รหสโครงการ SUT3-304-53-36-01

รายงานการวจย

การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ของมนษย เพอการตรวจวเคราะหและรกษา โรคพษสนขบา ดวยเทคโนโลยเฟจ

Production of human monoclonal antibody for diagnosis and therapy of rabies by phage display technology

ไดรบทนอดหนนการวจยจาก มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

รหสโครงการ SUT3-304-53-36-01

รายงานการวจย

การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ของมนษย เพอการตรวจวเคราะหและรกษา โรคพษสนขบา ดวยเทคโนโลยเฟจ

Production of human monoclonal antibody for diagnosis and therapy of rabies by phage display technology

คณะผวจย

หวหนาโครงการ รองศาสตราจารย เภสชกรหญง ดร มณฑารพ ยมาภย

สาขาวชา เทคโนโลยชวภาพ ส านกวชา เทคโนโลยการเกษตร

ผรวมวจย

ดร ผกามาศ ขาวปลอด

ฝายวจยและพฒนา

สถานเสาวภา สภากาชาดไทย

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ 2553 - 2555

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

พฤศจกายน 2557

กตตกรรมประกาศ การวจยครงนไดรบทนอดหนนจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ประจ าปงบประมาณ 2553 ถง 2555 โดยมกรรมการจากสภาวจยแหงชาตเปนผประเมนขอเสนอโครงการ ผวจยขอขอบคณ นางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท นกศกษาปรญญาโท ทไดเปนผชวยวจยหลกในการท าการคดเลอกและวเคราะหเฟจ โดยใชผลงานนเปนสวนหนงของวทยานพนธ ระดบปรญญาโท ขอขอบคณ นางสาวสจนตนา ชมแสง และดร นนทนจ จารเศรณย นกวจยในหองปฏบตการ ทไดท าหนาทสรางคลงเฟจ ซงไดเลอดจาก นายสตวแพทยธนท กลกาจณาวรรณ และนายสตวแพทยสทศน แสงชวงศ นางสาวสจนตนา ชมแสง และนางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท เปนตนแบบในการสรางคลง อกทงขอขอบคณ คณปยมาศ มหาบญญานนท เจาหนาทบรหารจดการทรพยสนทางปญญา ของ มทส ทไดชวยเหลอในขนตอนการจดสทธบตรเปนอยางด นอกจากนแลวยงขอขอบคณ คณศภกาญจน บญอย นางสาวเพญสดา สมภงา นางสาวสภมาส บณฑตสาธสรรค ทชวยดแลในเรองงานการเงน และงานธรการ เปนอยางด

บทคดยอภาษาไทย โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบา ถกคดเลอกจากคลงแอนตบอด (scFv) มนษยทไมถกกระตนดวยไวรสกอโรคพษสนขบา (คลง YAMO-I) และคลงทถกกระตนดวยไวรส (คลง Yamo-Rb) ดวยเทคโนโลยเฟจ โดยท าการคดเลอก (ไบโอแพนนง) จ านวน 1-5 รอบ โดยใชเชอไวรสกอโรคพษสนขบาทหมดฤทธแลว (inactivated virus) 2 ชนด คอ PCEC และ PVRV เปนเปาหมายในการคดเลอก ซงสามารถคดเลอกโคลนทสามารถจบจ าเพาะตอเชอพษสนขบาไดจ านวน 14 โคลน ไดแก IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v และ IVB4cv ผลจากการทดสอบโดยใชวธการอไลซาพบวา โคลนเหลานมความสามารถในการจบจ าเพาะไดดตอเชอทใชในการคดเลอก ล าดบเบสของดเอนเอไดถกวเคราะหโดยวเคราะหล าดบเบสอตโนมต โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบาทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) ทง 13 โคลนถกน ามาทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา (Neutralization) ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา มเพยง IRA7c และ IIIRC2c ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได ดงนนจงไดเลอกแอนตบอดเพยง 4 โคลนมาผลต และท าใหบรสทธไดดดวยวธการ IMAC ไดแก IYF5c IIYG4v IRA7c และ IIIRC2c โดยท าการน ายนของแอนตบอดเหลานไปใสไวใน พลาสมด pET27b(+) เพอใหยนท าการแสดงออก โดยการผลตเปนแอนตบอด scFv แบบอสระในแบคทเรย E coli BL21 ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชแอนตบอด scFv แบบอสระ (soluble scFv)ยนยนผลการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชโมโนโคลนอลแอนตบอดทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) คอมเพยง IRA7c และ IIIRC2c ซงไดรบการคดเลอกมาจากคลงแอนตบอดมนษยทไดรบการกระตนดวยเชอพษสนขบาเทานน ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได โดยมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบา 454 IUmg และ 020 IUmg ตามล าดบซงชนสวนของแอนตบอดมนษยทง 2 น สามารถน าไปพฒนาตอยอดเพอน าไปใชเปนแอนตบอดส าหรบการรกษา หรอปองกนโรคไดตอไป นอกจากนนแลวยงมผลการทดลองทนาสนใจคอ แอนตบอดโคลน IYF5c ซงแสดงความสามารถในการจบไดเปนอยางดกบเชอไวรสชนดตาย (PCEC) จากการวเคราะหดวยวธการ ELISA แตกลบไมมความสามารถยบยงการกอโรคไดเลย ซงผลการทดลองนแสดงใหเหนวาไมสามารถใชผลจากการวเคราะหดวยวธ ELISA ในการคาดเดาความสามารถของแอนตบอดในการยบยงโรคไดจรง อยางไรกตามแอนตบอดน อาจน าไปประยกตใชเปนตวตรวจสอบเชอไวรสกอโรคพษสนขบาในระดบ strain ไดตอไป การวจยนน าไปส การยนขอจดสทธบตร 5 ฉบบเพอคมครองล าดบกรดอะมโนของแอนตบอดทง 14 ชนดทไดคนพบ และผลงานน าเสนอและต พ ม พ ในร าย ง านกา รประช มฉบ บ เต มขอ ง ง านประช ม ระด บน านาชาต IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED ในป 2555 ซงยงไดรบรางวล ผเขารอบสดทายในการเปนผลงานตพมพดเยยม อกดวย

บทคดยอภาษาองกฤษ

Human monoclonal antibodies against Rabies virus were selected from non-immunized human scFv library (YAMO-I library) and immunized library (Yamo-Rb library) by using phage display technology The biopanning was performed for 1-5 rounds by using two types of inactivated rabies vaccines as targets These are purified vero cell rabies vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones from various methods of biopanning that can bind to rabies IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv were isolated and their genes were sequenced We found that clones IVB4cv and IRA7c were identicalThese two clones were isolated from the same library by using different biopanning method Thus there are a total of 13 positive clones Phage scFv were tested for neutralization capacity by the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) Only clones IRA7c and IIIRC2c showed neutralization of the rabies virus in vitro Four scFv antibodies genes were transferred into pET27b (+) expression vector for over-expression in E coli BL21 and purified by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Neutralization assay using soluble scFv confirm and indicated that only clones IRA7c and IIIC2c which were derived from immunized library could neutralize the virus at 454 and 020 IUmg respectively These two clones could be used as the basis for the development into therapeutic antibodies in the future It is interesting to note that clone IYF5c which shows very strong binding to PCEC virus by ELISA method couldnrsquot neutralize the virus These results indicated that ELISA result canrsquot be used to predict neutralization activity of the antibody Nevertheless clone IYF5c could be developed as the strain specific detection probe in the future The outcome of this research project has led to the filing of 5 patent applications claming the amino acid sequences of the isolated 14 scFv antibody clones as well as one publication in a proceeding which was awarded ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo by the IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED in the year 2012

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

รหสโครงการ SUT3-304-53-36-01

รายงานการวจย

การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ของมนษย เพอการตรวจวเคราะหและรกษา โรคพษสนขบา ดวยเทคโนโลยเฟจ

Production of human monoclonal antibody for diagnosis and therapy of rabies by phage display technology

คณะผวจย

หวหนาโครงการ รองศาสตราจารย เภสชกรหญง ดร มณฑารพ ยมาภย

สาขาวชา เทคโนโลยชวภาพ ส านกวชา เทคโนโลยการเกษตร

ผรวมวจย

ดร ผกามาศ ขาวปลอด

ฝายวจยและพฒนา

สถานเสาวภา สภากาชาดไทย

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ 2553 - 2555

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

พฤศจกายน 2557

กตตกรรมประกาศ การวจยครงนไดรบทนอดหนนจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ประจ าปงบประมาณ 2553 ถง 2555 โดยมกรรมการจากสภาวจยแหงชาตเปนผประเมนขอเสนอโครงการ ผวจยขอขอบคณ นางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท นกศกษาปรญญาโท ทไดเปนผชวยวจยหลกในการท าการคดเลอกและวเคราะหเฟจ โดยใชผลงานนเปนสวนหนงของวทยานพนธ ระดบปรญญาโท ขอขอบคณ นางสาวสจนตนา ชมแสง และดร นนทนจ จารเศรณย นกวจยในหองปฏบตการ ทไดท าหนาทสรางคลงเฟจ ซงไดเลอดจาก นายสตวแพทยธนท กลกาจณาวรรณ และนายสตวแพทยสทศน แสงชวงศ นางสาวสจนตนา ชมแสง และนางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท เปนตนแบบในการสรางคลง อกทงขอขอบคณ คณปยมาศ มหาบญญานนท เจาหนาทบรหารจดการทรพยสนทางปญญา ของ มทส ทไดชวยเหลอในขนตอนการจดสทธบตรเปนอยางด นอกจากนแลวยงขอขอบคณ คณศภกาญจน บญอย นางสาวเพญสดา สมภงา นางสาวสภมาส บณฑตสาธสรรค ทชวยดแลในเรองงานการเงน และงานธรการ เปนอยางด

บทคดยอภาษาไทย โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบา ถกคดเลอกจากคลงแอนตบอด (scFv) มนษยทไมถกกระตนดวยไวรสกอโรคพษสนขบา (คลง YAMO-I) และคลงทถกกระตนดวยไวรส (คลง Yamo-Rb) ดวยเทคโนโลยเฟจ โดยท าการคดเลอก (ไบโอแพนนง) จ านวน 1-5 รอบ โดยใชเชอไวรสกอโรคพษสนขบาทหมดฤทธแลว (inactivated virus) 2 ชนด คอ PCEC และ PVRV เปนเปาหมายในการคดเลอก ซงสามารถคดเลอกโคลนทสามารถจบจ าเพาะตอเชอพษสนขบาไดจ านวน 14 โคลน ไดแก IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v และ IVB4cv ผลจากการทดสอบโดยใชวธการอไลซาพบวา โคลนเหลานมความสามารถในการจบจ าเพาะไดดตอเชอทใชในการคดเลอก ล าดบเบสของดเอนเอไดถกวเคราะหโดยวเคราะหล าดบเบสอตโนมต โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบาทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) ทง 13 โคลนถกน ามาทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา (Neutralization) ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา มเพยง IRA7c และ IIIRC2c ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได ดงนนจงไดเลอกแอนตบอดเพยง 4 โคลนมาผลต และท าใหบรสทธไดดดวยวธการ IMAC ไดแก IYF5c IIYG4v IRA7c และ IIIRC2c โดยท าการน ายนของแอนตบอดเหลานไปใสไวใน พลาสมด pET27b(+) เพอใหยนท าการแสดงออก โดยการผลตเปนแอนตบอด scFv แบบอสระในแบคทเรย E coli BL21 ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชแอนตบอด scFv แบบอสระ (soluble scFv)ยนยนผลการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชโมโนโคลนอลแอนตบอดทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) คอมเพยง IRA7c และ IIIRC2c ซงไดรบการคดเลอกมาจากคลงแอนตบอดมนษยทไดรบการกระตนดวยเชอพษสนขบาเทานน ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได โดยมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบา 454 IUmg และ 020 IUmg ตามล าดบซงชนสวนของแอนตบอดมนษยทง 2 น สามารถน าไปพฒนาตอยอดเพอน าไปใชเปนแอนตบอดส าหรบการรกษา หรอปองกนโรคไดตอไป นอกจากนนแลวยงมผลการทดลองทนาสนใจคอ แอนตบอดโคลน IYF5c ซงแสดงความสามารถในการจบไดเปนอยางดกบเชอไวรสชนดตาย (PCEC) จากการวเคราะหดวยวธการ ELISA แตกลบไมมความสามารถยบยงการกอโรคไดเลย ซงผลการทดลองนแสดงใหเหนวาไมสามารถใชผลจากการวเคราะหดวยวธ ELISA ในการคาดเดาความสามารถของแอนตบอดในการยบยงโรคไดจรง อยางไรกตามแอนตบอดน อาจน าไปประยกตใชเปนตวตรวจสอบเชอไวรสกอโรคพษสนขบาในระดบ strain ไดตอไป การวจยนน าไปส การยนขอจดสทธบตร 5 ฉบบเพอคมครองล าดบกรดอะมโนของแอนตบอดทง 14 ชนดทไดคนพบ และผลงานน าเสนอและต พ ม พ ในร าย ง านกา รประช มฉบ บ เต มขอ ง ง านประช ม ระด บน านาชาต IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED ในป 2555 ซงยงไดรบรางวล ผเขารอบสดทายในการเปนผลงานตพมพดเยยม อกดวย

บทคดยอภาษาองกฤษ

Human monoclonal antibodies against Rabies virus were selected from non-immunized human scFv library (YAMO-I library) and immunized library (Yamo-Rb library) by using phage display technology The biopanning was performed for 1-5 rounds by using two types of inactivated rabies vaccines as targets These are purified vero cell rabies vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones from various methods of biopanning that can bind to rabies IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv were isolated and their genes were sequenced We found that clones IVB4cv and IRA7c were identicalThese two clones were isolated from the same library by using different biopanning method Thus there are a total of 13 positive clones Phage scFv were tested for neutralization capacity by the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) Only clones IRA7c and IIIRC2c showed neutralization of the rabies virus in vitro Four scFv antibodies genes were transferred into pET27b (+) expression vector for over-expression in E coli BL21 and purified by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Neutralization assay using soluble scFv confirm and indicated that only clones IRA7c and IIIC2c which were derived from immunized library could neutralize the virus at 454 and 020 IUmg respectively These two clones could be used as the basis for the development into therapeutic antibodies in the future It is interesting to note that clone IYF5c which shows very strong binding to PCEC virus by ELISA method couldnrsquot neutralize the virus These results indicated that ELISA result canrsquot be used to predict neutralization activity of the antibody Nevertheless clone IYF5c could be developed as the strain specific detection probe in the future The outcome of this research project has led to the filing of 5 patent applications claming the amino acid sequences of the isolated 14 scFv antibody clones as well as one publication in a proceeding which was awarded ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo by the IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED in the year 2012

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

กตตกรรมประกาศ การวจยครงนไดรบทนอดหนนจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ประจ าปงบประมาณ 2553 ถง 2555 โดยมกรรมการจากสภาวจยแหงชาตเปนผประเมนขอเสนอโครงการ ผวจยขอขอบคณ นางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท นกศกษาปรญญาโท ทไดเปนผชวยวจยหลกในการท าการคดเลอกและวเคราะหเฟจ โดยใชผลงานนเปนสวนหนงของวทยานพนธ ระดบปรญญาโท ขอขอบคณ นางสาวสจนตนา ชมแสง และดร นนทนจ จารเศรณย นกวจยในหองปฏบตการ ทไดท าหนาทสรางคลงเฟจ ซงไดเลอดจาก นายสตวแพทยธนท กลกาจณาวรรณ และนายสตวแพทยสทศน แสงชวงศ นางสาวสจนตนา ชมแสง และนางสาวณชชา พฤกษาเมธานนท เปนตนแบบในการสรางคลง อกทงขอขอบคณ คณปยมาศ มหาบญญานนท เจาหนาทบรหารจดการทรพยสนทางปญญา ของ มทส ทไดชวยเหลอในขนตอนการจดสทธบตรเปนอยางด นอกจากนแลวยงขอขอบคณ คณศภกาญจน บญอย นางสาวเพญสดา สมภงา นางสาวสภมาส บณฑตสาธสรรค ทชวยดแลในเรองงานการเงน และงานธรการ เปนอยางด

บทคดยอภาษาไทย โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบา ถกคดเลอกจากคลงแอนตบอด (scFv) มนษยทไมถกกระตนดวยไวรสกอโรคพษสนขบา (คลง YAMO-I) และคลงทถกกระตนดวยไวรส (คลง Yamo-Rb) ดวยเทคโนโลยเฟจ โดยท าการคดเลอก (ไบโอแพนนง) จ านวน 1-5 รอบ โดยใชเชอไวรสกอโรคพษสนขบาทหมดฤทธแลว (inactivated virus) 2 ชนด คอ PCEC และ PVRV เปนเปาหมายในการคดเลอก ซงสามารถคดเลอกโคลนทสามารถจบจ าเพาะตอเชอพษสนขบาไดจ านวน 14 โคลน ไดแก IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v และ IVB4cv ผลจากการทดสอบโดยใชวธการอไลซาพบวา โคลนเหลานมความสามารถในการจบจ าเพาะไดดตอเชอทใชในการคดเลอก ล าดบเบสของดเอนเอไดถกวเคราะหโดยวเคราะหล าดบเบสอตโนมต โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบาทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) ทง 13 โคลนถกน ามาทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา (Neutralization) ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา มเพยง IRA7c และ IIIRC2c ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได ดงนนจงไดเลอกแอนตบอดเพยง 4 โคลนมาผลต และท าใหบรสทธไดดดวยวธการ IMAC ไดแก IYF5c IIYG4v IRA7c และ IIIRC2c โดยท าการน ายนของแอนตบอดเหลานไปใสไวใน พลาสมด pET27b(+) เพอใหยนท าการแสดงออก โดยการผลตเปนแอนตบอด scFv แบบอสระในแบคทเรย E coli BL21 ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชแอนตบอด scFv แบบอสระ (soluble scFv)ยนยนผลการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชโมโนโคลนอลแอนตบอดทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) คอมเพยง IRA7c และ IIIRC2c ซงไดรบการคดเลอกมาจากคลงแอนตบอดมนษยทไดรบการกระตนดวยเชอพษสนขบาเทานน ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได โดยมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบา 454 IUmg และ 020 IUmg ตามล าดบซงชนสวนของแอนตบอดมนษยทง 2 น สามารถน าไปพฒนาตอยอดเพอน าไปใชเปนแอนตบอดส าหรบการรกษา หรอปองกนโรคไดตอไป นอกจากนนแลวยงมผลการทดลองทนาสนใจคอ แอนตบอดโคลน IYF5c ซงแสดงความสามารถในการจบไดเปนอยางดกบเชอไวรสชนดตาย (PCEC) จากการวเคราะหดวยวธการ ELISA แตกลบไมมความสามารถยบยงการกอโรคไดเลย ซงผลการทดลองนแสดงใหเหนวาไมสามารถใชผลจากการวเคราะหดวยวธ ELISA ในการคาดเดาความสามารถของแอนตบอดในการยบยงโรคไดจรง อยางไรกตามแอนตบอดน อาจน าไปประยกตใชเปนตวตรวจสอบเชอไวรสกอโรคพษสนขบาในระดบ strain ไดตอไป การวจยนน าไปส การยนขอจดสทธบตร 5 ฉบบเพอคมครองล าดบกรดอะมโนของแอนตบอดทง 14 ชนดทไดคนพบ และผลงานน าเสนอและต พ ม พ ในร าย ง านกา รประช มฉบ บ เต มขอ ง ง านประช ม ระด บน านาชาต IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED ในป 2555 ซงยงไดรบรางวล ผเขารอบสดทายในการเปนผลงานตพมพดเยยม อกดวย

บทคดยอภาษาองกฤษ

Human monoclonal antibodies against Rabies virus were selected from non-immunized human scFv library (YAMO-I library) and immunized library (Yamo-Rb library) by using phage display technology The biopanning was performed for 1-5 rounds by using two types of inactivated rabies vaccines as targets These are purified vero cell rabies vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones from various methods of biopanning that can bind to rabies IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv were isolated and their genes were sequenced We found that clones IVB4cv and IRA7c were identicalThese two clones were isolated from the same library by using different biopanning method Thus there are a total of 13 positive clones Phage scFv were tested for neutralization capacity by the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) Only clones IRA7c and IIIRC2c showed neutralization of the rabies virus in vitro Four scFv antibodies genes were transferred into pET27b (+) expression vector for over-expression in E coli BL21 and purified by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Neutralization assay using soluble scFv confirm and indicated that only clones IRA7c and IIIC2c which were derived from immunized library could neutralize the virus at 454 and 020 IUmg respectively These two clones could be used as the basis for the development into therapeutic antibodies in the future It is interesting to note that clone IYF5c which shows very strong binding to PCEC virus by ELISA method couldnrsquot neutralize the virus These results indicated that ELISA result canrsquot be used to predict neutralization activity of the antibody Nevertheless clone IYF5c could be developed as the strain specific detection probe in the future The outcome of this research project has led to the filing of 5 patent applications claming the amino acid sequences of the isolated 14 scFv antibody clones as well as one publication in a proceeding which was awarded ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo by the IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED in the year 2012

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

บทคดยอภาษาไทย โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบา ถกคดเลอกจากคลงแอนตบอด (scFv) มนษยทไมถกกระตนดวยไวรสกอโรคพษสนขบา (คลง YAMO-I) และคลงทถกกระตนดวยไวรส (คลง Yamo-Rb) ดวยเทคโนโลยเฟจ โดยท าการคดเลอก (ไบโอแพนนง) จ านวน 1-5 รอบ โดยใชเชอไวรสกอโรคพษสนขบาทหมดฤทธแลว (inactivated virus) 2 ชนด คอ PCEC และ PVRV เปนเปาหมายในการคดเลอก ซงสามารถคดเลอกโคลนทสามารถจบจ าเพาะตอเชอพษสนขบาไดจ านวน 14 โคลน ไดแก IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v และ IVB4cv ผลจากการทดสอบโดยใชวธการอไลซาพบวา โคลนเหลานมความสามารถในการจบจ าเพาะไดดตอเชอทใชในการคดเลอก ล าดบเบสของดเอนเอไดถกวเคราะหโดยวเคราะหล าดบเบสอตโนมต โมโนโคลนอลแอนตบอดของมนษยทจ าเพาะตอเชอพษสนขบาทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) ทง 13 โคลนถกน ามาทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา (Neutralization) ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบา มเพยง IRA7c และ IIIRC2c ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได ดงนนจงไดเลอกแอนตบอดเพยง 4 โคลนมาผลต และท าใหบรสทธไดดดวยวธการ IMAC ไดแก IYF5c IIYG4v IRA7c และ IIIRC2c โดยท าการน ายนของแอนตบอดเหลานไปใสไวใน พลาสมด pET27b(+) เพอใหยนท าการแสดงออก โดยการผลตเปนแอนตบอด scFv แบบอสระในแบคทเรย E coli BL21 ผลจากการทดสอบความสามารถในการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชแอนตบอด scFv แบบอสระ (soluble scFv)ยนยนผลการยบยงการกอโรคพษสนขบาโดยใชโมโนโคลนอลแอนตบอดทแสดงบนผวเฟจ (Phage scFv) คอมเพยง IRA7c และ IIIRC2c ซงไดรบการคดเลอกมาจากคลงแอนตบอดมนษยทไดรบการกระตนดวยเชอพษสนขบาเทานน ทมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบาได โดยมความสามารถยบยงการกอโรคพษสนขบา 454 IUmg และ 020 IUmg ตามล าดบซงชนสวนของแอนตบอดมนษยทง 2 น สามารถน าไปพฒนาตอยอดเพอน าไปใชเปนแอนตบอดส าหรบการรกษา หรอปองกนโรคไดตอไป นอกจากนนแลวยงมผลการทดลองทนาสนใจคอ แอนตบอดโคลน IYF5c ซงแสดงความสามารถในการจบไดเปนอยางดกบเชอไวรสชนดตาย (PCEC) จากการวเคราะหดวยวธการ ELISA แตกลบไมมความสามารถยบยงการกอโรคไดเลย ซงผลการทดลองนแสดงใหเหนวาไมสามารถใชผลจากการวเคราะหดวยวธ ELISA ในการคาดเดาความสามารถของแอนตบอดในการยบยงโรคไดจรง อยางไรกตามแอนตบอดน อาจน าไปประยกตใชเปนตวตรวจสอบเชอไวรสกอโรคพษสนขบาในระดบ strain ไดตอไป การวจยนน าไปส การยนขอจดสทธบตร 5 ฉบบเพอคมครองล าดบกรดอะมโนของแอนตบอดทง 14 ชนดทไดคนพบ และผลงานน าเสนอและต พ ม พ ในร าย ง านกา รประช มฉบ บ เต มขอ ง ง านประช ม ระด บน านาชาต IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED ในป 2555 ซงยงไดรบรางวล ผเขารอบสดทายในการเปนผลงานตพมพดเยยม อกดวย

บทคดยอภาษาองกฤษ

Human monoclonal antibodies against Rabies virus were selected from non-immunized human scFv library (YAMO-I library) and immunized library (Yamo-Rb library) by using phage display technology The biopanning was performed for 1-5 rounds by using two types of inactivated rabies vaccines as targets These are purified vero cell rabies vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones from various methods of biopanning that can bind to rabies IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv were isolated and their genes were sequenced We found that clones IVB4cv and IRA7c were identicalThese two clones were isolated from the same library by using different biopanning method Thus there are a total of 13 positive clones Phage scFv were tested for neutralization capacity by the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) Only clones IRA7c and IIIRC2c showed neutralization of the rabies virus in vitro Four scFv antibodies genes were transferred into pET27b (+) expression vector for over-expression in E coli BL21 and purified by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Neutralization assay using soluble scFv confirm and indicated that only clones IRA7c and IIIC2c which were derived from immunized library could neutralize the virus at 454 and 020 IUmg respectively These two clones could be used as the basis for the development into therapeutic antibodies in the future It is interesting to note that clone IYF5c which shows very strong binding to PCEC virus by ELISA method couldnrsquot neutralize the virus These results indicated that ELISA result canrsquot be used to predict neutralization activity of the antibody Nevertheless clone IYF5c could be developed as the strain specific detection probe in the future The outcome of this research project has led to the filing of 5 patent applications claming the amino acid sequences of the isolated 14 scFv antibody clones as well as one publication in a proceeding which was awarded ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo by the IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED in the year 2012

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

บทคดยอภาษาองกฤษ

Human monoclonal antibodies against Rabies virus were selected from non-immunized human scFv library (YAMO-I library) and immunized library (Yamo-Rb library) by using phage display technology The biopanning was performed for 1-5 rounds by using two types of inactivated rabies vaccines as targets These are purified vero cell rabies vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones from various methods of biopanning that can bind to rabies IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv were isolated and their genes were sequenced We found that clones IVB4cv and IRA7c were identicalThese two clones were isolated from the same library by using different biopanning method Thus there are a total of 13 positive clones Phage scFv were tested for neutralization capacity by the Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) Only clones IRA7c and IIIRC2c showed neutralization of the rabies virus in vitro Four scFv antibodies genes were transferred into pET27b (+) expression vector for over-expression in E coli BL21 and purified by Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) Neutralization assay using soluble scFv confirm and indicated that only clones IRA7c and IIIC2c which were derived from immunized library could neutralize the virus at 454 and 020 IUmg respectively These two clones could be used as the basis for the development into therapeutic antibodies in the future It is interesting to note that clone IYF5c which shows very strong binding to PCEC virus by ELISA method couldnrsquot neutralize the virus These results indicated that ELISA result canrsquot be used to predict neutralization activity of the antibody Nevertheless clone IYF5c could be developed as the strain specific detection probe in the future The outcome of this research project has led to the filing of 5 patent applications claming the amino acid sequences of the isolated 14 scFv antibody clones as well as one publication in a proceeding which was awarded ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo by the IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMED in the year 2012

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

สารบญ

กตตกรรมประกาศ 3

บทคดยอภาษาไทย 4

บทคดยอภาษาองกฤษ 5

สารบญ 6

บทท 1 บทน า 7

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย 7

วตถประสงคของการวจย 8

ขอบเขตของการวจย 8

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย 8

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม และ สารสนเทศทเกยวของ 10

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 14

บทท 4 บทสรป 17

สรป และวจารณผลการวจย 17

ขอเสนอแนะ 18

เอกสารอางองของโครงการวจย 21

ภาคผนวก 28

ภาคผนวก ก การเผยแพรผลงาน 28

1 ผลงานน าเสนอในทประชมวชาการ 28

2 การยนจดสทธบตร 28

ภาคผนวก ข การผลตบคลากร 30

ประวตผวจยหลก 31

ประวตผวจยรวม 32

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหาการวจย

โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษา ผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปมผเสยชวต

จากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนม ไมนอยกวา 30 เปนผทควรไดเซรมหรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกด เพอปองกนการเกดโรคไดอยางแทจรง ในประเทศไทย คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภามประมาณปละ 40 ของคนไขทสมผสโรคทงหมด สวนในประเทศทก าลงพฒนาอนทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการอาทเชน

1 ปญหาการขาดแคลนอาสาสมครและสตวทดลอง เพราะการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ าบอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2 ปญหาการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต 3 ปญหาจากการใช เนองจากเซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน

foreign protein เมอน ามาใชในคน จงท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยทางพนธวศวกรรม โดยใชเทคโนโลยเฟจ เพอการผลต แอนตบอดยมนษยตอไวรสโรคพษ

สนขบาจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดานการตรวจวเคราะห (diagnostic) เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอ การพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทยตอไป โดยเฉพาะในกลมโรคทไมไดรบการสนใจจากประเทศทพฒนาแลวเชนโรคพษสนขบาเปนตน

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

วตถประสงคของการวจย

เพอพฒนา ทงบคคลกร และเทคโนโลยในการประยกตใชเทคโนโลยเฟจในการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอดมนษยตนแบบ เพอการรกษา และ วนจฉย โรคพษสนขบา โดยแบงเปนวตถประสงคยอยตางๆ ดงน

1 เพอหาวธการทเหมาะสมในการท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด (bio-panning) สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา ไดอยางจ าเพาะเจาะจงจากคลงของ เฟจ แอนตบอด ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงของ แอนตบอดมนษยทมความหลากหลายสง

2 เพอท าการสรางคลงของเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทมความ จ าเพาะตอไวรสโรคพษสนขบา 3 เพอท าการคดหาเฟจทแสดงโมโนโคลนอล แอนตบอด สวน scFv ทสามารถจบกบไวรสทท าใหเกดโรค พษสนขบา จาก

คลงทไดสรางขนในขอ 2 ดวยวธการทไดพฒนาขนจากวธการในขอ 1 4 เพอใชวธการ ELISA ในการตรวจคณสมบตในการมอนตรกรยากบไวรส ของ โมโนโคลนอล แอนตบอดตางๆ ทไดคดหา

มาตามกระบวนการในขอ 1 และ 3 5 เพอตรวจสอบคณสมบตในการยบยงการเจรญเตบโต และการท าลาย ไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบา โดยการท าการ

ตรวจสอบในระดบเซลล

ขอบเขตของการวจย

ท าการคดเลอกโมโนโคลนอลแอนต บอด มนษย ชนด scFv จากคลงแอนตบอดมนษย ldquoยาโม 1rdquo ซงเปนคลงทมความหลากหลายสง และท าการสรางคลงโมโนโคลนอล แอนตบอด มนษย ทมภมคมกนจ าเพาะเจาะจงตอเชอพษสนขบา แลวคดเลอก โมโนโคลนอลแอนตบอด จากคลงทงสอง ทมคณสมบตเหมาะสมในการน าไปประยกตใชทางการตรวจวนจฉย และรกษา โดยการวเคราะหดวยวธการ ELISA การยอมเซลล การวเคราะหความสามารถในการยบยงการตดเชอของไวรส rabies ในระดบเซลล เพอใหสามารถใชเปนตนแบบในการใชเทคนควศวกรรมแอนตบอด ในการแปลงโครงสราง โมโนโคลนอล แอนตบอด ทไดคดเลอกมาใหมคณสมบตเหมาะสมเพอเปนตนแบบในการประยกตใชทางการตรวจ วนจฉย และรกษาตอไป เชน การเชอมกบ โปรตนเรองแสง reporter protein ส าหรบท า biosensor การสรางเปนแอนตบอดโมเลกลค (diabody) หรอเปลยน เปนโมโนโคลนอลแอนตบอดทสมบรณ เพอใชเปนตนแบบในการพฒนาเปน HRIG ส าหรบผทถกสนขบากดตอไป

ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของโครงการวจย

เทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทมศกยภาพสงในการน ามาสรางเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ในรปแบบตางๆ (recombinant human monoclonal antibody) เพอการประยกตใชทหลากหลาย ขอดทส าคญของเทคโนโลยนคอ สามารถใชคดหา และพฒนาคณสมบตใหเหมาะสม เพอท าการผลต แอนตบอดไดอยางไมจ ากด ซงการผลตเปน โมโนโคลนอลแอนตบอด ของมนษย ตอเชอไวรสทท าใหเกดโรคพษสนขบานน มประโยชนอยางยงใน

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

การใชในการรกษาผปวยทถกสนขบากด เพราะไมท าใหเกดอาการไมพงประสงค และปลอดจากการปนเปอน รวมทงยงสามารถใชในการตรวจวนจฉยดวย

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรมและสารสนเทศทเกยวของ

11 โรคพษสนขบา โรคพษสนขบาเปนโรคทยงคงไมมทางรกษาผทสมผสโรคเมอแสดงอาการแลวจะเสยชวตทกราย ในแตละปม

ผเสยชวตจากโรคนทวโลกไมต ากวาปละ 50000 คน และ 90 ของผทเสยชวตจะอยในประเทศในเอเชย เชน อนเดย บงคลาเทศ จน ฟลปปนส พมา ไทย เปนตน มผทสมผสโรคและตองไดรบการฉดวคซนไมต ากวาปละประมาณ 10 ลานคนซงในจ านวนนมผทควรไดเซรมไมนอยกวา 30 เนองจากคนไขทไดรบวคซนตองใชเวลาไมนอยกวา 7-10 วนคนไขจงจะมระดบแอนตบอดยถงระดบทจะคมกนโรคได การทคนไขไดรบเซรม หรอ passive antibody รอบแผลทนททถกกดจะสามารถ neutralize ไวรสไดทนท คนไขทมารบการรกษาและตองไดรบเซรมทสถานเสาวภาประมาณปละ 40 ของคนไขทฉดวคซนหลงสมผสโรค แตในความเปนจรงทวโลกมผทสมผสโรคและไดรบเซรมมเพยงประมาณ 3 เทานน ประเทศไทยเปนหนงในไมกประเทศในเอเชยทสามารถผลตเซรมจากมา ( Equine Rabies Immunoglobulin ERIG ) และจากคน (Human Rabies Immunoglobulin HRIG) ภายใตมาตรฐาน GMP (Good Manufacture Practice) อยางไรกตามยงมปญหาและอปสรรคทงในแงของการผลตและการน ามาใชหลายประการดงน

ปญหาจากมาและอาสมคร 1ปญหาการฉดวคซนกระตนอาสาสมครและมาเพอน าซรมมาผลต ERIG และ HRIG พบวาเมอฉดวคซนกระตนซ า

บอยๆทงมาและอาสาสมครจะมการตอบสนองของระดบ neutralizing antibody ไมดนกท าใหมผลตอระดบแอนตบอดยของ final product ซงท าใหตองเปลยนมาหรออาสาสมครชดใหมท าใหเสยเวลาและเพมตนทนการผลตขน

2อาสาสมครตองเสยเวลา คาใชจายในการเดนทางและรบกวนหรอขาดรายไดจากการหยดงานหลายครง 3ตองการอาสาสมครจ านวนมากเพอน ามาผลต HRIG 4อนตรายจากการปนเปอนของไวรสหรอโปรตนในคนบางชนดทไมสามารถก าจดไดในระหวางกระบวนการผลต ปญหาจากการใช 1เซรมทผลตจากมาอาจท าใหเกดการแพ (anaphylaxis) เนองจาก ERIG เปน foreign protein เมอน ามาใชในคน จง

ท าใหตองมการท า skin test กอนใชซงหากใหผลบวกจ าเปนตองเปลยนไปใช HRIG ซงอาจขาดแคลนหรอมราคาแพงกวา ERIG หลายเทา และหากไมม HRIG กจ าเปนตองใช ERIG ดวยความระมดระวงและควรมความพรอมของเครองมอในกรณการเกด anaphylactic shock ซงบางครงท าใหแพทยบางทานตดสนใจไมใช ERIG และฉดวคซนเพยงอยางเดยวซงจะท าใหคนไขมความเสยงตอการตดเชอโรคพษสนขบาจากการไมไดรบเซรมเพมขน

2 ERIG ทใชจะอยในรปของ F(abrsquo)2 ซงไดตดสวนของ Fc ออกไปเพอลดการแพจากการใชแอนตบอดยซงเปนโปรตนจากมา ซงความจรงแลว Fc มบทบาทส าคญในกลไกการกระตนภมคมกนและ immune cells ตางๆนอกเหนอจากการจบกบไวรสโดยตรงซงมผลโดยตรงในการปองกนการตดเชอและก าจดไวรส

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

ดงนนการพฒนาเทคโนโลยเพอการผลต complete form ของแอนตบอดยตอไวรสโรคพษสนขบาทเปนโปรตนของมนษยจงมความส าคญและเหมาะสมในการน ามาใชในแงของ therapeutic use ส าหรบปองกนโรคพษสนขบาทสด นอกเหนอจากการน ามาใชในดาน diagnostic เชน การผลต conjugate ( anti-rabies conjugated FITC) หรอการพฒนา rapid diagnostic kit (ICT-kit) เปนตน และทส าคญทสดคอเรยนรและการพฒนาคนเพอน าไปสการผลตแอนตบอดยมนษยชนดอนๆเพอประโยชนในการพฒนาการรกษาโรคตดเชอและโรคอนๆทเปนปญหาทางดานสาธารณสขของประเทศไทย

12 การผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด ดวยเทคโนโลยเฟจ

เทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจ หรอเทคโนโลยเฟจ (phage display technology) เปนเทคโนโลยทไดรบความสนใจ และไดรบการพฒนาเปนอยางยงในชวงเวลา 20 กวาปทผานมาน ทงนเปนเพราะเทคโนโลยนมขอเดนทส าคญคอสามารถคดเลอกไดทงยนและโปรตนจากยนนน ทมความสามารถในการมอนตรกรยา (interaction) ทตองการไดอยางเฉพาะเจาะจง โดยใชวธการคดเลอกความสามารถในการจบกบสารเปาหมาย (target) ทสะดวกและรวดเรว ภายในหองทดลอง (in vitro) [1-4] โปรตนทกลาวมานอาจเปนเปบไทด (peptide) เสนสนๆ [156] หรอโปรตนขนาดตางๆ กนตงแตความยาว 7-500 กรดอะมโน [25] รวมทง antibody ประเภทตางๆ [78] ดงนนจงพบวาไดมการประยกตใชเทคโนโลยนในการศกษาการมอนตรกรยาระหวางโปรตนหลายประเภท เชน การจบกนของเปบไทดกบโปรตนโดเมนชนดตางๆ [9] หรอการใชเปนแหลงคลงของ cDNA เพอใชในการคดหาโปรตนทมความสามารถในการจบกบโปรตนทตองการศกษา [3] คลงของเฟจทแสดงเปบไทดเสนสนๆ ยงถกใชเปนแหลงในการหาตวกระตนหรอยบยงการท างานของเอนไซม [1011] เปบไทดเสนสนๆทมความเฉพาะเจาะจงสงเหลานสามารถน าไปใชเปนตวตนแบบในการพฒนายา (drug lead) ตอไปได [12-16]

การใหความสนใจทจะน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชเปนแหลงในการผลต monoclonal

antibody นนไดเรมตนขนตงแตป 2533 [17] โดยในขนแรกเปนการสรางคลงของ antibody จากสตวทไดรบการกระตนดวย antigen แลว โดยท าการแสดงเฉพาะสวนของ antibody ทมหนาทในการจบคอ สวน Fab [1819] หรอ สรางเปน antibody เสนเดยวทมเฉพาะสวนทมหนาทในการจบ เรยกวาสวน single chain variable fragments (form) scFv [17] antibody เหลานจะถกแสดงบนโปรตนทปกคลมผวชนดรอง (pIII) พบวามความส าเรจจากการใชคลงเหลานในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen หลายชนด [720-27] แตขอจ ากดประการส าคญของการใชวธการนคอตองท าการกระตนสตวทดลองกอนจงเปนการเสยเวลา และยงเปนคลงทมเฉพาะ antibody ทเกดจากการกระตนดวย antigen ทใช อยางไรกตามความส าเรจนนบเปนเครองชวาสามารถน าเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจมาใชในการคดเลอกและผลต monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบอยางมความเฉพาะเจาะจงสงไดจรง

การพฒนากาวส าคญทท าใหการประยกตใชเทคโนโลย เฟจในการผลต monoclonal antibody เปนท

แพรหลายและไดรบความสนใจเปนอยางสง ทงในงานวจยขนพนฐาน และการประยกตใชในอตสาหกรรมทางเทคโนโลยชวภาพดานตางๆ เรมตนในเวลา 2 ปตอมา เมอนกวทยาศาสตรสามารถสรางคลงของ monoclonal antibody จากสตวทไมไดรบการ

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

กระตนภมคมกนมากอนไดส าเรจ (nonimmune library หรอ naiumlve library) [28] คลงชนดนสามารถประยกตใชในงานวจยไดกวางขวางกวาคลงทสรางจากสตวทไดรบการกระตนภมคมกนมากอนหลายเทา เพราะสามารถใชในการสราง monoclonal antibody ตอ antigen เกอบทกชนดทตองการ เนองจากคลงของ antibody ทสรางขนนเปนตวแทนความเปนไปไดทงหมดจากระบบภมคมกนของสตวตามธรรมชาต โดยพบวา monoclonal antibody ทคดเลอกมาไดนนมคณภาพดคอมความสามารถในการจบ (affinity ในชวง 1-200 nM) และมความจ าเพาะเจาะจง (specificity) สงเทากบ monoclonal antibody ทสรางจาก hybridoma [28-31]

คลงทใชกนอยในปจจบนนนมหลายประเภท โดยแตละคลงกมความแตกตางกนในดานตางๆ เชน ความ

แตกตางในชนดของโปรตนปกคลมผวทใชแสดง antibody (pIII หรอ pVIII) แหลงทมาของ RNA ทจะใชเปนตนแบบในการสราง โครงสรางของ antibody ทใชแสดง (แบบ Fab หรอ ScFv) ชนดของพลาสมดทใชในการสรางคลง (plasmid หรอ phagemid) สายพนธ (strain) ของแบคทเรยทใชในการเลยงเฟจ สายพนธของ helper phage หรอขนตอนการตดตอยนเขาไปในตวเฟจ ทงนนกวจยกลมใดจะใชวธการไหนนนขนอยกบความช านาญ ประสบการณ และวสดทมอย นอกจากนนแลวในปจจบนยงมความพยายามในการสรางคลงจากเสน ดเอนเอสงเคราะห (synthetic oligonucleotide) [32-34] อกดวย

เทคนคทางพนธวศวกรรมอกอยางหนงทมประโยชนในการสราง antibody ใหมคณภาพสงคอมความจ าเพาะ

เจาะจง และความสามารถในการจบสง (high specificity และ affinity) คอการน า antibody ทคดไดจากคลงมาพฒนาเปน monoclonal antibody ทมคณภาพดขน (maturation) โดยใชหลกการก ากบววฒนาการ (directed evolution) [835]ดวยเทคนคตางๆเชน การท าใหเกดการกลายพนธอยางสมดวยเทคนคทาง PCR ทมความแมนย าต า (error prone PCR) [3637] หรอ การใชเทคโนโลยการสลบสบเปลยนดเอนเอ (DNA shuffling) [38-42]การปรบปรงคณภาพดวยวธน โดยเฉพาะอยางยงโดยการสลบสบเปลยนดเอนเอ พบวามประสทธภาพดในการสราง antibody ทมความสามารถในการจบสงมากขนกวาเดมหลายเทา ตวอยางเชนพบวาสามารถเพมประสทธภาพในการจบของ antibody บางประเภทไดถง 10 เทา ท าใหได monoclonal antibody ทมความสามารถในการจบสงถง 1011 M-1 ซงสงกวาคาทจะไดจาก monoclonal antibody ทผลตดวยวธการเดม (คอ1010 M-1) [43-45]

นอกจากการปรบปรงคณภาพในการจบแลว ยงสามารถใชเทคโนโลยนในการปรบปรงคณสมบตอนๆตามวตถประสงค

ของการใชงาน เชนความสามารถในการท างาน (function) ตางๆ เชนการกระตนการสงสญญาณภายในเซลล (cell signaling) [46-53] หรอการใชเปนตวกระตนหรอตวยบยง (agonist หรอ antagonist) โปรตนหรอเอนไซมตางๆในเซลล [5455] นอกจากนนแลวยงใชในการคดเลอก antibody ททนตอสภาวะบางอยางเชน สภาวะกรด ดาง หรอทนตอเอนไซมทยอยโปรตน (proteinase) [5657] หรอทสภาวะ reducing [41] รวมทงการปรบปรงใหมคณสมบตเหมาะสมในการใชเปนยารกษาโรค (therapeutic use) [13-153358-65] หรอตดฉลาก (tag) [66-71] เพอประยกตใชในงานวจยดานตางๆ

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

กลาวโดยสรป การประยกตใชเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเพอการผลต monoclonal antibody นน มประโยชนมากและมขอดกวาเทคโนโลยการผลตแบบเดม (conventional method) หลายประการ ดงจะไดสรปไวเปนขอๆดงน

1 การผลต monoclonal antibody ดวยเทคโนโลยเฟจ สะดวก และประหยดกวาการใชเทคนคดงเดม เพราะใชเวลานอย

กวา ใชเงนนอยกวา ใชแรงงานและความช านาญนอยกวาและขอส าคญคอไมตองใชสตวทดลอง 2 สามารถใชกบ antigen ไดหลากหลายชนดกวา เพราะสามารถใชกบ antigen ทเปนพษตอสตวหรอ antigen ทคลายกบ

โปรตนในสตวทดลอง หรออาจใชเซลลทงเซลลเปน antigen กได นอกจากนนยงสามารถใชกบ antigen ทไมสามารถกระตนระบบภมคมกนของสตวได (nonimmunogenic antigen)

3 สามารถใชในการผลต monoclonal antibody ตอ antigen จ านวนมากชนด ซงมความส าคญเปนอยางยงในงานดาน proteomics ในปจจบน

4 สามารถประยกตใชในการสราง antibody ทมคณสมบตเหมอนของคน (humanized antibody) เพอใชในการรกษาโรค (therapeutic antibody)

5 สามารถปรบปรงใหมคณสมบตเปลยนไปตามตองการ เชนมความสามารถในการจบ หรอความจ าเพาะเจาะจงส งขน หรอทนตอสภาวะตางๆ

6 สามารถน าไปผลตเปนจ านวนมากไดงาย ดวยเทคนคการเพาะเลยงแบคทเรย และเซลลสตวโดยทวไป เพอใชในการผลตในระดบอตสาหกรรม

ในปจจบนไดมตวอยางการประยกตใชเทคโนโลยเฟจเพอการผลตโนโนโคลนอล แอนตบอด เพอใชในการรกษาผป วย

โรคพษสนขบาแลว [72-74] ซงเปนการผลตโดยบรษท crucell และขณะนอยในระหวางการทดลองในมนษย (clinical trial) [75] ซงแอนตบอดทใชเปนโมโนโคลนอล แอนตบอดผสมกน 2 ชนด ชนดแรกไดมาจาก hybridoma สวนชนดท 2 ไดมาจากเทคโนโลยเฟจ เนองจากแอนตบอดนเปนของบรษทเอกชน ดงนนถามขายในทองตลาด กคาดไดวาจะมราคาสงมาก ดงนนการผลตเพอการใชในการตรวจ รกษาเองในประเทศจงจะมประโยชนมาก ทงความสามารถในการพฒนาเทคโนโลยขนสง ความสามารถในการแขงขน และการลดการน าเขา รวมทงยงเปนการชวยสรางบคลลากรทมความช านาญในเทคโนโลย ขนสงนดวย โดยคลงของแอนตบอดตนแบบ และวธการในการสรางคลงนน ไดรบการพฒนาขนในประเทศไทยจากโครงการวจยทผวจยหลกเคยไดรบการสนบสนนจากสภาวจยแหงชาตมากอน ดงนนจงไมตดปญหาเกยวกบ สทธบตร หรอทรพยสนทางปญญา

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

บทท 3 วธการด าเนนการวจย และ ผลการวจย 31 วธการคดเลอกเฟจ วธการนเปนวธการทไดพฒนาขนในโครงการวจยน สามารถใชในการคดหาเฟจทจบจ าเพาะกบไวรสกอโรคพษสนขบา จากทงคลงแอนตบอดปฐมภม (คลงยาโม 1) และคลงทตยภมชอ Yamo-Rabies ทไดสรางขนจากโครงการวจยน 311 การคดเลอก แอนตบอดผานการดดแปลงพนธกรรมสายเดยว

ใชหลกการ การคดเลอกความสามารถในการจบกบเปาหมายอยางเฉพาะเจาะจง (affinity selection) ในหลอดอมโน (immunotube) ดงน

ขนท 1 การตรงแอนตเจนเปาหมาย

11 ใส 035-14 IU ของ ไวรสทหมดฤทธ (inactivated virus) ใน 100 mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลอดอมโน (immunotube)

12 ปดฝาดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน ขนท 2 การคดเลอกรอบแรก

21 เตมสารละลายเพมความคงตว (5 wv sucrose 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 45 นาทจากนน ลางหลอดอมโน (immunotube) 2 ครงดวย PBS

22 เตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (Non-fat dried milk) ใน PBS ปรมาณ 4 ml ปดปากหลอดอมโน (immunotube) ดวยจกทมากบหลอดอมโน (immunotube) แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

23 เท 2 wv MPBS ออก 24 เตมคลงของเฟจปรมาณ 1010 ทเจอจางอยใน 4 wv MPBS ปรมาณ 200 ul ปดฝาดวยจกแลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง 25 เทสารทง แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 10 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 10 รอบ 26 ท าการสกด (elute) เฟจทจบกบแอนตเจน โดยใสทรบซน บฟเฟอร (trypsin buffer) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตม 50 mM glycine-HCl pH 20 ปรมาณ 100 ul แลวตงทงไวอก 10 นาท 27 ท าใหสารสกดเปนกลาง (neutralize) โดยการเตม สารละลายท าใหเปนกลาง (Neutralization solution) (200

mM NaHPO4 pH 75) จ านวน 100 ul

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA

28 เกบเฟจทสกดมา ไดครงหนงไวท 4degC สวนอกครงหนงเอาไปใสลงในหลอดทมแบคทเรย E coli TG1 ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) ในน าเลยง 2xYT จ านวน 2 ml

29 ท าการเลยงแบคทเรยทถกตดเชอ (infect) ดวยเฟจทไดจากการคดเลอกในรอบท 1 บนจานเลยงเชอผสมวน 2xYT ทม 100 ulml ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 wv โดยปนแยกเซลลทไดใหตกลงมาทความเรวประมาณ 3000 xg เปนเวลา 5 นาท จากนนเทน าเลยงทงใหเหลอประมาณ 100 ul แลวเกลย (spread) ลงบนจานเลยงเชอ จากนนน าไปบมท 37 degC ขามคน โดยในขนตอนนกอนทจะเกลยเชอลงทงหมดตองน าเชอสวนหนงมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน แลวจงน าไปเกลย (spread) ลงบนจานวนเลยงเชอ เพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) ดงทไดอธบายไวโดยละเอยดในขนท 5 เพอใหสามารถค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดในรอบน นอกจากนนแลวในกรณทตองการคดเลอกเพยงรอบเดยว ยงสามารถขามจากขนตอนทไดแบคทเรยโคโลนเดยวในขนน ไปตอในขนท 6 คอการสรางเปนตวเฟจ เพอท าการตรวจความสามารถในการจบดวยวธการ ELISA ในขนตอนท 7 ไดเลย ขนท 3 การเตรยมเฟจเพอท าการคดเลอกรอบทสอง

31 ท าการเกบรวบรวมโคโลนของแบคทเรยทโตขนบนจานเลยงเชอโดยใสน าเลยง 2xYT จ านวน 1 ml ลงไปแลวใชแทงแกวขดเอาแบคทเรยออกมาใหหมด กระจายเชอใหเขากนด อยาใหตดกนเปนกอน

32 น าแบคทเรยจากขนแรกจ านวน 10 ul ไปเลยงในอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 wv น าตาลกลโคส จ านวน 10 ml

33 น าไปบมทอณหภม 37 degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 2 ชวโมง 34 เตมเฟจตวชวย (KM13) จ านวน 5x1011 ตว 35 น าไปบมทอณหภม 37 degC โดยไมตองเขยาเปนเวลา 30 นาท 36 น าไปปนเหวยง ท 4degC เปนเวลา 10 นาท 37 แยกเอาสวนใสดานบนออก แลวใสอาหารเหลว 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50 ugml kanamycin และ

น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 10 ml กระจายแบคทเรยทอยกนหลอดใหดในอาหารเหลวน 38 น าแบคทเรยไปบมทอณหภม 30degC พรอมกบเขยาไปดวยอยางแรงเปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการคดเลอกในรอบตอไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการคดเลอกรอบท 2 อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทายหรออาจนอยกวานน 2-10 เทาแลวแตความเหมาะสม ขนท 4 การคดเลอกรอบทสอง

41 ท าการแยกอาหารเลยงเชอทมเฟจอยจากขนทแลวโดยการ ปนตกตะกอน ทความเรว 3300 xg เปนเวลา 15 นาท แลวเกบสวนใสดานบน (supernatant) ไวในหลอดทดลองทสะอาด

42 ท าการตกตะกอนเฟจโดยการเตมสารละลาย PEGNaCl (20 Polyethylene glycol 8000 25M NaCl) ปรมาณ 25 มล ลงใน supernatant จากขนท 41 ผสมใหเขากนด แลวตงทงไวบนน าแขง 1 ชงโมง

43 น าไปปนตกตะกอนท 3300 xg เปนเวลา 30 นาท 44 ก าจดสวนใสดานบน (PEGNaCl) ออกแลวปนตกตะกอนอกครงท 3300 xg เปนเวลา 5 นาท 45 ก าจด PEGNaCl ออกใหหมด 46 เตม PBS ปรมาณ 500 ul แลวผสมกบตะกอนเฟจใหเขากนด 47 น าเฟจทงหมดทไดจากขนท 45 ไปท าการคดเลอกรอบท 2 ตามวธทไดอธบายไวในขนท 2

ถาตองการคดเลอก 3 รอบ ใหท าซ าตงแตขนท 2 และ 3 อกครงหนง ขนท 5 การแยกเปนแบคทเรยโคโลนเดยว หลงจากทไดบมเฟจทสกด ออกมาได กบ E coli TG1 ตามขนตอนท 28 แลว ท าการแยกใหไดเปนโคโลนเดยวของแบคทเรย ซงแสดง โมโนโคลนอลแอนตบอด โครงสรางตางๆกนดงน

51 น าแบคทเรย TG1 ทตดเชอดวยเฟจมาเจอจางลงทละ 10 เทา (10 fold serial dilution) กอน 52 น าแบคทเรยทกความเจอจางประมาณ 100 ul ไปเกลย ลงบน บนจานวนเลยงเชอ 2xYT ทม 100 ugml

ampicillin และ น าตาลกลโคส 1 (wv) 53 น าไปบมท 37degC ขามคนเพอใหไดเปนแบคทเรยโคโลนเดยว (single colony) เพอใชในการสรางเปนเฟจโคโลน

เดยวในขนท 6 ตอไป รวมทงตองท าการค านวณจ านวนของเฟจทคดเลอกมาไดทงหมด โดยการนบจ านวนเฟจทโตบนเฟจเลยงเชอแลวคณกบคาการเจอจาง (dilution) ทใช ขนท 6 การเตรยมเฟจโคโลนเดยว ขนตอนนใชเวลา 2 วน วนแรกเปนการเลยงแบคทเรยแตละโคโลนทมเฟจมด (phagemid) ทแสดงโมโนโคลนอลแอนตบอดแตละโคลนเพอเกบไวใชตอไป (stock) และเพอน าไปผลตเปนตวเฟจโดยการท าใหตดเชอดวยเฟจตวชวย วนแรก

61 เลอกจานเลยงเชอ ทมแบคทเรยเปนโคโลนเดยวจากขนกอน จากนนใชไมจมฟน หรอลวดเขยแตละโคโลนขนมา 62 น าแตละโคโลนไปเลยงใน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml kanamycin และ น าตาลกลโคส

1(wv) ทอยในหลมบนจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จ านวน 100 ul ดงนนจงสามารถเลยงแบคทเรยไดทละ 96 โคโลน ตอจานวด ในคราวเดยวกน

63 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) ไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลาขามคน วนท 2

64 น าแบคทเรยปรมาณ 2-5 ul จากแตละหลมในขนทแลวไปใสในหลมบนจาน ELISA ทม 2xYT + 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) อย 200 ul สวนแบคทเรยทเหลอเกบไวใชในระยะยาว โดยการเตมกลเซอรอล (glycerol) ใหไดปรมาตรสดทาย 15 แลวน าไปเกบไวท -80degC

65 น าไปบมท 37degC โดยการเขยาเบาๆ เปนเวลา 3-4 ชวโมง 66 เตม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + น าตาลกลโคส 1 (wv) + 109 เฟจตวชวย จ านวน 50 ul 67 น าไปบมท 37degC โดยไมตองเขยา เปนเวลา 1 ชวโมง 68 น า microtiter plate ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท 69 ก าจดสวนใสดานบน (supernatant) ออก แลวเตม 2xYT ทม 2xYT ทม 100 ugml ampicillin 50ugml

kanamycin ปรมาณ 200 ul 610 น าไปบม ท 30degC 250 rpm เปนเวลา 20 ชวโมง

ในวนนใหท าการตรงโปรตนเปาหมายบนจาน ELISA เพอท าการตรวจสอบในวนถดไปดวย โดยใชวธการตรงดงทไดอธบายในขนท 1 ปรมาณของแอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวนโคโลนทจมขนมาในขนท 61 นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส นมปลอดไขมน 2 wv (MPBS) ปรมาณ 200 ul หรอแอนตเจน อนทเหมาะสม ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของเฟจทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความถกตอง ขนท 7 การท า โมโนโคลนอล เฟจอไลซา (Monoclonal Phage ELISA)

71 น าจานวดปรมาณระดบอณ (microtiter plate) จากขนท 610 ไป ปนตกตะกอน ท 3300 xg เปนเวลา 15 นาท เพอแยกสวนใสดานบน (supernatant) ทมเฟจอยไปใชในการวเคราะหตอไป

72 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS จากนนเตม นมปลอดไขมน 2 wv (2 wv MPBS (2 Non-fat dried milk ใน PBS) ปรมาณ 200 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง เพอปองกน (block) การจบแบบไมจ าเพาะ (non-specific binding)

73 เตมเฟจจากขน 71 ปรมาณ 100 ul ทเจอจางอยใน MPBS 4 wv ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

74 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 75 เตม HRP anti-M13 ทเจอจาง 15000 เทาใน 2 (wv) MPBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 76 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 77 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส

78 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครอง ELISA plate reader ทความยาวแสง 405 nm

79 คดเลอกเฟจทมความสามารถในการจบด คอมคา OD เปน 2 เทาของคาควบคม (control) ขนไป เพอการวเคราะหตอไป 312 การผลตชนแอนตบอดอสระทไมอยบนผวเฟจโดยการเปลยนชนดของแบคทเรย วธการนใชในการผลตชนโมโนโคลนอลแอนตบอด แบบใดกไดถาในโครงสรางของเฟจมดมรหส TAG ระหวางชนของ แอนตบอด กบ pIII ดงทไดอธบายแลวขางตน โดยชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจอาจอยในน าเลยงเชอหรออยในชองวางในผนงเซลล (periplasmic space) ของแบคทเรย ขนอยกบเวลาทใชในการเลยงเชอ หลงจากทไดชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว สามารถน าไปท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ไดตอไป ในกรณทมโคลนของ scFv จ านวนมากทตองการทดสอบ อาจท าการผลตทละหลายๆโคลนในปรมาณนอยๆโดยการเลยงใน จานวดปรมาณระดบอณ 96 หลม เมอไดชนโมโนโคลนอลแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจแลว ควรน าไปยนยนความสามารถในการจบกบ แอนตเจน อกครงหนงโดยวธการ ELISA ดวย รายละเอยดของการท าในขนตอนตางๆทไดกลาวมาขางตนอธบายไดดงน ขนตอนท 1 การเตรยม ชนแอนตบอดทไมอยบนผวเฟจ ทอยในน าเลยงเชอ

1 จมโคโลนเดยว E coli HB2151 ทอยบนจานวนแรธาตเลยงเชอ (mineral agar plate) มา 1 โคโลนแลวน าไปเลยงในน าแรธาตส าหรบเลยงเชอ (mineral broth) ท 37oC

2 น าเฟจโคโลนเดยวทคดแยกไดจากขนตอนการคดเลอกเฟจจ านวน 10 ul จากนนน าไปผสม กบ E coli HB2151 จ านวน 200 ul ทก าลงโตอยในชวงชก าลง (log phase) (OD600 ประมาณ 04) แลวบมไวทอณหภม 37oC เปนเวลา 1 ชวโมงโดยไมตองเขยา เพอใหเฟจ เขาไปโตใน แบคทเรย

3 น าแบคทเรยไปเกลย ใหไดเปนโคโลนเดยว ลงบนจานวน 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ 1 น าตาลกลโคส wv แลวน าไปบมท 37oC ขามคน

4 ท าการจมโคโลนเดยวไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 2 wv อย แลวบมท 30oC โดยการเขยาไปดวยขามคน

5 น าแบคทเรยจากขนทแลวจ านวน 50ul ไปเลยงใน น าเลยงน าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin และ น าตาลกลโคส 01 wv จ านวน 50-100 ml ท 30oC โดยการเขยาไปดวยจนโตไดคา OD600 = 09 (ใชเวลาประมาณ 3-4 ชวโมง)

6 น าไป ปนตกตะกอน ท 3000 xg เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4oC แลวน าไปผสมใหเขากนด (resuspend) ใน น าเลยง 2xYT ทม 100 ugml ampicillin + 1mM IPTG แลวเลยงท 30oC เปนเวลา 20 ชงโมง

7 ท าการปนแยกเซลลจากน าเลยงเชอโดยการ ปนตกตะกอน ท 5000xg 4oC เปนเวลา 15 นาท ชนแอนตบอดอสระ จะอยในสวนน าใสดานบน (supernatant)

8 น าไปใชในการตรวจสอบทาง ELISA หรอน าไปเกบไวท 4oC เพอ ท าใหบรสทธโดยวธการ IMAC (immobilized metal affinity chromatography) ตอไป

ขนตอนท 2 การตรวจสอบความสามารถในการจบกบ แอนตเจน ดวยวธการ ELISA

1 ใส 007-01 IU ของไวรสทไมมฤทธ (inactivated virus) ใน 100mM NaHCO3 ปรมาณ 100 ul ลงในหลมของจาน ELISA ชนดประสทธภาพการจบสง (high-binding capacity Maxisorb) ปรมาณของ แอนตเจน ทจะใชในการตรวจสอบ ELISA อาจใชเทากบปรมาณทใชในการคดเลอกรอบสดทาย หรออาจนอยกวานนแลวแตความเหมาะสม โดยท าการตรงลงในหลมเทากบจ านวน ชนแอนตบอดอสระ ทตองการทดสอบ นอกจากนนแลวยงตองมตวควบคม (background) ในการวเคราะหดวย โดยการใส 3 BSA ใน PBS หรอ นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 MPBS) อนทเหมาะสม ปรมาณ 200 ul ลงไปในหลมของจาน ELISA ใหเทากบจ านวนของ แอนตบอดอสระ ทตองการท าการวเคราะห โดยควรท าการทดสอบแบบ สอง หรอ สามซ า (duplicate หรอ triplicate) เพอความนาเชอถอ

2 ปดปากหลมดวยเทปใส หรอแผนพลาสตกส าหรบหม (plastic wrap) จากนนบมท 37 degC เปนเวลา 3 ชวโมง แลวเกบไวท 4degC เปนเวลา 1 คน

3 เตม สารละลายเพมความคงตว (ซโครส 5 wv 03 wv BSA and 50 mM NaHCO3) ปรมาณ 100 ul ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา45 นาท

4 ท าการลางจาน ELISA ทเตรยมไวจากขนทแลว 2 ครงดวย PBS 5 เตม นมปราศจากไขมน 2 wv ใน PBS (2 wv MPBS)(ปรมาณ 200-250 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 6 เท 2 wv MPBS ทง 7 เตมน าเลยงเชอสวนในดานบนทปนแยกเซลลออกแลว (culture supernatant) หรอ สารสกดจากผนงเซลล

(periplasmic extract) ทม ชนแอนตบอด อสระ ปรมาณ 50-200 ul ทเจอจางอยในนมปลอดไขมนใน 4 wv PBS ปรมาณ 50 ul ปดปากหลม แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง

8 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 9 เตมตวตรวจสอบฮสตดนทเชอมอยกบ เอชอารพ (HisProbe-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul

ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 10 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 11 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 ปรมาณ 200 ul แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 12 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน

ELISA ทความยาวแสง 405 nm

13 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคมขนไป เพอการวเคราะหตอไป

หมายเหต ในกรณทตองการใช แอนตบอดตอ c-Myc ในการตรวจสอบ อาจท าไดดงน (ขนท 1-7 เหมอนกน) 1 คว าทงสารทอยในหลม แลวลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ ใน

ระหวางแตละรอบทลางอาจแชและเขยากอนเปนเวลา 5 นาท 2 เตมโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ c-Myc ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไว

ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง 3 ลางดวย PBST (PBS + 005 Tween20) 3 รอบ แลวลางตอดวย PBS อก 3 รอบ 4 เตม แอนตบอดแพะทสามารถจบกบแอนตบอดหนท เชอมอยกบ เอชอารพ (goat anti mouse-HRP) หรอ

แอนตบอดกระตายทสามารถจบกบแอนตบอดหนทเชอมอยกบ เอชอารพ (rabbit anti mouse-HRP) ทเจอจาง 15000 เทาใน PBS ปรมาณ 100 ul ลงในแตละหลม แลวบมไวทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง

5 เตมสาร ABTS + 005 H2O2 แลวตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 15-60 นาทเพอรอใหเกดส 6 ท าการวดคาความเขมของสจากปฏกรยาทเกดขนโดยการอานคา OD (optical density) ดวยเครองอานจาน ELISA

ทความยาวแสง 405 nm 7 คดเลอกโคลนทมความสามารถในการจบด คอมคา OD ทเปน 2 เทาของคาควบคม ขนไป เพอท าการวเคราะห

ตอไป 32 วธการสรางคลงเฟจแบบทตยภมจากอาสาสมครทไดรบการกระตนใหผลตแอนตบอดตอไวรสกอโรคพษสนขบา ท าการสรางคลงเฟจดวยวธการทไดพฒนามากอนแลวในหองปฏบตงานของหวหนาโครงการวจย ซงไดรบการตพมพไปแลวดงน Pansri P Jaruseranee N Rangnoi K Kristensen P and Yamabhai M (2009 ) A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens BMC Biotechnol 9 6

ซงขนตอนการสรางคลงโดยละเอยด สามารถดไดจากรายงานการวจย เรอง ldquoการพฒนาเทคโนโลยการแสดงโปรตนบนผวเฟจเ พอการผลตโมโนโคลนอล แอนตบอด (Application of phage display technology for the production of monoclonal antibody) รหสโครงการ SUT3-304-47-24-11

ทงนความแตกตางของการสรางคลงคอ ตนแบบของ mRNA เพอจะใชสรางเปนคลงแอนตบอดชนดทตยภมนน ไดมา

จากอาสาสมคร 4 คน เปนชาย 2 คน หญง 2 คน ทไดรบการกระตนดวยการฉดวคซนชนด PVRV (VeroRab Pitman-more W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France) or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India) ตามวธการ

ของ WHO ทไดน ามาใชท สภากาชาดไทย สกดเลอดจากอาสาสมครมาคนละประมาณ 50 ml ผลการวเคราะหคณภาพคลงพบวามขนาดเลกกวาคลงยาโม 1 คอ มคา diversity ประมาณ 105 และมความสมบรณของ recombinant antibody insert ประมาณรอยละ 50 อยางไรกตามพบวาคลงนมคณภาพดพอ เพราะสามารถคดหาแอนตบอดทมคณสมบตดไดส าเรจ 33 แอนตบดมนษยทมความจ าเพาะตอไวรสกอโรคพษสนขบาทคดหามาได จากผลจากการท า biopanning ดงทไดอธบายในหวขอ 31 ผวจยสามารถคดหาแอนตบอดไดทงหมด 14 โคลน ผลงานนไดรบการตพมพใน Proceeding ดงน Pruksametanan N Yamabhai M and Khawplod P (2012) Selection of single chain human monoclonal antibody (scFv) against Rabies virus by phage display technology Paper presented at IEEE International Conference on NanoMolecular Medicine and Engineering NANOMEDp78-81 ซงผลงานนยงไดรบรางวล ldquoBest Conference Paper Finalistrdquo ในประเภทนกวจยอกดวย ผลงานวจยทไดตพมพ แสดงใน 4 หนาถดไป

Selection of Single Chain Human Monoclonal Antibody (scFv) Against

Rabies virus by Phage Display Technology

Natcha Pruksametanan and Montarop Yamabhai

Phage Display Biotechnology Laboratory

School of Biotechnology Institute of Agricultural Technology

Suranaree University of Technology

Nakhon Ratchasima Thailand

montaropsutacth

Pakamatz Khawplod

Queen Saovabha Memorial Institute

Thai Red Cross Society

Bangkok Thailand

pakamatzyahoocom

Abstractmdash Human monoclonal antibodies

against Rabies virus were selected from non-

immunized human scFv library (YAMO-I

library) and immunized library (Yamo-Rb

library) by using phage display technology The

biopanning was performed for 2-5 rounds by

using two types of inactivated rabies vaccines as

targets These are purified vero cell rabies

vaccine (PVRV) and purified chick embryo cell

vaccine (PCEC) A total of 14 positive clones

from various method of biopanning that can bind

to rabies ie IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c

IYC12c IYD1c IYF5c IIRD5v IIYB5v

IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v and IVB4cv

were isolated and their genes were sequenced

The ELISA result showed that the positive clones

always bind strongly to the targets that were used

for biopanning however some clones can cross-

react to the related virus These selected scFv

antibodies will be tested for neutralization

activities in vitro in the next step

Index TermsmdashPhage display Rabies virus

single-chain fragments(scFv) human

monoclonal antibody

INTRODUCTION

Rabies is a fatal zoonotic disease that is

transmitted by both wild and domestic animals

Globally it is estimated that at least 55000 people

die of rabies and there are about 10 millions people

who receive post-exposure vaccination annually

Currently available rabies immune globulin (RIG)

for clinical use are Equine Rabies Immunoglobulin

(ERIG) and Human Rabies Immunoglobulin

(HRIG) However RIG was produced in limited

amounts [1] Moreover HRIG is too costly not

easily available and suffered from potential

disadvantages such as limited capacity batch-to-

batch variation and possible contamination with

blood borne adventitious agents ERIG also has

drawbacks of animal origin that carries a risk of

occasional adverse reaction including anaphylaxis

especially after second exposure [2 3] Thus

utilization of Phage display technology for the

production of human antibody specific to rabies

virus is attractive and suitable alternative strategy

for the prevention treatment and diagnostic of

rabies Phage display technology has been shown to

be a powerful method for the generation of antibody

in vitro by mimicking the selection strategies of the

immune system [4] In phage display antibody

fragments are expressed as fusions to capsid proteins

presented on the surface of the filamentous

bacteriophage particles which are approximately 7

nm by 900-2000 nm in length Therefore this system

provides direct linkage between the antibody

genotype (DNA sequence in phage paticle) and its

phenotype (affinity and specificity of phage-

displayed antibody)

In this study Phage display scFv antibody

libraries were used to select single chain human

monoclonal antibodies (scFv) against rabies virus

scFv is a popular format in the recombinant antibody

technology because it can be cloned and

manipulated as individual polypeptide and

efficiently displayed on the surface of bacteriophage

(phage) Even if single chain fragments of variation

(scFv) are significantly smaller then full-length

human antibodies IgGs (25 vs 150 kDa) They can

still bind their respective antigens tightly (ie with

dissociation constants of 5 uM to 10 nM ) and

represent structurally minimized version of full-

length human antibodies IgGs Moreover When

compared to fragment of antigen binding (Fabs)

which are ~50 kDa scFvs which generally resistant

and aggregation have twice smaller than Fabs [5]

Therefore scFv antibody is an attractive

nanomaterial for both diagnostic and therapeutic

purposes

METERIALS AND METHODS

Meterials

Two types of phage display libraries ie Non-

immunized (YAMO-I) [4] and immunized libraries

(Yamo-Rb) were constructed in our laboratory Both

libraries were constructed using antibody genes

isolated from the peripheral blood of human donors

The YAMO-I library was constructed from 140 non-

immunized (Naiumlve) donors whereas Yamo-Rb

library was constructed from four human donors

immunized with PVRV (VeroRab Pitman-more

W138-153-3M strain Sanofi-Pasteur Lyon France)

or PCEC (LEP-Flury strain Rabipur Chiron India)

Selection of human scFv phage library on

inactivated rabies virus (Biopanning)

Selection was performed using inactivated rabies

vaccines (PVRV orand PCEC) as targets Two to

five rounds of selection were carried out Maxisorp

Immuno tube (Nunc Denmark) was pre-coated with

035-14 IU of inactivated rabies virus at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 pH 85 After that the immuno tube was

stabilized with 5 wv sucrose 03 wv BSA and

50 mM NaHCO3 for 45 min Then the tube was

washed three times with phosphate buffered saline

(PBS 137 mM NaCl 3 mM KCl 8 mM Na2HPO4

15 mM KH2PO4 pH 74) and blocked with PBS

containing skimmed milk (2 wv MPBS) for 1

hour For each round of biopanning the phage

library (~1010 phages) was incubated with pre-

coated inactivated rabies virus in 4 wv MPBS

for 2 hours at room temperature Unbound phage

was washed away with PBS supplemented with

005 (vv) Tween 20 (PBST) and with PBS Phage

antibody against rabies viruses was recovered with

1x trypsin buffer and 02M glycine HCl pH 20 The

eluted phage was infected into E coli to obtain

individual phage clones as previously described [6]

For each round of selection specificities of

2

individual phage scFv clones were identified by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [6]

Monoclonal Phage ELISA

Single colony of each round of biopanning was

randomly picked and cultured in 96-deep well plate

followed by super-infection by KM13 helper phage

[4] Phage supernatants were collected after

centrifugation and subjected to ELISA for screening

of monoclonal anti-rabies virus phage-scFv The

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark)

was immobilized with inactivated rabies at 37 oC for

3 hours following by 4 oC overnight in 100 mM

NaHCO3 and 2 skimmilk in 100 ul PBS buffer as a

control The phage supernatant was added to

Immuno 96 microWellTM plate (Nunc Denmark) and

the binding phage-scFv was detected with HRP-

conjugated anti-M13 antibody (15000) The color of

the reaction was developed with ABTS reagent

(Fluka) The reaction was quantified by measuring

the absorbance at 405 nm

DNA sequence and analysis

After the positive cloned are confirm by ELISA

twice Each clone of positive Phagemid DNA was

extracted using DNA miniprep kit (Qiagen) The

restriction fragment analysis was performed by using

BstN-1 The selected positive clone with variable

restriction pattern were confirmed by automated

DNA sequencing (Macrogen Korea) and analyzed

with Igblast software

(httpwwwncbinlmnihgovigblast) and the

sequence alignment of the scFv antibodies was done

using CLUSTALW 21

(httpwwwebiacukToolsmsaclustalw2)

RESULTS AND DISSUSSIONS

A total of 14 positive clones from various

method of biopanning were isolated These are

IRA7c IIIRC2c IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c

IYF5c IIRD5v IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v

IIYD4v and IVB4cv After DNA sequence analysis

we found that clones IVB4cv and IRA7c were

identical These two clones were isolated from the

same library ie Yamo-Rb by using different

biopanning method Clone IVB4cv was obtained

from the fourth round of biopnning using a

combination of both PCEC and PVRV as targets

whereas clone IRA7c was from the first round of

panning using PCEC as a target Clones IIIRC2c

IRC3c IYC11c IYC12c IYD1c and IYF5c were

selected by using PCEC as a target while IIRD5v

IIYB5v IIYG4v IIYE5v IIYG8v IIYD4v were

selected by using PVRV as a target The ELISA

results in Fig 1 showed that the positive clones

always bind strongly to the target that was used for

biopanning Nine clones were obtained from naiumlve

library (YAMO-I) and four clones were from

immunized library (Yamo-Rb) Five clones which

are IRA7c IIIRC2c IIYG4v IIYE5v and IVB4cv

showed cross-reactivity to both PCEC and PVRV

targets

(a)

(b)

Fig 1 (a) ELISA plate showing positive reactions (green

colour) with PCEC or PVRV and negative reaction

(clear) with 2 skimmilk and 3 BSA

(b) ELISA signal at OD 405 nm

The BstN-1 fingerprinting analysis of 14

positive clones was shown in Fig 2 In this figure

pMOD (empty vector) was digested to compare with

the positive scFv clones (pMOD+scFv gene)

Fig 2 Restriction fragment analysis by BstNI

After the positive cloned were confirmed

by automated DNA sequencing The DNA sequence

of each scFv clone was analyzed with Igblast and the

sequence alignment of the 14 scFv antibodies was

done using CLUSTALW software Fig 3 showed

the origin of germline and family of all the isolated

VH and VL segments whereas Fig 4 illustrates the

amino acid sequence alignmnet of all positive

clones It is interesting to note that clone IRC3c

which consist only VL could still bind to the target

even if the signal is quit low when compared to other

0

05

1

15

2

25

3

35

IYF

5c

IIY

E5

v

IVB

4c

v

IIY

G4

v

IIY

D4

v

IRA

7c

IIY

B5

v

IYD

1c

IIIR

C2

c

IIR

D5

v

IRC

3c

IYC

12

c

IYC

11

c

IIY

G8

v

OD

40

5 n

m

PCEC PVRV 2 Skimmilk 3 BSA