12H20 (5) Ácido láurico

A esta ecuación se añaden a continuación las reacciones que implican la formación de A TP. Para la escisión del ácido láurico en 6 acetil~CoAs, existen 5 etapas de producción de FADH2, cada una de las cuales rinde 2ATPs por etapa, o bien 10 ATPs y 5 etapas generadoras de 5NADH, cada una de las cuales rinde' 3A TPs por etapa, o 15 A TPs. El total es de 25 ATPs. Para la combustión completa de las porciones acilo de los 6 acetil~CoAs producidos se precisan 6 vueltas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que rinden 6 X 12 ATPs = 72 ATPs. Tenemos, de este modo, 97 ATPs pro~ ducidos. Podemos escribir una ecuación igualada para su formación:

97ADP + 97Pi -- 97ATP + 97H20 (6)

Sumando las ecuaciones (5) y (6), tenemos

CllH23COOH + 17~ + 97ADP + 97P¡--12C02 + 97ATP + 109H20 (7)

563

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

Cuando el ácido Jáurico se convierte en lauroil~CoA, un A TP se transforma en AMP y PPi:

ATP + HzO == AMP + pp¡ (8)

El pp¡ producido en la ecuación (8) se transforma en dos Pi por acción de la pirofosfatasa:

(9)

Sumando las ecuaciones (8) Y (9), tenemos

ATP + 2HzO ~ AMP + 2P¡ (10)

Si se suman las ecuaciones (7) y (10), obtenemos

CllH23COOH + 170z + 95P¡ + 97 ADP ~ 12COz + 96ATP + 107HzO + AMP (11)

Después, el AMP se fosforila a ADP a expensas del ATP por acción de la adenilato~quinasa:

AMP + ATP == 2ADP (12)

Sumamos ahora las ecuaciones (11) Y (12) para dar la ecua~ ción global para la combustión del ácido láurico:

CllHz3COOH + 170z + 95P¡ + 95ADP -----+

12COz + 95ATP + 107HzO (13)

Se consume un total de 34 átomos de oxígeno, que pode~ mos distribuir del modo siguiente: la reoxidación de las 5 flavoproteínas reducidas durante la escisión del lauroil~CoA para dar 6 acetil~CoAs, precisa 5 átomos de oxígeno. La reoxidación de los 5 NADHs producidos durante la escisión del lauroil~CoA a 6 acetil~CoAs precisa 5 átomos de oxígeno. La reoxidación de los transportadores electrónicos reducidos producidos en las 6 vueltas del ciclo de los ácidos tricarboxí~ licos durante la oxidación de los 6 acetil~CoAs precisa 24 átomos de oxígeno. El total es 34 átomos de oxígeno, o sea 17 moléculas de oxígeno.

Observemos que se produce una gran cantidad de agua durante la combustión completa de un ácido graso, y que la mayor parte de ella deriva de las reacciones de fosforilación asociadas. Este hecho es de cierta significación biológica, ya que explica que algunos animales puedan obtener tanta agua como combustible de sus reservas grasas. Así es como se «almacena» agua en forma de grasa en la giba del camello.

Oxidación de los ácidos grasos no saturados

Los ácidos grasos no saturados, como por ejemplo el ácido .oleico, se oxidan por la misma ruta general que los ácidos grasos saturados, pero en este caso se plantean dos problemas especiales. Los dobles enlaces de los ácidos no saturados que se encuentran en la naturaleza tienen la configuración cís (pág. 287), mientras que los intermediarios acílicos A2~insatu~ rados del CoA, de la oxidación de los ácidos grasos satura~

564

FIGURA 20-12

Eliminación por oxidación de tres unidades de acetil-CoA del ácido oleico para producir un t..3-cis-enoil-CoA.

18

11

10 I 9 cis

8 Oleil-CoA

:f O=í

S I CoA

1 12

: I cis

O=C I S I CoA

FIGURA 20-13

Reacción de la enoil-CoA-isomerasa.

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

dos presentan la configuración trans, tal como hemos visto. Además, los dobles enlaces de la mayoría de los ácidos grasos insaturados se encuentran en posiciones tales de la cadena car~ bonada que la eliminación sucesiva de fragmentos de dos átomos de carbono a partir del extremo carboxílico produce derivados acílicos grasos ¡l3~no saturados del CoA en lugar de los acilos grasos insaturados t:..2 del CoA, que funcionan como intermediarios normales en el ciclo del ácido graso. Véase para la oxidación del ácido oleico la figura 20~ 12.

Estos problemas se han resuelto gracias al descubrimiento de un enzima auxiliar, la enoil~CoA~isomerasa, que cataliza un desplazamiento reversible del doble enlace desde la con~ figuración A3~cis a la A2~trans (fig. 20~13). El aciHgraso insa~ turado~A2~trans) ~CoA resultante es el sustrato normal para el enzima siguiente de la secuencia de oxidación del ácido graso, la enoil~CoA~hidratasa, que hidrata a aquél para formar L~3~hidroxiacil~CoA (véase más atrás). La oxidación com­pleta del oleil-CoA para producir nueve unidades de acetil­CoA por el ciclo de oxidación del ácido graso requiere, por tanto, una etapa enzimáti~a adicional catalizada por la enoil­CoA~isomerasa, . además de las necesarias para la oxidación de los ácidos grasos saturados.

Los ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido lino~ leico (pág. 287), necesitan un segundo enzima auxiliar para completar su oxidación, ya que contienen dos o más dobles enlaces en posición cis. Si se separan del linoleil-CoA tres unidades sucesivas de acetil~CoA, queda un doble enlace A3~cis, 10 mismo que ocurría en el oleil-CoA (fig. 20-14). Aquél se transforma por intervención de la enoil-CoA isome­rasa anteriormente descrita, en el isómero ¡l2-trans, mientras que éste experimenta las reacciones habituales, con pérdida de dos acetil~CoAs, que dejan un ácido de ocho carbonos A2-insaturado (fig. 20~ 14). Obsérvese, sin embargo, que el doble enlace del último se halla en configuración cis. Aunque el doble enlace A2_cis puede ser hidratado por la enoil-CoA­hidratasa, el producto es el D-estereoisómero de un 3-hidro­xiacil-CoA, no el L~estereoisómero que se forma normalmente durante la oxidación de los ácidos grasos saturados. El em~ pleo del D~estereoisómero precisa de un segundo enzima auxi~ liar, la 3~hidroxiacil~CoA~epimerasa, que cataliza la epimeri­zación en el átomo de carbono 3 para rendir el isómero L (fig. 20~ 14). El producto de esta reacción reversible es oxidado después por la 3-hidroxiacil~CoA deshidrogenasa, específica del isómero L~, y a continuación se escinde por acción de la tiolasa, con lo que se completa el ciclo de la oxidación. El acil-(graso saturado) ~CoA, seis carbonos, que deriva del ácido linoleico, puede oxidarse seguidamente para dar tres moléculas de acetil~CoA. Estos dos enzimas auxilia~ res del ciclo de oxidación del ácido graso hacen posible la oxidación completa de todos los ácidos no saturados corrientes encontrados en los lípidos que existen en la naturaleza. El número de moléculas de A TP producidas durante la oxida~ ción completa de un ácido graso no saturado es algo menor que el formado en la oxidación del ácido graso saturado correspondiente, ya que los ácidos grasos no saturados poseen un número menor de átomos de hidrógeno y, por tanto, menos electrones que transferir al oxígeno por la vía de la cadena respiratoria.

565

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCiÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

FIGURA 20-14 Rufa de la oxidación del ácido linoleico mostrando la acción de enzimas auxiliares.

18 cis

17 15 13 12 10 9

Linoleil-CoA

3 Acetil-CoA

C-S-CoA --!<:.----" 11 O

o 2 AcetU-CoA ~o~~A ~1

C-S-CoA .!Somerasa > 12 10 8... . 5 3 C-S-CoA -_<!..._--.... 12 8

cis 10

cis

11 9 6 4 11 ~~ O 11 9 7 6 4 2

A' -cis-A 6 -cis-DienoU-CoA A1-trans-A' -cis-DienoU-CoA

O 11

8 6 4 28 6 4 2

8 6 4 . . C-S-CoA ~

~C-S-COA. > ~C-S-COA H OH 11 3-hidroxiacil- HO H 11

3 2 enoil-CoA hidratasa

O CoA-epimerasa O A'-cis-Enoil-CoA D-3-hidroxiacil-CoA L-3-hidroxiacU-CoA

Cuerpos cetónicos y su oxidación

El hígado de muchos vertebrados posee la capacidad enzimá~ tica de desviar parte del acetil~CoA procedente de la oxida~ ción del ácido graso o del piruvato, probablemente durante los períodos de formación excesiva, hacia la producción de acetoacetato libre y de D~,B~hidroxibutirato, los cuales son transportados por la sangre a los tejidos periféricos, donde pueden ser oxidados por medio del ciclo de los ácidos tricar~ boxílicos. Estos compuestos (fig. 20~1), junto con la acetona, reciben colectivamente el nombre de cuerpos cetónicos. El acetoacetato libre, que es la fuente principal de los demás cuerpos cetónicos, se forma a partir del acetoacetil~CoA; cierta cantidad de éste procede de los cuatro últimos átomos de carbono de un ácido graso de cadena larga después de la eliminación oxidativa de sucesivos restos de acetil~CoA en la matriz mitocondrial. Sin embargo, la mayor parte del aceto~ acetil~CoA formado en el hígado procede de la condensación cabeza~cola de dos moléculas de acetil~CoA derivadas de la oxidación del ácido graso por acción de la acetil~CoA-acetil,., transferasa:

Acetil~CoA + acetil~CoA ~ acetoacetil-CoA + CoA

El acetoacetil-CoA formado en estas reacciones experimenta después la pérdida del CoA en un proceso conocido como desacilación para dar acetoacetato libre, mediante una ruta especial que tiene lugar en la matriz mitocondrial. Implica ésta la formación y escisión enzimática del f3-hidroxi~f3~metilglu'­taril~CoA (fig. 20-15), intermediario que también actúa como precursor de los esteroles. La suma de las dos reacciones que aparecen en la figura 20-15 es

Acetoacetil~CoA + H20 ~ acetoacetato + CoA

El acetoacetato libre así producido, se reduce enzimática~ mente a D~,B~hidroxibutiratopor la D-f3-hidroxibutírato deshi­drogenasa ligada al NAO, que se halla localizada en la membrana mitocondrial interna. Este enzima es específico.

566

FIGURA 20-15 Desacilación del acefoacetil-CoA.

CH3-C-CH2 -C - S-CoA

~ ~ Acetoacetil-CoA

+ CH3CO-S-CoA Acetil-CoA

H.O ~ hidroximetil-glutaril-CoA­CoA 1 sin tasa

COOH 1

CH. 1

HO-cr-CH3 ,8-Hidroxi-,8-metU­glutaril-CoA

CH2

1 C-S-CoA

11 O

lhldroximetil-glutatU-coA. Iiasa

CH3-C-CH2-COOH Ácido aceto-acético 11 O

+

CH3CO-S-CoA Acetil-CoA

Capitulo 20 Oxidación .de los ácidos grasos

FIGURA 20;16 Transferencia de CoA desde el succinil;CoA al ácido acetoacético.

COOH I

CH3

I c=o I

3-oxoácido-CoA .. trans{erasa

COOH I

CH3

I c=o CH. CH. I + eH.

I CH.

I CH.

+ CH. I C-S-CoA

I COOH

I COOH

I c=o I 11

O S-CoA

SuccinU;CoA Ácido acetoacétlco Ácido succinlco Acetoacetil-CoA

para el estereoisómero 0- libre, y no oxida al o-ft-hidroxibu­tiril-CoA:

Acetoacetato + NADH + H+ ~ o-p-hidroxibutirato + NAD+

La mezcla de acetoacetato libre y de ft-hidroxibutirato resul­tante de esta reacción puede difundirse fuera de las células hepáticas a la corriente sanguínea y ser transportada a los tejidos periféricos. Normalmente, la concentración de cuer­pos cetónicos en la sangre es muy baja, pero en el ayuno, o la enfermedad diabetes mellitus, puede alcanzar niveles suma­mente elevados. Este estado, conocido como cetosis. aparece cuando la velocidad de formación de los cuerpos cetónicos· por el hígado. rebasa la capacidad de los tejidos periféricos para utilizarlos, provocando su consiguiente acumulación en la sangre. I

El o-ft-hidroxibutirato se oxida a acetoacetato en los tejidos periféricos, donde este último es activado posteriormente por transferencia de CoA del succinil-CoA (lig. 20-16). El suc­cinil-CoA necesario procede de la oxidación del a-oxogluta­rato (pág. 466). El acetoacetil-CoA formado en los tejidos periféricos por estas reacciones experimenta a continuación la escisión tiolítica, rindiendo dos moléculas de acetil-CoA, que pueden incorporarse al ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Aunque el .ft-hidroxibutira'to puede ser utilizado por medio del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en todos los tejidos, su empleo por el cerebro en ciertas condiciones reviste caracte­rísticas especiales. Normalmente, el cerebro, de forma casi exclusiva, emplea glucosa como combustible; sin embargo, en períodos de ayuno prolongado, en que el suministro de glu­cosa se ve limitado, el cerebro puede emplear el ,8-hidroxibu­tirato producido a partir de los ácidos grasos en el hígado como combustible de oxidación principal. Mediante las reac­ciones anteriormente mostradas, se convierte en acetil-CoA, que se incorpora después al ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Oxidación de los ácidos grasos de número impar de carbonos. Destino del propionil-CoA

Los ácidos grasos de número impar de carbonos, que son escasos, pero que se presentan en algunos organismos ma­rinos (pág. 287), pueden ser oxidados también en el ciclo de oxidación de los ácidos grasos. Se separan sucesivamente restos de acetil-CoA, hasta que se llega al propionil-CoA, resto terminal de tres carbonos. Este compuesto se forma

567

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGÍA DEL ENLACE FOSFATO

también en la degradación oxidativa de los aminoácidos valina e isoleucina (pág. 589). El propionil~CoA experimenta la carboxilación enzimática en un proceso dependiente del A TP, formando Ds~metilmalonil~CoA (fig. 20~17), reacción que es catalizada por la propionil, ... CoA~carboxilasa. Este enzima contiene biotina como grupo prostético (pág. 351). En la etapa siguiente el Ds~metilmalonil~CoA experimenta una epimeriza~ ción enzimática a LR~metilmalonil~CoA por acción de la metil~ malonil~CoA~racemasa (fig. 20~18). En la siguiente etapa de reacción, catalizada por la metilmalonil~CoA mutasa, el LR~metilmalonil~CoA (Hg. 20~ 18) se isomeriza a succinil~CoA, que puede experimentar su desacilación por inversión de la reacción de la succinil~CoA~sintetasa (pág. 468) para rendir succinato libre, uno de los intermediarios del ciclo de los áci~ dos tricarboxílicos.

La metilmalonil~CoA mutasa necesita al coenzima B!2 (pá~ gina 354) como cofactor. El estudio de esta reacción intra~ molecular por medio de trazadores isotópicos ha revelado que ésta tiene lugar por emigración del grupo -CO-S-CoA completo, desde el átomo de carbono 2 del metilmalonil~CoA al átomo de carbono metílico, a cambio de un átomo de hidrógeno.

Los enfermos aquejados de anemia permclosa, que son deficientes en vitamina B!2 debido a su falta de factor intrín~ seco (pág. 356), excretan por la orina grandes cantidades de ácido metilmalónico así como de su precursor el ácido propió~ nico, lo cual d,emuestra que en tales pacientes la reacción de la metilmalonil~CoA~mutasa, dependiente del coenzima B12,

es defectuosa.

Rutas secundarias de la oxidación de los ácidos grasos

Los a~hidroxiácidos grasos encontrados en algunos cerebrósi~ dos y gangliósidos (cap. 11, págs. 298 y 300) de los tejidos animales se forman en la hidroxilación enzimática de los áci~ dos grasos saturados por acción de una monooxigenasa (pá~ gina 512):

RCH2CH2COOH + cofador reducido + O2 ~ RCH2CHOHCOOH + H20 + cofactor oxidado

o:~ Hidroxiácido graso

El cofactor reducido puede ser el ácido ascórbico o la tetra~ hidrobiopterina (pág. 582).

Los ácidos grasos experimentan también oxidación en el hígado, en el átomo de carbono (1), para formar en último tér~ mino ácidos a y (1)~dicarboxílicos. Esta ruta se llama de la (1)~oxidación, y su función en los mamíferos es desconocida todavía.

En las semillas de las plantas en germinación, se produce una ruta especial para la oxidación del ácido graso, llamada a~oxidación (fig. 20~19), en la que el carbono carboxílico del ácido graso se pierde en forma de CO2 y el átomo de car~ bono a se oxida a grupo aldehído a expensas del peróxido de hidrógeno. Esta reacción es catalizada por la peroxidasa del ácido graso. El peróxido de hidrógeno necesario es apor~ tado gracias a la oxidación directa de las flavoproteínas redu~ cidas por el oxígeno molecular. El aldehído graso formado es oxidado al correspondiente ácido carboxílico. Esta secuen~

568

1 FIGURA 20-17

Carboxilación del propionil-CoA.

CHaCH2C-S-CoA 11 O

+ ATP

+ CO2

+ H.O

1l propionil-CoA-carboxilasa (hidroliza ATP)

COOH 1

H-C-CH

Propionil-CoA

1 a D,-Metilmalonil-CoA C-S-CoA

11 O

+ ADP

+ Pi

FIGURA 20-18

Racemización del metilmalonil-CoA y su conversión en succinil~CoA, En la última reacción obsérvese que todo el grupo -C-S-CoA es transferido desde el átomo

11 O

de carbono 2 al átomo de carbono metílico.

COOH 1

H-C-CH 1 3

C-S-CoA 11 O

II metllmalonil-CoA­racema,sa

tCOOH

2 1 3CH3-C-H

1

C-S-CoA 11 O

II meUlmalonU.CoA. mutasa

tCOOH 1

2CH2

1 3CH2

1

C-S-CoA 1I O

Ds-Metilmalonil­CoA

LR-Metilmalonil­CoA

Succinil-CoA

FIGURA 20-19

R.uta de la a-oxidación.

RCI-ltCI-ltCOOH

2I-1t(),¡ ~perOXidasa de ácido graso

3H20

RCI-ltCH + CO2

11 O

RCH2COOH Ácido graso

y-NADH

"'\ NAD+

RCI-ltCI-ltOH Alcohol graso

Capítulo 20 Oxidación de los ácidos grasos

cia de reaCClOn de dos enzimas se repite después sobre el ácido graso acortado. Como la peroxidasa del ácido graso ataca solamente a los ácidos grasos que tienen de 13 a 18 átomos de carbono, esta ruta no puede conducir a la oxidación completa de los ácidos grasos de cadena larga. Los aldehídos producidos por la a-oxidación pueden experimentar alternati­vamente una reducción para dar alcoholes grasos de cadena larga, que se producen en grandes cantidades en las ceras vegetales.

Resumen

Los ácidos grasos libres de los tejidos animales son activados, en primer lu­gar, por esterificación para formar tioésteres acHicos del CoA en la mem­brana mitocondrial externa, convirtiéndose después en ésteres O-acilicos grasos de la carnitina, que pueden atravesar la membrana mitocondrial in­terna y penetrar en la matriz, en donde se vuelven a formar de nuevo los tioésteres de los acilos grasos y del CoA, acil-(graso)-CoA. Todas las eta­pas subsiguientes de la oxidación de los ácidos grasos tienen lugar en forma de ésteres del CoA dentro de la matriz mitocondrial. La eliminación de sucesivas unidades de acetil-CoA por oxidación del acil-(graso saturado de cadena larga)-CoA, recibe el nombre de ,8-oxidación. Se necesitan cuatro etapas de reacción para separar cada resto de acetil-CoA: 1) la deshidrogenación de los átomos de carbono 2 y 3 por acción de las deshidrogenasas de acil-(graso)-CoA dependientes del FAD, 2) la hidra­tación del doble enlace A.'-trans resultante por la enoil-hidratasa, 3) la deshidrogenación del L-,8-hidroxi-acil-(graso)-CoA mediante una deshidro­genasa NAD+-dependiente, y 4) una escisión (tiólisis) que necesita CoA, del ,8-oxoacil-(graso)-CoA, para formar acetil-CoA y el tioéster del CoA de un ácido graso acortado en dos átomos de carbono, el cual puede reincorporarse a la secuencia. Para la oxidación completa del ácido palmítico, de 16 átomos de carbono, se necesitan siete ciclos a través del sistema, produciéndose en conjunto ocho moléculas de acetil-CoA. Los electrones que se separan en las dos etapas de deshidrogenación fluyen hacia el oxigeno a lo largo de la cadena respiratoria, acompañados de la fosforilación oxidativa del ADP. El acetil-CoA formado durante la oxidación del ácido graso se oxida después a CO, y H,O mediante el ciclo de los ácidos tricarboxilicos. La ecuación global para la oxidación del ácido palmítico es

Ácido palmítico + 230, + 129P¡ + 129ADP --+ 16CO, + 145H,O + 129ATP

En este proceso, cerca del 40 % de la energía libre estándar de la oxida­ción del ácido palmítico se recupera en forma de fosfato de energía elevada.

Los ácidos grasos insaturados necesitan unas etapas enzimáticas adi­cionales con objeto de 1) desplazar los dobles enlaces a una posición adecuada para la etapa de hidratación, y 2) producir el L-estereoisómero del intermediario 3-hidroxi. Los cuerpos cetónicos acetoacetato y ,8-hidro­xibutirato se forman en el hígado como consecuencia de la desacilación del acetoacetil-CoA. Luego son transportados a otros tejidos, en donde se oxidan por medio del acetil-CoA y del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los ácidos grasos de número impar de carbonos ~e oxidan a acetil-CoA y a propionil-CoA. La carboxilación del propionil-CoA rinde metilmalonil­CoA, que .experimenta isomerización a succinil-CoA. Tanto la hidroxila­ción en a como la oxidación en posición '" representan rutas secundarias del metabolismo de los ácidos grasos en los animales. En los vegetales. la a-oxidación de ácidos grasos de cadena larga conduce a la formación de aldehídos grasos. que se reducen posteriormente a alcoholes grasos. componentes a su vez de las ceras vegetales.

Bibliografía

Libros

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569

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCIÓN DE LA ENERGíA DEL ENLACE FOSFATO

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Artículos

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Problemas

1. Escríbanse las ecuaciones igualadas para los siguientes procesos meta­bólicos, incluyendo todas las etapas de activación necesarias y todas las fosforilaciones oxidativas. Supóngase que las reacciones se realizan en el hígado, el riñón o el corazón y que el oxalacetato es fácilmente asequible.

a) Oxidación del ácido mirístico a acetil-CoA. b) Oxidación del ácido araquidónico a C~ y HzO. e) Oxidación del ácido palmítico a acetoacético. d) Oxidación del monooleil-dipalmitoil-glicérido a COz y HzO. e) Oxídación del ácido n-nonanoico a COz y HzO.

2. Si el ácido n-nonanoico marcado con C" en el átomo de carbono 7 se oxida en condiciones en que está operando el cido de los ácidos tricarboxílicos. bqué átomos de carbono de los intermediarios siguientes quedarán marcados: a) succinato, b) oxalacetato, e) a-oxoglutarato?

3. El piruvato marcado con C 14 en el átomo de carbono 2 se incuba con tejido hepático. ¿Qué·átomos de carbono del ,B-hidroxi-,B-metilglutaril­CoA quedarán marcados rápidamente?

570

CAPíTULO 33 Traducción: biosíntesis de las proteínas

Vamos a considerar ahora el tercero de los grandes interro~ gantes que formula la continuidad genética de los organis~ mos vivos: ¿Cómo se traduce la información genética conte~ nida en la secuencia nucleotídica del RNA mensajero, a la estructura proteica? En este capítulo trataremos de los meca~ nismos por medio de los cuales se construye la cadena poli~ peptídica, y de cómo los ribosomas hacen posible la transfe~ rencia de información genética a una adecuada secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica. En los capítulos si~ guientes estudiaremos otras características del proceso de traducción, esto es, la identificación de los tripletes de código de los aminoácidos, la regulación de la síntesis de las proteínas y el ensamblaje de bioestructuras tridimensionales a partir de una información genética monodimensional.

Los mecanismos enzimáticos por los cuales se forman los enlaces peptídicos de las moléculas proteicas han atraído desde hace tiempo la atención de los bioquímicos. Una de las pri~ meras formulaciones admitía que las peptidasas y los enzimas proteolíticos funcionan no sólo en la degradación, sino tam~ bién en la síntesis de las proteínas por inversión de su acti~ vidad hidrolítica. Sin embargo, cuando se descubrió el papel central desempeñado por el A TP en las reacciones biosinté~ ticas, así como el concepto de que las reacciones biosintéticas y las catabólicas siguen rutas diferentes, la inversión de la actividad hidrolítica pareció un mecanismo improbable para la biosíntesis proteica. De hecho, los primitivos estudios de reac~ ciones que podían considerarse como modelos o prototipos de la síntesis de proteínas, tales como la síntesis enzimática de la glutamina a partir del ácido glutámico (pág. 707). y la formación del glutatión (pág. 726) partiendo de sus amino~ ácidos componentes, revelaron que para la formación de en~ laces amídicos o peptídicos se requería A TP como donador energético. Similarmente, no se disponía de información acerca de la manera como se construía la cadena polipeptídica. Una de las primeras suposiciones era la de que primero se forma~ ban péptidos cortos y que después éstos se ensamblaban para formar las cadenas polipeptídicas.

Pero hasta que se aplicó la técnica de los trazadores isotó~ picos no se hizo en realidad ningún avan~e significativo en el estudio de la biosíntesis proteica. Las investigaciones sobre

941

PARTE 4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

animales o células intactas realizadas con aminoácidos radiac~ tivos pronto revelaron que las proteínas de los tejidos anima~ les experimentan un recambio (<<turnover») metabólico, que la síntesis proteica requiere una fuente de energía metabólica, y que no eran los péptidos sencillos sino los aminoácidos los verdaderos precursores inmediatos de las proteínas.

La era moderna de la investigación sobre el mecanismo de la biosíntesis proteica comenzó al principio de la década de los 50 con las importantes investigaciones de P. C. Zamecnik y sus colegas en Boston, quienes por vez primera desarrolla~ ron sistemas exentos de células para el estudio de las síntesis de proteínas, e identificaron unas partículas de ribonucleo~ proteína, los ribosomas, como el lugar de la biosíntesis pro~ teica, y descubrieron los tRNAs de transferencia.

Los ribosomas como lugar de la síntesis proteica

Zamecnik y colaboradores inyectaron aminoácidos radiacti~ vos a ratas de laboratorio. A intervalos sucesivos extrajeron sus hígados, los homogeneizaron y fraccio!1aron por centrifu~ gación diferencial (pág. 389). Examinaron entonces las frac~ ciones intracelulares, investigando la presencia de aminoácidos etiquetados que estuvieran incorporados a las proteínas. Si se dejaban transcurrir períodos largos, es decir, horas o días, entre la inyección y el fraccionamiento del hígado, todas las fracciones intracelulares contenían proteína etiquetada. Sin embargo, si el hígado era fraccionado muy poco después de la inyección, solamente la fracción microsómica (pág. 390) era la que contenía proteína radiactiva. Con estos resultados se llegó a la conclusión de que las proteínas son primeramente sintetizadas en unas estructuras intracelulares contenidas en la fracción microsómica, y que después, estas proteínas recién sintetizadas son transferidas desde dichas estructuras a otros componentes celulares. Zamecnik y colaboradores observaron pronto que la incubación de aminoácidos marcados con prepa~ rados de hígado de rata, exentos de células, provocaba tam~ bién la incorporación de radiactividad a las proteínas micro~ sómicas. Esta incorporación de aminoácidos requería la adi~ ción de A TP y de sustratos respiratorios para el aporte de energía. Se comprobó así que para la síntesis de proteínas, no era necesaria la estructura de la célula intacta.

Entonces los homogenados hepáticos se fraccionaron en sus fracciones nuclear, mitocondrial, microsómica y soluble, ensa~ yándose varias combinaciones de estas fracciones y observán~ dos e su capacidad de incorporación de aminoácidos etiqueta~ dos a las proteínas. Se halló que era necesaria la mezcla de dos de las fracciones, la microsómica y la soluble o citoso!. La fracción microsómica servía como de recipiendaria de los aminoácidos recién incorporados, mientras que la fracción so~ luble proporcionaba ciertos cofactores esenciales. En estos. experimentos de reconstrucción las mitocondrias se necesitan solamente como aportadores de energía en forma de A TP.

Al someter a la fracción microsómica etiquetada a un ulte~ rior sub fraccionamiento, la radiactividad incorporada se recu~ peró princip?lmente en forma de unas pequeñas partículas de ribonucleoproteína. Tales partículas habían sido previamente localizadas por A. Claude en el citoplasma con auxilio del microscopio electrónico, y más tarde fueron observadas por

942

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

K. R. Porter y G. E. Palade sobre la superficie del retículo endoplasmático, pero su función era, a la sazón, aún desco~ nocida. Estas partículas de ribonucleoproteína, que más tarde fueron denominadas ribosomas, pueden despegarse del retículo endoplasmático por tratamiento por un detergente, y ser sepa~ radas en forma homogénea por centrifugación diferencial. Los ribosomas purificados de este modo incorporan aminoácidos radiactivos a los enlaces peptídicos por incubación con A TP, Mg2+ Y la fracción soluble o citosol del hígado de rata. Pronto otros investigadores pudieron observar la incorporación de aminoácidos a los ribosomas de muchas otras células, espe~ cialmente de los reticulocitos, glóbulos rojos inmaduros que son sumamente activos en la síntesis de hemoglobina, así como a los de células de E. coli.

Cofactores esenciales y etapas sucesivas de la biosíntesis de proteínas

Zamecnik y colaboradores hallaron que la fracción soluble del hígado aporta dos categorías de factores esenciales para la síntesis proteica. Uno de los tipos es termolábil y por tanto, se suponía que era de naturaleza proteica, mientras el otro es termoestable. Uno de los factores solubles termolábiles del citoplasma hepático, se descubrió que era un enzima catali~ zador de una reacción de activación ATP~dependiente, por la cual los aminoácidos libres se esterificaban a un compuesto termoestable también presente en la fracción soluble. El acep~ tor de aminoácidos termoestable es un tipo de RNA de bajo peso molecular, que en un principio se denominó «RNA so~ luble» o sRNA, pero que ahora se designa RNA de trans~ ferencia (tRNA) para indicar su función de modo más exacto. El éster aminoacil~tRNA así formado en la reacción de acti~ vación se une al ribosoma, donde funciona como dador de un resto aminoacilo en las subsiguientes reacciones de prolonga~ ción de la cadena peptídica.

Investigaciones posteriores han revelado que la síntesis de las cadenas polipeptídicas tiene efecto en cuatro etapas prin~ cipales, y que en cada una de éstas se requieren enzimas y cofactores específicos. La tabla 33~1 proporciona alguna orien~ tación para la descripción . que sigue. En la primera etapa, que se denomina de activación, y que se produce completa~ mente en el citoplasma soluble, los aminoácidos son esterifi~ cados enzimáticamente a sus correspondientes tRNAs a ex~ pensas de la energía del A TP. En la segunda etapa, que se llama de iniciación, el RNA mensajero, que es portador del mensaje genético que especifica la secuencia de aminoácidos, y el primer aminoacil~tRNA o iniciador, se unen a la subuni~ dad menor del ribosoma en un proceso que requiere tres pro~ teínas específicas denominadas factores de iniciación (IF~ 1, IF~2, IF~3), así como GTP y Mg2+. La subunidad ribosómica mayor se adhiere entonces para formar un ribosoma funcional, listo para la etapa siguiente.

La tercera etapa se denomina de prolongación. y en ella la cadena polipeptídica se prolonga por adición secuencial de nuevos restos aminoacilo, que son enzimáticamente transferi~ dos desde los ésteres aminoacil~tRNAs, cada uno de los cua~ les se ha unido al ribosoma respondiendo a un codón o tri~ plete de bases específico del mRNA. Para la prolongación de

943

PARTE 4 REPLICACIÓN. TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

TABLA 33-1. Componentes requeridos en las cuatro etapas principales de la síntesis proteica en E. coli.

Etapa

1. Activación de los aminoácidos

2. Iniciación de la cadena polipeptídica

3. Prolongación

4. Terminación

Componentes necesarios

Aminoácidos tRNAs Aminoacil-tRNA-sintetasas ATP Mg'+

fMet-tRNA en los procariotas (Met-tRNA en los eucariotas) Codón de iniciación en el mRNA

(AUG) mRNA GTP Mg'+ Factores de iniciación (IF-l. IF-2.

IF-3) Sub unidad ribosómica 30S Subunidad 50S

Ribosomas 70S funcionales Aminoacil-tRNAs especificados por

codones Mg'+ Factores de prolongación (EF-T y

EF-G) GTP

Ribosomas 70S funcionales Codón de terminación en el mRNA Factores polipeptídicos de liberación

(R¡, R, Y R3 )

cadena son indispensables dos proteínas o factores de prolon~ gación, EF~T y EF~G. Después de la formación de cada nuevo enlace peptídico. el ribo soma se desplaza a lo largo del mRNA para situar al codón siguiente en posición de alinear al nuevo aminoacil~tRNA. proceso que requiere ener~ gía suministrada en forma de GTP.

La última etapa de la síntesis proteica es la de terminación, cuando la cadena polipeptídica se ha completado. cosa que ocurre cuando se alcanzan unas adecuadas señales de termi~ nación en el mRNA; entonces el producto es liberado del ribosoma de acuerdo con un proceso que también requiere unas proteínas específicas llamadas [actores liberadores.

Dirección y velocidad de crecimiento de la cadena durante la síntesis de polipéptidos

Antes de proceder a examinar con más detalle las etapas de la síntesis proteica. debemos considerar la dirección de creci~ miento de la cadena polipeptídica para saber si se construye a partir del resto amino~terminal o a partir del resto carboxilo~ terminal. Esta información era vital para construir una sólida hipótesis química de trabajo. dado que los aminoácidos son sillares de construcción asimétricos que poseen una «cabeza», el grupo a amino, y una «cola». el grupo a carboxilo. La res~ puesta a esta cuestión básica surgió a partir de los experi~ mentos llevados a cabo por H. M. Dintzis. Se adicionó leucina etiquetada con tritio a suspensiones de reticulocitos activos. sintetizando las cadenas a y f3 de la hemoglobina. que con~ tienen muchos restos de leucina y cuyas secuencias amino~

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FIGURA 33-1

Adición de restos de leucina etiquetada al extremo carboxilo-terminal de la cadena a de la hemoglobina. La zona coloreada indica la localización de los restos de leucina etiquetada a lo largo de la cadena, después de la exposición de los reticulocitos a la HJ -leucina por los períodos que se indican, a 15 oC. Después de 4: min de exposición, únicamente resultaron etiquetados unos cuantos restos del extremo carboxilo-terminal, puesto que estas cadenas ya estaban casi terminadas en el instante en que la leucina etiquetada fue añadida.

Etiquetado de los péptidos (zona de flechas coloreadas)

1 1 I I i

I I I 1 1 1 1 1

1 I 1 1 1 1 1 1 1

i 1 1 1

1 i 1 1 1

¡ 1 ¡ I 1 1 1

i 1 1 1 i I

1 I 1 1 I 1 I 1

a I b i e 1 d 1 1 f I I e I

Extremo Péptidos trípticos NH2-

terminal

1 1

1

1 1

1

i 1

I 1

1 1 g

Extremo COOH­terminal

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

ácidas eran conocidas. La incubación se llevó a cabo a baja temperatura (15 oC) para disminuir la velocidad de la síntesis proteica. Se tomaron muestras de los reticulocitos a distintos intervalos de tiempo, comprendidos entre cuatro y sesenta minutos. Se aisló la hemoglobina etiquetada formada por los reticulocitos, Se separaron sus cadenas a de las {3 y se escin~ dieron por la acción hidrolítica de la tripsina, separándose los fragmentos resultantes mediante e!ectroforesis sobre papel. Se midió la radiactividad específica de cada uno de los péptidos, contenedores de leucina, producidos por la acción tríptica. Como quiera que las posiciones de dichos péptidos en las cadenas hemoglobínicas eran de antemano conocidas (pági~ na 113), fue posible deducir cuál de los extremos de la cadena polipeptídica se construyó primero (fig. 33~ 1 ). Se observó que después de 4 minutos de incubación con H3~leucina, única~ mente estaba etiquetado e! péptido que contenía leucina en el extremo carboxilo~terminal de la cadena polipeptídica. Me~ diante una exposición más prolongada a la H3~leucina, se observó un aumento en e! número de péptidos marcados, todos los cuales estaban agrupados en el extremo carboxilo~terminal. En las muestras obtenidas después de 60 min de incubación;. los restos de leucina de todos los péptidos trípticos estaban igualmente etiquetados, lo que significaba que la longitud completa de la cadena polipeptídica se había construido du~ rante e! período de los 60 mino Es obvio que las cadenas hemoglobínicas, que resultaron marcadas al final del intervalo de 4 min, ya estaban casi completadas cuando se adicionó la leucina isotópica. Por esto, sólo unos pocos restos de leucina etiquetados podían haberse incorporado al extremo de tales cadenas antes de que se completasen y fueran liberadas de! ribosoma. Inversamente, en aquellas cadenas que acababan de ser iniciadas cuando se adicionó la leucina, todos los péptidos contenedores de leucina resultaban etiquetados excepto el del extremo amino~terminal. Se llegó a la conclusión, por tanto, de que las cadenas polipeptídicas se construyen comenzando por el aminoácido amino~terminal, cuyo grupo carboxilo se combina con e! grupo amino del aminoácido entrante. La adi~ ción de restos sucesivos al extremo carboxilo~terminal libre del polipéptido en crecimiento continúa hasta que la cadena se completa. Esta conclusión ha sido ampliamente confirmada por otros tipos de experimentos realizados tanto con especies procariotas como eucariotas.

Un corolario interesante de dichos experimentos es el de que proporcionan información precisa con respecto al tiempo requerido para sintetizar una cadena polipeptídica completa. A 37 oC, un solo ribosoma del reticulocito intacto de conejo puede completar una cadena a entera de hemoglobina (146 restos) en unos 3 min, ritmo que representa algo menos de un resto por segundo. Tanto en E. coli como en otras bac~ terias cultivadas en un medio óptimo, cada ribo soma funcional puede insertar unos 20 aminoácidos por segundo.

Reacción de activación aminoácida y su especificidad

En el primer estadio de la síntesis proteica, que tiene lugar en el citosoI. los 20 distintos aminoácidos que funcionan como sillares de construcción de las proteínas son esterificados a sus correspondientes tRN As por la acción de una clase de enzi~

945

PARTE -4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

mas denominados activadores de aminoácidos, o más especí~ ficamente, aminoacil~tRN A~sintetasas, cada una de las cuales es estrictamente específica de un aminoácido y de su corres~ pondiente tRNA. La reacción que catalizan es:

Aminoácido + tRN A + A TP Mgl+)

aminoacil~tRNA + AMP + PP; (1 )

Casi todos los enzimas activadores de los 20 distintos amino~ ácidos, se han obtenido en forma altamente purificada, parti~ cularmente los de E. coli; varios de ellos se han cristalizado. Tienen pesos moleculares del orden de 100 000 a 240 000. Algunos poseen una sola cadena polipeptídica de peso mole~ cular 100 000 (por ejemplo, el de la leucina), otros tienen por lo menos dos subunidades idénticas, y otros poseen sub~ unidades desiguales. La glicil~tRNA~sintetasa posee dos sub.; unidades de peso molecular 35 000 Y otras dos de peso 82 000. Todos muestran un requerimiento absoluto de Mg2+ y contie~ nen como mínimo un grupo sulfhidrilo, que es esencial para su actividad.

En la reacción de activación tiene lugar la escisión de piro~ fosfato del ATP (pág. 421) que rinde AMP y pirofosfato, lo mismo que ocurre en las reacciones de activación análogas de los ácidos grasos (pág. 558). La transferencia de un amino~ ácido a su tRNA se verifica en dos etapas separadas sobre el centro catalítico del enzima. En la primera fase, el A TP reac~ ciona con el aminoácido con desplazamiento de piro fosfato, formando un producto intermedio ligado al enzima, esto es, un ácido aminoacil~adenílico (fig. 33~2). En este producto in~ termedio, el grupo carboxilo del aminoácido está unido por un enlace anhídrido con el grupo 5'~fosfato del AMP; el enlace anhídrido, de elevada energía, activa al grupo carboxilo del aminoácido. En la segunda etapa, el grupo aminoacilo es transferido desde el AMP al extremo 3' de su tRNA, seguido de la liberación de los productos, un aminoacil~tRNA y ácido adenílico. Estas dos fases son:

A TP + aminoácido ~ [ácido aminoacil~adenílico] + piro fosfato (2 )

[Acido aminoacil~adenílico] + tRNA ~ aminoacil~tRNA + ácido adenílico (3)

El grupo aminoacilo pasa a esterificar, por medio de su grupo carboxilo activado, al grupo 2' ~hidroxilo del resto AMP~ter~ minal situado al extremo 3' de la molécula del tRNA, preci~ samente el de la secuencia C~C~A terminal (pág. 327), como se muestra en la figura 33~3. Después se forma una mezcla en equilibrio de los ésteres aminoacílicos de los grupos 2' y 3' ~hidroxilo terminales del tRNA.

Obsérvese que la reacción de activación global procede con un relativamente pequeño descenso de energía libre estándar. El nuevo enlace éster formado entre el aminoácido y el tRNA producido a expensas de la hidrólisis de un enlace de elevada energía del A TP es, por tanto, un enlace de alta energía. Como quiera que el piro fosfato formado en la reacción de activación experimenta la subsiguiente hidrólisis a ortofosfato por la pirofosfatasa, resulta que por cada molécula de amino~

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FIGURA 33-2

Estructura general de los aminoacil­adenilatos formados en el centro activo de las aminoacil-tRNA-sintetasas.

0-. 1

}t-CH-C-O-P=O 1 11 1 N~ O O

1

CH2

vO~Adenina

h)..fh OH OH

FIGURA 33-3

Estructura general de los aminoacil-tRNAs. Véase también la figura 33-5 para detalles de la estructura del tRNA.

R

I 1 H-C-NI! I 3

C=o I O

Grupo aminoacilo

FIGURA 33-4 Análogos de aminoácidos sintéticos. Pueden ser incorporados a las cadenas polipeptídicas en lugar de los correspon­dientes aminoácidos naturales.

p-Fluorofenilalanina

CHaCH2 SCH.CH.CHCOOH I

NH.

Etionina

CHaCH.CH.CH.CHCOOH I

NH.

Norleucina

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

ácido activada se escinden dos enlaces fosfato de alta energía. Por 10 tanto, la reacción global de activación aminoácida en la célula es esencialmente irreversible. Los enzimas de activa~ ción, se determinan por 10 general midiendo la velocidad de in~ corporación al ATP adicionado del pirofosfato etiquetado con p32, según la primera de las dos etapas de reacción (2). Este intercambio, libremente reversible, requiere la presencia como sustrato del aminoácido específico, pero no necesita a su tRNA.

Las aminoacil~tRNA~sintetasas son muy específicas tanto del aminoácido como del tRNA correspondiente. Éste es un asunto de la mayor importancia, porque una vez formado el aminoacil~tRNA, es sólo reconocible, por el triplete anticodón de su porción tRNA, y no por el resto aminoácido, como ya veremos. Por tanto, las aminoacil~tRNA sintetasas tienen que poseer dos centros de unión muy específicos, uno para el sus~ trato aminoácido y otro para el correspondiente tRNA; existe también un tercer centro para la unión de A TP. Las aminoacil~ tRNA~sintetasas son tan específicas en discriminar entre los aminoácidos naturales que en las condiciones celulares sólo existe una posibilidad de error de 1 en 10000. Sin embargo, estos enzimas pueden «ser engañados» a aceptar ciertos aná~ logos no biológicos de aminoácidos, en vez de sus sustratos normales. Entre ellos se encuentran la p~fluorofenilalanina, análogo de la fenilalanina, y la etionina y la norleucina, aná~ logos de la metionina (fig. 33A). Incluyendo a estos análogos a la dieta de un animal, resultan incorporados a las proteínas en posiciones normalmente ocupadas por la fenilalanina o por la metionina, respectivamente.

Estructura de los tRNAs y especificidad de los enzimas activadores

La especificidad de las aminoacil~tRNA sintetasas por sus co~ rrespondientes tRNAs es un tema complejo e interesante, que requiere, en primer lugar, revisar la estructura covalente y los componentes nucleotídicos de las moléculas de tRNA (véase cap. 12, pág. 327). Se conocen las secuencias de bases completas de unos 50 tRNAs, y se dispone de información importante en relación con sus conformaciones, sus especifi~ cidades y funcionalismo de las diferentes partes de sus es~ tructuras.

Se dispone en la actualidad de datos de primera importancia respecto a que las. moléculas de tRNA, que tienen de 73 a 93 restos nucleotídicos y un peso molecular de alrededor de 25000, poseen una conformación tridimensional específica, Muestran un efecto hipercrómico sustancial (pág. 886) a 260 nm cuando se calientan, lo cual indica que muchas de sus bases están apareadas, seguramente porque existen lazos en la cadena monohebra del tRNA. De hecho, del 60 al 70 % de la estructura del tRNA está en forma de doble hélice. Una vez fundidos los tRNAs por calefacción, al enfriarse recobran rápidamente su configuración nativa. Por otra parte, se ha comprobado que la conformación nativa de las moléculas de tRNA es esencial para su actividad biológica: un tRNA desplegado no es capaz de actuar como aceptor aminoácido. Partiendo de las secuencias de bases de los tRNAs ha sido posible construir una serie de conformaciones que permiten el apareamiento intracatenario de bases. Lo sorprendente es

94:7

PARTE '4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

A I e I y Pu

Extremo 5' p ,r

Brazo DHU

na ". Pu- n, u , y ~~~+-~-

G* \ q, n· ... A-· 2 n1 Pu

Py I U Pu

Base \ /

«vacilante:. - '- ........ 1 1

Anticodón 5' 3'

Extremo 3'

Brazo aminoácido

Br azo T.¡,C

c .... P~

c... ",/ T-'I'

Brazo sobrante (no está presente

en todos los tRNAs)

Brazo anticodón

Pu I

e

el descubrimiento de que aunque los tRNAs de diferentes aminoácidos tienen composiciones en bases completamente distintas todos los tRNAs pueden dibujarse bidimensio­nalmente en una misma forma de hoja de trébol (pág. 332) si se disponen las cadenas de suerte que proporcionen el má­ximo de apareamiento intracatenario de bases (fig. 33-5). Algu­nos tRNAs, los de cadenas más largas, son capaces de formar un quinto brazo corto. Varios tRNAs se han obtenido en estado cristalino. El análisis de rayos X de los cristales del tRNA de la fenilalanina (de la levadura) muestra que su molécula está asimétrica mente doblada, formando una estruc­tura compacta de unos 9,0 nm de longitud y de 2,5 nm de grosor, con el brazo anticodón en un extremo y el brazo ami­noácido en el otro (fig. 33-6~-

A partir de los datos de secuencia de bases se han identifica­do algunas características estructurales biológicamente impor­tantes (fig. 33-5). Todas las moléculas de tRNAs poseen una misma secuencia terminal Pu-C-C-A al extremo 3' del brazo aminoácido. El último resto, el ácido adenílico, es el lugar al que se le esterifica el grupo aminoacilo por las aminoacil-sinte­tasas (fig. 33-5). Es característico que exista un resto pseu­douridínico ('1') en el brazo T'I'C de todos los tRNAs; simi­larmente, un resto de dihidrouridina caracteriza al brazo dihidrouridinico. El brazo anticodón contiene un triplete de

948

FIGURA 33-5

Estructura general de hoja de trébol de los tRNAs. Los puntos gruesos del armazón son restos nucleósidos, y las líneas transversales representan pares de bases. Los restos característicos o invariables, comunes a todos los amino­ácidos, aparecen en color.

Clave: Pu = nucleósido pur/mco Py = nucleósido pirimidínico

.¡, = pseudouridina G* = guanosina o

2' -O-metilguanosina nI = O a 1 nz = 1 a 3 n3 = 1 a 3 114 = O a 2 restos nuc1eósidos

en el brazo DHU, según el RNA.

En algunos tRNAs la rama DHU contiene sólo tres pares de bases.

FIGURA 33-6 Conformación tridimensional del tRNA de la fenilalanina de levadura, deducida del análisis de difracción de rayos X con una resolución de 0,3 nm. [Adaptado de S. H. Kim y colaboradores, Science, 185: 436 (1974)].

Brazo T,¡..C (sombreado)

54

56

FIGURA 33-7

Extremo 5' Brazo 64 1

Triacantina [6-(3-metilbut-2-enilamino) purina] , una de las purinas minoritarias que se encuentran adyacentes al anticodón. Este compuesto es una citoquinina, hormona vegetal que induce la división celular.

CRa I C-CRa

11 CH I CH2

I NH

()) N N

H

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

nucleósidos específico, que es distinto en cada uno de los tRNAs de los diferentes aminoácidos. Este triplete es el anti­codón, que es complementario del correspondiente triplete co-d6n del mRNA. El triplete anticodón del aminoacil-tRNA tiene la secuencia de bases adecuada para poder formar enla­ces de hidrógeno específicos con las bases del codón corres~ pondiente en el rnRN A (pág. 982). De esta manera se selec~ ciona el aminoácido requerido y se sitúa correctamente para su transferencia a la cadena polipeptídica en crecimiento. Una de las bases del anticodón es la base «vacilante» (pág. 975), que es menos específica en su interacción con la correspon­diente base del codón, que lo son las otras dos bases del antico­dón. Al lado del extremo 5' del anticodón se encuentra un resto uracilo, y al lado del extremo 3' hay una purina o un de­rivado purínico. En algunos tRNAs, especialmente en los de plantas, en esta última posición se encuentra un derivado iso~ pentenilo de una purina (fig. 33-7). Parece ser que estas bases características sirven como «obstructores» para desmarcar al anticodón (pág. 983).

Las moléculas de tRNA han de contener, por lo menos, otros dos lugares específicos, el de reconocimiento del enzima, por el cual se une el tRNA al correspondiente enzima acti­vador, y el sitio o lugar de Nación al ribosoma. Los restos nucleotídicos variables difieren no sólo con el aminoácido, sino también con el órgano o especie de que se trate; la aminoacil­sintetasa de un determinado aminoácido funciona óptimamente con los correspondientes tRNAs de la misma especie.

Una llamativa característica de la estructura molecular de los tRNAs es la presencia de bases minoritarias (pág. 327, ca­pítulo 12), además de las bases normales A, U, G Y C. Se han descubierto por lo menos 40 nucleósidos minoritarios en los tRNAs, la mayoría de los cuales son formas metiladas de los nucleósidos normales. Los enzimas que catalizan la meti­lación de determinadas bases en los tRNAs fueron hallados por E. Borek; requieren S-adenosil-metionina (pág. 710) como donador de grupos metilo. Hay varias funciones posibles para las bases minoritarias. Pueden servir para no permitir el aparea­miento de bases en ciertos puntos con objeto de provocar la característica estructura de los brazos, para no permitir un indeseable apareamiento de bases con el RNA mensajero y para hacer al tRNA menos susceptible al ataque hidrolítico de las nucleasas.

Para cada aminoácido hay más de un tRNA específico. Las células de levadura contienen cinco diferentes tRNAs homólogos o isoaceptores. que reaccionan específicamente con la leucina y con la leucil-tRNA-sintetasa, cinco para la serina, cuatro para la glicina y cuafro para la lisina. Sin em­bargo, una determinada aminoacil-sintetasa no es igualmente reactiva con todos los tRNAs homólogos. Por otra parte, en algunas células se encuentra más de una aminoacil-tRNA­sintetasa para determinados aminoácidos, que pueden diferir en su especificidad relativa por los tRNAs homólogos. El fundamento biológico de la multiplicidad de tRNAs homólo­gos y de aminoacil-tRNA-sintetasas no es completamente co­nocido. Se ha descubierto que las células de Neurospora crassa contienen, por lo menos, dos especies de tRNA para muchos aminoácidos. Una de las especies se encuentra solamente en las mitocondrias, y la otra, u otras, sólo en el citoplasma, lo

949

PARTE -4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

que indica que las síntesis proteicas mitocondrial y citoplas~ mática utilizan distintos tipos de tRNA. Por otra parte, la sintetasa de las mitocondrias es específica para la forma mito~ condrial de tRNA, y la sintetasa del citoplasma es específica del tRNA citoplasmático. Sin embargo, la localización intra~ celular no es la única consideración a tener en cuenta, puesto que las células procariotas también contienen múltiples clases de tRNAs para determinados aminoácidos: en conjunto, las células de E. coli contienen unos 80 tRNAs distintos para los 20 aminoácidos.

Papel de adaptador del tRNA

Una vez que un aminoácido está esterificado a su correspon~ diente tRNA, no contribuye a la especificidad del aminoacil~ tRNA, pues el grupo aminoacilo no es reconocido como tal ni por el ribosoma ni por el patrón mRNA. Esto fue demos ... trado de modo irrefutable mediante inteligentes experimentos en los que se modificó químicamente el resto aminoácido de un aminoacil~tRNA. Por ejemplo, primeramente se preparó cis~ teinil~tRNAcys por la acción del enzima activador de la cisteína radiactiva, ATP y tRNAcys. Entonces se convirtió en alanil~ tRNAcys por reducción del resto cisteinilo, utilizando hidró­geno y un catalizador, procedimiento que no introduce cambio alguno en la molécula del tRNA. Este aminoacil~tRNA híbri~ do, que contiene el anticodón de la cisteína, pero que en realidad es portador de alanina, se incubó entonces con un sistema ribosómico ae reticulocitos, que contenía todos los otros tRNAs, aminoácidos y enzimas activadores, así como los mRNAs necesarios para formar las cadenas de la hemo­globina. Las nuevas cadenas polipeptídicas sintetizadas fueron examinadas para determinar si el alanil-tRNAcys híbrido había transferido su anómalo resto de alanina a aquellas posiciones de la cadena de hemoglobina normalmente ocupadas por la cis­teína. La respuesta fue positiva: la alanina etiquetada se incorporó, en grandes y significativas cantidades, en las posi­ciones de la cisteína. Este experimento constituyó la demos­tración de la hipótesis, postulada primeramente por F. H. C. Crick y M. B. Hoagland, de que el tRNA es un «adaptador» molecular, en el cual se acopla el aminoácido para poder ser adaptado al lenguaje de tripletes nucleotídicos del código genético. Este experimento demostró también que los enzimas activadores deben tener una gran especificidad tanto para sus aminoácidos como para sus tRNAs, pues cualquier error intro­ducido durante la reacción de activación, no puede después ser corregido durante la formación de la cadena polipeptídica.

Estructura ribosómica

Antes de estudiar la etapa de iniciación de la síntesis pro­teica, la compleja estructura de los ribosomas requiere alguna revisión (pág. 333 Y también cap. 36), puesto que existe una definida ordenación espacial de los centros de enlace en los ribosomas, así como una serie de complejas interacciones en­tre los componentes enlazados, a medida que se va formando la cadena polipeptídica. Los ribosomas 70S de E. coli y de otras células procariotas, que tienen un peso de partícula de 2,7 megadaltons, han sido estudiados muy detalladamente.

950

FIGURA 33-8 R.epresentación esquemática de un ribosoma de E. eoli, en la que se muestran los centros de unión principales para el peptidil-tRNA. el aminoacil-tRNA y el mRNA. Existen además centros de unión para los factores de iniciación, los factores de prolongación y los factores de liberación.

Subunidad

Surco de rastreo (centro de unión del

rnRNA)

Centro peptidilo (P)

Centro aminoacilo (A)

Subunidad menor

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

En condiciones especiales, se disocian en subunidades 50S y 305, cada una de las cuales contiene RNA y varias proteí~ nas. La subunidad 50S contiene dos RNAs componentes, con~ cretamente, RNAs 235 y 55, así como 34 clases distintas de proteínas. Las subunidades 305 contienen una molécula de RNA ribosómico 165 y 21 clases distintas de proteínas. Las proteínas ribosómicas son insolubles en agua a pH 7,0 en condiciones normales, pero pueden ser extraídas selectiva y secuencialmente mediante disoluciones salinas concentradas. Una extracción suave de la subunidad 305 con disoluciones concentradas de cloruro de cesio se lleva varias de las pro~ teínas ribosómicas y deja un núcleo interior, del cual se pueden extraer proteínas adicionales por procedimientos más drásticos. Las múltiples proteínas distintas extraídas de las subunidades 305 y 50S pueden separarse por electroforesis en gel a pH 4,5. Como veremos más adelante (cap. 36, pá~ gina 1037), los ribosomas pueden reensamblarse a partir de sus componentes RNAs y proteínas.

Los ribosomas del citoplasma de los eucariotas son mucho mayores que los de lós procariotas; tienen un coeficiente de sedimentación de 735 a 80S, un diámetro de unos 22 nm y un peso de partícula de unos 4,0 megadaltons. Sus subunida~ des tienen coeficientes d.P: sedimentación de unos 60S y 405. Sin embargo, el tamaño de las subunidades varía algo entre plantas y animales, lo que también ocurre con el tamaño del RNA. Los ribo somas de las plantas contienen rRNAs de 255 y 165 o 185, y los ribosomas animales rRNAs de 285 y 185. El rRNA 285 de los ribosomas animales varía un poco de tamaño en las distintas especies según su posición filogené~ tica, y su peso molecular varía desde los 1,4 millones en el caso del erizo de mar hasta los 1,75 millones en los mamíferos.

Aunque al menos algunas de las proteínas de los ribosomas tienen una función catalítica, la función específica del RNA ribosómico no está todavía clara, aunque tiene centros de enlace para un número de proteínas ribosómicas (pág. 1038). Parece muy probable que el rRNA y los distintos tipos de proteínas arracimadas formando las subunidades de 305 y 50S de los ribosomas 70S participen en cambios conformacionales que desplacen al ribosoma con su cadena polipeptídica en crecimiento, a lo largo del mRNA. Así, los ribo somas pueden ser unos sistemas mecanoquímicos que pueden considerarse incluidos en la misma clase de bioestructuras que la actomio~ sina del músculo y que los microtúbulos de los flagelos euca~ rióticos (pág. 1039).

La figura 33~8 es una representación esquemática de la estructura del ribosoma, que muestra los centros peptidilo y aminoacilo en la subunidad 50S. El mRNA discurre por una ranura, que seguramente es la que existe entre la subunidad grande y la pequeña. Los tamaños de los codones no están en la adecuada proporción relativa; en la ranura se albergan unos 8 codones aproximadamente.

Iniciación de las cadenas polipeptídicas

En E. coli y en todos los otros procariotas, la síntesis de todas las proteínas comienza con el aminoácido metionina, codificada por el codón de iniciación AUG. El resto de me~ tionina iniciador no entra como metionil~tRNA, sino como

951

PARTE 4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

N-formil-metionil-tRNA (fMet-tRNA) (fig. 33-9), producto de una transformilación enzimática en la cual se transfiere un grupo formilo desde el Nlo-formil-tetrahidrofolato (pág. 353) al grupo a-amino del metionil-tRNA. Hay dos especies de metionil-tRNAMet : solamente una de ellas, designada metionil­tRNAF, es capaz de aceptar el grupo N-formilo. La reacción es la que sigue:

Nlo-Formil-tetrahidrofolato + Met-tRNAF ~ tetrahidrofolato + fMet-tRNAF

El enzima que cataliza esta reacción no formila a la metionina libre ni a un resto de metionina unido a la otra especie de tRNAMet• Ahora parece probable que el fMet-tRNAF inicia la síntesis de la cadena polipeptídica no sólo en las bacterias sino también en las mitocondrias de las células eucarióticas (véase más abajo). El fMet-tRNAF se ha obtenido en forma cristalina (fig. 33-9). Se ha descubierto que el resto iniciador de la síntesis proteica en el citoplasma de las células eucariotas es un resto de metionina no acilado, esterificado a un tRNAMet

específico, el tRN A iniciador. Durante la síntesis proteica tiene efecto una continua diso­

ciación de los ribosomas 70S en sus subunidades 50S y 30S, y una también continuada reasociación de las subunidades para formar ribosomas intactos. Esto lo demostraron en primer lugar R. Kaempfer y colaboradores, quienes cultivaron células de E. coli durante varias generaciones en un medio en el que las fuentes de carbono, nitrógeno e hidrógeno, estaban muy enriquecidas en los isótopos pesados C13, NIS y H2. Los ribo­somas sintetizados por estas células «pesadas» tienen una mayor densidad (pág. 884) que los ribosomas de células cul­tivadas con fuentes normales de carbono, hidrógeno y nitró­geno. Después, las células pesadas de E. coli, se incubaron en un nuevo medio con fuentes normales de carbono, hidrógeno y nitrógeno. Los ribosomas aislados de estas células se some­tieron a centrifugación en gradiente de densidad, observán­dose que contenían dos especies de híbridos distantes. Una de ellas consistía en una unidad 50S pesada y otra 30S ligera, mientras que la otra especie la integraban una subunidad 50S ligera y otra 30S pesada. A partir de las velocidades de for­mación de tales híbridos se dedujo que los ribosomas 70S experimentaban constantemente una disociación en sub unida­des, y que las subunidades se reasociaban continuamente. El significado de este proceso de disociación-reasociación quedó aclarado cuando M. Nomura y sus colegas hallaron que los ribosomosas 70S tienen primeramente que disociarse en sub­unidades 50S y 30S, antes de que pueda comenzar la síntesis polipeptídica. El mRNA y el aminoacil-tRNA iniciador no se pueden unir directamente a los ribosomas 70S, sino que pri­mero se unen a las subunidades 30S, las cuales entonces se combinan con las subunidades 50S. Sin embargo, investiga­ciones subsiguientes realizadas en varios laboratorios, demos­traron que se trata de un complejo proceso que comprende múltiples etapas (fig. 33-10), y requiere la participación de tres proteínas específicas, denominadas factores de iniciación (IF-l. IF-2 e IF-3). Estas proteínas pueden extraerse de los ribosomas en forma soluble utilizando disoluciones concentra­das de sal: sus pesos moleculares aproximados son 9000,

952

FIGURA 33-9 N -F ormil-metionina, aminoácido iniciador en los procariotas. Abajo se muestran unos cristales de N-formil-metionil-tRNA.

H I

CH -8-0 .. r -CH -C-COOH 3 '''2 2 I

NH I c=() I ti

FIGURA 33-10 Formación del complejo de iniciación y del ribosoma funcional 70S (E. colijo IF-2 e IF-3 son los factores de iniciación. La unión del ribosoma 50S al complejo de iniciación provoca la liberación de los factores de iniciación y la hidrólisis del GTP.

50S

5'

5'

lmRNA

Ribosoma 70S inactivo

Subunidad 30S con IF-3

unido

mRNA

1 fi?-e-"'''- "NA

fMet

~Codón d, lnkiadoo

Complejo de iniciación

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

65000 y 21 000, respectivamente. Los factores de iniciación no son componentes permanentes de las subunidades 30S; como ya veremos experimentan ciclos sucesivos de unión y liberación.

Si bien aún existen detalles rodeados de cierta inseguridad, la secuencia de etapas de la formación de un ribosoma 70S funcional completo es como sigue: en primer lugar, la sub­unidad 30S forma un complejo con el IF-3, que entonces se une al mRNA; a este complejo se le adiciona una molécula de IF-l. Entonces, el fMet-tRNA y GTP se une al IF-2, y el complejo resultante se enlaza con el complejo anterior de subunidad 30S, IF-3, mRNA e IF-l, rindiendo el deno­minado complejo de iniciación (Hg. 33-10). Después, el com­plejo de iniciación se combina con la subunidad 50S formando el ribosoma 70S funcional completo; en este proceso el GTP se hidroliza a GDP y Pi, y los tres factores de iniciación IF-l, IF-2 e IF-3 se disocian del ribosoma.

Es posible que un tan elaborado proceso de iniciación se requiera para asegurar que el aminoacil-tRNA iniciador se una al centro peptidilo y se sitúe en el codón de iniciación AUG, de suerte que los ribosomas comiencen la traducción en el punto correcto del mRNA. Los factores de iniciación son reutilizados múltiples veces para comenzar nuevas cadenas.

Se ha podido establecer que la traducción de los codones del mRNA tiene efecto en dirección 5' ~ 3'; así, los centros P y A del ribosoma reconocen la polaridad de la cadena del mRNA.

Ciclo de la prolongación

La prolongación se efectúa cuando el aminoacil-tRNA ini­ciador (o el peptidil-tRNA) situado por su codón en la correcta posición en el mRNA, se une al centro peptidilo, per­maneciendo libre el centro A. El proceso de prolongación tiene lugar en tres etapas principales (Hg. 33-11).

Etapa 1. Unión del aminoacil-tRN A entrante

En la primera etapa, el aminoacil-tRNA entrante se adiciona al centro aminoacilo (centro A) del complejo ribosómico 70S completo, según un proceso bastante complicado. Primera­mente, el aminoacil-tRNA entrante se une a una proteína citoplasmática específIca; en los procariotas recibe el nombre de factor de prolongación T (EF-T), y ha sido obtenida en forma cristalina. El EF-T contiene dos subunidades, EF-Ts y EF-Tu. El EF-T se combina con el GTP para formar un complejo EF-Tu-GTP, con liberación de EF-Ts. El complejo EF-T u-GTP se combina entonces con el aminoacil-tRNA, formando un complejo ternario EF-TwGTP-aminoacil-tRNA. Este complejo se combina después con el ribosoma, de forma tal que el aminoacil-tRNA se sitúa en el centro A con su anticodón unido por enlaces de hidrógeno al correspondiente codón del mRNA. Simultáneamente, el GTP enlazado es hidrolizado a GDP y Pi; el GDP abandona al ribosoma en forma de un complejo EF-Tu-GDP. La energía proporcionada por la hidrólisis del GTP, parece ser la requerida para poner al aminoacil-tRNA en la situación correcta. El EF-T no

953

PARTE 4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

FIGURA 33-11

Etapas de la prolongación. EF-T y EF-G son factores de prolongación.

Centro aminoacilo (A)

unido al Ribosoma complejo

iniciación

tRNAAla_i-I~~.I..""""C::::~I.. ....... libre

5' _ ...... .1.-

El tRNAAla* libre

abandona

5'-............. _ ............. ..., (fMet) (Ala)

954

(Phe)

Codones

r---8- GDP+ P,

(Phe)

Reacción de la peptidil-transferasa

(Phe)

~8-GTP

l'--8 + GDP + Pi

El ribosoma queda ahora listo para el siguiente aminoacil-tRNA

FIGURA 33-12

Reacción de la peptidil-transferasa. El enlace peptídico se forma por un desplazamiento nucleofílico en el que el grupo amino del nuevo aminoacil-tRNA desplaza al tRNA del aminoácido anterior del átomo de carbono carboxílico para dar un peptidil-tRNA prolongado.

Peptidil-tRNA

I O=C

I NH

I R-CH

1 I C--I'--

(L I

Rz-CH

I C--u'--

11 O

Nuevo

I tRNA O=C

I NH

I R-CH

1 I O=C

I NH

I R-CH

z \ C

" O

Peptidil tRNA prolongado

Centro

Extremo 5' del mRNA

peptidil­transferasa de la subunidad 50S

Extremo 3'

FIGURA 33-13

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

acepta fácilmente al fMet~tRNA iniciador. La fijación del aminoacil~tRNA al centro A puede ser bloqueada por deter~ minados antibióticos, particularmente por las tetraciclinas (véase más adelante). En las células eucarióticas, los factores de prolongación se designan por EF~l y EF~2 y funcionan de un modo algo diferente.

Etapa 2. Formación del enlace peptídico

Con el fMet~tRNA en el centro P y el recién captado amino~ acil~tRNA sobre el centro A, se forma el primer enlace peptí~ dico por el ataque nucleofílico del grupo amino del aminoacil~ tRNA sobre el carbono carboxílico esterificado del fMet~ tRNA. Esta reacción es cata liza da por la peptidil~transferasa, que está presente en la subunidad 50S del ribosoma (figs. 33~11 y 33~ 12). El producto es un dipeptidil~tRN A unido al cen~ tro A, mientras que el tRNA descargado o libre permanece unido al centro P. Para la formación del nuevo enlace peptí~

Modo de inhibición de la puromicina.

Peptidil-puromicina

HOCH, O

NH OH I C=O

H3C0-o-CH2-{H

HN I C=O I Ra-9H

HN I C=O I

~-9H NH I C=O I

R-CH 1 I

NH.

Extremo NH2-terminal

Puromicina (en color)

Cadena peptídica

La puromicina se parece a un amínoacil­tRNA y puede reaccionar con un peptidil-tRNA rindiendo peptidil-puromicina. Como que su cadena polipeptídica no puede prolongarse más, la peptidil­puromicina es liberada del ribosoma. Se han aislado varias peptidil-puromicinas de longitudes variadas.

Peptidil-tRNA

Adenilato terminal ~2 de un tRNA <N Jl.)

N N 0-I

-O-P-O-CH O 11 2

O

o OH I <--, --- Enlace escindido C=O cuando el peptidil-

R -tH tRNA se prolonga • I

NH I C=O I

R-CH 3 I

NH I C=O I

~-9H NH I C=O I

R-CH I I

NH.

Extremo NH2-terminal

Cadena peptídica

El grupo amino de un aminoacil-tRNA entrante puede desplazar al tRNA del aminoácido COOH-terminal y así prolongar la cadena.

955

PARTE 4: REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

dico no se requiere ni ATP ni GTP; parece ser que se forma a expensas de la energía del enlace éster de la N ~formil~metioni~ na con su tRNA. Si bien esta descripción se refiere a la forma~ ción del primer enlace peptídico de una cadena polipeptídica, un 'proceso idéntico tiene efecto en cada ciclo de prolongación: esto es, el grupo amino libre del nuevo aminoacil~tRNA recién unido al centro A desplaza al tRNA del peptidil~tRNA situa~ do sobre e! centro P para formar el nuevo enlace peptídico.

Esta imagen del mecanismo viene apoyada por importantes experimentos sobre la inhibición de la síntesis proteica por el antibiótico puromicina (fig. 33~ 13 ), que tiene una estructura muy similar a la de un derivado aminoacilo del resto adenílico terminal de un tRNA. Sin embargo, en vez del enlace éster nor~ mal entre e! grupo 2' ~ o 3' ~hidroxilo de la: porción de ribosa y el grupo carboxilo del aminoácido, la puromicina posee un enlace amido entre su azúcar componente y e! grupo carboxilo de la 4~metoxi~fenilalanina, esto es, e! éter metílico de la tiro~ sina. La puromicina interrumpe la prolongación de la cadena en virtud de su capacidad de unirse al centro A cuando el P está ocupado, con la consiguiente formación de un derivado covalente peptidíl~puromicina (fig. 33~ 13). La peptidil~puromi~ cina así formada se disocia del ribosoma dado que no posee la estructura precisa para ser reconocida por el aparato de transposición y ser trasladada al centro P. Estas observaciones no sólo establecieron el modo de actuación del antibiótico. sino que aportaron importantes datos confirmadores de que el cre~ cimiento de la cadena se efectúa por adición de los aminoacil~ tRNAs al extremo carboxilo terminal de las cadenas poli~ peptídicas.

Etapa 3. Transposición

Una vez formado e! enlace peptídico. e! peptidil~tRNA recién alargado todavía se halla unido al centro A y situado en la posición del codón de! aminoácido nuevamente añadido. En~ tonces, en la nueva etapa del ciclo de prolongación (fig. 33~11). el ribosoma se traslada al nuevo codón del mRNA y simultá~ neamente cambia al peptidil~tRNA desde el centro A al cen~ tro P. Este proceso de transposición es bastante complicado y se verifica según una secuencia de etapas definida. Para ello se requiere una proteína específica denominada factor de prolongación G (EF~G), así como GTP. Primeramente, el GTP se une al EF~G, y el complejo formado se une al ribo~ soma. Entonces el GTP experimenta su hidrólisis a GDP y Pi. Esta hidrólisis de! GTP proporciona la energía para el cambio de conformación que traslada e! ribosoma al codón siguiente del mRNA, y cambia al peptidil~tRNA del centro A al P. El centro A queda entonces abierto. con un nuevo codón en su sitio listo para recibir a un nuevo aminoacil~tRNA y comenzar un nuevo ciclo de prolongación. Después de la etapa de transposición. e! EF~G se disocia del ribosoma.

Los hechos implicados en la prolongación requieren una muy especializada topología de los centros de enlace para el pep~ tidil~tRNA. e! aminoacil~tRNA. el mRNA. los factores de prolongación y e! GTP (véase también cap. 36. pág. 1037). Probablemente, el ribosoma experimenta complicados cambios de forma específicos durante cada ciclo de formación de un enlace. El mRNA se «arrastra» por un surco o túnel del

956

FIGURA 33-14

Etapas de la liberación de la cadena polipeptídica completada. R,. R2 y R3. son factores de liberación. El funcionamiento de cada uno de ellos depende del codón de terminación.

Extremo COOH­terminal del

peptidil-tRNA

j~ Cambio del peptidil-tRNA al centro P

mRNA

Hidrólisis del rH O enlace éster Z con el tRNA

terminal

-Phe-Cys-Ala -Ser (COOH) Cadena polipeptídica libre

+

mRNA

Ribosoma 70S libre

Capítulo 33 Tradllcción: Biosíntesis de las proteínas

ribosoma. puesto que en los polirribosomas (véase más ade~ lante) una parte sustancial de la cadena del mRNA no es susceptible al ataque de la ribonucleasa. Se supone que esta fracción consta de todos los segmentos situados en el interior

- de los túneles del ribosoma en un momento dado (unos 25 nucleótidos por ribosoma). Otro segmento comparable de la cadena polipeptídica en formación está también similarmente protegido del ataque de los enzimas proteolíticos.

Terminación de la cadena polipeptídica

La terminación de una cadena polipeptídica y su disociación del ribosoma requiere unas etapas especiales que aún no se conocen del todo. Como veremos en el capítulo 34 (pág. 978). la terminación de las cadenas polipeptídicas está señalizada por uno de los tres codones especiales de terminación en el mRNA. Una vez que el último resto aminoácido carboxilo terminal se ha incorporado a una cadena polipeptídica en el ribosoma. el polipéptido está todavía unido covalentemente por su grupo carboxilo terminal. al tRNA. el cual está situado en el centro A del ribosoma. La liberación del polipeptidil~ tRNA del ribosoma es inducida por tres proteínas específicas. denominadas [actores de liberación, y que se simbolizan por R,. R2 y R3 (fíg. 33~ 14). Se unen al ribosoma para provocar un desplazamiento del polipeptidil~tRNA desde el centro A al centro P. El enlace éster entre la cadena polipetídica y el último tRNA se hidroliza. aparentemente. por la acción de la peptidil~transferasa. cuya especificidad y acción catalítica parece que resultan alteradas por los factores de liberación enlazados. Una vez liberado el polipéptido. el último tRNA y el mRNA abandonan al ribosoma. El ribosoma 70S libre. se disocia entonces en sus subunidades 50S y 305. proceso que requiere uno de los factores de iniciación específicos. pu~ diendo de este modo iniciarse una nueva cadena polipeptídica.

Es muy poco lo que se sabe respecto al estado en que una cadena polipeptídica completada abandona al ribosoma. si lo hace en forma de una cadena arrollada al azar o bien como una molécula plegada en su conformación terciaria activa. Este segundo proceso alternativo parece el más probable. puesto que los ribosomas aislados muestran una gran variedad de actividades enzimáticas. además de las implicadas en el mecanismo de síntesis· de enlaces peptídicos. Dichas activida~ des se cree que son debidas a cadenas polipeptídicas casi com~ pletadas. de enzimas. que permanecen fuertemente unidas, pero que todavía están experimentando su propia síntesis.

Modificación post~traducción de las cadenas polipeptídicas

Una vez terminada la construcción de un polipéptido por parte de un ribosoma. puede que el primero necesite de alguna mo~ dificación covalente para producir su forma biológicamente activa.

El grupo N ~formilo del resto fMet no se encuentra en la proteína acabada de los procariotas. y se elimina por la acción de una desformilas? Es más, el resto metionilo iniciador de algunos polipéptidos puede también ser eliminado por la ac~ ción de una' metionina~aminopeptidasa. Algunas proteínas están acetiladas en su grupo a~amino terminal, tal como

957

PARTE 4 REPLICACIÓN. TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (pág. 106 Y 1029). Tales grupos acetilo se introducen después de que la síntesis proteica se ha completado. y no están rela~ cionados con la iniciación de la cadena durante la biosíntesis proteica.

Después de construida la cadena polipeptídica. se forman enlaces cruzados disulfuro intracatenarios. C. B. Anfinsen y otros investigadores han observado que los microsomas pue~ den catalizar la oxidación de los grupos - SH de las formas inactivas. reducidas químicamente. de la ribonuc1easa. de la lisozima y de otras proteínas. con formación de enlaces disul~ furo. Por el hecho de que estos productos de oxidación recu~ peran. en gran parte. su actividad enzimática nativa, parece probable que la cadena polipeptídica reducida se pliegue es~ pontáneamente a su conformación nativa aproximada, situando adecuadamente a los grupos - SH, para que puedan producir los enlaces cruzados correctos cuando son sometidos a la oxidación enzimática (cap. 6, pág. 144). La información ne~ cesaria para establecer los enlaces cruzados correctos de las proteínas, es inherente a la secuencia aminoácida de la cadena polipeptídica. Otros aspectos del plegamiento y de la asocia~ ción de subunidades polipeptídicas de las proteínas o1igoméri~ cas, se describen en otros lugares (págs. 147 y 1028).

Entre las modificaciones covalentes que tienen efecto des~ pués de la traducción se encuentran la fosforilación (pág. 445), la metilación (Pág. 763) Y la hidroxilación (pág. 708). así como las reacciones que implican la unión de coenzimas o de grupos prostéticos.

Inhibidores de la biosíntesis proteica

Además de los antibióticos que ya se han mencionado (tetra~ cic1ina y puromicina) otros muchos inhibidores conocidos de la síntesis proteica han llegado a convertirse en importantes agentes para la disección de la estructura y fuación del ribo~ soma (Hg. 33~15). El cloranfenicol inhibe la síntesis proteica en los ribosomas 70S de las células procarióticas (y de las mitocondrias eucarióticas) , porque bloquea la reacción de transferencia de peptidilo. No inhibe la síntesis de proteínas que llevan a cabo los ribosomas 80S de las células eucariotas. El c1oranfenicol se ha utilizado para tratar determinadas in .. fecciones en el hombre, pero es relativamente tóxico, posible~ mente, porque inhibe la síntesis proteica en los ribosomas mitocondriales. Por otra parte, la ciclohexímida (también deno­minada actídiona) inhibe la síntesis proteica en los ribosomas 80S de los eucariotas, pero no inhibe la de los ribosomas 70S de los procariotas. La cic10heximida bloquea la formación del enlace peptídico. Tanto el c1oranfenicol como la cic10heximida se ligan a las subunidades mayores de los ribosomas.

La estreptomicina y los antibióticos relacionados con ella (la neomicina y la kanamícina) se unen a la subunidad menor de los ribo somas de las células procarióticas. Inhiben la sín~ tesis proteica y provocan una lectura errónea del código ge~ nético, seguramente, por una alteración de la conformación del ribosoma que provoca el que los aminoacil-tRNAs estén menos unidos a los codones del mRNA. Las células mutant~s resistentes o dependientes de la estreptomicina poseen sub~ unidades ribosómicas 30S genéticamente alteradas.

958

FIGURA 33-15 Otros inhibidores de la síntesis proteica.

Cicloheximida (inhibe la síntesis proteica por los ribosomas 80S eucarióticos).

NH-C-CHCl

-O- I " 2 O.N f ~ CH-CH O - I I

OH CH. I

OH

Cloranfenicol (inhibe la síntesis proteica por los ribosomas 70S de las bacterias. por bloqueo de la transferencia de peptidilo).

OH

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

NH 11

~N-C-NH NH

OH-~-NH.

HO OH

O J-a\:H ~

CHO

Estreptomicina (se une a una proteína especifica de la subunidad 30S de los ribosomas de E. coli y provoca inhibición y una lectura errónea).

Tetraciclina (inhibe la unión del aminoacil-tRNA a la subunidad 30S).

HOOC"-.". /~ /C~ /CH3

C CH. ~C

HO

HO H O-C-CH. "'CH

" . O

CH.

Ácido fusídico (inhibe indirectamente la etapa de transposición).

Entre otros inhibidores distintos de los antibióticos se en­cuentran el alcaloide emetina, que inhibe la fijación de los aminoacil-tRN As. y la toxina diftérica, proteína tóxica secre­tada por el organismo de la difteria. La toxina diftérica es un enzima que cataliza una reacción entre el NAD+ y el factor de prolongación EF-2 en los ribosomas eucarióticos que rinde un complejo ADP-ribosa-EF-2 inactivo. con lo que se produce una inhibición de la transposición.

La abrina y la ricina son unas proteínas tóxicas de origen ve­getal que inhiben la síntesis proteica en los ribosomas eucarióti­cos por inactivación de las subunidades 60S. bloqueando así la prolongación. Existe alguna evidencia de que estas proteínas vegetales son más tóxicas para las células cancerosas que para las normales. Ambas proteínas. así como la toxina diftérica. contienen dos cadenas polipeptídicas unidas por enlaces di­sulfuro cruzados.

Polirribosomas

Operando bajo condiciones especiales de aislamiento. que evi .. ten la acción de la ribonucleasa y la de fuerzas mecánicas de cizalla. los ribosomas se obtienen agrupados en racimos que

959

PARTE 4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

contienen desde 3 ó 4 hasta 100 ribosomas individuales. Tales agrupamientos que se denominan polirribosomas (o polisomas) pueden fragmentarse en ribosomas individuales (monosomas) por la acción de la ribonuc1easa, 10 cual indica que los polirri~ bosomas se mantienen agrupados por RNA. En las micro~ grafías electrónicas incluso puede distinguirse una fibra de conexión entre ribosomas adyacentes (fig. 33~ 16). La hebra de RNA que los une es de mRNA, que es leído si~ multáneamente por varios ribosomas, que permanecen algo distanciados entre sí. Cada uno de los ribosomas individuales de un polisoma puede construir una cadena polipeptídica com~ pleta, y no requiere la presencia de otros ribosomas. Un dis~ positivo tal utiliza a un mRNA patrón con mayor eficiencia, puesto que se pueden fabricar varias cadenas polipeptídicas a un mismo tiempo (fig. 33~17). Tal como ya se ha indicado anteriormente, la traducción se verifica en dirección 5' -+ 3'. En las bacterias, la transcripción y la traducción funcionan acopladamente, de modo que el mRNA ejecuta dicha traduc~ ción a medida que va siendo transcrito por el DNA (fig. 33~18).

Las cadenas polipeptídicas de la hemoglobina, que contienen unos 150 restos aminoácidos, son codificadas por moléculas de mRNA que poseen 3 X 150 = 450 restos nuc1eotídicos, lo que significa cadenas de unos 150 nm de longitud. Puesto que cada ribosoma 80S de reticulocito tiene unos 22 nm de diámetro, es obvio que a lo largo del mRNA existe espacio suficientemente amplio para que varios ribosomas lo puedan leer simultáneamente. Los polirribosomas aislados de los reti~ culocitos contienen 5 ó 6 ribosomas. Si 6 es el número máximo, el espacio medio que separa a ribo somas sucesivos de 22 nm en ia cadena del mRNA es igual a unO$ 3 nm. Evidentemente, los ribosomas individuales son capac~s de funcionar con rela~ tivamente poco espacio libre a ""lo largo de la cadena del mRNA; se supone que sus velocidades de movimiento están sincronizadas. Entre los mayores sistemas polirribosómicos es~ tán los responsables de la biosíntesis de las cadenas pesadas de la miosina, que contienen unos 1800 restos aminoácidos (pági~ na 763). Tales polisomas contienen por lo menos 60 ribosomas.

La microscopía electrónica de gran resolución ha demostrado que los polirribosomas poseen un elevado grado de ordena~ ción tridimensional. Los polirribosomas de seis o más riboso~ mas, a veces forman apretadas estructuras helicoidales regu~ lares con las subunidades menores mirando hacia dentro (fi~ gura 33~ 19). Se ha hecho el extraordinario descubrimiento de que enfriando ciertos tejidos de organismos superiores, parti~ cularmente los del embrión de pollo, a O oC durante un tiem~ po determinado previo a su fijación y seccionamiento, los ribosomas forman tetrámeros, que adoptan una disposición reticular muy regular en el interior de la célula. y llegan a organizarse formando cristales (fig. 33~20).

Requerimiento energético de la síntesis proteica

Hemos visto que durante la reacción de activación para la formación de cada molécula de aminoacil~tRN A se 'utilizan, probablemente. dos enlaces fosfato de alta energía (pág. 946). Además, una molécula de GTP es escindida a GDP y Pi durante la unión de cada aminoacil~tRNA al

960

FIGURA 33-16

Micrografías electrónicas de polirribosomas de reticulocitos que funcionan en la síntesis de cadenas polipeptídicas de la hemoglobina.

Preparación sombreada.

Preparación teñida con acetato de uranilo para mostrar la hebra de mRNA entre los ribosomas.

FIGURA 33-17

Un polirribosoma. Cinco ribosomas leyendo al mRNA simultáneamente, desde el extremo 5' al 3'.

O Subunidades os ribosómicas

entrantes

"'- /

1

\

1

70S

1

O

30S

Cadena polipeptídica

en crecimiento

Cadena polipeptídica completada

50S 30S

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

centro A del ribosoma. y otra molécula de GTP es hidrolizada en la transposición del ribosoma a lo largo del mRNA. Por lo tanto. se necesitan en conjunto cuatro grupos fosfato de elevada energía para la síntesis de cada enlace peptídico de la proteína completada. Ello representa un gran tirón termo.., dinámico en la dirección de síntesis. dado que se invierten un total de unas 7.3 X 4 = 29.2 kcal para la generación de un enlace peptídico cuya energía libre estándar de hidrólisis. aun .. que no se conoce exactamente. es. como máximo. de unas - 5.0 kcal. El ~Go' de la síntesis del enlace peptídico es de unas -24.2 kcal. produciéndose la síntesis del enlace peptí .. dico a expensas de la energía del enlace fosfato. que es abru .. madoramente exergónica y esencialmente irreversible. Aunqué ello pueda parecer un excesivo malgasto. es el precio que la célula tiene que pagar para garantizar la fidelidad perfecta de la traducción del mensaje genético del mRNA a la secuen .. cia aminoácida de las proteínas. La síntesis proteica consume más energía que cualquier otro proceso biosintético en la mayoría de los organismos: en las células de E. coN hasta un 90 % de la energía biosintética es consumida en la bio .. síntesis proteica.

Síntesis proteica y secreción al citoplasma en las células eucarióticas

La biosíntesis de las cadenas polipeptídicas en los grandes ribosomas 80S del citoplasma de las células eucarióticas. obe .. dece al mismo modelo que la de los ribosomas 70S de las bacterias. si bien hay algunas diferencias de detalle. El amino .. ácido iniciador. en vez de la N .. formilmetionina es la metio .. · nina. en la forma de un tipo especial de metionil .. tRNA que

FIGURA 33-18 Complejo funcional de DNA. mRNA. RNA-polimerasa y un ribosoma en una célula bacteriana. Los ribosomas pueden comenzar a leer un mRNA ya antes de que haya sido completado por la RNA- polimerasa.

Cadena polipeptidica

en crecimiento

961

PARTE 4 REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

responde al codón de iniciación AUG del mRNA. En la iniciación eucariótica también se requieren factores de inicia~ ción y GTP para la formación del complejo de iniciación que tiene que comenzar en la subunidad ribosómica 40S. La pro ... long ación por parte de los ribosomas eucarióticos requiere a los factores de prolongación EF~l y EF~2; además, se nece~ sita GTP tanto para la fijación del aminoacil~tRNA como para la etapa de transposición. El EF~2 de los sistemas euca~ rióticos (pero no su contrapartida en los procarióticos) es inactiva do por una nueva reacción provocada por la toxina diftérica antes descrita. Las etapas de terminación en los eucariotas no han sido analizadas con detalle.

En las células procariotas los ribosomas están, en su mayor parte, libres en el citoplasma, principalmente como polirribo­somas, mientras que en las células eucariotas los ribosomas pueden encontrarse o bien libres, o ligados al retículo en do­plasmático, constituyendo la superficie rugosa del retículo (pág. 35). Se ha postulado que los ribosomas citoplasmáticos libres de los eucariotas se emplean para la biosíntesis de la,s proteínas destinadas al uso interior, como ocurre en el caso de la síntesis de la hemoglobina en los reticulocitos, mientras que los ribosomas que están adheridos a la superficie externa del retículo endoplasmático, se cree que construyen las pro"> teínas que han de secretarse al exterior de la célula. Los ribo­somas ligados al retículo endoplasmático son especialmente abundantes en las células exocrinas pancreáticas, las cuales sintetizan y secretan los enzimas digestivos, así como en las células hepáticas, que forman y secretan proteínas del plasma sanguíneo.

El curso de la síntesis proteica en las células exocrinas del páncreas ha sido estudiado con algún detalle por métodos bioquímicos y de microscopía electrónica (Hg. 33~21). Las pro~ teínas nuevamente formadas, tales como los zimógenos tripsi­nógeno y quimotripsinógeno, abandonan a los ribosomas liga~ dos y pasan a través de la membrana del retículo endoplas­mático, por un proceso que aún no se conoce, penetrando en el espacio intracisterno que actúa como un sistema de canales colectores. El contenido del espacio interior de las cisternas es concentrado y «empaquetado» en el aparato de Golgi pare formar granulos de zimógenos -grandes agregados densos de moléculas zimógenas- rodeadas por una sola membrana. Las moléculas de zimógenos se almacenan en esa forma hasta su secreción. La liberación de su contenido al exterior celular, tiene efecto después de que la membrana del zimógeno se ha fusionado con la membrana plasmática y ha abierto al exterior el lumen del gránulo de zimógeno (Hg. 33~21).

Síntesis proteica en las mitocondrias

Las mitocondrias aisladas de muchos tipos de células eucarió~ ticas, incorporan aminoácidos etiquetados a las proteínas mi­tocondriales. Las mitocondrias poseen todos los elementos esenciales requeridos para la síntesis proteica, incluyendo mRNA, ribosomas, tRNAs y aminoacil~tRNA~sintetasas. todos los cuales son distintivos y diferentes de los necesarios en las síntesis proteicas extramitocondriales de los eucariotas. Los ribosomas de las mitocondrias varían considerablemente de tamaño según la posición de la célula en la escala filo-

962

FIGURA 33-19

Ordenación helicoidal apretadamente enroscada de ribosomas individuales de un polirribosoma libre. Los ribosomas están a poca distancia entre sí a lo largo del mRNA. [Copiado de E. Shelton y E. L. Kuff, J. Mol. Biol., 22: 23 (1966) l.

FIGURA 33-20 Micrografías electrónicas que muestran ribosomas dispuestos según una distribución cristalina, de hígado de embrión de pollo mantenido a O oC durante algún tiempo antes de la fijación.

Pequeño aumento

1,0 p,m

Gran aumento

FIGURA 33-21 Biosíntesis y secreción de proteínas zimógenas en una célula exocrina de páncreas.

Representación esquemática de una célula pancreática, para mostrar las etapas de la secreción de las recién sintetizadas proteínas zimógenas. [Copiado de D. Fawcett, «Structural and Functional Variations in the Membranes 01 the Cytoplasm», de S. Seno y E. V. Cowdry ( eds.), Intracellular Membrane Structures. !apanese Society for Cel! Biology, Okayama, Japón, 1963].

Almacenaje

Concentración y empaquetado ----/H,~z:.c en las vesículas

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

Micrografía electrónica de una célula exocrina, mostrando los gránulos de zimógeno, densos a los electrones.

1,Op.m

genética. Los ribosomas mitocondriales de los organismos superiores tienen valores de sedimentación de 50S a 60S. mientras que los de eucariotas primitivos, levaduras y hongos muestran valores de 70S a 80S. Sus respectivas subunidades varían también en tamaño de un modo correspondiente: en las mitocondrias de las células humanas las subunidades son 45S y 35S. mientras que las de levadura son 55S y 38S. Los ri~ bosomas no siempre son fácilmente visibles en la micrografías electrónicas de las mitocondrias de tejidos animales: con fre~ cuencia se hallan localizados en las porciones de membrana interna situadas entre las crestas (pág. 521).

Como antes se ha indicado, las mitocondrias de las células eucarióticas contienen tRNAs y aminoacil~tRNA~sintetasas específicas y distintivas, que se diferencian de las presentes en el citoplasma extramitocondrial. La síntesis proteica reali~ zada por los ribosomas de las mitocondrias es inhibida por el cloranfenicol, mientras que las síntesis de proteínas extrami~ tocondriales realizadas por los ribosomas 80S de las células eucarióticas no lo es. Por otra parte, la síntesis proteica mito~ condrial emplea a la N~formilmetionina como aminoácido ini~ ciador, mientras que los ribosomas 80S citoplasmáticos utilizan a la metionina. La síntesis proteica mitocondrial se parece, por tanto, a la de las bacterias. Estas observaciones apoyan la hipótesis (pág. 1068) de que las mitocondrias se originaron a partir de bacterias aeróbicas parásitas durante la evolución de las células eucariÓticas.

Además de un DNA mitocondrial circular específico (ca~ pítulos 12 y 31) las mitocondrias contienen también una RNA~ polimerasa~DNA~dependiente, inhibible por la actinomicina D. La observación de que la actinomicina D inhibe la síntesis proteica en las mitocondrias aisladas indica que el mRNA mitocondrial es requerido para dicha síntesis.

963

PARTE -4 REPLICACIÓN. TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN

Un tema del mayor interés lo constituye la identidad de las proteínas sintetizadas por las mitocondrias. pues se dispone de muchos datos reveladores de que la gran mayoría de en~ zimas y proteínas mitocondriales son especificadas por genes de los cromosomas nucleares. y sintetizadas en los ribosomas extramitocondriales. El DNA de las mitocondrias codifica al rRNA mitocondrial. y probablemente a la mayor parte de los tRNAs. dejando sólo a una pequeña cantidad de DNA mitocondrial la función de codificar la síntesis proteica. Se sabe que el DNA de las mitocondrias especifica la síntesis de una o más subunidades proteicas hidrofóbicas de la ATPasa~Fl (pág. 533). de una subunidad del citocromo aa3 (pág. 503) Y posiblemente. una subunidad del citocromo b.

Los cloroplastos también disponen de una maquinaria ae síntesis proteica independiente. parecida a la de las mitocon~ drias. Una de las sub unidades de la ribosa~difosfato~carbo~ xilasa y alguna de las subunidades de los ribosomas del cloro~ plasto son sintetizadas en los propios cloroplastos.

Envejecimiento y errores de la síntesis proteica

Se concede mucho interés a la cuestión de la exactitud de la síntesis proteica en los tejidos animales. y a las consecuencias de los errores cometidos. Parece claro que los aminoácidos de similar estructura pueden reemplazar a un determinada aminoácido no más de una vez en 3000 restos; se supone que la posibilidad de errores con aminoácidos distintos es mucho me~ Dor. Se ha postulado que la frecuencia de error en la biosínte~ sis proteica aumenta con la edad del animal. hasta el punto de que las moléculas de proteína resultantes pueden tornarse menos activas o incluso inactivas. Esta hipótesis se ha confir .. mado mediante experimentos directos en los que se ha com .. parado la cantidad de aldolasa cataIíticamente activa presente en los músculos esqueléticos de animales experimentales. con la cantidad de proteína aldolasa determinada con un anti~ cuerpo específico de la aIdolasa. en función de la edad del animal. Si bien la cantidad total de aldolasa inmunológica~ mente detectable permanecía inalterada en los músculos de los animales viejos. la aldolasa aislada mostraba un tercio de la actividad catalítica del enzima aislado de animales jóvenes. La deducción es que en la biosíntesis de la aldolasa en los animales viejos se cometían muchos errores. provocando que una gran proporción de la población de moléculas de aldolasa fuera inactiva. Estas interesantes observaciones. que merecen ser ampliadas. implican que con la edad puede producirse un deterioro en la exactitud de la traducción.

Resumen

La síntesis de proteínas a partir de aminoácidos activados tiene lugar en la superficie de los ribosomas. Los aminoácidos son primeramente activa­dos en el citoplasma por la acción de aminoacil-tRNA-sintetasas. que catalizan la formación de ésteres aminoacilo de tRNAs homólogos; simul­táneamente se escinde A TP en AMP y pirofosfato. Las aminoacU-tRNA­sintetasas son altamente específicas tanto para el aminoácido como para su correspondiente tRNA. Para cada aminoácido. hay más de un tipo de tRNA. Las aminoacil-tRNA-sintetasas también exhiben una conside­rable especificidad de especie. La porción aminoácida de un aminoacil­tRNA no contribuye a la especificidad de interacción del aminoacil-tRNA con el codón complementario del mRNA; por lo tanto. el tRNA es un «adaptador».

964

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

Las cadenas polipeptídicas se construyen a partir del resto aminoácido N-terminal. Los nuevos restos aminoacUo se añaden al grupo carboxUo terminal del peptidil-tRNA por desplazamiento nuc1eofílico del tRNA del carbono carboxílico. En E. coli, el aminoácido iniciador es la N-formil­metionina, que entra como N-formilmetionil-tRNA (fMet-tRNA). El fMet­tRNA y el mRNA se unen a las subunidades 30S libres de los ribosomas, formando el complejo de iniciación según un proceso que requiere GTP y tres factores de iniciación, I-Fl. IF-2 e IF-3. Después, el factor de iniciación se combina con la subunidad 50S para formar un ribosoma funcional 70S. En el subsiguiente proceso de prolongación, son necesarios un factor de prolongación citoplasmático EF-T y la hidrólisis de GTP para asegurar la adecuada unión del aminoacil-tRNA entrante. El grupo peptidilo situado sobre el locus peptidilo es transferido al grupo amino del nuevo aminoacil-tRNA en el centro aminoacilo gracias a una actividad enzimática presente en la subunidad 50S. Un factor de prolongación EF-G del citoplasma, así como la hidrólisis de una segunda molécula de GTP, son indispensables para la transposición del peptidil-tRNA desde el centro aminoacilo al centro peptidilo. Para la inserción de cada resto aminoácido se requieren cuatro enlaces fosfato de alta energía. El peptidil-tRNA formado, al llegar a un codón determinación en el mRNA, se libera del tRNA y del ribosoma por la acción de los factorés de liberación R, y R,. Se conocen muchos inhibidores de la síntesis proteica; en su mayoría se combinan con la mayor o la menor de las subunidades ribosómicas, inter­firiendo con una etapa especifica. La puromicina inhibe la síntesis de la cadena peptídica por su interacción con el peptidil-tRNA en el ribosoma, formando peptidil-puromicina que se descarga del ribosoma.

Los polirribosomas, también denominados polisomas, consisten en molé­culas de mRNA a las que están adheridos varios o muchos ribosomas, cada uno de los cuales, lee el mRNA independientemente, y construye una cadena polipeptídica. En las células eucarióticas, la síntesis proteica puede tener lugar en tales ribosomas libres, o bien en los ribosomas ligados al reticulo endoplasmático. En las células pancreáticas, las cisternas del retículo endoplasmático forman canales para el transporte de la nueva proteína sintetizada, hacia su liberación. También tienen lugar síntesis proteicas en las mitocondrias y en los c1oroplastos, los cuales poseen mRNAs, tRNAs especificos, aminoacil-tRNA-sintetasas y ribosomas; estos últimos se parecen, en muchos aspectos, a los de las bacterias.

Bibliografía

V éanse también las referencias bibliográficas del final de los capítulos 34 al 36.

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Problemas

1. La ríbonucleasa de E. coli contiene 104 restos aminoácidos. ¿ Cuánto tiempo consumiría la traducción de su mRNA en condiciones intrace­lulares? Compárese con el tiempo empleado en la síntesis de su gen. Véase Problema 2, capítulo 32.

2. Suponiendo que la reacción comienza con aminoácidos libres, tRNAs, aminoacil-tRNA-sintetasas, GDP, ATP, ribosomas y factores de tra­ducción, ¿cuántos enlaces fosfato de elevada energía se utilizan para la traducción del mRNA de la ribonucleasa en una sola vez?

3. La masa total de RNA en E. coli es 3,2 X 1010 daltons, el 80 % de la cual es rRNA, el 15 % es tRNA y el 5 % es mRNA. Un ribonucleótido tiene un peso molecular medio de 340. a) Admitiendo que el peso molecular del RNA por ribosoma es 1.7 X 106

, y que la longitud media del mRNA es de 1000 nucleótidos, ¿cuántos ribosomas habrá por mensajero? b) ¿Cuántas moléculas de tRNA habrá por ribosoma, si cada adaptador tiene una longitud de 90 nucleótidos?

4. ~I peso molecular total de las proteínas ríbosómicas de E. coli es de 1 millón por ribosoma. Admitiendo que cada proteína se encuentra en una sola molécula en cada uno de los 15000 ribosomas de la célula, y que cada molécula de rnRNA proteico del ribosoma es traducida 15 veces, calcular lo siguiente: a) ¿Con qué frecuencia tiene que ser transcrito cada gen proteico del

ríbosoma? b) ¿Cuántos nucleótidos contienen esos genes, si el peso molecular

medio de un resto aminoácido en las proteínas ribosómicas es 11O?

966

Capítulo 33 Traducción: Biosíntesis de las proteínas

c) Para sintetizar una cantidad suficiente de mRNA para codificar todas las proteínas de los ribosomas de una sola célula, ¿cuántos enlaces fosfato de elevada energía se consumen para transcribir esos genes, partiendo de ATP y de ribonucleótido-5'-monofosfatos?

d) ¿Cuántos enlaces fosfato de alta energía se gastan para traducir esos rnRNAs, con una mezcla de incubación como la del Proble­ma 2? Hágase la aproximación de que el componente proteico de cada ribosoma es sintetizado como un solo péptido a partir de un solo mRNA.

e) ¿Cuántos enlaces fosfato de alta energía se gastan para sintetizar los ribosomas, incluyendo la transcripción del rRNA y del mRNA, así como la traducción del mRNA?

f) Compárese con la energía consumida en la replicación (cap. 32, Problema 5).

B) ¿De qué otros componentes hay que considerar el costo, para calcular el costo total de energía del mecanismo de síntesis pro­teica?

5. Cuanto más separadas están dos mutaciones, más probable es su recombinación para formar el DNA de tipo salvaje. Del gen de las proteínas de la cabeza del bacteriófago Ti se aislaron 26 mutantes diferentes designados de la A a la Z. Se observaron las siguientes frecuencias relativas de recombinación, en el cruzamiento de cua­tro mutantes representativos: S X D = 0,2 "lo, y X D = 0.3 "lo. E X Y = 0.2 "lo. y X S = 0.5 "lo. Trazado el mapa de transducción se localizó el mutante E al extremo 3' de la hebra transcrita relativa a las otras mutaciones. a) Construir el mapa genético de las cuatro mutaciones. mostrando la dirección de la transcripción. b) Las cua­tro mutaciones son de un tipo denominado de mutación sin sentido. que provocan una terminación prematura de la traducción del mRNA. Si el gen y la proteína son colineares (como experimentos de este tipo demostraron) ordenar las proteínas mutantes por tamaños decre­cientes.

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