156 J. Schwarzmeier et al.: Pyruvatkinase-~'fanget der Erythrocyten bei heredit/irer Myopathie Kiln. Wschr.

Pyruvatkinase-Mangel dcr Erythrocyten bei heredit/irer Myopathie J. SC~IWAI~ZI~EIEI~, K. Mos~R und A. L v ~ *

I. )/iedizinische Universit~tsklinik Wien (Vorstand: Prof. Dr. E. Deutsch)

De/ieient Pyruvate Kinase Activity in Erythrocytes in a Case with Inherited Myopathy.

Summary. Pyruvate kinase activity was found to be 50% lowered in I~BC in ~ case with progressive muscular dystrophy. Concomitantly, ~he skeletal muscle showed a considerable decrease in Mg++-ATPase activity. IVfeasuremente of phosphate transfer in the erythrocytes showed a twofold increase in 3~P-efflux in the patient as compared to normal I~BC, but ~his seems not to be a consequence of pathological erythroeyte membrane permeability.

Zusammen/assung. Untersuchungen des Erythrocytensteff- wechsels eines Falles yon progressiver Muskeldystrophie er- gaben eine Erniedrigung der Pyruvatkinase-Aktivit~t um 50 %. Gleichzeitig wurde in der Skeletmuskulatur eine deutliche Verminderung der Magnesium-ATPase gefunden. - - Die Be- stimmung des Phosphattransfers in den roten Blutzellen zeigte eine gesteigerte 3eP-Abgabe, doch seheint dies nicht als StSrung der Membranpermeabilit~t der Erythrocyten erkl~rt werden zu kSnnen.

1965 besehrieben Tarui u. Mita, rb. [8] bei einem, dutch Mangel an Phosphofruetokinase (PFK) ge- kennzeiehneten, neuen Typ yon Myopa.thien neben einem fast vollst/indigen Fehlen des Enzymes in der t~uskulatur eine deutliche Verminderung der P F K - Aktivititt in den roten Blutzellen. Sp/itere Unter- suchungen derselben Autoren [9] zeigten, dab die Er- niedrigung der PFK-Akt iv i t£ t in den Erythroeyten auf das Fehlen des ,,lKuskel-Anteiles" des Enzym- proteins zur/iekzuffihren war. - - Es kann demnaeh in vereinzelten Fallen der einer MEuskelerkrankung zu- grundeliegende genetisehe Enzymdefekt auch Ursache yon StSrungen des Erythroeytenstoffwechsels sein.

In der vorliegenden Mitteilung sell fiber StoH- wechselver/~nderungen der Erythrocyten bei einer primaren Myopathie beriehtet werden. Darfiber hinaus werden die in der 1V[uskulatur gefundenen Abwei- chungen veto normalen Euzymmuster besprochen.

K l i n i k Bei dem zur Zeit der Untersuchung 34 Jahre alten Patien-

ten M. F. besteht seit 8 Jahren das Syndrom einer progressiven ~¢[uskeldystrophie veto pelvico-femoralen und scapulo-hume- ralen Typ. Es liegen auBerdem erhebliche myotone Symp~ome vor, eine dystxophische Myotonie veto Typ Curshmann- Steinert besteht jcdoch nicht. Die primi~re Mnskelerkrankung ist familiar, der Erbgang X-chromosomal rezessiv.

Der interne Status weist keine organpathologischen Ver- i~nderungen auf.

Untersuchungen des Muskelsto]]wechsels

In tIinbliek auf die prim~re Myopathie des Patien- ten wurden enzymatisehe Untersuchungen im Serum und in einer bioptisch gewonnenen Muskelprobe (M. quadrieeps sin.) durehgeftihrt. Eine ausfiihrliche Dar- stellung der dabei angewandten Methoden finder sich bei Moser, Lujf und Suko [6]. - - Diese biochemischen Untersuchungen brachten im wesentliehen Ergebnisse wie sic bei progressiver Muskeldystrophie angetroffen werden: Aus Ta,belle 1 ist ersichtlich, dal~ im Serum die Aktiviti~ten der CPK und Aldolase deutlich, die der LDH und der Transaminasen GOT und GPT leicht erhbht sind. - - I m Muskel (Tabelle 2) weisen die glycolytischen Enzyme geringe bis deutliche Aktivit/~ts- erniedrigungen auf; die Enzyme aus dem Pentose- phosphateyclus (G-6-PDtt und 6-PGDH) sowic die Glutamatdehydrogenase zeigen, entsprechend einer starkeren fibrotipomatSsen Durehsetzung der erkrank-

* Mit Unterstfitzung des Fends zur FSrderung der wissen- schaf~lichen Forschung in ~sterreich.

Tabelle 1. ~bersicht iiber die im Serum des Patie.~ten M.F. gemessenen Enzymaktivitdten in mE/ml Serum. lm Vergleich

dazu Normalwerte und mittlere Streubreiten

Nol~nal- ~= Patient werte M.F.

Fru ctese- 1,6~diphosphat- 4,09 3,00 30,00 Aldolase

Kreatinphosphokinase 0,80 0,20 7,50

Lactatdehydrogenase 112,00 11,40 372,00 Glutamatoxa]acetat- 9,00 3,00 20,00

transaminase

Glutamatpyruvat- 13,00 3,00 18,00 transaminase

Pyruvatkinase 192,10 121,00 360,00 Mg++ ATPase 67,60 34,20 9,00

T~belle 2. Ubersicht iiber die im Muskel des Patienten M.F. gemessenen En~zymaktivitiiten in IE/g FeuchtgewicM. Im Ve,r-

gleich dazu Normalwerte und mittlere Streubreiteu

Normal- ± Patient werte M.F.

Phosphorylase (a + b) 4,25 1,71 3,90 Hexokinase 1,88 0,62 1,59 Phosphofructokinase 32,10 10,70 21,20 Fructose- 1,6-diphosphat- 39,90 7,20 14,20

Aldolase Triosephosph atisomerase 380,00 ]06,00 123,00 Glyeerinaldehyd-3-phosphat-

dehydrogenase 219,00 67,00 202,00 3 -Phosphoglyceratkinase 117,50 40,50 59,10 Phosphoglyeeratmutase 135,20 39,00 81,30 Enolase 62,30 18,10 24,30 Pyruvatkinase 215,00 58,50 161,00 Lactatdehydrogenase 185,70 61,50 91,80 Glucose-6-phosphat-

dehydrogenase 0,35 0,05 0,56 6-Phosphogluconat-

dehydrogenase 0,27 0,05 0,54 Glutamatdehydrogenase 0,I0 0,04 0,50 Mg+ + ATPase 8,12 2,30 0,80 M~latdehydrogenase 208,00 42,50 102,00 Kreatinphosphokinase 276,00 49,00 112,00 Myokinase 49,60 25,60 25,60

ten Muskulatur, starke Aktivit/itssteigerungen. Auf- fallend ist eine ausgeprggte Verminderung der Magne- sinm-ATPase-Aktivit~t sowohl im Muskel als aueh im Serum. Die Aktivit/tt der Pyruvatkinase, die sich

~9. Jg., Heft 3, 1971 J. Schwarzmeier et al. : Pyruvatkinase-MangeI der Erythrocyten bei heredit~rer Myopathie 157

in den Erythroeyten (s. u.) deutlich verringert erwies, ist im ~{uskel normal und im Serum leieht erhSht.

TabelIe 4. f)bemicht iil)er die in den Erythroeyten des Patienten M.P. gernessenen Enzymaktivitgten in 1E/10 ~ Ery. Im

Vergleieh dazu 3"ormatwerte und mittlere Streubreiten

Hiimatologi2che Untersuchungen

Die klnlisch-h~Lmatologisehen Befunde sind in Tabelle 3 zusammengefaBt. Die Bestimmung der Halb- wertszeit ~Cr-markierter Erythrocyten ergibt, wie aus dieser Tabelle ersiehtlich ist, mit 16,5 Tagen eine deut- liehe Verktirzung der Ubertebenszeit der roten Blut- zellen, w~hrend die tibrigen Befunde im Bereieh der Norm liegen.

T~belle 3. Be/u~Me der klinisch-hgmatologischen Laboratoriums- untersuchung bei Patient M. F.

Normal- ± Patient werte M.F.

Hexokinase 1,7 0,25 2,1 Glucose-P-Isomerase 89,0 7,0 79,5 Phosphofructokinase 17,7 2,2 23,2 Glyc. a ldehyd-3-P-DHG 225,0 34,5 182,0 3-P- Glyeerat-l-Kinasc 413,0 51,0 320,0 Pyruva~kinase 41,7 6,3 21~7 Lactatdehydrogenase 270,0 36,7 259,0 Glucose-6-P-DtiG 17,1 2,3 14,8 6-P-Gluconat-DHG 7,7 0,8 9,0 Glutathionreductase 9,7 1,3 7,0 Magnesium++-ATPase 33,0 3,7 39,5

Erythrocyten (10*/txl) 5,7 H~imatokrit ( % ) 50 H~moglobin (g- % ) 16,2 F~rbeindex 0,96 Mittlercs Erythrocyten-Einzelvolumen (ix ~) 88 Mittlerer Hb-Anteil

der Erythrocyten (Vol.- % ) 41 Osmotisehe l~esistenz der Erythrocyten

( % NaC1) 0,55--0,35 t~cticulocyten (°/00) 8 Leukoeyten (~1 -~) 7050 DifferentiM-Btutbild normaler Befund Sternalpunktat normater Befund Price-Jones Kurvc GipfeI bci 8 ~ Erythrocyten-Halbwertszeit 51Cr markiert

(Tage) 16,5 Coombs-Test ncgativ Blocking-Test negativ Kglteagglutinationstiter 1 : 8 positiv Harnbilirubin negativ Harnurobilinogen normal Scrumbitirubin (nag- % ) 0,44/0,I8

Tabelle 5. Ubersicht iiber die in den Erythrocyten des Patienten M.F. gemessenen Substrate in ~zMol/lOll Pry, iiber die Glu- tathion-Stabilitgt in Prozent des Ab/aUs aowie iiber den Kalium- and Natriumgehalt in mVal/l, lm VergIeich dazu Normalwerte

und mittlere Streubreiten

Normal- -~: Patient werte M.F.

ATP (vMol/10 n Ery) 19,8 2,0 13,2 ADP (~Mol/10 n Ery) 1,9 0,4 1,70 AMP (~Mol/10 n Pry) 0,7 0,1 0,85 Pyruvatbildung/h 0,9 0,3 0,65 (~Mol/10 n Ery) LactatbiIdung/h 28,2 8,6 15,2 (v.Mol/10 n EIT) GSH (~zMo]/10 n Ery) 21,0 3,0 24,8 GSH-Stabilit~t ( % ) 15,9 6,4 8,5 Natrium (reVal/I) 17,4 3,3 15,0 Kalium (mVal/1) 88,7 5,1 75,0

Erythrocytensto//wechsel a) Methodik. Das aus der V. cubitalis entnommene Blur

wurde mit Citrat (1:10, Enzymbestimmungen) bzw. Hep~rin (30 IE/ml, Messung des Phosph~ttransfers) ungerinnb~r ge- m~cht. Zur Bestimmung von ATP, ADP und AMP wurde Voll- blur direkt in eisgckiihlte 6 %ige Perchlors~ure eingebracht.- Die weitcre Verarbeitung der Blutproben, die Bestimmung der En~z~nnaktivit~ten und des Substratgehaltes sowie die 1V[essung der Aufnahme und Abgabe yon ~2P-Orthophosphat erfolgte nach don in vor~ngegangeaen Arbeiten dargestellten i~[ethoden [5, 7].

b) Ergebnisse. Tabetle 4 gibt die in den Erythro- eyten des Patienten M. ~. gemessenen Enzymaktivi- t/~ten wieder. Wie sieh zeigt, ist. die Pyruvatldnase mit 21,7IE/10 n Erythroeyten um etwa 50% gegeniiber dem Normalwert erniedrigt. Bei den fibrigen Enzymen bestehen (mit Ausnahme einer leiehten ErhShung der Hexokinase- und einer geringfiigigen Verminderung der Glyeerinaldehyd-3-P-dehydrogenase- sowie 3-P- Glyeeratkinase-Aktivit/it) keine fiber die mittleren Streubreiten hinausgehenden Aktivit~tsgnderungen.

Die 1Vfiehaetis-Konstante der PK ffir Phospho- enolpyruvat (Kin PE~) ist, wie aus Abb. 1 hervorgeht, gegeniiber Normalf/~llen deutlieh ver/~ndert. Ebenso ist das pH-Optimum der PK (Abb. 1) in den Patienten- erythroeyten yon pI-I 7,3 auf pH 8,0 versehoben. Die Laetatbfldung in den roten Blutzellen ist mit 15,2 aMol/ I0 n Ery deutlieh vermindert (Tabelle 5), w/~hrend die Pyruvatbildung keine Vergnderung zeigt. - - Die Messung des ATP-Gehaltes (Tabelle5) ergibt eine Verminderung auf 13,2 ~Mol/10 n Ery, die Wel~e ffir ADP und A1V[P liegen im Normalbereieh. - - Die Be-

stimmung des reduzierten Glutathions (GSH), der GSH-Stabitit~t sowie des Natrium- und Kaliumge- haltes ergibt, wie ebenfalls aus Tabelle 5 ersichtlieh ist, keine pathologischen Wel~e.

Neben Un~ersuchungen der glycolytisehen Stoff- wechselleistungen, schien es von Interesse auch die Membranpermeabfliti~t der Erythrocyten des Patien- ten zu bestimmen. Es wurde zu diesem Zweck eine Messung des Phosphattransfers wghrend einer Periode von 30 rain durehgeftihrt. Die Aufnahme yon Radio- phosphor in die roten ]3]utze]len wurde nach Zusatz yon trggerfreiem 32P-Orthophosphat (5 ~Ci 3~P/ml- Probe), ansehlieBender 30minfitiger Inkubation bei 37 ° C und folgender raseher Abktihlung bestimmt. Die ~P-Konzentration, ausgedrfiekt in Prozent der der Erythrocytensuspension zugesetzten ~2P-Orthophos- phatmenge, erreichte in den roten Blut.zellen des Pa- tienten dabei einen der Norm entspreehenden Weft yon 27,5 %.

Die 32P-Abgabe dagegen (Abb. 2) ist im Vergleich zu gesunden Versuehspersonen deutlieh gesteigert. 30 rain naeh Inkubation der mit Radiophosphor vor- beladenen Erythroeyten in einem PhosphaL-Loeke- Plasma-Medium (9 T Loeke-L6sung + 1 T Plasma) ist die Abgabe yon 32p auf beinahe das Doppelte des Vergleiehswertes angestiegen. - - Gteiehzeitig mit den a2p-Efflux-Messungen wurde die Konzen~ration des anorganisehen Phosphats innerhalb der Erythroeyten bestimmt. Diese betrug zu Beginn der 1Vfegperiode 0,75 ~ o l P/g Erythroeytenmasse und erreiehte nach 30 min einen Wert yon 1,01 ~N[ol P/g.

158 J. Schwarzmeier et al. : Pyruvatkinase-Mangel der Erythrocyten bei heredit~rer :gyopathie Klin. Wschr.

~30 o

i,o / / / , 4 . . . . . . \ . i . . ~ Km PEP fi}r PR . "

/ normal 13,3- 5,1 .10~ P~i . M . P . I 0,5-12,2.10 ~

~,0 I I ~ I a_ 6 7 8 pH 9

Abb. l. pH-Abhgngigkeit der Pyruvatkinase-Reaktion und Michaelis-Konstante (Kin) ffir Phosphoenolpyruvat in nor-

malen und in den Erythrocy~en des Pa~ienten M. F.

6 ~o

~5

UA c~

+5 normal

g

0 5 10 15 mm 30 Abb. 2. ~P-Abgabe a~s den Erythrocyten gesunder Versuchs- personen und des Patienten M. F. w~hrend 30 rain Inkubation in Phosphat-Locke-Plasma-Medium. Inkubations~cmperatur 37 ° C. Angabe in relativen Einheiten, bezogen auf die nach 10rain im extracellularen Medium der Ery~hrocyten der

Vergleichspersonen vorhandenen ~P-Aktivit~it

Diskussion

Wi~hrend in den Berichten yon Tarui u. 3fitarb. [8, 9] sowie Layzer et al. [4] fiber das gleiehzeitige Auftreten yon heredit~rer i~Iyopathie und h~molyti- scher Erkranknng ein gleiehartiger Enzymdefekt (PFK-Mangel) in Muskulatur und Erythroeyten be- schrieben wurde, konnten wir im vorliegenden Fa]l einer progressiven N[uskeldystrophie eine derartige Koinzidenz nicht nachweisen. In der Sketetmnskulatur land sieh eine deutliche Verminderung der ~agnesium- abhi~ngigen ATPase, in den roten Blutzellen dagegen ein Mangel an Pyruvatkinase (PK).

Das Enzymmuster der bioptisehen Probe aus dem M. quadriceps entspricht (mit Ausnahme der Mg- ATPase) weitgehend den unspezifischen Ver/~nderun- gen wie sie bei ursi~ch]ieh verschiedenen ~uskelerkran- kungen gefunden werden und gibt keine ttinweise auf die Atiologie der vorliegenden ~yopathie. Der niedrige Wert ffir die Mg-ATPase in Muskel und Serum l ~ t unter Umsti~nden an eine generelle, zur Zeit aller- dings nieht n£her faBbare MembranstSrung denken.

Unter diesem Aspekt haben wir an den Erythro- cyten des Patienten Untersuchungen des Phosphat- transfers durchgefiihrt. Die Ergebnisse dieser Studien ]assen (mit aller gebotenen Vorsieht) jedoeh darauf sehliel~en, da]~ die Phosphatpermeabilitat der Erythro-

cytenmembran normal ist. Nach den Untersuehungen yon Gerlach u. Mitarb. [2] ist die Orthophosphat- konzentration in den Erythrocyten bestimmend ffir das AusmaB der Phosphatabgabe. Die erhShte a2p_ Abgabe aus den roten Blutzellen unsercs Patienten diirfte demnach dutch ErhShung des intraee]lu]£ren Orthophosphatspiegels auf Grund der verminderten Synthese organischer Phosphatverbh~dungen bedingt sein.

Die Aktivit~tserniedrigung der PK in den Erythro- cyten betr~gt 50 % im Vergleich zum Normalwert. Als Folge dieses Enzymdefektes tritt, wie in der geringeren Lactatbfldung zum Ansdruck kommt, eine Vcrringe- rung der Glykolyse ein. Gleichzeitig wird die in der PK-Reaktion effolgende ATP-Bildung beeintr~chtigt und die Bereitstellung yon Energie in den Erythro- eyten herabgesetzt. Hiermit in Zusammenhang steht m5glicherweise die dutch 51Cr-~Iarkierung naehgewie- sene Verktirzung der Erythrocyteniiberlebenszeit, eine klinisch manifeste tt~molyse allerdings tr i t t nicht auf.

Die Ver/~nderungen der 5~chaelis-Konstantc der PK flit Phosphoenolpyruvat sowie die Versehiebung des pH-Optimums der PK lasscn annehmen, dal3 in den Erythroeyten des Patienten ein genetisch ver- i~ndertes Enzymprotein vorliegt. - - Es stellt sich nun die Frage, inwieweit eine gemeinsame genetische Basis ffir die in den Erythroeyten und in der Muskulatur ge- fundenen Stoffwechse]st5rungen angenommen werden kann. Die Beantwortung wird dadurch erschwert, dal3 die StSrungen in diesen beiden Zellsystemen so ver- sehiedenartig sind und der Defekt in der einen, keinen entsprechenden in der jeweils anderen Zellart zu haben seheint. Eine Kl~rung dieser Frage wird erst dureh weitere Studien mSglieh sein.

Ffir ausgezeic~mete teehnische Assistenz danken wir ~'1. W. t~othmann und Frl. Ch. Plevka.

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Dr. K. Moser I. Medizinisehe Uuiversit~tsklinik A-1090 Wien, Spitalgasse 23