Quantificao e caracterizao genotpica de Cryptosporidium

spp. isolados de gua bruta superficial e esgoto bruto para a

monitorizao em mananciais de abastecimento pblico na

Regio Metropolitana de So Paulo (RMSP)

Ronalda Silva de Arajo

Tese apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Sade Pblica da

Faculdade de Sade Pblica da

Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Doutor em

Cincias.

rea de concentrao: Servios de

Sade Pblica.

Orientao: Prof. Associada Maria

Helena Matt.

So Paulo

2015

expressamente proibida a comercializao deste documento tanto na sua forma impressa

como eletrnica. Sua reproduo total ou parcial permitida exclusivamente para fins

acadmicos e cientficos, desde que na reproduo figure a identificao do autor, ttulo,

instituio e ano da tese.

DEDICATRIA

minha pequena e dedicada famlia Ronaldo,

Victor Hugo, Cleo, Sushi, Raika, Pity e Dudu pela

minha ausncia durante a realizao deste

trabalho.

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus por me dar fora, sade e esperana em todos os momentos da

minha vida;

minha orientadora, Dra Maria Helena Matt, que me deu a oportunidade de

realizar esse trabalho, me acolheu novamente no laboratrio de Prtica de Sade

Pblica da USP e que, alm disso, sempre esteve disposio para o que fosse

preciso;

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), pela

concesso da bolsa de estudo que permitiu minha participao neste projeto;

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) que junto

com a Companhia de Saneamento Bsico do Estado de So Paulo (SABESP) por

meio do edital PITE-FAPESP n 2010/50797-4, proporcionou o suporte financeiro

desta pesquisa;

Companhia Ambiental do Estado de So Paulo (CETESB), pelo apoio e

colaborao no controle, coleta e distribuio das amostras de gua e de esgoto e

pela parceria de anos nos incentivando no desenvolvimento cientfico e acadmico;

Life Technologies, em especial Cinthia e Tomoko, pelo conhecimento e suporte

tcnico que foram fundamentais na execuo deste projeto;

Ao Laboratrio de Protozoologia do Departamento de Biologia Animal do Instituto

de Biologia da UNICAMP e Professora Dra. Regina Maura Bueno Franco e

Nilson Branco, que gentilmente forneceram os oocistos de Toxoplama gondii e

ovos de Ascaris suum para a validao da PCR em tempo real;

Professora Dra. Regina Maura Bueno Franco do Laboratrio de Protozoologia da

UNICAMP pela ateno e por aceitar integrar a banca de avaliao deste trabalho;

Ao Professor Dr. Rodrigo Martins Soares do Laboratrio do Departamento de

Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal da Faculdade de Medicina

Veterinria e Zootecnia da USP pelas orientaes e por aceitar o convite para

integrar a banca de avaliao deste estudo;

Professora Dra. Maria Ins Zanoli Sato por ser to solcita e aceitar o convite

para participar da banca de avaliao deste estudo;

Professora Maria Tereza Pepe Razzolini do Laboratrio de Biologia Ambiental

da USP pelo processamento das amostras pelo Mtodo1623.1, ensinamentos sobre

o tema da pesquisa e por aceitar participar da banca de avaliao deste estudo;

Professora Maria Anete Lallo pela amizade, por ter me motivado na rea da

pesquisa durante a minha graduao e por ser solcita mediante o convite para

integrar a banca de avaliao deste estudo;

Ao meu marido Ronaldo, pela cumplicidade e dedicao a mim e ao nosso filho

Victor Hugo durante os quatro anos desta trajetria e por cuidar da nossa famlia

com carinho;

Ao meu amigo Adriano Pereira pelos 15 anos de amizade, que mesmo distncia

torce por mim e pela minha carreira em todos os momentos;

minha amiga Milena (marida), pelo carinho, apoio intelectual e pessoal, alegrias

e tristezas durante toda minha jornada na Faculdade de Sade Pblica/USP.

s minhas amigas Livia Carminato Balsalobre Zillo e Martha Rojas, pois h 10

anos formamos o quarteto que mais deu certo nesta vida porque fomos escolhidas

para trilhar este caminho juntas;

s minhas amigas e companheiras de laboratrio Bruna Aguiar (Bru) e Mariana

Charleaux (Mari), pela amizade e por serem meus braos (direito e esquerdo) na

execuo deste trabalho;

Ao meu amigo Lincohn Zappelini da Silva pela nova amizade e por conceder as

fotos dos pontos de coleta utilizadas neste trabalho;

Ao meu pai, uma pessoa simples e sbia que me ensinou que a humildade a

melhor virtude do ser humano;

famlia Nogueira especialmente minhas cunhadas Rosngela e Elisngela pela

amizade, apoio e carinho;

Por fim... A todos os meus amigos, prximos ou distantes, pela amizade, afinidades

e sorrisos, pois os amigos so uma famlia que podemos escolher.

EPGRAFE

O acesso gua potvel uma necessidade humana e, portanto, base do direito humano.

A gua contaminada compromete tanto a sade fsica como social de todas as pessoas.

uma afronta dignidade humana.

Kofi Annan

Ex-Secretrio das Naes Unidas

RESUMO

Arajo RS. Quantificao e caracterizao molecular de Cryptosporidium spp. isolados em

gua bruta superficial e esgoto bruto para a monitorizao em mananciais de abastecimento

pblico na regio Metropolitana de So Paulo (RMSP) [Tese de Doutorado]. So Paulo:

Faculdade de Sade Pblica da USP; 2015.

As doenas de veiculao hdrica, sobretudo aquelas causadas por protozorios

intestinais, emergiram como um dos principais problemas de sade pblica. Diferentes

aspectos so abordados sobre a biologia e a epidemiologia dos principais protozorios

parasitas de transmisso hdrica. Cryptosporidium est descrito como um importante

parasita associado a casos de surtos de veiculao hdrica e alimentos no mundo. A

epidemiologia complexa desse protozario e o fato de que a maioria das espcies e

gentipos no pode ser diferenciada morfologicamente, aumentam o interesse por

metodologias sensveis e rpidas na deteco de espcies responsveis pela infeco em

humanos. Neste estudo foram avaliadas 50 amostras de gua bruta superficial, coletadas no

Rio So Loureno da Serra (P1A) e Represa de Guarapiranga (P2A) e 50 de esgoto bruto

coletadas em So Loureno da Serra (P1E) e no poo vertical de Taboo da Serra (P2E)

entre os meses de janeiro e dezembro de 2013. O isolamento dos oocistos na gua foi

realizado pelo Mtodo 1623.1 e as amostras de esgoto bruto por centrifugao, separao

imunomagntica (IMS). A caracterizao genotpica ocorreu por meio da nested PCR,

clonagem e sequenciamento com base no gene 18S rRNA comum a todas as espcies de

Cryptosporidium. O ensaio de PCR em tempo real (qPCR) foi avaliado simultaneamente

para deteco e quantificao de oocistos nas amostras. De acordo com os resultados

obtidos pela nested PCR, Cryptosporidium foi detectado na gua bruta superficial em 12%

(3/25) no manancial P1A e 16% (4/25) no P2A. No esgoto bruto o parasito foi detectado

em 20% (5/25) das amostras no ponto P1E e 24% (6/25) no poo vertical P2E. A qPCR

detectou 52% (0,79 a 1,85 oocistos/L) de amostras positivas no manancial P1A e o parasito

foi detectado em 64% (0,72 a 1,4 oocistos/L) no manancial P2A. No esgoto bruto 72% das

amostras foram positivas tanto no ponto P1E (7 a 655 oocistos/L) como no P2E (5 a 519

oocistos/L). A caracterizao molecular permitiu a identificao de C. parvum e C.

hominis na gua bruta superficial, e C. hominis, C. parvum, e C. muris no esgoto bruto. As

espcies do gnero Cryptosporidium identificadas neste estudo apresentam expressiva

relevncia para o desenvolvimento da doena humana. Neste sentido, as metodologias de

concentrao e caracterizao empregadas nas anlises demonstraram no geral, o potencial

para aplicao em estudos de vigilncia ambiental e foram teis na diferenciao de

espcies patognicas. A presena de C. muris associada s espcies antroponticas

identificadas auxiliou na investigao de provveis fontes de contaminao no ambiente

confirmando a necessidade da expanso de medidas efetivas para proteo destes

mananciais.

Descritores: Sade Pblica; Cryptosporidium; Genotipagem; gua Bruta Superficial;

Esgoto Bruto; PCR quantitativo.

ABSTRACT

Arajo RS. Quantification and molecular characterization of Cryptosporidium spp. from raw

surface water and raw sewage for the monitoring of public water supply sources in the

metropolitan region of So Paulo [Thesis]. So Paulo (BR): Faculdade de Sade Pblica da

USP; 2015.

Waterborne diseases, especially those caused by intestinal protozoa, have emerged

as a major public health problem. Different aspects are addressed on the biology and

epidemiology of most waterborne protozoan parasites. Cryptosporidium is described as an

important parasite associated with cases of waterborne and food outbreaks in the world.

The complex epidemiology of this protozoan, as well as the fact that most species and

genotypes cannot be differentiated morphologically, increase the interest for sensitive and

rapid methods for the detection of species responsible for infection in humans. In this

study, 50 samples of raw surface water were collected from So Loureno River (P1A) and

Guarapiranga Dam (P2A), and 50 samples of raw sewage were collected from So

Loureno da Serra (P1E) and from Taboo da Serras vertical well (P2E), between January

and December of 2013. The isolation of oocysts in water was carried out by the USEPA

Method 1623.1 and raw sewage samples were processed by centrifugation,

immunomagnetic separation (IMS). Genotypic characterization occurred by nested PCR,

cloning and sequencing based on 18S rRNA gene, which is common to all Cryptosporidium

species. Real time PCR assays (qPCR) were carried out both for detection and

quantification of oocysts simultaneously in the samples. According to the results obtained

by nested PCR, Cryptosporidium was detected in raw surface water in 12% (3/25) of

samples at P1A and in 16% (4/25) at P2A. In raw sewage the parasite was detected in 20%

(5/25) of samples at P1E and 24% (6/25) in P2E vertical well. qPCR detected 52% (0.79 to

1.85 oocysts/L) of positive samples at P1A, while the parasite was detected in 64% (0.72 to

1.4 oocysts/L) of samples at P2A water supply. Regarding raw sewage, 72% of samples

were positive both at P1E (7 to 655 oocysts/L) and P2E (5 to 519 oocysts/L Molecular

characterization allowed the identification of C. parvum and C. hominis in raw surface

water, and C. hominis, C. parvum and C. muris in raw sewage. Cryptosporidium species

identified herein belong to a group of organisms of significant relevance in waterborne

diseases. Therefore, concentration and characterization methodologies applied in our

analyses showed to be useful for environmental surveillance studies, as well as they were

useful in the differentiation of human pathogens. The presence of C. muris associated to

anthroponotic species helped in the investigation of likely contamination sources in the

environment, confirming the need of expansion in effective measures to protect these water

supplies.

Descriptors: Public Health; Cryptosporidium; Genotyping; Raw surface water; Raw sewage;

quantitative PCR.

NDICE

1. INTRODUO................................................................................................. 20

1.1 Consideraes gerais................................................................................... 20

1.2 Aspectos relevantes no setor de saneamento no Brasil............................... 28

1.2.1 Plano de Segurana da gua.............................................................. 32

1.3 O gnero Cryptosporidium e sua ocorrncia no meio ambiente................. 34

1.4 Mtodos de identificao de Cryptosporidium........................................... 42

2. OBJETIVOS...................................................................................................... 48

2.1 Objetivo geral............................................................................................... 48

2.2 Objetivos especficos.................................................................................... 48

3. MATERIAL E MTODOS.............................................................................. 49

3.1 rea do estudo e periodicidade das coletas................................................... 49

3.2 Procedimento para concentrao das amostras............................................. 52

3.2.1 gua bruta superficial.......................................................................... 52

3.2.2 Esgoto bruto......................................................................................... 54

3.3 Caracterizao genotpica de Cryptosporidium............................................ 54

3.3.1 Extrao de DNA total......................................................................... 54

3.3.2 Controles internos para confirmao das espcies isoladas................. 55

3.3.3 Clonagem............................................................................................. 55

3.3.4 Reao em cadeia pela polimerase dupla (nested PCR)....................... 56

3.3.5 Bioinformtica...................................................................................... 58

3.4 Anlise quantitativa (qPCR)......................................................................... 59

3.4.1 Iniciadores e sonda TaqMan (Applied Biosystems)......................... 59

3.4.2.Curva Padro........................................................................................ 60

3.4.3 Condies de amplificao da qPCR.................................................. 61

3.4.4 Anlises estatsticas.............................................................................. 64

4. RESULTADOS.................................................................................................. 65

4.1 Deteco de Cryptosporidium nas amostras de gua bruta pela nested

PCR......................................................................................................................... 65

4.2 Deteco de Cryptosporidium nas amostras de esgoto bruto pela nested

PCR......................................................................................................................... 67

4.3 Ensaio de validao da qPCR........................................................................ 75

4.3.1 Anlise de sensibilidade dos iniciadores e sonda.................................... 75

4.3.2 Anlise de especificidade dos iniciadores e sonda.................................. 77

4.3.3 Avaliao da reprodutibilidade da curva-padro para quantificao...... 80

4.4. Resultados de deteco e quantificao de C. hominis/C. parvum nas

amostras ambientais amplificadas pela qPCR........................................................ 83

5. DISCUSSO...................................................................................................... 89

5.1 Consideraes finais..................................................................................... 105

6. CONCLUSO................................................................................................... 108

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................ 110

8. ANEXOS............................................................................................................ 124

Deteco de cistos de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. pela tcnica

filtrao/IMS/FA (Mtodo 1623.1/EPA 2012), utilizando sistema Filta-Max

..... A1

Deteco de cistos de Giardia spp. e Cryptosporidium spp. por meio da tcnica

Concentrao/IMS/FA (McCuin & Clancy, 2005) para Esgoto bruto (efluente

primrio).................................................................................................................. A2

Apresentao da capa do curculo Lattes................................................................ A3

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Aspectos histricos relevantes no setor de saneamento no

Brasil.................................................................................................................. 30

Quadro 2. Etapas para o desenvolvimento de um Plano de Segurana da

gua.................................................................................................................... 34

Quadro 3. Caractersticas e localizao dos pontos de coleta utilizados no

estudo.................................................................................................................. 50

Quadro 4. Iniciadores e sonda do gene 18S rRNA desenvolvidos neste

estudo.................................................................................................................. 59

Quadro 5. Condies de amplificao do DNA de Cryptosporidium pela

qPCR.................................................................................................................. 62

Quadro 6. Resultados da amplificao e caracterizao genotpica pela

nested PCR e sequenciamento das amostras de gua bruta superficial e esgoto

bruto.................................................................................................................... 74

Quadro 7. Valores com as mdias de Cts por nmero de cpias obtidas pela

qPCR no ensaio de validao.............................................................................. 75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Avaliao da reprodutibilidade da curva padro utilizada nas

amostras de gua bruta para deteco de Cryptosporidium pela qPCR,

apresentando os valores de Mdia, Desvio Padro e Coeficiente de

Variao.............................................................................................................. 80

Tabela 2. Avaliao da reprodutibilidade da curva padro utilizadas nas

amostras de esgoto bruto para deteco de Cryptosporidium pela qPCR,

apresentando os valores de Mdia, Desvio Padro e Coeficiente de

Variao.............................................................................................................. 81

Tabela 3. Resultados de deteco e quantificao pela qPCR e o nmero de

ciclos necessrios para atingir o threshold durante a amplificao nas

amostras de gua bruta superficial...................................................................... 84

Tabela 4. Resultados de deteco e quantificao pela qPCR e o nmero de

ciclos necessrios para atingir o threshold durante a amplificao nas

amostras de esgoto bruto.................................................................................... 85

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rio So Loureno da Serra (P1A)(A); Ponto de captao do esgoto

bruto (P1E) gerado na cidade de So Loureno da Serra (B). Fonte:

Laboratrio de Anlises Biolgicas do Departamento de Sade

Ambiental/USP................................................................................................... 51

Figura 2. Reservatrio do Guarapiranga (P2A) prximo ao ponto de captao

(A); Poo vertical utilizado na coleta do esgoto bruto (P2E) de Taboo da

Serra (B). Fonte: Laboratrio de Anlises Biolgicas do Departamento de

Sade Ambiental/USP.........................................................................................

51

Figura 3. Fluxograma do processamento das amostras de gua bruta

superficial e esgoto bruto para obteno dos sedimentos utilizados na

extrao do DNA e amplificao das amostras por nested PCR e qPCR...........

53

Figura 4. Total de amostras (n=50) com percentual positivo para cada ponto

de coleta obtidos pela nested PCR do gene 18S rRNA do parasito

Cryptosporidium na gua bruta superficial......................................................... 65

Figura 5. . Eletroforese em gel de agarose 1,2% dos produtos amplificados

nas reaes de nested PCR para o fragmento de 826pb. M (marcador de peso

molecular 100bp), Ca (controle positivo amostra ambiental); As amostras 2 a

11 esto dispostas em ordem nas diluies: 1:10, 1:100 e 1:1000; nC+

(controle positivo da nested); dC+ (controle positivo direto da segunda

amplificao); C- (controle negativo); Br (branco)............................................

66

Figura 6. Total de amostras (n=50) com percentual positivo em cada ponto

de coleta obtidos pela nested PCR do gene 18S rRNA do parasito

Cryptosporidium no esgoto bruto.......................................................................

67

Figura 7. Alinhamento entre as sequncias obtidas a partir dos fragmentos

amplificados de 826pb do gene 18S rRNA pela nested PCR de amostras

ambientais e as sequncias representantes das diferentes espcies e gentipos

de Cryptosporidium disponveis no banco de dados GenBank...........................

69

Figura 8. Relaes evolutivas dos txons baseadas no mtodo de Neighbor-

Joining utilizando sequncias do gene 18S rRNA de diferentes espcies de

Cryptosporidium disponveis no banco de dados GenBank e os valores de

bootstrap aps 2000 rplicas. As demais amostras representadas pelas letras A

e E so amostras positivas de gua e esgoto oriundas deste estudo. As

Amostras 15E (A) e 15E (B) referem-se a sequncias clonadas de espcies

mistas...................................................................................................................

73

Figura 9. Representao grfica linear utilizada nas anlises de sensibilidade

da qPCR. O eixo X est representado pela quantidade de ciclos na reao e o

eixo Y os valores da magnitude do sinal gerado (Rn) nas condies da

qPCR.................................................................................................................. 76

Figura 10. Eletroforese em gel de agarose a 3% mostrando bandas

especficas de 150pb da curva padro e controle positivo utilizado na qPCR.... 76

Figura 11. Grfico da curva padro representando a curva de regresso linear

utilizada na qPCR. No eixo X so apresentados os valores de quantificao e

no eixo Y os valores de CTs. Na legenda a cor vermelha representa as

amostras positivas da curva, a cor azul o controle positivo clnico e a cor

verde DNA extrado de amostra de gua bruta...................................................

77

Figura 12. Representao da curva padro e amplificao positiva para C.

hominis. de acordo com a legenda as amostras referentes s linhas A e B esto

relacionadas com a curva-padro e a linha F com o controle positivo clnico,

as demais linhas representam os resultados de amplificao negativos

referentes aos outros patgenos.......................................................................... 78

Figura 13. Representao das curvas de amplificao positiva no qPCR para

C. parvum e C. hominis. O rudo abaixo do limiar (Threshold) representa

amostras negativas de outras espcies que no resultaram em amplificao. O

eixo X est representado pela quantidade de ciclos na reao e o eixo Y os

valores da magnitude do sinal gerado (Rn) nas condies da qPCR................ 79

Figura 14. Grfico multicomponente representando o ensaio qPCR com a

curva padro e amplificao positiva para C. hominis e negativa para C.

muris. O eixo X apresenta o nmero de ciclos da reao e o eixo Y os valores

atribudos a intensidade do sinal fluorescente. Na legenda em azul

representando as amostras amplificadas com a sonda ligada ao corante

reporter FAM e vermelho para o ROX.............................................................. 79

Figura 15. Representao grfica do ensaio qPCR com amplificao positiva

do IPC (internal positive control). As demais linhas representam os rudos da

reao de amplificao........................................................................................ 82

Figura 16. Resultados obtidos para amostras de gua bruta (P1A e P2A) e

esgoto bruto (P1E e P2E), positivos e negativos para a presena de

Cryptosporidium quando avaliadas por meio da reao de qPCR...................... 86

Figura 17. Nmero de oocistos/L de acordo com os meses de coleta

detectados na qPCR a partir do DNA de Cryptosporidium extrado

diretamente nas amostras de gua bruta superficial no ponto P1A..................... 87

Figura 18. Nmero de oocistos/L de acordo com os meses de coleta

detectados na qPCR a partir do DNA de Cryptosporidium extrado

diretamente nas amostras de gua bruta superficial no ponto P2A..................... 87

Figura 19. Nmero de cpias/L do fragmento 18S rRNA a partir do DNA de

Cryptosporidium extrado diretamente das amostras de esgoto bruto no ponto

P1E...................................................................................................................... 88

Figura 20. Nmero de cpias/L do fragmento 18S rRNA a partir do DNA de

Cryptosporidium extrado diretamente das amostras de esgoto bruto no ponto

P2E...................................................................................................................... 88

Introduo 20

1. INTRODUO

1.1. Consideraes gerais

Embora a gua seja o componente mais abundante na natureza, ocupando da

superfcie da terra, a questo da disponibilidade e da qualidade da gua utilizada para

consumo tornou-se um assunto relevante para as autoridades sanitrias e comunidade

cientfica. O interesse pela temtica justifica-se pelo fato de que todos os seres vivos so

dependentes deste recurso para sobreviver (SOUZA et al., 2010).

Todavia, a utilizao de gua potvel no desenvolvimento das atividades humanas

aumentou ao longo dos anos e, em contrapartida, a quantidade de gua disponvel para

consumo que possa satisfazer tais finalidades no acompanhou esse crescimento. A

crescente demanda de recursos hdricos somada falta de planejamento nos centros

urbanos, uso inadequado da gua e lanamento de esgoto domstico e industrial em rios,

riachos ou lagos, contriburam significativamente com o panorama de degradao dos

mananciais (SOUZA et al., 2010; LEONETI et al., 2011).

Os sistemas hdricos contaminados tm o potencial de causar doena e atingir um

grande nmero de pessoas provocando surtos. No Brasil, aes conjuntas de rgos

pblicos e privados por meio de polticas de saneamento ambiental, diretrizes e metas para

universalizao dos servios de saneamento tm estimulado o aprimoramento no setor de

abastecimento e tratamento de gua (ANA, 2010; LEONETI et al., 2011).

A importncia da gua como meio de veiculao de doenas entricas

reconhecida mundialmente. Nesse sentido, a necessidade de investimentos e planejamento

de aes de saneamento e esgotamento sanitrio tornou-se indispensvel considerando que

Introduo 21

o efluente tratado tem por finalidade reduzir os impactos ambientais e promover a sade da

populao, interrompendo o ciclo de transmisso de doenas (OMS, 2003; GOMES et al.,

2011).

Os microrganismos patognicos quando presentes na gua destinada para o

consumo humano indicam a inexistncia ou inadequao do tratamento de dejetos e da

proteo aos mananciais utilizados para abastecimento pblico. O problema central reside

no fato de que esses eventos apresentam consequncias econmicas e sociais relacionadas

aos custos com o tratamento adequado da gua, aes coletivas de sade e tratamento dos

indivduos afetados, podendo at mesmo gerar falta de confiana na qualidade da gua

potvel utilizada pela populao (KARANIS et al., 2007).

A gastroenterite infecciosa uma sndrome aguda geralmente identificada nas

doenas relacionadas ao saneamento. A infeco provoca distrbios no sistema

gastrointestinal gerando quadros de diarreia, clicas intestinais, vmitos e complicaes

relacionadas desidratao severa, o que torna a doena extremamente relevante para a

Sade Pblica. Estima-se que a incidncia anual de casos de diarreia aguda no mundo seja

de 4,6 bilhes de episdios gerando 2,2 milhes de mortes a cada ano (OMS, 2010).

De acordo com o Fundo das Naes Unidas para a Infncia (UNICEF), os dados

sobre mortalidade infantil em menores de cinco anos de idade so preocupantes, com duas

mil mortes dirias causadas por doenas diarreicas das quais 90% so relacionadas gua

contaminada, falta de saneamento e prticas inadequadas de higiene. Para a UNICEF os

nmeros so alarmantes uma vez que aproximadamente 800 milhes de pessoas em todo

mundo no tem acesso gua potvel e os ndices de saneamento bsico so igualmente

preocupantes, de tal modo que a melhoria na qualidade da gua poderia reduzir de maneira

significativa mortalidade infantil em todo o mundo (UNICEF, 2013).

Introduo 22

Diretrizes para proteo da sade humana com base na qualidade da gua potvel

tm sido publicadas regularmente pela Organizao Mundial da Sade (OMS). O Guia

para Qualidade da gua de Consumo (Guidelines for Drinking-water Quality) fornece

subsdios para avaliao da qualidade da gua e reduo de risco sade recomendando os

valores guia dos parmetros fsicos, qumicos e microbiolgicos, com a finalidade de que o

produto consumido pela populao seja de qualidade para proteo e promoo da sude

humana (OMS, 2011).

Os mananciais utilizados para captao de gua para o consumo humano podem

conter substncias em suspenso muito variadas, apresentando caractersticas fsicas e

qumicas prprias e quantidades adicionais de compostos orgnicos e inorgnicos

provenientes de despejos domsticos e industriais, podendo alterar ainda mais o perfil do

manancial influenciando inclusive a microbiota aqutica. Portanto, preciso ampliar as

medidas de proteo e fazer a readequao dos processos de tratamento de gua para cada

ponto de captao em cada regio (ANA, 2010).

A Organizao Mundial da Sade recomenda o uso do Plano de Segurana da gua

(PSA) pelos rgos de gesto de gua. O PSA fornece instrumentos para diretrizes

operacionais como, por exemplo, o mapeamento do sistema de abastecimento, a

identificao e avaliao dos riscos ao consumidor desde a captao da gua at o produto

final a ser distribudo. Refere-se ainda monitorizao e adequao das medidas de

controle preventivas visando melhora efetiva na qualidade da gua utilizada para

abastecimento (OMS, 2005).

Para adquir a caracterstica de potabilidade a gua deve ser submetida ao

tratamento convencional que segue parmetros fsicos, qumicos e microbiolgicos pr-

determinados. No Brasil, a Portaria n 2914, publicada pelo Ministrio da Sade em

dezembro de 2011 e que estabelece os padres de qualidade da gua para o consumo

Introduo 23

humano, ressalta a importncia das boas prticas no abastecimento de gua sob a

perspectiva do risco sade humana, reconhecendo assim no seu inciso VI do artigo 13, a

importncia do PSA recomendado pela OMS (BRASIL 2011b).

O controle laboratorial de contaminao da gua por microrganismos patognicos

possvel mediante a anlise da presena ou ausncia de indicadores bacteriolgicos. Os

coliformes totais incluindo os principais gneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e

Enterobacter e os coliformes termotolerantes (que tem como principal representante a

bactria Escherichia coli) so utilizados no processo de avaliao da gua por

contaminao de origem fecal. Porm, diferentes processos analticos so necessrios para

determinao destes indicadores e a ausncia de um microrganismo no elimina a presena

de outros tornando a anlise insuficiente na proteo da sade humana (BRASIL, 2004;

BETTEGA et al., 2006).

Os protozorios entricos pertencem a um grupo de organismos de expressiva

relevncia nas doenas de veiculao hdrica e representam um desafio para as autoridades

de sade e indstrias produtoras de gua. Em geral, esses agentes exibem em sua

constituio biolgica caractersticas particulares como a eliminao de grande nmero de

formas infecciosas no ambiente e a resistncia aos processos convencionais de tratamento

de gua, eficientes na remoo de bactrias e vrus patognicos, porm insuficientes na

inativao e eliminao de cistos e oocistos na gua (ROSEN, 2000; RYU &

ABBASZADEGAN, 2008).

Os gneros Cryptosporidium e Giardia esto entre os principais protozorios

intestinais estudados no mundo, podendo ser transmitidos ao homem por meio da gua e

alimentos contaminados com oocistos e cistos infecciosos. Nos Estados Unidos os dois

parasitos esto associados a mais de 50% dos surtos de gua de consumo humano captadas

de fontes superficiais registrados no perodo 1986 a 2000, e em segundo lugar est a

Introduo 24

enterobactria Escherichia coli O157:H7 (ARNONE e WALLING, 2007; BALDURSSON

E KARANIS, 2011).

A maior parte dos casos contaminao de gua associados a surtos de

criptosporidiose e giardose ocorreu na Amrica do Norte e no Reino Unido. A deficincia

nos processos de tratamento e ps-tratamento em conjunto com o aumento do nmero de

casos da doena no homem, so as razes principais para propagao dos surtos citados

(KARANIS et al., 2007; CHALMERS et al., 2010 ).

No Brasil, a norma de potabilidade da gua vigente, est atenta importncia do

monitoramento dos protozorios na gua de abastecimento e tornou obrigatria, conforme

os princpios do PSA, a pesquisa de Cryptosporidium e Giardia quando for identificada

mdia geomtrica anual maior ou igual a 1.000 Escherichia coli/100mL de forma a

garantir qualidade da gua potvel e proteger a sade da populao (BRASIL, 2011b).

Nesse ponto, considerando a gua como um importante veculo de transmisso dos

patgenos causadores da criptosporidiose e da giardose em humanos e animais, diferentes

ferramentas metodolgicas que objetivam a identificao de seus oocistos e cistos em

fontes de gua e esgoto sanitrio foram avaliadas e tornaram-se disponveis na comunidade

cientfica (CAREY, 2004).

Alm disso, possvel avaliar o significado para a sade humana da presena

desses patgenos na gua, mediante a determinao da probabilidade de infeco no

hospedeiro humano. A Avaliao Quantitativa de Risco Microbiolgico (AQRM) uma

ferramenta utilizada para o estabelecimento de critrios e padres microbiolgicos e

amplamente recomendada pela Organizao Mundial da Sade (OMS) e pela Agncia de

Proteo Ambiental Americana (United States Environmental Protection Agency -

USEPA) para instrumentalizar polticas de proteo de mananciais e de controle de

qualidade de guas de consumo humano (USEPA, 2005; IGNOTO, 2010).

Introduo 25

AQRM fornece dados sobre o risco de infeco por Cryptosporidium e Giardia

estimando a probabilidade de infeco devido ingesto de gua contaminada, com base

nas concentraes dos protozorios detectados na gua. Entretanto, fatores limitantes como

a recuperao do mtodo utilizado na pesquisa do parasito, falta de dados sobre a

viabilidade, infectividade e imunidade podem influenciar de forma negativa na avaliao

de risco, superestimando os dados (SATO et al., 2013).

Estudos epidemiolgicos em nosso pas ainda esto em andamento. Embora tenha

sido institudo desde a dcada passada o Programa de Monitorizao das Doenas

Diarreicas Agudas (MDDA) ainda no est estruturado de forma adequada em todo pas.

Entretanto, o programa tem permitido elucidar alguns surtos de veiculao hdrica

associados a protozorios e vrus, como o ocorrido em General Salgado no ano 2000, que

teve como agente etiolgico Cyclospora cayetanensis e o surto de norovrus ocorrido tanto

na Baixada Santista como no interior do Estado (CVE, 2008; CVE, 2010).

Frente ausncia de metodologias padronizadas para deteco e monitoramento de

Giardia spp. e Cryptosporidium spp. em amostras de gua, a United States Environmental

Protection Agency (USEPA) props o Mtodo 1623 para identificao simultnea desses

protozorios, o qual foi recm-revisado. O processo envolve etapas de filtrao,

concentrao, purificao por separao imunomagntica (IMS), anlise e confirmao dos

gneros por imunofluorescncia (IF) e contraste interferencial diferencial (DIC) (USEPA,

2012).

Deve-se observar, no entanto, que a IMS apresenta comportamento varivel em

amostras de gua com alta turbidez. Outras limitaes do Mtodo 1623 esto relacionadas

com a incapacidade de distinguir as espcies ou gentipos que afetam o homem e a

infectividade dos oocistos, uma vez que somente microrganismos viveis fornecem riscos

sade humana (DiGIORGIO et al., 2002; BAQUE et al., 2011).

Introduo 26

Uma variedade de tcnicas de concentrao foi sugerida e utilizada para a pesquisa

e o isolamento dos oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia em amostras de gua

(FRANCO e CANTUSIO, 2002; HIGGINS et al. 2003; HACHICH et al., 2004; JIANG et

al., 2005; McCUIN e CLANCY, 2005; RAZZOLINI et al., 2010; ARAUJO et al., 2011).

Em geral, as tcnicas descritas apresentam limitaes, como por exemplo, a demora

nos procedimentos, baixa reprodutibilidade e custo elevado. Contudo, importante

ressaltar que no h restrio quanto aplicao de tais metodologias desde que estes

mtodos sejam validados e se ateste a equivalncia ao Mtodo 1623 (PEREIRA et al.,

2009).

Um estudo interlaboratorial realizado nos Estado de So Paulo e Minas Gerais, com

gua bruta superficial, teve como objetivo avaliar o desempenho das principais

metodologias de concentrao propostas, de acordo com as caractersticas dos mananciais

nacionais. Os pesquisadores concluram que, embora o mtodo de filtrao em membranas

apresentasse bons resultados na recuperao, o sistema Filta-Max apresentou melhor

desempenho e atendeu a todos os critrios para anlise de Cryptosporidium e Giardia

(FRANCO et al., 2012).

As tcnicas de maior sensibilidade, especificidade e rapidez como amplificaes de

cidos nuclicos atravs da PCR (reao em cadeia pela polimerase) despertaram o

interesse dos pesquisadores por superar algumas limitaes dos mtodos convencionais na

deteco e caracterizao de organismos patognicos principalmente em amostras

ambientais (XIAO et al., 2004).

Logo, as tcnicas genotpicas tornaram-se necessrias no apoio s investigaes

epidemiolgicas, sendo particularmente importantes durante a averiguao de fontes

suspeitas podendo discriminar entre os gneros e as espcies de protozorios detectados e

Introduo 27

auxiliar em casos de surtos da doena ou casos espordicos (XIAO et al., 2004; RYAN et

al., 2005; PLUTZER e TOMOR, 2009; ROBERTSON et al., 2010).

A tcnica de reao de amplificao em tempo real (qPCR) considerada uma

tcnica promissora para deteco e quantificao de diferentes organismos em diversos

tipos de amostras. A qPCR um sistema adaptado para deteco de sequncias alvo que

permite a determinao da variabilidade gentica entre os isolados e medir a quantidade

relativa de DNA acumulada ao final dos ciclos da reao (GUY et al., 2003; STOUP et al.,

2006; ALONSO et al., 2011; RYU et al., 2010; STAGGS et al., 2013).

As vantagens em relao ao PCR convencional esto na reduo do tempo do

ensaio, reduo de riscos de contaminao e aumento da sensibilidade. O procedimento

segue o princpio geral da reao em cadeia pela polimerase, e sua caracterstica

fundamental que o DNA amplificado detectado por uma sonda especfica fluorescente

ou um corante de ligao ao DNA que emite um sinal aps a hibridizao com o DNA alvo

complementar dupla-fita, assim a reao progride e pode ser acompanhada em tempo real

(ALONSO et al., 2011).

Na literatura avaliada, diferentes problemas relacionados ao PCR em tempo real

so citados, desde a sensibilidade das sondas para limites de deteco mais sensveis como

componentes inibitrios frequentemente encontrados em amostras ambientais resultando

em reduo significativa da sensibilidade e cintica da tcnica. No entanto, estudos

adicionais so necessrios para avaliao mais precisa da aplicabilidade dessa metodologia

e ainda, para compreender qual o significado para a sade pblica da deteco e

identificao de espcies de Cryptosporidium no meio ambiente (STROUP et al., 2006;

ALONSO et al., 2011; STAGGS et al., 2013).

Introduo 28

1.2. Aspectos relevantes no setor de saneamento no Brasil

O planejamento dos sistemas de saneamento em centros urbanos fundamental

para promover a sade humana e gerar impactos positivos sobre o meio ambiente

(SOARES et. al., 2002). De acordo com HELLER (1998), a consolidao do enfoque

sade, saneamento e meio ambiente foi crucial para sensibilizar e orientar organizaes

governamentais, tcnicos da rea e a populao sobre os efeitos dos agentes poluidores no

ambiente como um fator determinante de agravos sade humana.

O objetivo do saneamento do meio est relacionado a um conjunto de medidas que

visam garantir melhores condies de sade populao e evitar a contaminao e

proliferao de doenas. Desta forma, o saneamento compreende o sistema de

abastecimento de gua e esgoto, sistema de coleta e disposio de resduos slidos,

drenagem urbana, e o controle de vetores, e constitui componentes importantes a serem

enfatizados nas polticas pblicas em sade e para preveno da morbi-mortalidade

(GOMES et al., 2011).

Muito embora os investimentos na rea de saneamento no Brasil tenham ocorrido

em alguns perodos especficos entre 1970 e 1980, atualmente o setor tem recebido maior

ateno governamental e uma significativa quantia de recursos a serem investidos. A partir

dessas consideraes, entende-se que as aplicaes dos recursos devem viabilizar os rgos

gestores no cumprimento dos aspectos legais, atender aos padres mnimos de qualidade a

fim de melhorar os ndices de sade, e finalmente garantir a sustentabilidade dos mesmos

(SOARES et al., 2002; LEONETI et al., 2011).

A partir de 1960, os servios pblicos de abastecimento de gua e coleta de esgotos

eram realizados por servios municipalizados com o apoio tcnico da atual Fundao

Nacional de Sade FUNASA do Ministrio da Sade. A partir da consolidao do Plano

Introduo 29

Nacional de Saneamento - PLANASA na dcada de 70, foram constitudas as empresas

estaduais de saneamento encarregadas da prestao de servios pblicos urbanos de gua e

esgotos, entre elas a SABESP em So Paulo, a COPASA em Minas Gerais e a CEDAE no

Rio de Janeiro (PEREIRA JUNIOR, 2008). O Quadro 1 apresenta a evoluo histrica no

setor de saneamento no Brasil desde o sculo XX at o incio do sculo XXI.

Diretrizes nacionais para o saneamento bsico e para a poltica federal de

saneamento bsico voltado para melhoria da oferta da quantidade e qualidade da gua

esto representadas pela Lei 9.433/1997 que se refere ao Plano Nacional de Recursos

Hdricos (PNRH) e pela Lei 11.445/2007 que instituiu o Sistema Nacional de Informaes

em Saneamento Bsico que, entre outras providncias, motivaram a cooperao entre os

municpios, estados e o Distrito Federal na ampliao do acesso a servios de saneamento

bsico de qualidade, com nfase na reduo das desigualdades regionais e melhoria da

qualidade de vida da populao brasileira (PEREIRA JUNIOR, 2008; ANA, 2010).

No entanto, as aes relacionadas ao meio ambiente e controle da poluio que

complementam as leis vigentes so elaboradas pelas agncias regulamentadoras como, por

exemplo, a resoluo do CONAMA N 430 de 13 de Maio de 2011, que complementa e

altera a Resoluo n 357/2005 sobre a classificao e diretrizes ambientais para a proteo

dos corpos de gua superficiais, bem como estabelece as condies e padres de

lanamento de efluentes (MMA, 2011).

Introduo 30

Quadro 1. Aspectos histricos relevantes no setor de saneamento no Brasil

Perodo Caractersticas da evoluo

Dcadas de

30 e 40

Apresentao do primeiro instrumento de controle de uso dos recursos

hdricos no Brasil: Cdigo das guas (1934).

Dcadas de

50 e 60

Primeiras iniciativas para estabelecer parmetros fsicos, qumicos e

microbiolgicos definidores da qualidade das guas por meio de Legislaes

estaduais e no mbito federal.

Dcada de 70

Consolidao do PLANASA Plano Nacional de Saneamento, com nfase

no ndice de atendimento por sistemas de abastecimento de gua; criao da

Secretaria Especial do Meio Ambiente (SEMA) com base nos conceitos de

ecologia e meio ambiente.

Dcada de 80

Surgimento de instrumentos legais definidores de polticas e aes do

governo brasileiro com a Poltica Nacional do Meio Ambiente; Reviso de

normas e instrumentos tcnicos dos padres de qualidade das guas

(resoluo 20/86 do Conselho Nacional do Meio Ambiente - CONAMA).

Dcada de 90

Planejamento e aes de saneamento com base no conceito de

desenvolvimento sustentvel; Portaria MS n 36/90 que estabelece normas e

padres para qualidade da gua de consumo; Instituio da Poltica e do

Sistema Nacional de Gerenciamento de Recursos Hdricos (Lei 9.433/97).

Sculo XXI

Portaria MS 1.469/2000 reviso dos padres de potabilidade e vigilncia

da qualidade da gua para o consumo humano e os padres de potabilidade,

substituda pela Portaria MS n 518/2004;

Resoluo do CONAMA 274/2000, define os critrios de balneabilidade nas

guas brasileiras. Considerando ser a classificao das guas doces, salobras

e salinas essencial defesa dos nveis de qualidade, avaliadas por parmetros

e indicadores especficos, de modo a assegurar as condies de

balneabilidade.

Resoluo do CONAMA 357/2005, classifica os corpos dgua e dispe

sobre diretrizes ambientais, e estabelece padres e condies de lanamentos

de efluentes de qualquer fonte poluidora;

Lei 11.445/2007 estabelece diretrizes nacionais para o saneamento bsico;

Resoluo CONAMA 396/2008, classifica as guas subterrneas e define

procedimentos para anlise e controle de qualidade para o monitoramento

das guas subterrneas;

Resoluo CONAMA 430/2011, altera a resoluo 357/2005 e estabelece

que qualquer fonte poluidora s poder ser lanada nos corpos de gua aps

o devido tratamento obedecendo aos padres orgnicos e inorgnicos

determinando o automonitoramento pelos responsveis pela fonte poluidora;

Portaria n 2.914/2011 revoga e substitui a portaria 518/2004 e dispe sobre os procedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para

consumo humano e seu padro de potabilidade.

Adaptado de SOARES et al., 2002; ANA 2010; BRASIL 2011b.

Introduo 31

Com o desenvolvimento na rea de saneamento e seguindo a tendncia mundial,

houve a necessidade da implantao de normas e revises tcnicas voltadas para melhoria

da qualidade da gua e esses padres so obtidos segundo orientaes da Portaria MS

2914/2011 recentemente revisada (BRASIL, 2011b).

De acordo com LEONETI et al. (2011), o saneamento no Brasil ainda est

marcado por grande desigualdade e deficincia de acesso, principalmente nas regies Norte

e o Nordeste, em face diversidade socioeconmica da populao. Ainda de acordo com

os autores, os ndices mais crticos esto relacionados coleta e tratamento de esgoto, visto

que a maior parte dos servios prestados est relacionada ao abastecimento de gua.

Dados do Sistema Nacional de Informaes sobre Saneamento Bsico (SNIS), em

2012, demonstram que o atendimento de abastecimento de gua da populao brasileira

total apresentou ndice mdio nacional nas reas urbanas de 93,2% e para a rede coletora

de esgotos 56,1%, destacando as regies Sul e Sudeste. J a mdia do pas para o

tratamento do esgoto gerado de 38,7% e coletados 69,4%, com destaque para a regio

Centro-Oeste, com 44,2% tratados e 90% coletados (SNIS, 2014).

O acesso gua tratada por meio de rede de abastecimento um dos servios

urbanos mais disponibilizados nos municpios brasileiros, sendo somente superado pela

energia eltrica. No Estado de So Paulo, o principal centro econmico do pas, o ndice de

atendimento de gua na rea urbana de 99,3%, valor considerado praticamente universal

e para esgoto coletado 95,5% com 74,9% tratado. De acordo com a Fundao Sistema

Estadual de Anlise de Dados - SEADE, apesar dos valores expressivos apresentados pelo

estado, ainda alarmante o percentual de carga poluidora remanescente de tratamento de

esgoto que retorna para os recursos hdricos, 59,4% (FUNDAO SEADE, 2012).

Os estados que mais investiram nos ltimos trs anos em servios de gua e esgotos

no Brasil foram: So Paulo, liderando os investimentos realizados, Minas Gerais, Bahia,

Introduo 32

Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, com 64,2% do total investido. Por outro lado, os cinco

estados que menos investiram foram Amazonas, Acre, Maranho, Amap e Alagoas, que

juntos tm participao de apenas 1,2% do total (SNIS, 2014).

Dessa forma, com objetivo de promover a melhoria no setor e reduzir as

deficincias, outras providncias so adotadas como: O programa de incentivo ao

tratamento de esgoto PRODES, gerenciado pela Agencia Nacional de guas, o Programa

Nacional de Vigilncia em Sade Ambiental - VIGIGUA e projetos de desenvolvimento

tecnolgico e inovao associados a institutos de pesquisa e parcerias pblico-privadas,

contribuindo na estratgia de universalizao dos servios e no crescimento econmico do

pas. O PNSB (Plano Nacional de Saneamento Bsico) previsto na Lei n 11.445/2007 que

teve sua verso final aprovada pelo Decreto presidencial N 8.141 de 20 de Novembro de

2013, norteia o planejamento dos programas governamentais e os procedimentos para

avaliao e monitoramento do saneamento bsico no Brasil com viso estratgica de futuro

(LEONETI et al., 2011; TRATA BRASIL, 2014).

1.2.1. Plano de Segurana da gua (PSA)

A baixa qualidade da gua pe em risco no s a sade humana como dos

ecossistemas naturais j ameaados por mudanas climticas extremas (ANA, 2010).

Devido ao crescimento populacional, mudanas demogrficas e a quantidade de detritos

despejados no ambiente aqutico superando sua capacidade de decomposio natural,

tornam-se necessrias medidas preventivas de aes conjuntas pelas autoridades de sade

pblica e novos planejamentos pelos servios de gua e saneamento para garantir a

segurana da gua consumida pela populao (OMS, 2012).

Introduo 33

A reduo dos contaminantes na fonte e o monitoramento sistemtico so ainda a

forma mais efetiva e barata de proteger a qualidade da gua. Alm dos microrganismos

introduzidos nos sistemas aquticos pela contaminao fecal humana e animal, as

atividades agrcolas e poluentes industriais, entre eles os contaminantes emergentes como

disruptores endcrinos e produtos farmacuticos, contribuem para a alterao qumica,

fsica e biolgica da gua (ANA, 2010).

O PSA tem sua metodologia baseada na gesto de riscos para sade pblica

auxiliando na garantia da qualidade da gua para o consumo humano. Como o plano

apresenta abordagem preventiva, ele norteia os governantes e as empresas produtoras de

gua, no s na tomada de decises e estratgias para melhoria da qualidade, como na

definio das responsabilidades quando os padres pr-determinados no so atendidos

(OMS, 2011).

No Brasil os estudos e as ferramentas necessrias para instalao do PSA em

sistemas de abastecimento esto sendo alcanados atravs de iniciativas de gesto coletiva

entre o Ministrio da Sade, Secretarias de Vigilncia em Sade, empresas produtoras de

gua potvel e rgos fiscalizadores (BRASIL, 2012).

Entretanto, o gerenciamento deve ter uma abordagem preventiva em relao

origem e s fontes de captao de gua, e como alguns aspectos relacionados com a gesto

da qualidade da gua no competem somente aos responsveis pelo sistema de

abastecimento de gua o desenvolvimento do PSA deve ser acompanhado pelos comits de

Bacias Hidrogrficas da regio e representantes do setor de sade (OMS, 2011). No

Quadro 2, est descrita a abordagem geral da constituio do Plano de Segurana da gua,

com as normas estabelecidas pela Organizao Mundial da Sade (BRASIL, 2012).

Introduo 34

Quadro 2. Etapas para o desenvolvimento de um Plano de Segurana da gua.

Etapas

preliminares

Planejamento das atividades, levantamento das informaes,

constituio da equipe tcnica multidisciplinar e implantao do PSA.

Avaliao do

sistema

Descrio do sistema de abastecimento de gua e validao do diagrama

de fluxo, identificao e anlise de perigos e caracterizao de riscos e

estabelecimento de medidas de controle dos pontos crticos.

Monitoramento

operacional

Controlar os riscos e garantir que as metas de sade sejam atendidas por

meio da seleo dos parmetros de monitoramento e estabelecimento de

limites crticos e de aes corretivas.

Planos de

gesto

Verificao constante do PSA, estabelecimento de aes em situaes

de rotina e emergenciais, organizao da documentao da avaliao do

sistema, estabelecimento de comunicao de risco, e validao e

verificao peridica do PSA.

Reviso do

PSA

Considerar: Os dados coletados no monitoramento, as alteraes dos

mananciais e das bacias hidrogrficas, as alteraes no tratamento e na

distribuio, a implementao de programas de melhoria e atualizao,

os perigos e riscos emergentes. O PSA deve ser revisado aps desastres

e emergncias para garantir que estes no se repitam.

Validao e

verificao do

PSA

Avaliar o funcionamento do PSA e saber se as metas de sade esto

sendo alcanadas.

Adaptado de BRASIL, 2012.

Um conjunto de aes e no somente o controle laboratorial, est estabelecido na

legislao nacional vigente como, por exemplo, boas prticas em abastecimento de gua e

a abordagem de mltiplas barreiras baseada nos princpios da anlise de risco onde se

estabelecem os procedimentos para prevenir, reduzir, eliminar ou minimizar a

contaminao (BRASIL, 2011b).

1.3 O gnero Cryptosporidium e sua ocorrncia no meio ambiente

O Cryptosporidium um coccdia pertencente ao filo Apicomplexa, que habita

preferencialmente as clulas da mucosa do trato gastrointestinal de diferentes hospedeiros,

Introduo 35

incluindo o homem. O protozorio tornou-se importante na rea mdica por causar diarreia

transitria em indivduos imunocompetentes e diarreia crnica de difcil tratamento em

pacientes com imunodeficincias, podendo lev-los ao bito (FAYER et al., 2000;

FAYER, 2010; CHALMERS & DAVIES, 2010).

A criptosporidiose ainda endmica na maioria das regies tropicais. A infeco se

d pela rota fecal-oral. O parasito apresenta baixa dose infectante em indivduos saudveis

( 10 oocistos) que podem continuar eliminando oocistos infecciosos at 60 dias aps o

desaparecimento dos sintomas gastrointestinais (CDC, 2012).

As principais vias de transmisso so o contato entre o homem e os animais,

pessoa-pessoa ou atravs da ingesto de oocistos infectantes presentes na gua e alimentos

contaminados. Portanto, a prevalncia em locais onde a moradia e o saneamento so

precrios aumenta o risco de contgio e consequentemente de surtos da doena (WHO,

2006; FRANCO 2007).

Em pases em desenvolvimento, as crianas menores de 5 anos de idade so

constantemente acometidas e a infeco crnica provoca distrbios cognitivos e

nutricionais alterando o metabolismo corporal. Considerando esses fatores,

Cryptosporidium descrito como um patgeno emergente e a criptosporidiose est inserida

na lista das doenas negligenciadas da Organizao Mundial de Sade desde 2004

(HUNTER et al., 2005; SAVOLI et al., 2006; CHALMERS & KATZER, 2013).

Devido importncia dos animais como reservatrio e sua capacidade de

disseminar oocistos infectantes no meio ambiente, o potencial zoontico do parasito

avaliado em diferentes estudos taxonmicos (XIAO, 2004; FAYER, 2010; RYAN &

POWER, 2012). A epidemiologia complexa e o fato de que a maioria das espcies e

gentipos no pode ser distinguida morfologicamente fazem aumentar significativamente o

interesse por mtodos mais sensveis e especficos indispensveis na deteco e

Introduo 36

diferenciao de espcies responsveis pela infeco no homem (RYAN et al., 2005;

HUMBER et al., 2007; ANTUNES et al., 2008; FERES et al., 2009; SAMRA et al., 2011;

RYAN et al., 2014 ).

A caracterizao genotpica favoreceu o conhecimento e a compreenso sobre a

diversidade gnetica entre os organismos deste gnero. Naturalmente, aps a re-descrio

taxonmica feita por UPTON & CURRENT em 1985, a espcie C. parvum passou a ser

utilizada amplamente para descrever o parasito no homem, bezerros e gados e outros

mamferos, alm de ser utilizado em ratos como modelo experimental. De fato, C. parvum

considerado um complexo de mltiplas espcies e muitos gentipos de Cryptosporidium

foram descritos como C. parvum antes de serem caracterizados como espcies novas

(XIAO et al., 2004; FAYER, 2010; REN et al., 2011).

A taxonomia atual descreve 26 espcies e mais de 40 gentipos para o gnero

Cryptosporidium, e algumas destas espcies so reconhecidas, por diversos pesquisadores,

como possveis agentes de doena no homem, entre elas o C. parvum (gentipo bovino ou

tipo II), C. hominis (C. parvum, gentipo humano ou tipo I), C. felis, C. meleagridis, C.

canis e C. cuniculus que so constantemente relatados em pacientes imunocompetentes e

C. parvum, C.hominis, C.muris, C.baileyi, C. felis, C. meleagridis, C.canis e C.suis, os

quais esto relacionados com criptosporidiose em pacientes imunocomprometidos (XIAO

et al., 2004; CACCI et al., 2005; SMITH et al., 2006; SUNNOTEL et al., 2006a;

FAYER, 2010; ELWIN et al., 2012; RYAN et al., 2014).

No entanto, as espcies mais frequentemente identificadas em estudos

epidemiolgicos so C. hominis e C. parvum e a prevalncia de ambas as espcies em

diferentes partes do mundo varivel. C. hominis descrito com maior frequncia na

Amrica do Norte, Amrica do Sul, Austrlia e na frica e C. parvum no continente

europeu (SAVOLI et al., 2006; XIAO, 2010; REN et al., 2012).

Introduo 37

O aumento no nmero de casos de criptosporidiose em diferentes reas geogrficas

destaca a importncia dos programas de vigilncia e monitoramento por mtodos capazes

de identificar o patgeno e consequentemente a origem da contaminao. Infeces

simultneas por C. parvum e C. hominis foram detectadas em 2012, na Holanda,

Alemanha, partes do Reino Unido e nos Pases Baixos. O parasito foi detectado mediante

anlises das fezes de pacientes com queixas gastrointestinais e todos os casos foram

notificados aos servios pblicos de sade regionais (FOURNET et al., 2013).

Do ponto de vista da sade pblica a diferenciao entre as espcies de

Cryptosporidium importante por tornar possvel a avaliao do ciclo de transmisso da

doena. No caso da espcie C. parvum, alm de patgeno humano, tambm considerada

zoontica, enquanto que em relao a espcie C. hominis, a contaminao deve ocorrer

somente atravs de dejetos humanos. Entretanto, um estudo conduzido por SMITH et al.

(2005) avaliou o ciclo natural de C. hominis e revelou que a quantidade de hospedeiros

para esta espcie pode estar subestimada, devido identificao de C. hominis em gado de

criao. Esta informao tem um significado importante para sade pblica caso outros

hospedeiros estejam implicados na disseminao desta espcie no ambiente.

Cryptosporidium est descrito entre os protozorios mais frequentemente

diagnosticados em casos de surtos associados gua no mundo. Tais ocorrncias vm

sendo atribudas a fatores biolgicos e caractersticas prprias do parasito Cryptosporidium

como, por exemplo, baixa dose infectante necessria para multiplicao no hospedeiro,

habilidade em permanecer no ambiente por longos perodos e resistncia elevada aos

processos convencionais de tratamento de gua (XIAO, 2004; RYU &

ABBASZADEGAN, 2008).

Desde a maior epidemia de criptosporidiose em Milwaukee (EUA), as agncias

reguladoras avaliam o risco da contaminao por oocistos presentes em gua potvel. A

Introduo 38

meta de risco tolervel adotada atualmente pela USEPA de 1 caso de infeco em 10.000

pessoas por ano nos Estados Unidos. Entretanto, estudos recentes revelam que o nmero

anual de infeco por Cryptosporidium est alm do esperado: 52 casos em 10.000

indivduos (JOHNSON et al., 2012).

Deste modo, a gua utilizada para consumo contaminada com oocistos infectantes

um fator preditivo para o desenvolvimento da doena em humanos (FERGUSON et al.,

2006). Nos Estados Unidos, surtos frequentes de veiculao hdrica fizeram a Agncia de

Proteo Ambiental Americana incluir o gnero Cryptosporidium e Giardia entre os

organismos a serem monitorados em mananciais de abastecimento (USEPA, 2005).

Os oocistos ocorrem em baixas densidades no ambiente, e os mtodos de

concentrao e de identificao so importantes para detectar a presena do protozorio na

gua. O mtodo padro internacional para anlise simultnea de Cryptosporidium e

Giardia na gua o mtodo 1623, recentemente atualizado. No entanto, a diferenciao

entre as espcies e seus respectivos gentipos s possvel por meio de tcnicas

moleculares (JOHNSON et al., 2012; USEPA, 2012).

As deficincias no processo de remoo de oocistos durante o tratamento da gua e

do esgoto e a facilidade de disseminao no ambiente de espcies que afetam o homem

demonstraram a necessidade da adoo de um programa de vigilncia ativo e bem

executado, principalmente em regies onde a concentrao do parasito fosse elevada

(OMS, 2003).

A deteco e identificao de diferentes espcies de Cryptosporidium em amostras

ambientais confirmam a importncia de medidas de intervenes para proteo das bacias

hidrogrficas devido possibilidade de contaminao dos mananciais por despejo de

esgoto tratado e no tratado, resduos agrcolas e urbanos e dejetos de animais domsticos

Introduo 39

silvestres (XIAO et al., 2001; SMITH et al., 2006; RYU et al., 2008; RAZZOLINI et al.,

2010; BRANCO et al., 2011; JOHNSON et al., 2012).

Considerando o potencial de veiculao hdrica na transmisso da criptosporidiose

e giardose, em Portugal foi realizado um estudo de investigao molecular associado ao

mtodo USEPA 1623 para avaliar 175 amostras de gua de diverentes fontes, entre estas,

gua bruta superficial e gua tratada. A presena do parasito Cryptosporidium foi detectada

em 46,3% (81/175) das amostras analisadas e as espcies mais prevalentes nesta regio

foram C. parvum seguido de C. hominis, C. andersoni, C. muris e Giardia duodenalis foi

detectada em 38,3% (67/175) (LOBO et al., 2008).

No sudoeste da Tailndia, SRISUPHANUNT et al. (2010), investigaram a presena

de Cryptosporidium e Giardia em amostras de gua de diferentes origens em reas

afetadas por Tsunamis entre os anos de 2005 e 2008. No primeiro perodo da investigao,

12,7% (15/118) das amostras foram positivas para Cryptosporidium spp e 7,6% (9/118)

foram positivas para Giardia spp., e no segundo perodo o percentual de amostras positivas

foi de 11,9% (5/42) para Cryptosporidum spp. e para Giardia spp., 7,1% (3/42). Apesar da

deteco de ambos os parasitos ter diminudo no segundo perodo ps-Tsunamis, este

estudo sugere a necessidade de medidas de controle na qualidade da gua de abastecimento

como forma de proteo e promoo da sade pblica nas provncias afetadas.

GALLAS-LINDEMANN et al. (2013), pesquisaram Cryptosporidium e Giardia

em 206 amostras de gua residual e 190 amostras de gua de rios incluindo uma rea

recreacional em Lower Rhine na Alemanha entre os anos de 2009 a 2011. Neste estudo a

presena de cistos de Giardia foi confirmada em 65% (134/206) e 31,1% (64/2060)

respectivamente nas amostras de gua residual, enquanto nas amostras de gua superficial

4,2% (8/190) foram positivas para Giardia e 9,5% (18/190) para Cryptosporidium spp.

Introduo 40

identificados pela tcnica de imunofluorescncia e microscopia de contraste interferencial

diferencial (DIC).

No Brasil, os estudos relacionados ao Cryptosporidium iniciaram em 1980, devido

s altas taxas de prevalncia de criptosporidiose em pacientes HIV positivos e pacientes

transplantados. Porm a pesquisa de Cryptosporidium no faz parte da rotina da maioria

dos laboratrios clnicos de anlises a menos que haja suspeita clnica. Estudos objetivando

a pesquisa de Cryptosporidium vm sendo realizados por diferentes grupos de pesquisa,

tanto na rea ambiental quanto em amostras clnicas, mas somente a partir do ano 2000 os

estudos empregando a deteco dos oocistos atravs de mtodos moleculares e a

genotipagem foram introduzidos no pas. (CARVALHO-ALMEIDA, 2005).

A presena de Cryptosporidium em amostras clnicas foi avaliada em hospitais e

universidades (CIMERMAN et al., 2002; GATEI et al., 2003 CARVALHO-ALMEIDA et

al., 2006; OLIVEIRA-SILVA et al., 2007; ARAUJO et al., 2008; GONALVES et al.,

2008; LUCCA et al., 2009; ASSIS et al., 2013), e a caracterizao gentica em isolados de

fezes de animais silvestres e domsticos evidenciam a ampla distribuio de espcies

zoonticas em diversos estudos no Brasil (MEIRELES et al., 2007; ANTUNES et al.,

2008; LALLO et al., 2009; PAZ e SILVA et al., 2013; PAZ e SILVA et al., 2014).

Em amostras ambientais grande parte das pesquisas de deteco de

Cryptosporidium desenvolvida em centros de pesquisas (FRANCO et al., 2001;

SANTOS et al., 2004; HACHICH et al., 2004; MACHADO et al., 2009; RAZZOLINI et

al., 2010; ARAUJO et al., 2011; HACHICH et al., 2013; BONATI & FRANCO, 2014).

CANTUSIO NETO et al. (2010) observaram em seus estudos a eficincia de

recuperao de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia em amostras de gua do

Rio Atibaia entre os anos de 2005 e 2006. A presena de Giardia spp. foi detectada em

87,5% das amostras analisadas com densidades de 2,5 a 120 cistos/L e Cryptosporidium

Introduo 41

spp em 62,5% com concentraes de 15 a 60 oocistos/L. A contaminao foi associada

descarga de esgoto no tratado no rio Atibaia.

BRANCO et al. (2012), investigaram a ocorrncia de oocistos de Cryptosporidium

e cistos de Giardia em manancial de uma cidade turstica no Estado de So Paulo. A

presena de ambos protozorios foi detectada nas amostras analisadas no estudo, com

concentraes mdias de 0,2 a 0,3 oocistos/L de Cryptosporidium sp e 0,07-0,1 cistos/L de

Giardia sp. O exame coproparasitolgico realizado em moradores de duas comunidades

rurais na mesma regio revelou que 49,2% (91/185) dos residentes apresentaram resultados

positivos para a presena de parasitas intestinais e entre os protozorios, o

Cryptosporidium foi o mais prevalente com 8,1% dos infectados.

Estudos moleculares que possibilitam avaliar a presena de espcies circulantes em

amostras ambientais e seu significado para sade pblica ainda so escassos no Brasil.

ARAUJO et al. (2011) avaliaram a ocorrncia de Cryptosporidium em amostras ambientais

no estado de So Paulo. A caracterizao molecular revelou a presena de C. hominis e C.

meleagridis em amostras de guas recreacionais e superficiais destacando a importncia da

continuidade dos estudos epidemiolgicos moleculares neste campo.

Na regio metropolitana de Curitiba, OSAKI et al. (2013) avaliaram por mtodos

moleculares a gua bruta superficial no ponto de captao de quatro estaes de tratamento

de gua (ETA) entre os anos de 2008 e 2009. Os autores utilizaram a tcnica de nested

PCR associada quantificao de oocistos por contagem em lmina e microscopia tica

que foi padronizada no estudo. Entretanto, a deteco de Cryptosporidium sp foi possvel

em apenas um dos pontos de captao sendo que a concentrao estimada de oocistos

detectados foi igual ou superior a 100 oocistos/L.

A identificao de espcies, sobretudo no ambiente, tem auxiliado o melhor

entendimento da dinmica de transmisso da criptosporidiose em diferentes surtos no

Introduo 42

mundo. Desde o reconhecimento do Cryptosporidium pela OMS como um importante

patgeno oportunista que deve ser monitorado na gua de abastecimento, diferentes

metodologias - capazes ou no de detectar variaes genticas - so utilizadas no controle e

vigilncia da criptosporidiose (CHALMERS & DAVIES, 2010).

Entretanto, a deteco de Cryptosporidium em amostras de guas continua sendo

um desafio, sobretudo no Brasil, devido inexistncia de dados epidemiolgicos de surtos

de criptosporidiose, e dificuldade de implementao e otimizao de mtodos de

deteco e quantificao acessveis, em termos de custos, e reprodutveis quando aplicados

nas guas dos manaciais do nosso pas (ARAUJO et al., 2011).

1.4 Mtodos de identificao de Cryptosporidium

O diagnstico de Crytosporidium em achados clnicos rotineiramente realizado

em amostras de fezes, atravs da microscopia tica. Contudo, nos ltimos anos cresceu o

interesse por mtodos de diagnsticos que fossem mais sensveis e especficos com

objetivo de facilitar a diferenciao das espcies detectadas e assim melhor compreender a

patogenicidade dos isolados clnicos e ambientais (SAVIOLI et al., 2006; GONALVES

et al., 2008).

Testes rpidos de Imunoensaios como ImmunoCard STAT, MERIFLUOR

Cryptosporidium/Giardia DFA test e ProSpecT Giardia and Cryptosporidium EZ

microplate assay (EIA) so utilizados para deteco de antgenos dos parasitas nas fezes e

concentrados ambientais. Ainda que o alto custo seja considerado o fator limitante na

utilizao, os testes imunolgicos quando empregados precisam ser interpretados com

cuidado devido baixa prevalncia dos parasitos na populao (JOHNSTON et al., 2003).

Introduo 43

No ambiente, a compactao de algumas partculas fluorescentes ao redor dos

oocistos e cistos presentes na gua bruta e/ou no esgoto bruto podem gerar resultados

falsos positivos ou mesmo falsos negativos durante a deteco por testes imunolgicos

(LeCHEVALLIER et al., 1995;OMS, 2006)

A identificao molecular de espcies e de gentipos de Cryptosporidium

possvel inicialmente por meio da PCR. A PCR a tcnica mais comum utilizada nos

laboratrios de pesquisa e investigao mdica. A tcnica baseia-se no processo natural de

replicao de DNA produzindo cpias do DNA de interesse in vitro sem a necessidade de

um organismo vivo. Entretanto, sua principal aplicao em amostras que tenham a

quantidade de DNA reduzida, aumentando esse nmero de forma exponencial (KARP,

2005).

De forma geral, os estudos utilizam diferentes fragmentos amplificados para

posterior genotipagem empregando tcnicas de digesto com enzimas de restrio (RFLP)

ou sequenciamento do fragmento para estudo de posicionamento taxonmico dos

organismos a fim de melhorar a efetividade na investigao e aperfeioar o processo,

tornando-o mais rpido (HIGGINS et al., 2003; ZHOU et al., 2003; XIAO et al., 2004;

RYAN et al., 2005; ARAUJO, 2008; PLUTZER e TOMOR, 2009).

A nested PCR uma tcnica de amplificao dupla e tem como finalidade

aumentar a sensibilidade de deteco em amostras com baixa concentrao de DNA,

principalmente em amostras ambientais. Apesar de aumentar a sensibilidade de deteco, a

probabilidade de contaminao da reao favorecida neste ensaio devido ao excesso de

manipulao do produto amplificado (COUPE et al., 2005).

De acordo com JIANG et al. (2005a) o maior problema a ser superado na aplicao

dos mtodos de amplificao por PCR a presena de inibidores tanto em amostras

clnicas como em amostras ambientais. Para que o sucesso da reao ocorra trs etapas

Introduo 44

bsicas devem ser consideradas: 1) a concentrao e purificao da amostra antes da

extrao do DNA; 2) a remoo dos inibidores durante a extrao do DNA e 3) a

padronizao da reao de amplificao.

Para o isolamento de (oo)cistos de Cryptosporidium e Giardia na gua a

metodologia 1623.1 (USEPA, 2012) o mtodo de referncia a ser utilizado. O

procedimento envolve etapas de filtrao, separao imunomagntica e identificao por

microscopia de imunofluorescncia. A falta de dados sobre a ocorrncia de

Cryptosporidium nos mananciais nacionais, fatores financeiros e o treinamento de tcnicos

para realizao do mtodo so considerados ainda fatores limitantes para a execuo do

procedimento em ampla escala (FRANCO, 2007).

Entretanto, esta metodologia recomendada pela USEPA associada s tcnicas de

amplificao de genes e regies no codificadoras do genoma do Cryptosporidium: 18S

rRNA, hsp70 (heat shock protein) e cowp (Cryptosporidium oocyst wall protein), so

amplamente indicadas para estudos taxonmicos (XIAO et al., 2004; CAREY et al., 2004;

CHALMERS et al., 2005; RYAN et al., 2005; COUPE et al., 2005; FERGUNSON et al.,

2006).

De maneira geral o locus 18S rRNA amplamente utilizado em estudos de

organismos estreitamente relacionados e utilizado em diversas aplicaes como anlise

filogentica e estudos de biodiversidade. O DNA codificador do RNA ribossomal consiste

em mltiplas cpias de um conjunto de segmentos de genes que so transcritos para

originar as molculas estruturais do ribossomo denominadas 5.8S, 18S, e 28S que so

intercalados por dois segmentos espaadores, ITS1 e ITS2 (MEYER et al., 2010).

As espcies C. hominis e C. parvum apresentam caractersticas fenotpicas e

genotpicas muito semelhantes em sua constituio e apenas diferenas sutis so notadas

por meio do mapeamento gentico nas duas espcies (XU et al., 2004).

Introduo 45

As anlises do genoma por sequenciamento completo revelam que o

Cryptosporidium apresenta oito cromossomos com extenso de aproximadamente 9.2

milhes de pares de bases e o DNA ribossomal amplificado por meio do gene 18S rRNA

apresenta cinco cpias por genoma haploide (esporozoto) consistindo em 20 cpias por

oocisto, favorecendo a sua deteco por este gene (Le BLANCQ et al 1997; BANKIER et

al., 2003; XU et al., 2004).

Sequncias homlogas do gene 18S rRNA relacionadas ao gnero Cryptosporidium

esto amplamente disponveis no banco de dados. Estas sequncias so caracterizadas por

regies conservadas intercaladas com regies polimrficas de aproximadamente 1700

pares de base e que apresentam trs domnios reconhecidos onde as diferenas entre as

espcies estreitamente relacionadas so encontradas em estudos de genotipagem (SILVA et

al., 2013).

Diagnsticos moleculares mais sensveis como reao de amplificao em tempo

real (qPCR) empregam um sistema de deteco e quantificao de sequncia alvo, com

sondas fluorescentes especficas para o produto de PCR amplificado. Alguns trabalhos

utilizam a qPCR com objetivo de demonstrar a sensibilidade e especificidade do mtodo na

identificao de Cryptosporidium presentes em amostras clnicas ou ambientais.

Entretanto, diferentes estudos confirmam a necessidade de pesquisas adicionais de

padronizao de sondas especficas que apresentem melhores resultados de deteco

principalmente quando aplicados em amostras ambientais (GUY et al., 2003; ALONSO et

al., 2010).

O sistema de PCR quantitativo sensvel e pode detectar at uma cpia de uma

sequncia especfica na fase exponencial da amplificao. A qPCR converte o sinal

fluorescente em um valor numrico a cada reao e o resultado obtido a relao

Introduo 46

quantitativa entre o valor inicial do alvo e a quantidade de produto amplificado acumulado

a cada ciclo referido pelo sistema como Ct (threshold cycle) (DORAK, 2006).

Na qPCR os valores de CTs so logartmicos e podem ser utilizados diretamente

pelo mtodo comparativo atravs de curvas de quantificao relativa ou indiretamente por

interpolao de curvas-padro criando valores lineares para as anlises quantitativas

conhecidas como ensaios de quantificao absoluta (APPLIED BIOSYSTEMS, 2014).

De acordo com RYAN et al. (2005), os mtodos de deteco e quantificao

associados especificidade dos ensaios de genotipagem so ferramentas extremamente

eficientes que podem ser utilizadas nos sistemas de gesto operacional das empresas

especializadas nos servios de tratamento da gua, auxiliando no monitoramento de

provveis fontes de contaminao em bacias hidrogrficas e para avaliao dos riscos

sade humana.

Nos Estados Unidos a aplicabilidade da qPCR foi testada em estudos de avaliao

de remoo de patgenos nos processos de tratamento de gua. Alm de rpido e

especfico, os ensaios de qPCR podem ser utilizados para quantificao simultnea de

diferentes organismos como vrus, bactrias, fungos e protozorios em diferentes matrizes

(RYU et al., 2010).

STAGGS et al. (2013), avaliaram o sistema TaqMan com base na deteco e

quantificao de oocistos de Cryptosporidium. Entretanto, os autores concluram que no

foi possvel medir com preciso os baixos nveis de oocistos que so normalmente

encontrados em fontes de gua potvel, sugerindo que avaliaes e estudos adicionais por

este sistema fossem realizados.

A determinao da viabilidade dos oocistos de Cryptosporidium e seus respectivos

gentipos, presentes em amostras de gua, tem grande significado para a avaliao mais

precisa da qualidade da gua, considerando que apenas oocistos viveis podem ser

Introduo 47

infecciosos para o homem. Entretanto, o mtodo usual para o teste de viabilidade

realizado por mtodos in vivo com ensaios de infectividade em modelos animais (BAQUE

et al., 2011).

Desta forma, as tcnicas de reao de amplificao e quantificao de genes

comuns s espcies de Cryptosporidium, presentes tanto em amostras clnicas como em

amostras ambientais, so consideradas promissoras proporcionando informaes precisas

de interesse para sade pblica j que podem ser aplicadas tanto em estudos de avaliao

de surtos como investigao de casos isolados (VERWEIJ et al., 2003; PLUTZER et al.,

2008; YU et al., 2008; RYU et al., 2010; BAQUE et al., 2011; SOUZA et al., 2012).

Objetivos 48

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Quantificar e caracterizar oocistos de Cryptosporidium spp. por mtodos

moleculares associados tcnica de concentrao por filtrao/IMS/IFA (Mtodo 1623.1

USEPA, 2012) recuperados de amostras de gua bruta superficial e esgoto bruto.

2.2 Objetivos especficos

1. Detectar o protozorio Cryptosporidium spp. nas amostras de gua bruta superficial

e esgoto bruto pela reao em cadeia da polimerase dupla (nested PCR);

2. Validar e aplicar a tcnica de real time PCR (qPCR) com base no gene 18S rRNA

para identificar e quantificar Cryptosporidium hominis e/ou Cryptospordium

parvum nas amostras de gua bruta superficial e esgoto bruto;

3. Sequenciar os fragmentos amplificados para confirmao das espcies encontradas

no estudo;

4. Fornecer informao quanto aos gentipos identificados para serem utilizados na

ferramenta de Avaliao Quantitativa de Risco Microbiolgico (AQRM), utilizada

pelos sistemas produtores de gua em seus Planos de Segurana da gua (PSA);

Material e Mtodos 49

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. rea do estudo e periodicidade das coletas

O presente estudo foi desenvolvido como parte do Projeto de Pesquisa intitulado

Modelo de Estudo para Avaliar o Impacto de Patgenos Entricos em Mananciais de

Abastecimento Pblico que pertence ao Programa de Apoio Pesquisa em Parceria para

Inovao Tecnolgica 1 (PITE - FAPESP 2010/50797-4).

As amostras utilizadas para este estudo foram obtidas em colaborao com a

Companhia Ambiental do Estado de So Paulo (CETESB) e Compania de Saneamento

Bsico do Estado de So Paulo (SABESP). As coletas foram realizadas em dois

mananciais localizados nos municpios de So Loureno da Serra e Taboo da Serra no

estado de So Paulo, ambos pertencentes Regio Metropolitana de So Paulo (RMSP) e

Microrregio de Itapecerica da Serra. De acordo com objetivo do Projeto PITE-FAPESP,

os pontos de amostragem foram definidos levando-se em conta a captao de gua do

manancial pelo sistema de abastecimento pblico, rede de tratamento de esgoto e os

municpios eleitos precisariam estar inseridos no programa de Monitoramento de Doenas

Diarricas Agudas (MDDA), coordenado pelo Centro de Vigilncia Epidemiolgica

(CVE) do Estado de So Paulo.

O municpio de So Loureno est localizado a 56 km da capital de So Paulo e

abastecido pelo rio So Loureno que faz parte de uma rede hdrica pertencente bacia do

Ribeira de Iguape (UGHRI-11) com atendimento urbano de gua de 41% dos domiclios e

a coleta de esgotos abrangendo 24% dos domiclios, segundo o relatrio do Plano

Municipal de Saneamento Bsico de So Loureno de novembro de 2010.

O municpio de Taboo da Serra utiliza como fonte de abastecimento o sistema

produtor integrado, constitudo pela represa Billings e Guarapiranga (UGRHI-06). O

Material e Mtodos 50

municpio possui o percentual de 100% no nvel de abastecimento de gua e 87% do

esgoto coletado, sendo 34% tratado na ETE Barueri segundo dados do Relatrio de

Qualidade das guas Superficiais do Estado de So Paulo (CETESB, 2013). As descries

e a localizao dos pontos de coleta podem ser visualizadas no Quadro 3. Foram realizadas

25 coletas, quinzenalmente, em cada ponto, totalizando 50 amostras de gua bruta

superficial e 50 amostras de esgoto bruto de Janeiro a Dezembro de 2013.

Quadro 3. Caractersticas e localizao dos pontos de coleta utilizados no estudo.

Municpio Tipo de amostra Descrio Localizao

geo-referenciada

So

Loure

no

da

Ser

ra

gua bruta

superficial

P1A-Rio So Loureno da

Serra

23517.82S

465638.97O

Esgoto bruto

P1E- Esgoto bruto gerado na

cidade de So Loureno da

Serra

235123.78S

465717.13O

Tab

oo

da

Ser

ra gua bruta

superficial

P2A-Reservatrio do

Guarapiranga, prximo da

barragem junto da captao

234017.60

464337.54O

Esgoto bruto

P2E-PV situado na Rua

Oshiaru Ogawa, esquina

com a Avenida Armando de

Andrade Centro

233624.93S

46464.27O

Fonte: Google Earth, https://earth.google.com

As coletas foram realizadas pela Diviso de Amostragem da CETESB, seguindo os

procedimentos do Guia Nacional de Coleta e Preservao de Amostras (CETESB, 2011),

as amostras foram transportadas sob refrigerao e processadas dentro do perodo de 24

horas. Os pontos de amostragem esto representados nas Figuras 1 e 2.

https://earth.google.com/

Material e Mtodos 51

Figura 1. Rio So Loureno da Serra (P1A)(A); Ponto de captao do esgoto bruto (P1E)

gerado na cidade de So Loureno da Serra (B). Fonte: Laboratrio de Biologia Ambiental

do Departamento de Sade Ambiental/USP.

Figura 2. Reservatrio do Guarapiranga (P2A) prximo ao ponto de captao (A); Poo

vertical utilizado na coleta do esgoto bruto (P2E) de Taboo da Serra (B). Fonte:

Laboratrio de Biologia Ambiental do Departamento de Sade Ambiental/USP.

A concentrao foi realizada em colaborao com o Laboratrio de Anlises

Biolgicas do Departamento de Sade Ambiental da Faculdade de Sade Pblica da

Universidade de So Paulo, e imediatamente encaminhada ao Laboratrio de Sade

Pblica da Faculdade de Sade Pblica da USP, para anlise molecular.

A B

B A

Material e Mtodos 52

3.2. Procedimento para concentrao das amostras

3.2.1 gua bruta superficial

Em cada ponto de captao foram coletados 20L de gua bruta superficial. No total,

50 amostras foram concentradas para as anlises, sendo: 25 amostras pertencentes ao ponto

P1A e 25 amostras ao P2A. As amostras foram processadas pelo Mtodo 1623.1 (Anexo 1)

conforme preconizado pela Agncia Ambiental Americana (USEPA, 2012). Os oocistos

foram concentrados atravs do sistema Filta-Max e purificados por separao

imunomagnt