Quantitativer Nachweis des Urobilinogens im Blutplasma

Acta Medica Scandinavica. Vol. XCVI, fasc. 11-IV, 1938.

Aus dem Krankenhaus am Coolsingel, Rotterdam. (Direktor: Dr. S. A. Westra.)

Quantitativer Nachweis des Urobilinogens im Blutplasma.

Von

Dr. C. J. ROOS.

Bei der Redaktion am 27 April 1938, eingegangen.

Im Harn und im Kot werden Urobilin und sein Mutterstoff, das Urobilinogen, meistens neben einander gefunden in verschiedenen Verhaltnissen (Heilmeyer). Durch Reduktion kann das Urobilin in Urobilinogen ubergehen, wahrend umgekehrt durch Oxydation eine Umsetzung von Urobilinogen in Urobilin stattfindet. Im allgemeinen verwendet man zum Nachweis von Uro- bilin die Fluoreszenz seines Zinksalzes, welches man durch Ver- setzung mit dem Schlesingerschen Reagens erhalt. Ausserdem kann man hier den Absorptionsstreifen beobachten, der im Spek- trum durch das Zinksalz entsteht. Zum Nachweis von Urobili- nogen benutzt man die rote Farbe, die durch Kondensation des Urobilinogens mit dem Ehrlichschen Aldehydreagens auftritt.

Beide Reaktionen werden gebraucht zur quantitativen Uro- bilin- und Urobilinogenbestimmung. Seitdem man die Unter- suchungen von Charnas und von Terwen kennt, zieht man meistens diejenige Reaktion vor, die sich der Eigenschaft des Urobilinogens bedient.

Die quantitative Urobilinbestimmung hat namlich verschiedene Beschwerden:

1) Urobilin ist eine besonders labile Verbindung, bei der durch die geringste Einwirkung ein Verlust an Material stattfindet

QUANTITATIVER NACBWEIS DES UROBILINOCENS IM BLUTPLASMA. 141

(z. B. schon bei der meistens notwendigen Oxydation von vorge- bildeten Urobilinogen zu Urobilin).

2) Urobilinprtiparate von verschiedenen Wntersuchern haben eine ganz verschiedene Fluoreszenzkraft. Heilmeyer bewies, dass die quantitativen Absorptionsspektra dieser Praparate nicht ganz gleich waren. Die Spektra stimmten eben nicht ganz, wenn er in genau derselben Weise aus demselben Urobilinogenpraparat Urobilin herstellte.

3) Die Urobilinreaktion ist eine Gruppenreaktion, die, wie Fischer bewiesen hat, durch eine Reihe Pyrrolderivate entsteht. Die Fluoreszenzreaktion ist also nicht spezifisch. Ausserdem haben Heilmeyer und Ohlig bei einer vergleichenden Untersuchung des quantitativen Absorptionsspektrums und der Fluoreszenz von dem mit Schlesingerschen Reagens enteiweissten Serumfiltraten gefunden, dass in manchen Fallen ein Teil der Fluoreszenz nicht von Urobilin verursacht werden kann.

Demgegeniiber stehen einige Vorziige der quantitativen Uro- bilinogenbestimmung. Die Aldehydreaktion ist auch eine Gruppen- reaktion einiger Pyrrolderivate, aber wegen der besonderen Me- thode von Terwen werden einzelne von der Mitbestimmung ausgeschlossen. Obwohl es ganz unsicher ist, dass das, was wir Uro- bilinogen nennen, immer ein und derselbe Stoff ist, und die Iden- titat von dJrobilinogen, und nStercobilinogen, zweifelhaft ist (siehe Fischer und Orth: ))Die Chemie des Pyrrols,, Leipzig 1937), ist doch das quantitative Absorptionsspektrum der Kondensa- tionsprodukte dieser Stoffe mit dem Aldehydreagens immer das- selbe, unabhangig vom Ausgangsmaterial (Heilmeyer). Ein an- derer Vorteil der Urobilinogenbestimmung ist die einfache Ver- gleichbarkeit der Farbstofflosung, entstanden bei der Aldehyd- reaktion, mit einer geeigneten Vergleichungslosung im Auten- riethkolorimeter. Die Beurteilung der Fluoreszenzstarke bei der Urobilinbestimmung bleibt eine ziemlich rohe Schltzung, oder man muss eine teuere Aparatur zur Verfiigung haben, die viele klinische Laboratorien sich nicht leisten konnen.

Verschiedene Untersucher haben quantitative Urobilinbestim- mungen im Blutserum ausgearbeitet, die auf die Fluoreszenz- reaktion mit dem Schlesingerschen Reagens beruhen. Wegen der oben erwahnten Griinde schien es uns wichtig, eine quantitative Methode zu besitzen, die sich auf die Eigenschaft des Urobilinogens

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stutzt, mit dem Ehrlichschen Reagens ein gefarbtes Kondensa- tionsprodukt zu liefern. Eine derartige Methode hat noch einen anderen Vorteil. Nach der Literatur zu urteilen (u. a. Schlesinger, Steensma), kommt im Blut wahrscheinlich nur Urobilinogen vor und kein Urobilin. Unsere Untersuchungen fuhrten uns zu demselben Resultat. Die obenerwahnten Ungenauigkeiten verbunden an der Oxydation des Urobilinogens zu Urobilin konnen bei einer direkten Urobilinogenbestimmung vermieden werden.

Bis heute hatte man keine Methode, rnit welcher quantitativ das Urobilinogen im Blut nachgewiesen werden konnte. Wohl gelang es einigen Forschern (u. a. Hildebrandt, Farmer Loeb) das Urobilinogen mittels des Ehrlichschen Aldehydreagens im Serum nachzuweisen. Unser Streben war darauf gerichtet, eine quantitative Methode zu finden, rnit der man Urobilinogen im Blut nach- weist. Dabei wollten wir uns moglichst eng an die vortreffliche Arbeitsweise von Terwen, zur quantitativen Urobilinogen- bestimmung im Harn und Kot, anschliessen.

Terwen reduziert mittels Natronlauge und Mohr’s Salz das eventuell im Harn oder im Kot anwesende Urobilin zu Urobili- nogen, indem er das Gemisch einige Stunden unter Abschliessung von Luft und Licht aufbewahrt. Die uberstehende Fliissigkeit wird filtriert und das Filtrat wird nach Ansauerung mit Wein- saure rnit der doppelten Menge gereinigten Aethers extrahiert. Nach Auswaschen dieses Extraktes mit Wasser (bei der Bestim- mung im Kot ist dies unnotig) wird das p-Dimethylaminobenzal- dehydreagens zugesetzt und dann 38 %ige Salzsaure. Man schuttelt 1% Minute kraftig durch. Nun wird Wasser und eine ge- sattigte Natriumacetatlosung zugegeben; es bildet sich unter dem Aether eine wtisserige Schicht, in der sich das rotgeflrbte Kon- densationsprodukt befindet, das sich im Aether nicht lost, Die unterstehende rote Fliissigkeit lasst man abfliessen, ihre Farb- intensitat wird im Kolorimeter verglichen rnit einer Phenolphtha- lein-Standartlosung.

Durch richtiges Abschltzen der Reagenzmengen kann man das Volumen der gefarbten Endflussigkeit sehr klein halten, wodurch man auto- matisch eine mehrfache Konzentration des Urobilinogens bekommt und ein sehr geringer Urobilinogengehalt noch zu bestimmen ist. Durch Beigeben von Natriumacetat wird die oxydierende Salz-

Diese Arbeitsweise hat eine Reihe Vorzuge.

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saure durch die unschadliche Essigsaure ersetzt; das Zuviel des gelbgefarbten Aldehydreagens ist unloslich in Essigsaure und geht in die Aetherschicht iiber. Der wichtigste Vorzug dieses Ver- fahrens ist, dass die sich in Salzsaure haltenden gefarbten Kondensa- tionsprodukte von Skatol und Indol nach Zufiigen von Natrium- acetat aus der Endfliissigkeit verschwinden und so von der Mit- bestimmung ausgeschlossen werden.

Wegen des Bestehens dieses bewahrten Verfahrens beschrankte sich unsere Hauptaufgabe darauf, das Blut- oder Plasmaurobili- nogen quantitativ in eine organische Flussigkeit zu bringen, worin wir dann die Kondensation nach Tenven ausfiihren konnten.

Das Urobilinogen geht nicht 'in ein Filtrat uber, welches man erhalt, indem man Blut, Serum oder Blutplasma mit den gewohn- lichen sauren Reagenzen enteiweisst. Es hat also keinen Sinn, so ein Filtrat mit Aether zu extrahieren. Alkohol kann man nicht verwenden, weil er sich unbeschrankt mit Wasser mischt.

Darum haben wir versucht, Blut oder Oxalatplasma nach Ansauren (Urobilinogen ist nur aus sauren Losungen extrahierbar), direkt rnit organischen Fliissigkeiten, in denen das Urobilinogen loslich ist, zu extrahieren. Hierbei ist es schwierig, Emulsions- bildung wsd Koagulation zu verhiiten. Dies gelingt aber, gluck- licherweise, wenn man die richtige Extraktionsfliissigkeit in ge- eigneter Menge und eine richtige Siiurekonzentration wahlt.

Bei Gebrauch von Petrolather in zweifacher Menge erhalt man nach dem Ausschiitteln in einem Scheidetrichter eine gute Ver- teilung in zwei Schichten, jedoch, wie es sich splter herausstellte, extrahiert der Petrolather ungenugend.

Aether ist ein sehr gutes Losungsmittel fur das Urobilinogen. Bei Extraktion rnit viermal soviel Aether als Blut oder Plasma kann man Emulsionsbildung vermeiden. Ein Nachteil ist die, sei es auch geringe, Loslichkeit des Urobilins im Aether; denn fur unsere Untersuchung ist es wichtig, mit einem selectiven Extraktionsmittel fur das Urobilinogen zu arbeiten. Ein weiterer Nachteil des -4ethers ist die rote Farbe des Blutextraktes und die gelbe des Plasma- extraktes. Um zuverlassige Ergebnisse zu erhalten, darf man nicht ein Extraktionsmittel beniitzen, das Farbstoffe mit auszieht, auch wenn diese keinen grossen Einfluss auf die Vergleichbarkeit der Endflussigkeit haben.

Darum haben wir als Extraktionsmittel vorliiufig Tetrachlor-

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kohlenstoff gewahlt. Genau wie Terwen habe ich feststellen konnen, dass das Urobilin sich hierin nicht lost. Beim Ausschiitteln von Blut oder Plasma rnit der doppelten Menge Tetrachlorkohlen- stoff tritt eine gute Trennung in zwei Schichten auf und in beiden Fallen erhiilt man einen farblosen, klaren und eiweissfreien Aus- zug. Wenn man die richtige Menge SAure verwendet, bleibt das Blut oder das Plasma fliissig, sodass man, falls es notig sein sollte, die Extraktion auf dieselbe Weise, beliebig oft, wiederholen kann.

Tetrachlorkohlenstoff ist fur das Urobilinogen ein etwas weniger gutes Losungsmittel als Aether, die Kondensation gelingt im Tetrachlorkohlenstoffmilieu ebensogut wie im Aether. Dies bewiesen eine Reihe Untersuchungen mit Urobilinogenhaltigem Harn, von dem. eine Portion extrahiert wurde, indem man sie einmal ausschiittelte rnit Aether und dann die Bestimmung nach Terwen ausfiihrte und von dem eine andere Portion einmal aus- geschuttelt wurde rnit Tetrachlorkohlenstoff, wonach man die Be- stimmung ausfiihrte nach der untenstehenden Beschreibung. Der gefundene Urobilinogengehalt bei Verwendung von Tetrachlor- kohlenstoff war immer etwas niedriger als beim Gebrauch von Aether. Der Unterschied war maximal 10 %. Vergleichende Be- stimmungen in wasserigen Urobilinogenlosungen (nach der Vor- schrift von Terwen aus Kot bereitet) gaben jedoch keine deutliche Unterschiede. Darum glaubten wir Tetrachlorkohlenstoff als ein geniigendes Extraktionsmittel betrachten zu diirfen und sind zu Versuchen rnit Blut und Plasma iibergegangen. Schliesslich erhielten wir eine Methode, rnit der es gelingt, alles oder fast alles Urobilinogen aus Blutplasma oder Blutserum zu extrahieren. Die quantitative Extraktion von Blut gelang uns aber nicht. Dies werden wir unten erlautern.

Vorschrift zur Besfimmung von Urobilinogen in Blutplasma und Blutser urn.

Plasma wird erhalten durch Abzentrifugieren von Oxalblut (1 Tropfen 20 % Kaliumoxalat auf 10 cm3 Blut). Das Plasma darf nicht hholytisch sein. Ein Teil Plasma oder Serum wird in einen Scheidetrichter pipettiert und versetzt rnit Teil 6 % Essig- saure. Die Reaktion des Plasma wird hierdurch immer geniigend sauer. Nun werden zwei Teile Tetrachlorkohlenstoff zugefugt

QUANTITATIVER NACBWEIS D ES UROBILINOCENS IY BLUTPLASMA. 145

und man schiittelt s/z-l1/2 Minute sehr kriiftig. (Zur Vermeidung von Emulsionen ist es von grosser Wichtigkeit, dass man mit kriiftigen, kurzen Bewegungen schiittelt, ab und zu das Schiitteln einen Augenblick unterbricht, und dann das Tempo ein wenig andert.)

Nachdem die Scheidung der Fliissigkeitsschichten stattgefunden hat, lasst man den Tetrachlorkohlenstoff sofort auf einen Filter abfliessen, der in einem Trichter auf ein Messglas gestellt ist. Dieses Verfahren ist meistens von Nutzen um den Auszug von der wenigen Triibung zu befreien. Das Volumen dieses klaren und im allgemeinen ganz farblosen Filtrates wird abgelesen. Den Inhalt des Messglases schiittet man in einen trockenen, sauberen Scheide- trichter. Jetzt setzt man eine Messerspitze trockenes Aldehyd zu, und schiittelt ein paar Ma1 um, damit das Reagens sich lost. Dann gibt man 10 Tropfen reine 38 %ige Salzsaure hinzu, und schiittelt sofort 1% Minute kraftig durch. Nun spritzt man etwas destil- liertes Wasser zu, schiittelt durch, setzt 3 cms geslttigte Natrium- acetatlosung zu und schuttelt wieder. Im Trichter bilden sich nun zwei Schichten; oben befindet sich die rotgefarbte Endflussigkeit und unten der farblose Tetrachlorkohlenstoff. Die Tetrachlor- kohlenstoffschicht lasst man in einen dritten Scheidetrichter abfliessen und befreit sie mit etwas Wasser von den Farbstoffresten. Den Tetrachlorkohlenstoff kann man ablaufen lassen. [Man kann auch, zur Kontrolle, hiervon ein wenig mit dem Schlesingerschen Reagenz und Tt. Jodii auf Fluoreszenz untersuchen. Falls diese Reaktion positiv ist (nur bei grossem Urobilinogengehalt des Plasmas) wiederholt man die Kondensation mit dem Aldehyd- reagens und fugt die gefarbte Endfliissigkeit der ersten Kondensa- tion hinzu.] Zu der meistens etwas triiben Endflussigkeit fugt man ungefiihr 100 cms Aether hinzu und schiittelt einige Augenblicke. Die jetzt klare Farblosung lasst man in ein Messglas abfliessen. Der Aether wird in den Scheidetrichter abgelassen, worin sich das Waschwasser des Tetrachlorkohlenstoffs befindet. Man schuttelt wieder und fiigt die wasserige untere Schicht zu der Endfliis- sigkeit im Messglas. Das Volumen wird abgelesen. Die gefarbte Losung wird mit der Vergleichsfliissigkeit im Kolorimeter verglichen .

D i e Vergleichsfliissigkeit von der Starke einer Einheit nach Terwen (0.4 mg Urobilinogen in 100 cc) wird hergestellt indem

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man 10 cc einer 0.005 %igen Phenolphthaleinlosung in Alkohol, pipettiert in einen Messkolben von 100 cc. Man fiigt ungefahr 50 cc dest. Wasser hinzu und 10 cc 10 %iges wasserfreies Natriumcarbonat. Jetzt wird bis zum Strich rnit destilliertem Was- ser beigefiillt. Die Losung, die taglich frisch hergestellt wird, tu t man in den Keil des Autenriethschen Kolorimeters; die Endflus- sigkeit kommt in die Kiivette.

Zum Vergleichen einer schwach gefarbten Endflussigkeit kann man durch Gebrauch von weniger Stocklosung die Vergleichs- losung nach belieben weniger stark machen.

Die Berechnung des Urobilinogengehalts im Plasma oder im Serum geschieht indem man die Verdunnungen berechnet, die wahrend der Arbeit gemacht worden sind.

Also: Vol. Tetra Vol. Endfl. 100-Kol. Wert

X Vol. Plasma Vol. Extrakt xEinheiten d. Ver-

gleichsl. =Urobilinogengehalt des Plasmas in Einh.

Mit Hilfe dieser Methode sind wir zur Studierung folgender Fragen ubergegangen.

100

Extrahiert man mit Tetrachlorkohlenstof f wirklich Urobilinogen aus Blutplasma?

Weil die Aldehydreaktion eine Gruppenreaktion ist, darf man wegen des Auftretens einer roten Farbe nach der Kondensation noch nicht auf das Vorhandensein von Urobilinogen schliessen. Wegen der kleinen Menge Blut woriiber man verfugen kann und wegen der meistens niedrigen Konzentration des Urobilinogens im Blut, wird es nicht leicht gelingen, hieraus eine, zur Identifikation genugende Menge Urobilinogen zu isolieren. Leichter gelingt die Isolation des Urobilins, nach Oxydation des Urobilinogens:

Es wurden 300cm3 Plasma von einem Patienten rnit Coma Hepaticum (Urobilinogengehalt nach unserem Verfahren 14 E) mit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Der Auszug wurde mit lll0 N Natronlauge geschuttelt und diese alkalische Losung einige Male rnit Petrolather ausgewaschen, dann wurde angesauert und rnit Petrolather extrahiert. Dieses Extrakt wurde ofters mit

QUANTITATIVER NACHWEIS D E S U R O B I L I N O G E N S I M BLUTPLASIYIA. 147 Wasser ausgewaschen und iiber Kalziumchlorid getrocknet. Die Petrolatherlosung wurde in diffusem Tageslicht in einem geschlos- senen Kolben aufbewahrt. Im Laufe der folgenden Tage sank ein wenig feines, orangebraunes Pulver zu Boden, das so fest an der Wand klebte, dass es nicht mehr zu entfernen war. Die Aldehyd- reaktion der Flussigkeit, die vorher sehr intensiv war, wurde allmahlich negativ. Der Niederschlag wurde in ein wenig Alkohol gelost. Es hatte einen Streifen auf der Urobilinstelle im Spektrum, indem durch abwechselndes Ansauren und Alkalisieren das saure in das alkalische Spektrum iiberging. Die alkoholische Losung gab direkt eine sehr starke Fluoreszenzreaktion mit dem Schle- singerschen Reagens.

Mit den Petrolatherextrakten, auf der erwahnten Weise bereitet, kann man noch zwei Reaktionen ausfiihren, die fur das Urobilinogen ziemlich spezifisch sein sollen.

So gelang es mir einmal in einem Alkaliextrakt einer nach oben erwhhnten Weise bereiteten Petrolatherlosung das nach Fischer und Meyer-Betz karakteristische dreistreifige Absorptionsspek- trum des violetten Urobilinogen-Kupfersalzes herzustellen. Die Streifen lagen innerhalb der von Fischer angegebenen Grenzen, und stimmten iiberein rnit denen von einem Kotextrakt, das auf genau dieselbe Weise bereitet worden war.

Wenn man ein derartiges alkalischen Extrakt einige Tage in diffusem Tageslicht aufbewahrt, bis die Aldehydreaktion negativ geworden ist, kann man mit der so entstandenen &Jrobilindosung eine von Terwen angegebene und von ihm spezifisch genannte Reaktion ausfiihren. Nach Neutralisation wird mit Kupferacetat und Chloroform geschuttelt. Die zu erst rote Chloroformschicht wird beim Stehen in den folgenden Tagen allmahlich violett und ein dreistreifiges Absorptionsspektrum wird sichtbar. Es ist mir einmal gelungen rnit einem aus Plasma bereiteten Extrakt auf diese Weise ein positives Ergebnis zu erlangen, wobei die Streifen innerhalb der von Terwen angegebenen Grenzen lagen.

Diese Reaktionen sprechen sehr fur die Anwesenheit von Urobilinogen in den auf diese Art untersuchten Plasmata. Es gibt noch einzelne andere Argumente, dass wirklich Urobilinogen im Blut vorhanden sein kann. Beziiglich des Absorptionsstreifens und der verschiedenen chemischen Eigenschaften gleicht die rote Endflussigkeit, die wir nach der Kondensation in Plasmaextrakten

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oft erhielten, vollkommen den Farbstofflosungen. die wir genau so aus Urobilinogenhaltigem Harn und Kot bereiteten.

Als die Endflussigkeit, die wir aus einem Plasmaextrakt erhielten, rotgefarbt war, konnten wir immer in einem anderen Teil desselben Extraktes Fluoreszenz und einen Urobilinzinksalz- streifen erhalten mit der Schlesingerschen Reagens und Jodtinktur. Zwischen dem Urobilinogengehalt von Plasma und Harn fand ich immer eine Parallele, sodass ich nie eine positive Reaktion im Plasma fand, falls nicht zugleich das Urobilinogengehalt des Harnes bedeutend erhoht war. (Einige Falle von chronischer Nephritis bildeten auf diese Regel eine erkllirliche Ausnahme).

Schliesslich darf man also sagen, dass die Stoffe, die nach unserem Verfahren aus Blut oder Plasma extrahiert werden, eine Reihe Reaktionen geben, die vollkommen den Reaktionen glei- chen, die man mit Extrakten aus Harn und Kot anstellen kann. Sie gelten als genugender Beweis, fur die Anwesenheit von Uro- bilinogen in diesen Exkreten. Es ist deshalb ziemlich sicher, dass Urobilinogen im Blut vorhanden sein kann.

Werden mit dem Urobilinogen andere Sioffe mitbestimmt?

Die Aldehydreaktion ist eine Gruppenreaktion, die verschiedene Pyrrolderivate geben konnen. Von verschiedenen in Frage kommenden Pyrrolderivaten wissen wir aber, dass sie nicht mitbestimmt werden. Hhoglobin und Bilirubin geben die Aldehyd- reaktion nicht. Terwen hat bewiesen, dass durch die Umsetzung der salzsauren Reaktion der Endflussigkeit mittels Natriumacetat in eine essigsaure, die Kondensationsprodukte von Skaiol und Indol aus dieser Flussigkeit verschwinden; folglich konnen sie die Bestimmung nicht storen. Ich fand, dass das im salzsauren Milieu lilarote Kondensationsprodukt von Tryptophan nach Ver- setzen mit Natriumacetat farblos ist. Das eventuelle Erscheinen von freiem Tryptophan im Blut ist also fur uns nicht wichtig. Weil unsere Extrakte eiweissfrei sind, kann das an Eimeiss ge- bundene Trypthophan uns auch nicht storen. Porphyrin geht aus einer Losung (hergestellt aus Kot nach Vorschrift von Fischer) in nicht nachweisbarer Menge in Tetrachlorkohlenstoff iiber, wenig- stens wenn die Konzentration des Porphyrins nicht sehr hoch ist.

Folglich konnen wir verschiedene Pyrrolderivate von der Mit-

QUANTITATIVER NACHWEIS DES UROBILINOCENS III BLUTPLASMA. 149

bestimmung ausschliessen. Es bleibt natiirlich denkbar, dass es noch andere Korper geben konnte, die imstande sind rnit dem Aldehyd zu reagieren. Das stets negative Ergebnis der Reaktion im Plasma bei nicht erhohter Urobilinogenurie beruhigt uns aber in dieser Hinsicht sehr.

Wird mit dem erwihnten Verfahren alles Urobilinogen bestimmt? Durch Anderungen in der Sauremenge und in der Zeitspanne

des Schiittelns, kamen wir zu dem Ergebnis, dass wir rnit unserem Verfahren tatsachlich die maximale Menge Urobilinogen aus dem Plasma extrahierten. Es bleibt die Frage, ob man auf diese Weise auch alles Urobilinogen entfernt. Zur Beantwortung dieser Frage wurde eine Reihe Experimente gemacht.

Extraktion von Plasma mit der vierfachen Menge Tetrachlor- kohlenstoff an Stelle einer zweifachen Menge ergab keinen hoheren Urobilinogenwert.

ofters haben wir zum Plasma, das absolut kein Urobilinogen zu enthalten schien, eine wasserige Urobilinogenlosung hinzuge- fiigt. Mit unserem Verfahren fanden wir dann in diesem Plasma einen Urobilinogengehalt, der genau mit dem Gehalt stimmte, welchen wir nach der Bestimmung in der wasserigen Losung hiitten finden miissen. Dieselben Bestimmungen wurden auch beim Ge- brauch von Aether als Extraktionsmittel getroffen; sie ergaben genau dieselben Resultaten und stimmten auch sehr gut iiberein mit den mit Tetrachlorkohlenstoff erhaltenen Werten.

Theoretisch miisste das Plasma kein Urobilinogen mehr enthalten, wenn durch einmalige Extraktion alles Urobilinogen daraus beseitigt ware. Da aber nach der Trennung immer ein Ted( f 15 yo) des Tetrachlorkohlenstoffs in der Plasmaschicht zuriickbleibt, ist dies nicht gut zu beweisen. Durch kriiftiges Zentrifugieren gelingt es aber ziemlich gut die Reste Tetrachlorkohlenstoff aus dem Plasma zu entfernen. In dem extrahierten und zentrifugierten Plasma fallt die Schlesingersche Reaktion meistens negativ aus. Nur wenn das Plasma sehr vie1 Urobilinogen enthielt war diese Reaktion wohl ma1 schwach positiv (nur nach Oxydation).

Man kann auch nach der Extraktion einen Teil des Tetra- chlorkohlenstoffes im Scheidetrichter zuriicklassen, eine zweite Portion hinzufiigen und nochmals extrahieren. Im zweiten Extrakt

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fand ich wiederholt einen Urobilinogengehalt, ungefahr iiberein- stimmend mit der Annahme einer vollst3ndigen Entfernung des Urobilinogens durch die erste Extraktion.

Schliesslich habe ich durch wiederholte Extraktion das Plasma vollig erschopft und den Urobilinogengehalt der vereinten Aus- ziige bestimmt. So fand ich einen Gehalt von 2.16 E nach einmali- ger Extraktion und nach dreimaliger, erschopfender Extraktion 2.25 E. Grosse Vorteile hat also eine mehrmalige Extraktion nicht.

Aus der Summe dieser Versuche machte ich die Schlussfolge- rung, dass man durch einmaliges Extrahieren nach der angegebenen Vorschrift praktisch alles Urobilinogen extrahiert. Nur bleibt die Moglichkeit des Bestehens einer nicht-extrahierbaren Urobilinogenfraktion offen. Weiter stellen wir fest, dass man mit Serum dieselben Ergebnisse erhalt als rnit Plasma und dass beide stammend aus demselben Blut, denselben Urobilinogengehalt haben.

Demgegenuber haben wir aber festgestellen miissen, dass es nichf gelingt aus dem Blut das Urobilinogen vollstandig zu extrahieren.

Von einer dem Blute zugesetzten Urobilinogenlosung bekannten Gehaltes findet man immer nur einen Teil zuriick. Bei einer zweiten Extraktion verhalt sich das Blut, als ob alles Urobilinogen bei der ersten Extraktion entfernt worden ware. Zusetzung kleiner Mengen gewaschener Erythrozyten haben schon eine bedeutende Senkung des scheinbaren Urobilinogengehalts eines Plasmas zur Folge. Der gefundene Urobilinogengehalt eines Blutes ist bedeutend niedriger als die Urobilinogenkonzentration seines Plasmas, auch als man, bei der Annahme eines Urobilinogenfreiseins der Blutkorperchen, eine Korrektion fur das Erythrozytenvolumen macht. Mischt man Blut rnit einer Urobilinogenlosung, so findet man nach dem Zentrifugieren alles zugefugte Urobilinogen im Plasma zuriick. Die Erythrozyten haben also kein Urobilinogen gebunden.

Dieses bis jetzt nicht erklarte Verhalten des Blutes ist nicht gebunden an die intakten Erythrozyten. Hamolysiertes Blut und hinzugesetzte Hamoglobinlosungen verhalten sich genau so.

Interessant ist es, dass Schlesinger und spater Steensma auch eine storende Wirkung der Erythrozyten beim Enteiweissen des Blutes rnit Alkohol zum Nachweis des Urobilins mit Zinkacetat fanden.

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Q U A N T I T A T I V E R NACEWEIS DES U R O B I L I N O G E N S I M BLUTPLASMA. 151

Isf neben dem Urobilinogen im Blutplasma Urobilin nachweisbar?

Bei fast jeder Urobilinogenbestimmung wurde ein kleiner Teil des Plasmas enteiweisst mit dem Schlesingerschen Reagens. Im Filtrat konnte ich nie Fluoreszenz nachweisen. Sie erschien in vielen Fallen, aber nicht bevor man das Filtrat einige Stunden aufbewahrt hatte, oder sofort, wenn man einen Tropfen Jodtinktur hinzusetzte. Dieser Befund ist nicht neu, doch ist er immer von allen Autoren, die darauf geachtet haben, bestatigt worden. Auch in dem vorher extrahierten Plasma konnte ich nie eine sofort positive Schlesinger-Reaktion nachweisen.

Sehr iiberrascht hat uns der Befund, dass man Blut oder Plasma ruhig stundenlang im Tageslicht aufbewahren kann bevor man die Urobilinogenbestimmung vornimmt. Der Urobilinogengehalt geht nicht zuruck, Urobilinbildung konnte nie nachgewiesen werden. Eine mit Blut oder Plasma versetzte Urobilinogenlosung bleibt stundenlang unverandert, wahrend sich in der wassrigen Losung in derselben Zeit schon vie1 Urobilin gebildet hat. Es ist also sehr wahrscheinlich, dass sich im Blut ein Stoff befindet, der die Oxydation des Urobilinogens hemmt. Es ist uns nichtgelungen, mit Hilfe von Blut, Urobilin zu Urobilinogen zu reduzieren.

Nach Beendigung dieser Versuche, als wir also wussten, dass wir rnit Hilfe des Tetrachlorkohlenstoffes nach unserem Verfahren das Urobilinogen im Plasma und im Serum bestimmen konnen, haben wir eine Extraktionsweise mit Aether ausgearbeitet, die dieselben Resultate hat wie die Extraktion mit Tetrachlorkohlen- stoff. Wir machten diese Versuche mit Aether erstens, weil wir uns moglichst eng an das Terwensche Verfahren anschliessen wollten und zweitens, weil das Arbeiten rnit Aether gewisse technische Vorteile hat.

Dte Vorschriff fur die Aefherexfraktion ist:

Versetzung des Plasmas (oder des Serums) im Scheidetrichter mit 1/3 Teil 6 %iger Essigsaure und 4 Teilen Aether (nach der Terwenschen Vorschrift gereinigt). Kraftig schiitteln wahrend ,1/2-11/2 Minute. Nach der Trennung in zwei Schichten lasst man das Plasma abfliessen und schuttet den Aether in ein Messgerat. Weiter wird genau nach der Terwenschen Vorschrift gearbeitet.

152 C. J. ROOS.

Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse einer Reihe vergleichender Bestimmungen mit Hilfe von Aether und Tetrachlorkohlenstoff im Blutplasma.

Besfimmung mit Aether 1) 0.81 E 2) 0.14 E 3) 0.094E 4) 0.27 E 5) 4.90 E 6) 0.77 E 7) 0.54 E 8) 2.12 E

Tabelle I. Besiimmung mil Teirarhlorkohlensioff

0.82 E 0.14 E 0.089 E 0.26 E 4.70 E 0.76 E 0.54 E 2.15 E

Wir schlossen aus diesen Ergebnissen, dass man auch zur Extraktion des Urobilinogens aus Plasma und Serum den Aether anwenden darf.

Klin ische Ergebn isse.

In der Tabelle I1 findet man eine Zusammenfassung der Er- gebnisse von Urobilinogenbestimmungen im Plasma und im Harn. Der Patient urinierte immer moglichst bald nach der Venenpunk- tion. Falls der Harnstoff bestimmt wurde, geschah das in einer Probe desselben Blutes und desselben Harnes, in dem das Uro- bilinogen bestimmt wurde.

Einige Male wird berichtet, dass nur eine Spur Urobilinogen gefunden wurde. Damit wollen wir sagen, dass die Endfliissigkeit, dessen Volumen moglichst klein (f 5 cc) gehalten wurde 1, so schwach rosafarben war, dass ein Vergleich mit einer Standart- losung nicht gut mehr moglich war.

Wir 'haben die ungefiihre Untergrenze der Genauigkeit unseres Verfahren festgelegt. Ich konnte bei Verwendung einer Wenol- phthaleinstandartlosung von 0.4 E die Farbengleichheit bis an den Schalwert 75 des Kolorimeters ziemlich genau ablesen. Hieraus kann man berechnen, dass man bei Gebrauch von 20 cm* Plasma eine Urobilinogenkonzentration bis an 0.03 E bestimmen kann.

l Zu erreichen durch z. B. 5 Tropfen Salzslure und 1 % cc Natrium- acetat zu verwenden.

Q U A N T I T A T I V E R NACHWEIS D E S U R O B I L I N O G E N S IY BLUTPLASMA. 153

Weil nach Terwen eine Einheit 0.4 mg in 100 cc ist, bedeutet dies, dass wir in 20 ems Plasma 0.0024 mg Urobilinogen noch bestimmen konnen.

Betrachten wir die Tabelle 11, so sehen wir, dass in fast allen Fallen nur dann Urobilinogen im Plasma gefunden wird, wenn der Urobilinogengehalt im Harn bedeutend erhoht ist. Bei vielen Patienten mit wenig Urobilinogen im Harn, fand ich kein Uro- bilinogen im Plasma (sind nicht in der Tabelle aufgezeichnet). Eine Ausnahme bilden die Falle 5, 6, 7 und 43. Es sind alles Pa- tienten mit chronischer Nephritis, Uramie und Herzdekompensa- tion. Sie hatten im Vergleich mit dem Urobilinogengehalt des Harnes viel zu viel Urobilinogen im Plasma oder im Serum. Dem- gegeniiber fanden wir bei verschiedenen Kranken rnit chronischer Nephritis, UrYmie, doch ohne Herzdekompensation, wenig Uro- bilinogen im Harn und keines im Plasma.

Die Falle 10, 14, 15 und 25 hatten einen totalen oder einen subtotalen Verschlussikterus. Im Uebereinstimmung rnit der enterogenen Theorie der Urobilinogenbildung war im Plasma und im Harn kein Urobilinogen nachweisbar.

Der Fall 8 ist im dieser Hinsicht interessant. Der Kranke war sehr ikterisch und hatte eine erhohte Urobilinogenurie: im Plasma war wenig Urobilinogen. Die Gelbsucht nahm zu und nach wenigen Tagen hatte der Urobilinogengehalt des Harnes sehr abgenommen und im Plasma konnte ich kein Urobilinogen mehr nachweisen. Dann verminderte die Intensitat des Ikterus und jetzt erhielten Plasma und Harn sehr viel Urobilinogen. 10 Tage spater war die Gelbsucht fast verschwunden; die Urobilinogenurie war vermindert und die Urobilinogenamie hatte sehr abgenommen.

Der Kranke rnit krupposer Pneumonie (29) hatte vor der Krise sehr viel Urobilinogen im Plasma und im Harn. Kurz nach der Krise war die Urobilinogenamie schon stark vermindert; die Uro- bilinogenurie nahm in den ersten Tagen noch zu. Man konnte den Eindruck gewinnen, dass wahrend der Krankheit eine Uro- bilinogenretention stattgefunden hatte.

Bei der Vergleichung des Harnstoffquotienten von Harn und Blut rnit dem des Urobilinogens von Harn und Plasma, scheint es, dass die Nieren das Urobilinogen weniger gut konzentrieren konnen als den Harnstoff. Ausnahmen bilden die Falle 8 und 16.

I 1 - Ada med. scandinav. Vol . XCVI.

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Zusammenfassung . Es wird ein Verfahren beschrieben rnit dem es gelingt, das

Urobilinogen im Blutplasma und im Blutserum mittels der Ehr- lichschen Reaktion zu bestimmen. Das Plasma wird nach An- sauren rnit Aether oder rnit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Blut kann nicht als Ausgangsmaterial benutzt werden, da die Erythrozyten und das Hamoglobin eine vollstandige Extraktion verhindern. Im Plasma ist kein praformiertes Urobilin nachzuweisen. Die Umsetzung des UrobMnogens in Urobilin wird durch Blut und Plasma sehr gehemmt. Man braucht daher eine Uro- bilinogenbestimmung in diesen Materialen nicht sofort vorzu- nehmen.

Die klinischen Ergebnisse lehrten, dass bei geringer Urobili- nogenurie kein Urobilinogen im Plasma nachzuweisen ist. Einige Faille von chronischer Nephritis rnit Uramie und mif Herzdekom- pensation zeigten aber wohl eine Urobilinogenamie bei niedriger Urobilinogenurie. Bei chronischer Nephritis mit Uramie ohne Herzdekompensation fanden wir kein Urobilinogen im Plasma. Bei allen Kranken mit vie1 Urobilinogen im Harn wurde Urobi- linogen im Plasma gefunden. Beim totalen Verschlussikterus konnte im Plasma nie Urobilinogen nachgewiesen worden.

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Documents

Quantitativer Nachweis des Urobilinogens im Blutplasma