Průtoková cytometrie• Princip průtokové cytometrie• Použití více fluorescenčních barev -

teorie kompenzace• Možnosti analýzy dat• Některé aplikace průtokové cytometrie

Imunologické laboratorní metody20.4.2009

Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“

Odpad

Detekce& Počítání

Vzorek

Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence.

Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován

Průtoková cytometrie je technologie, kteráumožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky

Složky průtokového cytometruSložky průtokového cytometruFluidika: vzorek – buněčná suspenze.

Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvořeníproudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření.

Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry)

Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu.

Analýza dat: Zobrazení dat & analýzaidentifikace populacíkvantifikace intenzity značeníkvantifikace zastoupení buněk v dané populaci

Schéma fluidiky

Unášecítekutina

Odpad

NatlakováníVakuum

TlakVzorku(Variabilní)

Tlakunáš. tek.(Stálý)

vzorekvzorek

Princip průtokové cytometrieJádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta

Quartznozzle

FluorescenFluorescenččnníí signsignáályly

Laserový paprsekLaserový paprsek

Nasátí buněk

Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm- na některých přístrojích lze měnit

Hydrodynamická fokusace v kyvetěDobré rozlišení Horší rozlišení

VzorekVzorekUnášecí tekutina Unášecí tekutina

Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku.Nevhodné pro DNA analýzu

Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorkuVhodné pro DNA analýzu

nízký vysoký

Rozptyl světla buňkou:Forward Scatter (FSC)Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla

FSC závisí na velikosti buňky

LaserLaserovýový paprsekpaprsekFSCFSC

DeteDetekktortor

Rozptyl světla buňkou:Side Scatter (SSC)

FSCFSCDeteDetekktortor

SbSběěrnrnéé ččooččkyky

SSCSSCDeteDetekktortor

Laserový paprsekLaserový paprsek

Intenzita SSC je proporcionálnímnožství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.)SSC závisí na granularitě buňky

Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC

FSC

SSC

Lymfocyty

Monocyty

Granulocyty

ErytrocytyErytrocytydebrisdebris,,MrtvMrtvéé bubuňňkyky

Detekce fluorescence, značení protilátkami

Intenzita fluorescence

FITC

FITC

101 104103102

Relativní intenzita fluorescence

Poče

t bun

ěk

FITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITC

Fluorescenční kanály• Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí

protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se • Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla

excitační. • Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí

soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnovédélky

Stokesův posun

LaseryLight amplification by stimulated emission of radiation

• Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) • Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci,

stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem).

• Stabilní zdroj záření

Lasery v průtokovém cytometru:

Dvoulaserové průtokové cytometryargon laser - modrý (488 nm)

helium-neon diode laser - červený (633 nm).

Třílaserové průtokové cytometryviolet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)

Detekce Fluorescence

FSCFSCDetectorDetector

CollectionCollectionLensLens

Laser BeamLaser Beam

FluorescenceFluorescenceDetector A, B, C, etcDetector A, B, C, etc……

EmitovanEmitovanáá fluorescence je pomocfluorescence je pomocíísestavy filtrsestavy filtrůů a a ččoočček rozdek rozděělena podle lena podle vlnovvlnovéé ddéélky do kanlky do kanáállůů..

Na koncových detektorech je v Na koncových detektorech je v kakažžddéém z nich vyhodnocena intenzita m z nich vyhodnocena intenzita fluorescence.fluorescence.

Intenzita fluorescence

FITC

FITC

101 104103102

Relative fluorescence intensity

Num

bero

f Eve

nts

FITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITC

Long Pass Filtry (LP)

• Propouští všechny vlnové délky vyšší nežspecifikovaná vlnová délka

• Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm

400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm

Tran

smitt

ance

Tran

smitt

ance

Short Pass Filtry (SP)

• Propouští všechny vlnové délky kratší nežspecifikovaná vlnová délka

• Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm.

400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm

Tran

smitt

ance

Tran

smitt

ance

Pásmové filtry• Propouší specifické rozmezí vlnových délek• Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět

vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 = 550+/-10, ne 550+/-20)

400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm

Tran

smitt

ance

Tran

smitt

ance

Dichroické filtry

• Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP)• Filtr je umístěn v úhlu 45°• Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu

paprsku, část světla je propuštena.

DichroicDichroicFilterFilter

Detector 1Detector 1

Detector 2Detector 2

Jednoduché schéma optiky přístroje FacsCalibur

Počet kanálů:2 lasery – obvykle 4 kanály3 lasery – až 11 kanálů

FITC

PE

PC5

APC

Spektra běžných fluorochromůLaser Lines (nm)Laser Lines (nm) 350350 457457 488488 514514 610610 632632

300300 400400 500500 600600 700700

PE-Texas Red

Texas Red

PI

Ethidium

PE

FITC

cis-Paranaric Acid

ElektronikaDetektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu

Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost detektoru

Konverze optického signálu do elektronických signálů(změny v napětí - pulsy)

Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ).

Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu

Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů

Vznik pulsu napětí na PMT

Voltage

LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

t

t

t

Voltage

Voltage

1.

2.

3.

Výška, šířka a plocha pulsu

čas (µs)

Napět

í

Plochy pulsu (A)

Výš

ka p

ulsu

(H)

Šířka pulsu (W)

400

Práh (Threshold)

Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.

Kompenzace

• Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc)

• V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů(tzv. přesvit, překryv spekter)

• Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu

Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser)

•Stejná excitace různá emise

•Překryv spekter(overlap)

Překryv spekter (spektral overlap)

FITC Fluorescein IsothiocyanatePE Phycoerytrin

KompenzaceJednobarevné značeníCD8 FITC

Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelnáZávisí na:• nastavení přístroje (PMT napětí na

detektorech)• vlastnostech dané šarže fluorochromu

FL2-%FL1=12%FL2-%FL1=0%

Kompenzace pomocí softwaru

• Je potřeba připravit jednobarevně značenékontrolní vzorky

• Software vypočítá hodnoty kompenzací• Snadné, přesné a rychlé• Umožňuje to mnohobarevnou analýzu

Možné na cytometrech nové generaceFL1 FL2 FL3

FL1 Comp 3.96 0FL2

Comp 27.35 5.15FL3

Comp 0 11.18

Kompenzační matrix

Mnohobarevná cytometrie• Výhody

• Šetří čas a vzorky• (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek

• Exponenciální nárůst informace• Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek

• Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%)• interní kontroly ve vzorku

• Problémy• Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů

• Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách• Vyšší možnost vzniku chyb

• Je potřeba zvolit správné kontroly

Analýza a interpretace dat• Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního

softwaru grafické zobrazení• Různé typy grafů• Statistiky• Názvy běžných programů (CellQuest, Flowjo, WinMDI,

FCS Express)

Histogramy – zobrazení 1 parametru

Event #

Param 1FSC

Param2SSC

Param3

FITC

Param4

PE

Param5

APC

1 100 500 10 650 4

2 110 505 700 700 6

3 90 480 720 670 10

4 95 490 15 720 15

0………10………100………1000…….10000

LIST MODE FILE

Čet

nost

(cou

nt)

Intenzita signálu

Dot ploty – zobrazení 2 parametrů

FSC

Periferní krev –populace dle velikosti a granularity

SSC

30%

60%Periferní krev –populace lymfocytů dle CD4 a CD8

Gatování

Gate je definován jako oblast(za pomoci logických operátorů- AND, NOT, OR)

Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subsetbuněk

Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají:• procento pozitivních buněk• Hodnota fluorescence (relativní hodnota)

Populace krevních dendritických buněk

Hlavní aplikace na průtokovém cytometru:

• DNA a RNA analýza• Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk)• Fenotypizace (zastoupení populací, testování

aktivace buněk)• Funkce buněk (Ca2+influx)• Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické

funkce)• Sorting a buněčná izolace

Stanovení zastoupení základních buněčných populací

CD

16 P

E, C

D56

PE

NK buňky

CD3 FITC

Ostatní populace:

CD16+CD56+ NK buňkyCD14+ monocyty

Periferní krev – populace lymfocytůdle CD4 a CD8:CD4+ Th lymfocytyCD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty

Analýza životnosti, apoptózyApoptóza– fosfatidylserin na vnější straně membrány– vazba Annexinu V

Mrtvé buňky- Průnik barvy do jádra (propidium iodide PI)

G1

S phase

G2

MG1

2 1

Analýza buněčného

cyklu

DNA obsah na průtokovém cytometru

G0/1

G2/MS

Eve

nts

1DNA obsah

Rozložení do fází buněčného cyklu

Značení konců DNA dUTP

Green Fluorescence

Green Fluorescence

Apoptóza –fragmentace DNA

Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluorescein-deoxyuridinetriphosphate (dUTP)]

Detekce v kanálu FITC

Apoptotické buňky (DNA je fragmentována

Živé buňky (DNA není fragmentována

Oxidační reakceNapř. Testování funkce makrofágůOxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.

• Superoxide Hydroethidine• Hydrogen Peroxide Dichlorofluorescein• Glutathione levels Monobromobimane• Nitric Oxide Dichlorofluorescein

Influx calciaStimulace – nespecifická, specifická (receptory)Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2)

Flow Cytometry Image Cytometry

Time (Seconds)0 36 72 108 144 180

RA

TIO

[sho

rt/lo

ng]

0 2

00 4

00 6

00 8

0010

00

StimulationStimulation

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 50 100 150 200

Rat

io: i

nten

sity

of 4

60nm

/ 40

5nm

sig

nals

Time (seconds)

Testování fagocytózy• Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ?• Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR

FITC (zelená)

0 102 103 104 105

<B-610/20-A>: DiI

0

102

103

104

105

<B-5

30/3

0-A

>: H

LA-D

R F

ITC

74.529.7 44.6

22.43.24

0 102 103 104 105

<B-610/20-A>: DiI

0

102

103

104

105

<B-5

30/3

0-A

>: H

LA-D

R F

ITC

73.345.7 27.5

24.82.01

0 102 103 104 105

<B-610/20-A>: DiI

0

102

103

104

105

<B-5

30/3

0-A

>: H

LA-D

R F

ITC

73.371.2 2.12

242.73

24 hodControl 0°C 4 hod