1

PROTEINI U URINUPROTEINI U URINU

PROTEINURIJEPROTEINURIJE

CILJ ANALIZE URINACILJ ANALIZE URINA

·STANJE BUBREGA I DONJEG DELA URINARNOG TRAKTA

··SISTEMSKE BOLESTI

·UZROK BOLESTI, STANJE I PROGNOZA

2

3

FUNKCIJA BUBREGAFUNKCIJA BUBREGA-- HOMEOSTAZA HOMEOSTAZA PROTEINAPROTEINA

·180 L plazme dnevno

·70 g/L proteina

·Ukupno 12600 g proteina dnevno proñe kroz glomerule

4

REFERENTNE VREDNOSTI ZA REFERENTNE VREDNOSTI ZA KONCENTRACIJU PROTEINA U 24h KONCENTRACIJU PROTEINA U 24h

URINUURINU

< 150 mg/24h< 150 mg/24h

SASTAV URINARNIH PROTEINASASTAV URINARNIH PROTEINA

•PROTEINI PLAZME - 60%

•PROTEINI URINARNOG TRAKTA- 40%

5

PROTEINI PLAZME PROTEINI PLAZME

·Albumin (20% od ukupno ekskretovanih proteina ≈ 20mg/24h)

·Proteini male molekulske mase (β2-mikroglobulin, lizozim, prealbumin, α1-kiseli glikoprotein, RBP)

·Imunoglobulini

PROTEINI URINARNOG TRAKTAPROTEINI URINARNOG TRAKTA

·Tamm-Horsfallov protein (40 mg/24h)

·Urokinaza

·Sekretorni IgA

6

PROTEINURIJAPROTEINURIJA

PovePoveććana koncentracija ana koncentracija proteina u urinuproteina u urinu

• 1. Mikroalbuminurija 30-300 mg/24h

• 2. Blaga proteinurija 300-500 mg/24h

• 3. Umerena proteinurija 500-1000 mg/24h

• 4. Teška proteinurija 1000 – 3000 mg/24h

• 5. Nefrotski sindrom > 3500 mg/24h

TIPOVI PROTEINURIJE PREMA TIPOVI PROTEINURIJE PREMA KONCENTRACIJI IZLUKONCENTRACIJI IZLUČČENIH ENIH

PROTEINA PROTEINA

7

PODELA PROTEINURIJAPODELA PROTEINURIJA

• ASIMPTOMATSKA• SIMPTOMATSKA

• IZOLOVANA ili POVEZANA SA • HEMATURIJOM

• PROLAZNA • TRAJNA

PROLAZNA PROTEINURIJAPROLAZNA PROTEINURIJA

• Funkcionalna ili benigna proteinurija (<1g/danu)

Vežbanje, temperatura, izlaganje hladnoći, hipertenzija, ateroskleroza

Ortostatska proteinurija (i više od 1g/24h)

Trudnoća (200-300 mg/24h)

preeklampsija do 3g/24h

8

TRAJNA PROTEINURIJATRAJNA PROTEINURIJA

·PRERENALNA

·RENALNA

·POSTRENALNA

PRERENALNA PROTEINURIJAPRERENALNA PROTEINURIJA(PRP)(PRP)

• Uzrok oboljenje van bubrega

• Veća količina proteina male molekulske

mase se filtrira kroz glomerule i to

prevazilazi kapacitete reapsorpcije tubula

9

TIPOVI PRPTIPOVI PRP

• HEMOGLOBINURIJA

• MIOGLOBINURIJA

• LIZOZINURIJA

• PROTEINURIJA LAKIH LANACA

RENALNA PROTEINURIJARENALNA PROTEINURIJA

• PRIMARNA GLOMERULARNA

• PRIMARNA TUBULARNA

• MEŠOVITI TIP

10

GLOMERULARNA PROTEINURIJAGLOMERULARNA PROTEINURIJA

> 2g/24h> 2g/24h

•SELEKTIVNA

•NESELEKTIVNA

PROCENA SELEKTIVNOSTI PROCENA SELEKTIVNOSTI GLOMERULARNE GLOMERULARNE PROTEINURIJEPROTEINURIJE

• Odnos klirensa IgG i albumina

[Albumin, se] X [IgG, ur][Albumin, ur] X [IgG, se]

Odnos klirensa IgG/albumin• Selektivna proteinurija <0.2<0.2• Neselektivna proteinurija >0.2

11

AKUTNI GLOMERULONEFRITISAKUTNI GLOMERULONEFRITIS

• oligurija• hematurija• urea, kreatinin• GFR •• proteinurijaproteinurija• EDEMEDEM•• hipertenzija

NEFROTSKI SINDROMNEFROTSKI SINDROM

•• Masivna proteinurija (> 2-3g/24h)

•• Edemi

• Hipoalbuminemija

• hiperlipidemija

• lipidurija

12

TUBULARNA PROTEINURIJATUBULARNA PROTEINURIJA

< 2g/24h< 2g/24h

• β β β β2 – mikroglobulin• RBP

• lizozim• αααα1 – kiseli glikoprotein

• enzimi• hormoni

DETEKCIJA TUBULARNE DETEKCIJA TUBULARNE PROTEINURIJEPROTEINURIJE

• ELEKTROFOREZA URINARNIH PROTEINA

agarozaSDS-PAGE

• SPECIFIČNI TESTOVI ZA PROTEINE MALE MOLEKULSKE MASE (β2-mikroglobulin, lizozim)

13

TIPOVI TUBULARNE TIPOVI TUBULARNE PROTEINURIJEPROTEINURIJE

•AKUTNA TUBULARNA PROTEINURIJAOpekotine

Ac. pankreatitisLekovi

•HRONIČNA TUBULARNA PROTEINURIJA

Fanconi sindromHronični pijelonefritis

TUBULARNA PROTEINURIJATUBULARNA PROTEINURIJAKOD SISTEMSKIH OBOLJENJAKOD SISTEMSKIH OBOLJENJA

• Cistinoza

• Wilsonova bolest

• Galaktozemija

• Balkanska nefropatija

• Sarkoidoza

• Multipli mijelom

• Infektivna oboljenja urinarnog trakta

• Fankonijev sindrom

• Trovanje Pb, Cd, As, CCl4, Hg, nefrotoksični lekovi

14

Copyright ©2004 American Association for Clinical Chemistry

Maachi, M. et al. Clin Chem 2004;50:1834-1837

Izabrani elektroforetogrami SDS-PAG EF

1i 6 –standardi 9 i 10 – Bence-Jones proteinurija

2- infekcija UT 11- albuminurija

3 i 7 – glomerularna proteinurija

4,8,12-15 – mešoviti tip proteinurije

5 – tubularna proteinurija

POSTRENALNA PROTEINURIJAPOSTRENALNA PROTEINURIJA

OBOLJENJA (infektivna ili maligna)

• Mokraćne bešike• uretera• uretre• prostate• spoljnih genitalija

SEDIMENT URINA

15

AKUTNO ZATAJIVANJE BUBREGAAKUTNO ZATAJIVANJE BUBREGA

• oligurija ili anurija

• proteinurijaproteinurija

•• hematurijahematurija

•• urea, kreatinin

•• metabolička acidoza

VASKULARNE BOLESTIVASKULARNE BOLESTI

•• Hipertenzija•• Oboljenje arteriola•• Tromboza renalnih vena

DIABETES MELLITUSDIABETES MELLITUS

• Dijabetička nefropatija• Mikroalbuminurija

16

ANALIZA PROTEINAANALIZA PROTEINAU URINUU URINU

•KVALITATIVNA

• KVANTITATIVNA

PROBLEMI KOD ODREðIVANJA PROBLEMI KOD ODREðIVANJA PROTEINA U URINUPROTEINA U URINU

•Sakupljanje 24h urina•Mala koncentracija proteina u uzorku•Velika inter i intraindividualnavarijacija u sastavu i količini proteina u uzorku•Koncentracija neproteinskihinterferenata•Sadržaj neorganskih jona

17

UZORAKUZORAK

•24h ili 12h URIN BEZ KONZERVANSA, na +4ºC

•SLUČAJNI UZORAK

•STABILNOST:48h NA +4ºC1 GODINA NA -80•C

ODREðIVANJE KONCENTRACIJE ODREðIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA U POJEDINAPROTEINA U POJEDINAČČNOM NOM

UZORKU URINAUZORKU URINA

ODNOS PROTEINIODNOS PROTEINI--KREATININKREATININ

Ref. vrednosti - P : Kr < 100 mg p/g Kr

P : Kr > 2000 mg p/ g Kr

> 3-4 g/24h PROTEINA

18

METODE ZA ODREðIVANJE KONCMETODE ZA ODREðIVANJE KONC. . PROTEINA U URINUPROTEINA U URINU

1. TURBIDIMETRIJSKE

TCA, SSA, BENZETONIJUM-HLORID

2. VEZIVANJE BOJE

PONCEAU S, COOMASIE BRILLIANT BLUE, PIROGALOL RED

3. HEMIJSKE METODE

BIURETSKA METODA, FOLIN-LOWRY,FeCl3 sa taninskom kiselinom

pH URINApH URINA

• KISELI URINProteinska ishranaGladovanjeDehidratacijaDiarejaDijabetička acidozaMetabolička irespiratorna acidozaMetabolizam mastiSanBakterije

• BAZNI URINBiljna hranaPovraćanjeRenalna tubularna

acidozaRespiratorna i

metabolička alkalozaNH4 bakterijeTh acetazolamidomIshrana siromašna UHHronično oboljenje

bubrega

19

REAGENS TRAKE

• Skrining urina• Reagens trake specifične za albumin• Konfirmacioni test - precipitacija u kiseloj sredini• Sorensenova proteinska greška indikatora (pH)• lekovi i Bence Jones proteini (blago + test traka i jako + turbidimetrijski test)

TEST TRAKE TEST TRAKE -- PRINCIP REAKCIJEPRINCIP REAKCIJE

pH=3 Tetrabromfenol plavo

proteini

pH=3 Tetrabromfenol plavo

nema proteina

Detekcioni limit 70-100 mg/L

+ rezultat

-rezultat

20

TURBIDIMETRIJSKE METODETURBIDIMETRIJSKE METODE1.SSA – sulfosalicilna kiselina

1.Proteini denaturisani kiselinom se talože pa je nastalo zamućenje veće što je veća koncentracija proteina.

•Najosetljivija metoda (10-25 mg/L)•Precipitira i polipeptide•Loša preciznost•Loše slaganje sa drugim metodama4x veći turbiditet sa albuminom nego sa globulinima

LALAŽŽNO + REZULTATINO + REZULTATI

• UZROK

ZAMUĆENJE URINA

KONTRASTI ZA Rö

TOLBUTAMID

PENICILIN

SULFOKSAZOL

ALKALNI URIN

4° amonijumove soli

TEST TRAKE - SSANe utiče lažno + ili –

ne utiče lažno +

ne utiče lažno +

ne utiče lažno +

ne utiče lažno +

lažno + lažno -

lažno + ne utiče

21

2. TCA – trihlor-sirćetna kiselina

Denaturisani protein u vidu fine suspenzije se odreñuje turbidimetrijski.

• manje osetljiva od SSA (20 mg/L, 1/2 zamućenja)

·važna kontrola temperature (25° C)

·interferencije: α1 kiseli glikoprotein, lekovi

3. METODA SA BENZETONIJUM HLORIDOM

·Najosetljivija od turbidimetrijskih metoda (10 mg/L)

·γ-globulini 11-31% manji turbiditet od albumina

· interferencija fluoresceina

22

KOLORIMETRIJSKE METODEKOLORIMETRIJSKE METODE

• Precipitacija proteina sa TCA ili sa Tsuchiya reagensom (fosfovolframova kiselina, HCl,etanol) i odreñivanje precipitiranih proteina biuretskim reagensom ili Folin-Lowry reagensom.

• Reakcija sa feri-hloridom posle taloženja proteina taninskom kiselinom.

KOLORIMETRIJSKE METODEKOLORIMETRIJSKE METODE

• Jako osetljive metode (5-17 mg/L)

• Mala varijacija izmeñu različitih proteina

• Velika linearnost (do 5g/L)

• Mane: zametne metode i ne mogu se automatizovati

• Biuretska metoda interferiraju Bi i NH4+

jon.

23

METODE KOJE SE ZASNIVAJU NA METODE KOJE SE ZASNIVAJU NA VEZIVANJU BOJEVEZIVANJU BOJE

• Coomassie Brilliant Blue (CBB)

• Pyrogallol red

• Ponceau S

PRINCIP METODAPRINCIP METODA

•CBB

Vezivanje proteina za boju

pomera apsorpcioni maksimum

boje sa 465 nm na 595 nm.

Obojeno jedinjenje je stabilno

1h.

Interferencija timol i salicilati,

urea.

•PONCEAU S

Reakcija izmeñu proteina i boje

Ponceau-S u TCA koja dovodi do

koprecipitacije proteina i boje.

Crveni talog se rastvara pomoću

NaOH a nastala ljubičasta boja se

meri na 560 nm. Interferencija

aminoglikozida.

24

MIKROALBUMINURIJAMIKROALBUMINURIJA

• Rani marker za razvoj dijabetičke nefropatije

• Koncentracija albumina30-300 mg/24h ili30-300 mg/g kreatinina ili

• Brzina ekskrecije albumina20-200 mg/min

MIKROALBUMINURIJA TESTMIKROALBUMINURIJA TEST -- KOME KOME I KADA?I KADA?

• DM I - nakon 5 godina od postavljanja Dg i kasnije jednom godišnje

• DM II - u trenutku postavljanja Dg i kasnijejednom godišnje

• Perzistentna, jasna proteinurija (> 300 mg/24h) nijenijeindikacija za test na mikroalbuminuriju

25

PROLAZNA PROLAZNA MIKROALBUMINURIJAMIKROALBUMINURIJA

• Kratkotrajna hiperglikemija

• Vežbanje

• Infekcije urinarnog trakta

• Hipertenzija

• Srčane bolesti

• Povišena telesna temperatura

MIKROABUMINURIJAMIKROABUMINURIJA --DEFINITIVNA DIJAGNOZADEFINITIVNA DIJAGNOZA

• Nakon preliminarne Dg povećanihkoncentracija albumina pozitivan nalaz u još bar 2 uzorka u toku 3-6 meseci.

• Prevencija nefropatije: lekovi ACEi i ARB

26

MIKROALBUMINURIJA MIKROALBUMINURIJA -- METODEMETODE

• Test trake sa imunohemijskim reagensomspecifičnim za albumin (“Micral test”)

• Imunofelometrijske metode - metodaizbora

• Imunoturbidimetrijske metode

• RID

• EIA

• RIA - referentna metoda

MIKROALBUMINURIJAMIKROALBUMINURIJA -- UZORAKUZORAK

• 24h urin

• prvi jutarnji ili bilo koji uzorak u tokudana - albumin/kreatinin odnos