1

E.. FEN FAKLTES Prof. Dr. Zeki Topu E. . Eczaclk Fakltesi zmir Giri

Rekombinant DNA teknolojisi genetik bilginin bir organizmadan dierine aktarlmasn salayan eitli deneysel protokolleri ierisine alan olduka geni bir terimdir. Bu amaca ulamay salayacak tek bir metodoloji seti bulunmamakla birlikte tipik bir rekombinant DNA almas u genel format takip eder (ekil 1); lgilenilen hedef DNA (insert DNA) verici organizmadan izole edilerek enzimatik olarak

krlr ve klonlama vektr olarak tanmlanan baka bir DNA moleklne balanarak rekombinant DNA oluturulur.

Klonlama vektr ve hedef DNA dan oluan yap konak bir hcreye transforme edilerek orada oalmas salanr (transformasyon).

Rekombinant DNA'y alan transforme olmu hcreler belirlenerek dierlerinden izole edilir. stee bal olarak, rekombinant DNA moleklnn kodlad protein rnnn konaklama

hcresince retimini kontrol amacyla maniple edilebilir.

ekil 1. Rekombinant DNA almasnda yer alan basamaklar. Gen ekspressiyonunun dzenlenmesi konusundaki bilgilerimizin nemli bir blm

DNA, RNA ve protein molekllerinin yaplarnn maniple/modifiye edilebilmesiyle elde edilmitir. Bu teknoloji aratrmaclara genleri izole etme ve konak bir organizmada oaltarak retme imkann salamtr. Bunun yannda rekombinant DNA teknolojisi bilim adamlarna genetik yapy istenilen rnleri oluturmak zere deitirme olanan verir. Blgesel yada ynl mutasyon teknikleri biyolojik molekllerin ilev snrlarn zorlarken bu teknoloji ile biyokimyasal almalarda genellikle almas g bir sorun olan miktarca az proteinlerin saflatrlmas ve amino asit dizilerinin belirlenmesi gl ortadan kalkmtr.

2

Dr. Zeki Topu

1978 de "ABD Genentech teki aratrmaclar insan inslinini kodlayan genleri izole ederek E.coli de oaltmay baardlar. E.coli hcreleri insan inslinin iki zincirini reten biyolojik fabrikalar gibi davranarak aratrmaclara retilen peptidleri saflatrp piyasada domuzdan elde edilen insline allerjik diabetler tarafndan kullanlma olanan salamtr. Bylece borsaclar ilk kez rekombinant DNA teknolojisini mitolojide kendisini sahibinin arzular dorultusunda yiyecek ve iecek ile dolduran "bereket boynuzu" nun 20. YYdaki versiyonu olarak grmeye baladlar. te yandan teknik ilerlemelerin kar engellemeler olmakszn topluma yerlemesi ok az rastlanan bir olaydr. leri blmlerde de geni olarak yer verilecei gibi bu almalarn younlamas eitli etik ve hukuksal tartmalarda gndeme getirmitir. Klonlanm organizmalarn sahiplenilmesi, almalarn evreye verebilecei muhtemel zararlar ve gvenlik gibi eitli konular, en azndan gelimi lkelerde, kayg duyulan ve sklkla sorgulanan balca konulardr. Dier birok disiplin gibi Gen teknolojisi dier bilim dallarnn salad bilgilerin amalgamasyonu ile gelime gstermitir. Bu alann mkemmellemesinde kayda deer katklar olan bilim dallar Biyokimya, Kimya Mhendislii, Mikrobiyoloji, mmunoloji, Genetik ve Enzimoloji olmutur. Bu dallar; a) nstrumentasyon olarak; Ultrasentrifj, elektron mikroskobu, elektroforez, X-n difraksiyonu, kromatografi ve DNA sentezleyicileri, b) Teknik olarak; Denaturasyon/renaturasyon, absorbans, shear degredasyonu, c) Radyoaktif izleyiciler olarak; Autoradiography, Sintilasyon sayac, d) Konu alan olarak Nkleik Asitler Enzimolojisi olmutur. Ksaca tarihsel geliimini zetlemek gerekirse, Gen teknolojilerinin gelimesinde kilometre ta olarak deerlendirilebilecek bulular 1944 te DNA nn genetik materyal olarak gsterilmesi, 1953 te Watson ve Crick tarafndan bu molekln ikili sarmal yapsnn belirlenmesi , 1973 te restriksiyon enzimlerinin izolasyonu, 1982 de ilk rekombinant ann kabul edilmesi ve 1988 de PCR metodolojisinin yaygnlamas olmutur. 1. METODOLOJ

1.1. Restriksiyonel Kesim Restriksiyon ve modifikasyon enzimleri (RE) (EC 3.1.2.1.4) ilk kez Bertani ve Weigle

tarafndan bakteriyofaj ile infekte edilen E. coli bakterisinde yaplan almalarda gzlenmi, restriksiyonel mekanizma ise Arber ve Dussoix tarafndan tanmlanmtr (Arber and Dussoix, 1962). Bu enzimler, ift sarmall DNA molekllerini zgn nkleotid tanma dizilerinden kesen endonkleazlardr.

Gnmzde, eitli organizmalardan izole edilen ok sayda RE kullanlmaktadr. E. coli den izole edilen 40 ayr zgnlkte 141 RE bulunmaktadr. Nkleotid dizisi belirlenen yaklak 30 tane RE incelendiinde, bazlarnn nemli lde homoloji gsterdikleri belirlenmitir (Meselson and Yuan, 1968). Bu enzimler etki zellikleri bakmndan Tip I, Tip II ve Tip III olarak snflandrlrlar, ancak sbstrat DNA larna zgn olmalar nedeniyle gen mhendisliinde yalnzca Tip II restriksiyon enzimleri kullanlmaktadr. Her RE, harften oluan bir ksaltma ile italik olarak belirtilir. lk harf enzimin izole edildii bakterinin cinsini, dier iki harf ise trn simgeler. Drdnc harf enzimin izole edildii suu (strain), Romen rakam ise ayn kaynaktan izole edilen ancak farkl zgnlk gsteren enzimleri ayrt etmek

iindir. RHindII: H. nfluenza bakterisinin d suundan elde edilen ikinci enzimdir. R, sz konusun enzimin modifikasyon deil, restriksiyon enzimi olduunu gsterir.

Restriksiyon enzimleri tarafndan tannan diziler genellikle yapda ve drt, alt ya da sekiz nkleotid uzunluundadrlar. ekil 2 ve 3te baz restriksiyon enzimlerinin tanma dizileri verilmitir. ekil 2 de verilen BamHI enzimi 5-, KpnI ise 3- uzantl ular olutururken SmaI

kt ulu rn vermitir. Bu palindromik dizi rneklerinde, alt zincirde 5'3' ynndeki dizi st zircirdeki 5'3' ynndeki dizi ile ayndr.

3

Dr. Zeki Topu

Restriksiyon enzimlerinin fizyolojik fonksiyonu; hcrenin yabanc DNA tayan yaplar keserek enfeksiyondan koruma eklinde bir savunma sistemi oluturmaktr. Hcrenin kendi DNA snn bu enzimler tarafndan kesilmesi ise her RE ne e bir modifikasyon enzimi

tarafndan nlenir (R Eco RI vs M Eco RI; R: restriksiyon., M: modifikasyon tipleri- rnein metilaz-). Tanma dizisindeki kritik nkleotidlerin metilasyonu RE ile DNA arasndaki etkileimi nler. Metilasyon genellikle m6A, m5C bazen de m4C pozisyonlarnda gerekleir (Linn and Arber, 1968).

ekil 2. Baz restriksiyon enzimlerinin tanma dizileri

Btn restriksiyon enzimleri aktivite iin Mg+2 iyonuna ihtiya duyarlar. EcoRI iin

Mn+2, Co+2 ve Zn+2 gibi dier divalan katyonlarn da kullanlabildii rapor edilmitir (Smith and Wilcox, 1970). Mg+2 iyonu, krlacak fosfodiester bann polarizasyonu ve/veya reaksiyon iin gerekli nkleofilin oluumu iin gerekli su molekllerinin aktivasyonunda gereklidir, ancak enzimin DNA sbstratna balanmas basamanda gerekli deildir. Bu enzimlerin katalizlerinde elektrostatik etkileimler ok nemlidir. Bir restriksiyon reaksiyonu, enzimin ya da sbstratn kovalent modifikasyonu ile inhibe edilir. Nitekim, DNA molekllerine zgn olarak balanan distamisin A, netropsin, actinomisin D, antramisin, olivomisin gibi ligandlar, karsinojenler, sitotoksik ilalar ve baz boyalar RE reaksiyonlarn inhibe ederler.

ekil 3. EcoRI restriksiyon rnleri.

Restriksiyon enzimleri sbstrat zerinde sadece tanma dizisi ile deil, daha dk

bir afinite ile non-spesifik dizilerle de etkileim gsterirler. Bir RE nin tanma ve katalitik blgeleri sbstratn farkl blgelerinde yer almaktadr.

4

Dr. Zeki Topu Restriksiyon enzimlerinin stabilitesi scaklk, tampon, enzim konsantrasyonu, eklenen

kimyasallar gibi parametrelere baldr. alma scakl aral 25-45 C arasnda deiir. ounlukla pH: 7.2-8.0 arasnda aktivite gsterirler. Reaksiyonlar stlarak ya da EDTA kullanlarak durdurulabilir. Ancak EDTA sadece katalitik aktiviteyi bloke eder, sbstrat

balamasn engellemez. Bu enzimlerin -20C de gliserol ierisinde, dondurulmadan saklanmalar gerekir. Suboptimum tampon ve yksek enzim konsantrasyonlarnda RE lerinin sbstrat zgnlkleri deiebilir. Farkl pH, dk iyon deriimi ve divalan katyon sbstitsyonu koullarnda gzlenen bu zellik enzimin yldz (star) aktivitesi olarak adlandrlr (Roulland-Dussoix and Boyer, 1969). Bu aktivite sadece suboptimal tampon koullarnda deil, ou RE iin yksek enzim konsantrasyonunda da gzlenebilmektedir. Reaksiyon ortamna spermine ve spermidine eklenmesinin bu aktiviteyi nledii rapor edilmitir (Roulland-Dussoix and Boyer, 1969). Aktivite tanm olarak genellikle, 1 g DNA

moleklnn optimum koullarda, 37 Cde, 1 saat ierisinde krlmas esas alnr. Restriksiyon enzimleri genel olarak yksek molekler arlkl DNA sbstratlar iin

dk Km parametresine sahip iken oligonkleotid sbstratlar iin bu sabit daha yksektir (Boyer, 1971, Kauc and Piekarowicz, 1978). Restriksiyon enzimlerinin bu zellii, muhtemelen sbstrat zerinde balanma blgesi ve molekler arla bal olarak DNA moleklnn gsterdii konformasyona baldr (Smith and Nathans 1973). Restriksiyon enzimlerinin kesim aktivitesi byk lde sbstrat topolojisinden bamszdr, ancak tanma blgesi yaknndaki nkleotid dizisinden etkilenirler (Wilson, 1988). Az da olsa baz RE, birden fazla kesim blgesine sahiptirler. Bu tr enzimler, birok tanma blgesine sahip olduklarndan gen manipulasyonlarnda pek kullanlmamaktadrlar. te yandan, birbirlerinin "izoimerleri" olarak adlandrlan baz enzimler gerek yapkan gerekse kt u oluturarak DNA zerinde ayn blgeyi tanrlar. Ayn nkleotid dizisini tanyan ancak farkl blgelerden kesim yapan enzimler ise neoizomerler olarak adlandrlrlar. 1.2. DNA Molekllerinin Birbirlerine Eklenmesi (Ligasyon) Ligazlar nkleik asit terminallerini fosfodiester ba oluturarak balayan enzim ailesidir. Sbstrat nkleik asit ligaz enziminin trne gre birletirilen DNA (DNA ligaz: EC 6.5.1.2) veya RNA (RNA ligaz: 6.5.1.3) olabilir. Ligaz enzimleri bakteri, maya ve memelileride kapsayan ok farkl organizmalarda bulunurlar. Bu enzimlerin in vivo fonksiyonlar replikasyon esnasnda oluan kk DNA molekllerini birletirmektir. Ayrca DNA rekombinasyonu ve tamirinde nemli rolleri vardr.

Restriksiyon kesimi sonucu oluan DNA paralar DNA ligaz enzimi kullanlarak birbirlerine eklenebilir (ekil 4). Ligaz aktivitesi iin 5'-P ve 3'-OH terminalleri iftsarmalli DNA zerinde olmaldr. Eer 5'- terminallerden sadece birtanesi fosforile ise sadece bu zincir balanr ancak bu haliylede DNA transformasyonu yaplabilir. E.coli den elde edilen ligaz NAD+, T4 faj ile enfekte edilmi bakterilerden elde edilen ligaz ise ATP varlnda aktivite gsterir. Ligaz enzimleri divalan katyonlara gereksinim duyarlar. Spermin ve spermidin gibi poliaminler tarafndan inhibe edilirler. Sadece T4 DNA ligaz kt ulu DNA molekllerini, daha az bir verimle olmak zere, birbirlerine balayabilir. ou zaman kt ular adaptr olarak adlandrlan sentetik DNA lar kullanlarak yapkan ulu hale dntrlebilir. allan DNA ularnn ligaz reaksiyonuna uygun zellik gstermedii durumlarda bavurulan bir baka yntem ise S1 nkleaz enzimi kullanlmasdr. S1 nkleaz RE lerden farkl olarak yalnzca teksarmalli DNA molekllerini kesmekte ve sbstrat zgnl gstermemektedir. S1 nkleaz ile muamele edilen DNA ular kt ulu hale dntrlebilir.

5

Dr. Zeki Topu

Restriksiyon Fragmanlarnn Ligasyonu

ekil 4. T4 DNA ligaz ile restriksiyonel fragmanlarn birbirlerine eklenmesi.

ve adaptr yntemi ile kullanl ular oluturulabilir. Gen mhendisliinde deiik DNA larn birbirlerine eklenmesinde kullanlan bir baka yntem ise "homopolymer tailing" (kuyruklama) tir. Bu yntemde terminal transferaz (TT) enziminin zelliklerinden yararlanlr. Bu enzim DNA nn 3'-ularna nkleotidleri ekleyen bir enzimdir. Terminal transferaz enzimi hernekadar kt veya 3'-ucun gizli olmas halinde reaksiyon verebiliyorsada hz ve verim dk olduu iin sz konusu DNA nce 5'3' ynnde DNA y kran exonkleaz ile 3'-uzantl hale getirilir. 2. KLONLANAN GENLERN ANALZ 2.1. Southern Blot

Bu ilemde molekler arlklarna gre agaroz jeli zerinde ayrtrlan DNA molekllerinin, sabit bir kat dzlem zerine replikas alnarak ilgilenilen genin varl test edilir. Yntem 1970 li yllarda E.M. Southern tarafndan gelitirilmitir (ekil 5). DNA moleklleri sabit dzlem olarak naylon veya nitrosellloz kada transfer edilir.

6

Dr. Zeki Topu

ekil 5. Southern blot ilem basamaklar.

Bandlarn membran zerine transferinden (Southern transfer) nce ift iplikli DNA fragmentlerinin komplementer ipliklerinin ayrlmas iin deprinasyon ve denatrasyon ilemlerinin yaplmas gerekmektedir. DNA fragmentleri, NaOH gibi bazlarla muamele edilerek denatre edilir, ift iplikli DNA bazlar arasndaki balar koparak tek iplikli hale gelir. Bu yntem ile 15 kb dan byk DNA molekllerinin transferi olduka gtr ve ok kk molekllerde de sorun yaanmaktadr. Tek zincirli halde bulunan DNA moleklleri, agoroz jelden (veya PAGE den) zerine yerletirilen bir nitroselloz veya naylon filtre kadna transfer edilir. Transfer ilemi elektrotransfer, alkali kapillarite veya dier yntemlerden biriyle kolaylkla yaplabilir. Transfer iin naylon membranlar daha salam ve birim alanda daha fazla DNA adsorbsiyonu salamas nedeniyle nitroselloz membranlara gre daha fazla tercih edilmektedirler. Membran radyoaktif ya da non-radyoaktif iaretli DNA probu ile hidridizasyona tabi tutulur. Balanmayan problarn uzaklatrlmasnn ardndan, iaretli probun baland DNA molekl/moleklleri film zerinde belirlenir.

Problar sadece filtredeki komplementerleri olan DNA ile eleerek kararl hidrojen balar olutururlar. Balanmam probun ve tek iplikli hedef DNA nn uzaklatrlmas iin filtre ykanr ve balanan probun hibridize olduu fragmentlerin yerlerini belirleme amacyla filtre zerine X-nlarna duyarl bir film kapatlarak radyoaktivitenin film zerine etkisi salanr. Bu film zerinde, iaretli problarla birlemi DNA sekanslarnn bulunduu blgeler bant olarak grlrler. Bu blgeler, istenen genin lokalize olduu yerleri ifade eder. Eer problar iaretlemede biotin kullanlmsa, kolorimetrik metotlar, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardm ile oluan renk deiiklii ve biyolminesans grntleme teknikleriyle hibridize DNAnn bulunduu yerler belirlenir. lgilenilen molekle gre snflandrlan blot teknikleri aadaki tabloda zetlenmitir (Tablo I). Tablo I. allan molekl trne gre uygulanan blot teknikleri Jel zerindeki molekl aretli Prob Blot yntemi

DNA DNA Southern

RNA DNA Northern

Protein Antikor Western

2. 2. DNA Nkleotid Dizisi Tayini Sanger tarafndan gelitirilen yntemde DNA nn iki zincirinden birisine komplementer zellikte radyoaktif ya da non-radyoaktif iaretli bir primer kullanlr. Ancak iaret, primer yerine kullanlan drt dNTP den birisinde de olabilir. DNA molekl denatre edildikten sonra primerler DNA polimeraz enzimi ile kalp zerinde senteze katlr.

7

Dr. Zeki Topu Sanger dizi analizinin avantaj orjinal kalp iin komplementer zinciri sentezleyen DNA polimeraz inhibe etmek amacyla, nkleotidlerin kimyasal analoglarnn kullanlmasdr. Bu molekller dideoksi nkleotid trifosfatlardr (ddNTP). ddNTP larda serbest 3-OH grubu olmad iin polimeraz senteze devam edemez. DNA dizi analizini devam ettirebilmek iin ksa bir oligonkleotid ile DNA sentezi balatlr, DNA polimeraz kalp iplik boyunca hareket eder veya radyoaktif iaretli nkleotidleri ya da floresan zellikli nkleotidleri yeni sentezlenen zincir ierisine ekler. Drt sekans reaksiyonunun her birine drt normal nkleotidin yalnzca bir inhibitr analounun eklenmesi ile bir sekans bilgisi salanr. Tpler ierisindeki DNA akrilamid jeli zerinde ayrtrlr. Jelin aasndaki ksa DNA fragmentleri 5-uta primere en yakn reaksiyon biti (terminasyon) noktasn gstereceinden nkleotid dizisi tabandan (51 u) tavana (31 u) okunabilir (ekil 6). Alternatif bir yntem olan Maxam-Gilbert nkleotid dizi tanmlama teknii kimyasallarn sala zararlar dolaysyla daha az tercih edilen bir yntemdir.

ekil 6. Dideoksi zincir terminasyonu ile DNA dizi analizi yntemi Gnmzde, DNA dizi analizine ait ilemi otomatize etmek iin cihazlar gelitirilmitir

ve bu hem normal hem de mutant genlerin analizi iin rutin olarak kullanlmaktadr. DNA dizisinin bilinmesi yeni izole edilen geni bir amino asit dizisinin tespiti, genetik hastalklardaki zel mutasyonlarn saptanmas ve molekler tan ilemlerinde kullanlan ya ASO problarnn ya da PCR primerlerinin tasarlanmas iin gereklidir. Otomatize olmu dizi analizi; insan genom projesinde insan genomundaki yaklak 3 milyar bazn tmnn nkleotid dizisinin tayininde olduu gibi E.coli, S.cerevisiae ve bir ok bilimsel ve medikal nemi olan organizmalarn dizilerinin tamamlanmasnda da youn olarak uygulanmtr.

8

Dr. Zeki Topu 3. GEN KLONLANMASINDA KULLANILAN VEKTRLER Klonlama vektr olarak plazmidler, bakteriyofaj ya da karyotik viral DNA ve kozmidler kullanlmaktadr. 3.1 Plazmid DNA Molekllerinin Genel zellikleri Bakterilerde ve baz tek hcreli karyotlarda bulunan extrakromozomal, otonom DNA elementleridir. F, R, D gibi eitli tipleri vardr. F plazmidleri transfer, R plazmidleri antibiyotiklere diren ve D plazmidleri olaan d metabolitleri kullanma iin gerekli bilgileri tarlar. Baz plazmidler zgn replikasyon orijinleri nedeniyle konak hcre seicilii gsterir. Plazmid replikasyonu konak RNA polimeraz tarafndan sentezlenen RNA primerleri ile balar. Plazmidler konak hcrenin replikasyon mekanizmasn kullanmada dzenleyici pozitif ve negatif efektrlere sahiptir. Bazlar partitisyon iin cis etkili kk DNA segmentleri de bulundurur. Klonlama iin en uygun plazmidler 15 kb den kk zgn RE dizisine sahip ve bir ya da birden fazla seilebilir genetik marker bulunduranlardr. Ampisilin, tetrasiklin ve kloramfenikole kar diren salayan proteinlerin sentezi plazmid vektrlerinde en fazla kullanlan genetik izleyicilerdir. ekil 7de vektr olarak sklkla kullanlan pBR322 plazmidinin genetik haritas verilmitir. Plazmid vektr kullanlarak yaplan bir klonlama rnei ekil 7de gsterilmektedir. Bu rnekte RE kesimi ve alkalin fosfataz enzimi muamelesi (alkalin fosfataz fosfat monoesterlerinin hidrolizini katalizler, enzimin fosfataz aktivitesi non-spesifiktir) sonras plazmid DNA s yine RE ile kesilmi olan hedef DNA ile T4 DNA ligaz varlnda kartrlmtr. Transformasyon sonunda DNA moleklndeki kesikler konak hcre tarafndan onarlmaktadr.

ekil 7. Plazmid klonlama vektr

9

Dr. Zeki Topu Bakteri hcrelerinden plazmid izolasyonu iin en fazla kullanlan yntem alkali liziz yntemidir.Bu yntemde plazmid tayan bakteriler SDS ve NaOH ile muamele edilir. SDS bakteri proteinlerinin denatrasyonunu, NaOH ise kromozomal ve plazmid DNA denatrasyonunu salar. Karm KOAc ile ntralize edilir. Kromomzomal DNA ve bakteri proteinleri KOAc ile kompleks kurarak ktrlr. Klonlama vektr olarak plazmidler tadklar eksojen DNA nedeniyle baz durumlarda kararllk gstermeyebilirler. Bu durum; a) Plazmid gen expressiyonunun yksek olmas, plazmid tamayan segregant hcre saysnn art b) Klonlanan gen rnnn konak hcreye inhibitr etki gstermesi c) Transpozisyon elementleri ve insersiyon dizileri nedeniyle olabilecek delesyonlar d) Rekombinant hcrelerin byme hzlarnn non-rekombinant hcrelere gre daha yava olmas ile aklanabilir. Bu kararszl azaltmak; a) Plazmidlerin partitisyon ilevine sahip zel DNA segmentlerine balanmas b) Konak hcre blnmesinin plazmid proliferasyonuna elenmesi c) Seici evre ile zorlama d) Transpozisyon elementlerini uzaklatrma e) Plazmid DNA sndan gerekli olmayan dizileri karma ile mmkndr.

3. 2 Faj DNA s Plazmidlere klonlanacak gen, genellikle 10 kb den daha fazla olamaz. Daha byk genlerin klonlanmas iin eitli ekillerde manipule edilmi faj DNA sndan yararlanr. En yaygn olan her iki ucunda 12 nkleotidten oluan komplementer iki tek zincirli uzantya (cos) sahip fajdr. Bu ular faj DNA snn E.coli iine girdiinde birbirine hibritlenip embersel hale dnmesini salar. Klonlama vektr olarak faj DNA s kararl, izolasyonu kolay, verimli ve seici olmalar ile karakterize edilirler. 3.3 Kozmid DNA Ularnda komplementer "cos" zincirlerine sahip olarak hem plazmid hem de faj DNA snn zelliklerini birlikte tarlar. 4. TRANSFORMASYON YNTEMLER Bakterilerin transformasyonu iin CaCl2 ya da elektroporasyon yntemleri kullanlr. CaCl2 ynteminde bakteriler log fazna ulamak zere yetitirilirler. Hcreler sentrifigasyon ile konsantre edilir ve CaCl2 ieren zelti ile sspansiyon haline getirilir. Oluan kompotent

hcreler plazmid DNA s ile kartrlr. Bu karm 42 C de 90 saniye stlarak DNA nn verimli bir ekilde hcre ierisine girmesi salanr. Hcreler plazmid tarafndan kodlanan antibiyotik diren genlerinin sentezi iin bir sre seici olmayan ortamda bytlr daha sonra antibiyotik ieren besi ortamna transfer edilir. Elektroporasyon yntemi ise kontroll yksek voltaj altnda hcrelerin plazmid DNA molekllerine geirgenliini arttrarak yaplan transfer ilemidir.Bu yntemde transformasyon verimlilii olduka yksektir. 4.1 Transformantlarn Seimi; Ligasyon ve transformasyon verimlilii yksek basamaklar olmadndan, istenilen DNAy tayan transforme olmu hcreler istenmeyen rekombinantlardan ve non-rekombinant hcrelerden seme, tarama ya da her iki ilemle ayrlarak izole edilirler. Seme ilemi sadece transforme olmu hcrelerin yaayabilecekleri ortam kullanlarak gerekletirilir. rnein ekil 7de verilen pBR322 plazmidinde hedef DNA BamHI blgesine yerletirilmi ise hcreler nce amp+ ortamnda yetitirilir. Bu aamada orjinal pBR322 yada

10

Dr. Zeki Topu rekombinant pBR322 tayan hcreler yaayabilir nk non-transforme hcreler amp-hassastr. pBR322deki BamHI tanma dizisi tet. geni ierisinde yerleik olduundan rekombinant koloniler ise tet-hassas olacaktr. u halde amp. ortamnda yetitirilen hcreler tet. ieren ortama transfer edilirse bu ortamda byme gstermeyen hcreler rekombinant olarak seilebilir ve amp. ortamndaki replika eleri ileri basamaklar iin plazmid izolasyonunda kullanlr. Bir baka plazmit olan pUC19 da, bir amp-diren geni ve E.coli

laktoz operonunun -galaktozidaz (lacZ') ve bu genin ekspressiyonunu dzenleyen lacI genleri tanmaktadr. Modifiye olmam pUC19 tayan hcreler laktoz operonunun uyarcs olan izopropilthiogalaktosid (IPTG) varlnda yetitirilirse lacI gen rn lacZ' geninin promotor-operatr blgesine balanamamakta ve bylece lacZ' geninin transkripsiyonu ve translasyonu gereklemektedir. lacZ' proteini kromozomal DNA tarafndan kodlanan baka bir protein ile etkileerek aktif hibrit -galaktozidaz retilmektedir. Bu durumda ortama

sbstrat olarak 5-bromo-4-kloroindolil--galaktosid (X-gal) eklenirse bu madde -galaktozidaz ile mavi renk verecek ekilde hidrolize olmaktadr. u halde modifiye olmam pUC19 tayan koloniler mavi olarak ayrtedilmekte rekombinant koloniler ise beyaz olarak seilebilmektedir. Ortamda amp. bulunmas ise plazmid tamayan hcrelerin oalmasna izin vermez. Eer klonlama vektr olarak faj kullanlm ise, faj alan hcreler ldrlerek berrak plaklar ya da yava geliimleri nedeniyle bulank plaklar olarak seilirler. 5. GEN KTPHANES 5.1. DNA ve RNA Molekllerinin Radyoaktif aretlenmesi 5.1.1. 5'-u aretlemesi

T4 polinkleotid DNA kinaz (PNK) enzimi 5'-nkleosit monofosfatlardan -fosfat grubunu polinkleotidlerin serbest 5'-OH pozisyonuna transfer eder. u halde ATP nin -pozisyonundaki 32P yaps radyoaktif olan ATP molekl kullanlarak DNA veya RNA nn 5'-ular radyoaktif olarak iaretlenebilir. Klonlama almalarnda RE kesimi sonucu elde edilen DNA molekllerinde 5'-ularn serbest -OH tamalar alkalin fosfataz muamelesi ile gerekletirilir. 5.1.2. Nick-translasyon Yntemi DNA endonkleaz ile kontroll muamele sonucu zerinde bir yada birka kesik oluturulur. Bu DNA deoksinkleotidtrifosfat (dNTP) lar varlnda DNA polimeraz ile reaksiyona alnrsa kesikteki 3'-ulara dNTP ler eklenerek yeni DNA lar sentezlenmi olur. Bu yntem ile iaretleme yapmak iin kullanlan dNTP lerden yalnz bir tanesinin 32P ile iaretli

olmas yeterlidir. Kullanlan dNTP de radyoaktivite -pozisyonunda olmak zorundadr. 5.1.3. Random Primer Yntemi DNA sentezinde grev alabilecek btn kombinasyonlar ieren sentetik oligomerler

denatre edilmi kalp DNA zerinde en az bir tanesi -pozisyonunda 32P tamak zere dNTP ler ve E.coli DNA polimeraz I enziminin Klenow fragmenti ile muamele edildiinde radyoaktivite DNA yapsna transfer edilir. Klenow enzimi E.coli DNA polimeraz I enziminin

5'3' exonkleaz aktivitesi tayan blmnn eliminasyonu ile elde edilmitir. 5.2 Gen Ktphanesi Hazrlamas 5. 2. 1. Genomik DNA ktphanesi Organizmann toplam DNA s RE ile fragmentlere ayrlr ve her fragment ligasyon ile bir vektre eklenir. Oluturulan konstruktlar (rekombinant DNA lar) konak hcreye verilir. Hedef DNA y tayan klon seilerek izole edilir ve karakterizasyon tamamlanr.

11

Dr. Zeki Topu

Hedef DNA y tayan klonun seilmesinde aadaki yntemler kullanlabilir; a) DNA hibridizasyonu; Bu yntemde hedef DNA denatre edilir. Oluan tek zincirli (ss) DNA naylon ya da nitroselloz bir matrixe irreversible (geri dnmsz) olarak balanr ve iaretli DNA probu ile inkbe edilir. Autoradyografi ile balanma tesbit edilir. Gen ktphanesinin taranmasnda prob olarak kullanlan DNA nn kayna olarak; i) Heterolog prob ii) Kimyasal sentezle retilen problar kullanlr. Heterolog prob ok yakn bir organizmann klonlanm DNA sdr. kinci tip problarn hazrlanmasnda ise proteinin bilinen amino asit dizisinden yararlanr. Gen ktphanesi RE ykm ile hazrlandndan oluan fragmentlerin boylar deiiklik gsterir. Bu nedenle jel elektroforezi ve restriksiyon haritalamas ile insert DNA nn uzunluunun ve akan blgelerinin bulunmasn gerekir. Ancak, klonlanan DNA yeteri kadar uzun ise start ve stop sinyallari tayacandan hedeflenen gen belirlenebilir. Kullanlacak RNA ve DNA problarn klon edilen genin durumuna gre seilir. Ribozomal RNA ve transfer RNA genlerinin klonlanmasnda rRNA ve tRNA moleklleri prob olarak kullanlr. nk hcre iindeki toplam RNA'nn % 80 den fazlasn bu molekller olutururlar. Sz konusu RNA'lar kolaylkla hcreden elde edilip, iaretlenebilir. Bunun dnda baz zel durumlarda eli RNA (mRNA) moleklleri de prob olarak kullanlabilir. Bu, klonlanacak gene ait olan mRNA'nn dier mRNA'lara gre zengin olduu durumlarda sz konusu olur. rnein hemoglobin geni klonlanmak istendiinde alyuvarlardaki mRNA prob olarak kullanlabilir. nk, buradaki mRNA'nn % 90 dan fazlas hemoglobin mRNA'sdr. Bunun yannda uzunluu 10 ile 15 nkleotid arasnda deien ve sentetik olarak hazrlanan kk DNA problar da kullanlmaktadr. Eer, klon edilecek gene ait olan proteinin amino asit dizisi biliniyorsa sentetik DNA problarnn yaplmas mmkn olur. Protein iin tm amino asit dizisinin bilinmesine gerek yoktur. ok az bir dizinin bilinmesi dahi yeterlidir.Yaplan i, genetik ifreyi kullanarak amino asit dizisine karlk gelen mRNA daki nkleotid dizisini saptamak esasna dayanr. b) mmnolojik Tarama; DNA probunun kullanlmasnn mmkn olmad hallerde klonlanm DNA transkripsiyona ve translasyona uruyorsa retilen proteinin ya da bir blmnn varl antikor kullanlarak belirlenebilir. Bu ilem iin koloniler bir matrixe aktarlr ve liziz edilerek paralanr. Matrix ve proteinler primer antikor (Ab) ile muamele edilir. Balanmayan fazla Ab ler uzaklatrldktan sonra matrix, primer Ab ye zgn ikinci bir Ab ile muamele edilir. ou durumlarda ikincil Ab ye konjuge edilen enzimin substrat eklenerek balanma rn oluumu ile belirlenir. c) Protein aktivitesi ile tayin Eer ilgilenilen gen, tayc hcrenin normal koullar altnda yapmad bir enzim retiyorsa geni tayan koloniler ortama sbstrat ilavesi ile tayin edilebilir. d)Komplementasyon ou kez bir gen hakknda sahip olunan bilgi bu genin protein rnnn ilevi hakknda bilgi anlamna gelir. lgilenilen gen bakteri bymesi iin mutlak gerekli bir enzimi kodluyor ise rnein Salmonella dan alnan byle bir gen E.coli ye klonlandnda transforme olmu hcreler bu gen rnnn mutlak gerekli olduu ortamda yetitirilerek seim yaplabilir. Bu metod "komplementasyon" olarak adlandrlr.

12

Dr. Zeki Topu 5 .2.2 c-DNA ktphanesi Primer DNA transkriptlerinden deil, olgun mRNA dan retilen ift sarmal DNA (dsDNA) lardan oluur. karyotik gen rnlerini DNA ilenmesi ve olgunlamasnn ok az rastland prokaryotik konak hcrelerde retmek iin gereklidir. Genomik DNA moleklleri bir organizmann hemen hemen btn hcrelerinde ayndr. cDNA klonlanmasnda kullanlan mRNA moleklleri ise hcrenin fonksiyonuna gre birbirlerinden farkllk gsterir. cDNA klonlanmas mRNA saflatrlmas ile balar. Bu ilem iin karyotik mRNA nn maturasyon esnasnda polyadenile olmas zelliinden yararlanlr. Poly A kuyruuna sahip mRNA, deoksitimidilata balanm selloz kolonuna baz iftlemesi ile balanr. cDNA ktphanesi hazrlamada anahtar enzim RNA kalb zerinde uygun primerler varlnda DNA sentezi yapabilen "retroviral RNA-baml DNA polimeraz (Reverse transkriptaz -RT-)" enzimidir. Bu enzim 3'5' exonkleaz aktivitesi tamaz. Oligo T primerleri ve dNTP varlnda RT mRNA ya komplementer DNA ipliini sentezleyerek RNA;DNA dubleksini oluturur. Bunu takiben RNaseH , RNA y seici olarak keserek bir sonraki basamakta DNA Pol I reaksiyonunda primer olarak grev alacak bir seri ksa mRNA fragmentleri oluur. DNA Pol I ikinci DNA ipliini sentezler. Sentez esnasnda fragmente olmu RNA primerleri enzimin 5-3 ekzonkleaz aktivitesi ile kesilerek atlr. Oluan dublex T4 DNA polimerazn 3-5 ekzonkleaz aktivitesi ile kr ulu hale getirilir. Elde edilen duplex oligolinkerlerin eklenmesi ve RE kesimi ile yapkan ulu hale getirilir ve vektrlere eklenir. 5. 3. Alt Klonlama (sub-cloning) Gen ktphanesinden izole edilen DNA klonu ncelikle yapsal bir analize tabi tutularak doruluu kontrol edilmelidir. En gl kant izole edilen klonun nkleotid dizisinin tanmlanmas ve sonucun prob hazrlamada kullanlan bilgi ile karlatrlmasdr. Bir baka kontrol ise genin klon seiminde kullanlan probtan baka bir prob ile hibridizasyonu esasna dayanr. zellikle antikor kullanlarak yaplan seimlerde immun serumun dier proteinlerle kross-reaksiyonu sz konusu olduundan klonlanan genlerin doruluk analizi gen mhendisliinin nemli bir basamadr.

Alt klonlama ilgilenilen genin rekombinant plazmidten izole edilerek baka bir vektre yeniden klonlanmas anlamna gelir. Burada ama genin nkleotid dizisinin belirlenmesi, ekspressiyonu ve zgnlnn "mutagenesis" ile deitirilmesidir. Bu ilem iin ska bavurulan bir vektr tek zincirli bakteriyofaj M13 ten elde edilen M13 DNA sdr. Bu molekl E.coli ierisinde otonom olarak replike olan ift sarmall dairesel DNA eklinde bulunur. Fajn bu formu replikatif form (RF) olarak adlandrlr. te yandan E.coli den serbest braklan DNA lar ise RF nin bir zincirinden gelen tek zincirli molekldr. u halde hedef DNA eer RF DNA sna yeniden klonlanrsa ve E.coli ye plazmid olarak transforme edilirse hedef DNA bakteri ierisinde replike edilir. Hedef DNA nkleotid dizisi tayini iin uygun olarak tek zincirli DNA eklinde bakteriden alnr.

6. PROKARYOTK SSTEMLERDE GEN EXPRESSYONUNUN MANPULASYONU Gen klonlanmasnda bir amata, klonlanan genin seilmi bir organizmada ekspressiyonudur. Ancak ekspressiyonu sratlendirmek iin transkripsiyon, translasyon, protein stabilitesi ve sekresyonu kontrol eden eitli genetik elementlerle donatlm zel vektrler gelitirilmitir. Bu ilem iin ska bavurulan bir yol ilgilenilen geni gl bir promotor kontrolu altndaki plazmide klonlamaktadr. Ancak bu durumun yarataca enerji sorunu hcrede eitli olumsuzluklara yol aabilir. Srekli olarak transkripsiyona urayan geni tayan plazmid birka blnme dngsnden sonra kaybolabilir. Bunu nlemek iin aktivitesi dzenlenebilir promotorlar gelitirilmitir. lemin esas, transkrispsiyonu, repressor proteinleri kullanarak konak hcrenin byme dngsnn belirli basamaklar ile snrlamaktr. Bu ilemin etkinlii repressor protein moleklnn promotor kopya saysna orannn

13

Dr. Zeki Topu dzenlenmesine baldr. Genellikle repressor protein geni ve buna karlk gelen promotor ayr sayda kopya tayan iki ayr plazmid zerine ina edilir. Repressor geni dk sayda, promotor dizi ise ok sayda kopya tayan plazmide insert edilir. Plazmid kopya saysnn artrlmas klonlanan gen rnn retilmesi iin her zaman uygun bir yntem olmad iin, bir baka yaklamda yksek kopya sayl plazmide ilgilenilen genin bir kopyasnn eklenmesi yerine, dk kopya sayl plazmide ilgilenilen genin ok sayda kopyasn klonlamaktr. Teknik olarak karlalabilecek sorun, her dizinin doru oryantasyonla yerletirilmesidir. Yabanc proteinler heterolog konak hcrelerde kontrol edilebilir promotrler varlnda bile ykm nedeniyle dk ekspressiyon gsterebilir.Bu sorunun zm, klonlanm gen rnnn kararl bir konak hcre proteinine balanmas ile mmkn olur. Fzyon proteinleri olarak adlandrlan bu kombinasyon klonlanm gen rnnn konak hcre proteazlarnca ykmn nler. Fuzyon proteinleri DNA dzeyinde iki genin kodlama blgesinin ligasyonu ile gerekletirilir. Ancak son rn olarak fzyon proteinin retilmesi de ounlukla istenmeyen bir durumdur. Bu durum hedef proteinin biyolojik fonksiyonunu ve klinik kullanmn etkiler. Bunun iin hedef geni tayc vektre balarken rn belirli proteazlarca tannacak blmleri kodlayan oligonkleotid linkerler kullanlr. Klonlamadan sonra fzyon proteini, hedef proteinin yannda konak hcre tarafndan antikor retiminde yararlanlabilecek konak protenini de saladndan antijen olarak kullanlabilir ve immunoaffinite kromotorafisi ile saflatrlabilir. Btn bunlarn yannda, translasyon verimlilii ve sentezlenen rnn stabilitesi de gz nne alnmas gereken parametrelerdir. Bu nedenle ou E.coli ekspressiyon vektrleri mRNA nn ribozomlara balanmas iin gerekli blgelerin, translasyon balang noktasndan uygun bir uzakla inas ile gelitirilmitir. Prokaryotlarla yaplan klonlamada bir baka manipulasyon da protein stabilitesi ile ilgilidir. Proteinlerin yar mrleri birka dakikadan bir ka gne farkllk gsterir. Bu farkllk proteinde dislfit ba oluumu ve N-terminalindeki amino asit kompozisyonuna baldr. Klonlanm genlere proteinlerin yar mrlerini artrc aminoasit eklenmesi ya da PEST dizileri olarak da adlandrlan proteolitik ykma duyarll artran prolin (Pro), glutamat (Glu), serin (Ser) ve threonin (Ser) amino asitlerinin hedef proteinin ilevini deitirmedii durumlarda manipule edilmesi nerilebilir. 7. YNL MUTASYON DNA nkleotid dizisi eitli yntemlerle deitirilebilir. DNA nkleotid dizisinde bilinerek yaplan nkleotid eklenmesi, karlmas ya da nkleotid deitirilmesi ynl mutasyon olarak adlandrlr. Bu yntemle proteinin fonksiyonu iin mutlak gerekli amino asitleri belirlendii gibi protein fonksiyonunu bozmadan hangi amino asitlerin birbirlerinin yerini alabilecei belirlenebilir. Nkleotid karlmas ya da eklenmesi eklinde yaplan mutasyonlarda restriksiyon endonkleazlar kullanlr. Deiiklik yaplan DNA lar, RNA ve protein sentezi ileminde kullanlr ve istenen protein ilevsel analize tabi tutulur. rnein, sentezlenen bir proteini mitokondriye ynlendirmekle grevli bir sinyal dizisi sitozoloik bir proteine eklenerek sz konusu proteinin mitokondriyel matrix proteini olarak ekspressiyonu salanabilir. zgn ynl mutasyon ile istenen herhangi bir blgede zel bir deiiklik yaplabilir. Bunun iin mutasyona uratmak istediimiz DNA, hazrlanan bir oligonkleotid ile ift zincir haline gelmeye zorlanr ("anneal" edilir). Kullanlan oligonkleotid, deiiklik yapmak istediimiz DNA moleklne bir nkleotid dnda tamamiyle komplementer zellikte olmaldr.

14

Dr. Zeki Topu 7.1. In vitro Mutagenez

Rekombinant DNA teknolojisi genlerin klonlanmas ve karakterizasyonunu salam olsa da yap-fonksiyon ilikilerinin, DNA dizilerinin deitirilerek bu deiikliklerin fonksiyonel etkilerinin belirlenmesi vazgeilmez bir neme sahiptir. Rekombinant DNA teknolojilerinin gelitirilmesinden nce bu almalar klasik genetik yntemlerle snrl olarak yaplabilmekteydi. Bu blmde in vitro mutagenez yntemleri tantlacaktr. DNA nkleotid dizisi eitli yntemlerle deitirilebilir ancak birok in vitro mutagenez yntem benzer bir deney ak emasna sahiptir (ekil 8).

ekil 8. In vitro mutagenez ileminin basamaklar lgilenilen geni tayan plazmid DNA s in vitro koullarda kimyasal ya da enzimatik

olarak mutasyona uratldktan sonra E. coli bakterisi mutant plazmidle transforme edilir ve plazmidleri alan bakteriler antibiyotik diren zelliklerinden yararlanlarak seilir. Transformantlarn seiminden sonra, mutant plazmidler kolonilerden izole edilerek karakterize edilir. Buna alternatif bir basamak ta kolonilerin ktphane eklinde toplanarak mutantlarn karakterize edilmesidir.

Mutajenez yaklamlar rastgele ya da ynlendirilmi olarak iki genel grupta incelenebilir. Rastgele mutasyonlar; klonlanm DNA zerinde zel bir fonksiyonun yerleimini aydnlatmada, basit genetik tarama yntemlerinin varlnda kullanldrlar ve genellikle ilk basamak almas olarak deenlendirilirler. Rastgele mutasyonlarla alnan sonular ynl mutasyonlarla daha ayrntl olarak allabilinir. Rastgele mutasyonlardan farkl olarak, ynlendirilmi mutasyon protein fonksiyonlarnn analizinde daha gvenilir sonu veren yntemleri kapsar. Bunlardan kaset mutagenez yntemi; vektre klonlanm genin iki RE ile kesimi sonucu ilgili genin serbest braklmas, sonrasnda sentetik dupleksin serbest braklan kaset yerine ligasyonu ve ardndan oluan konstrktn dizi analizine tabi tutulmas basamaklarndan oluur. zellikle DNA-protein etkileimlerinin belirlenmesinde kullanl bir yntem olan primer mutagenez ynteminde ise DNA ya balanabilme zellii gsteren bir proteinde, istenen deiiklik yaplarak mutasyonlarn etkisi in vitro olarak tanmlanabilir (Hutchison et al., 1978). Yntemin ilkesi ilgilenilen geni tayan tek zincirli dairesel DNA kalbna, deitirilmesi istenen nkleotid dnda kalp ile tamamen komlementer sentetik bir oligonkleotidin hibridizasyonu ve ardndan primerin, nkleotid trifosfatlar ve DNA polimeraz varlnda polimerizasyonuna dayanr. Ligaz reaksiyonu ile dairesel ift zincirli DNA oluturularak E. coli hcreleri sentezlenmi DNA ile transforme edilir, bylece yabanl ve mutant E. coli poplasyonlar oluturulur. Mutant DNA tayan hcreler

15

Dr. Zeki Topu dierlerinden uygun bir tarama sistemi ile ayrt edilerek fonksiyonel testlere tabi tutulurlar. Seim ileminde en verimli testler Kunkel (Kunkel, 1985) ve Taylor (Taylor and Eckstein, 1985) tarafndan gelitirilen yntemlerle yaplmaktadr. Kunkel yntemi yabanl DNA zincirine T yerine U inkorporasyonu, Taylor ynteminde ise mutant DNA zincirine thionikleotid inkorporasyonu ile yaplmaktadr. Her iki yntemde de M13 ya da fajmid vektrler kullanlmaktadr. 8. TANI YNTEMLER Kullanl bir tan yntemi zgn, hassas ve uygulanabilir olmaldr. Klasik tan yntemleri potansiyel patojenin kltr ortamnda bytlmesi ve bunu takiben eitli fizyolojik zelliklerinin analizine dayanr. Bu tip testler etkin ve byk lde zgn olmalarna karlk yava ve yksek maliyetleri nedeniyle kullanszdr. Son yllarda gelitirilen immnolojik ve DNA tan yntemleri klinik almalar nemli lde kolaylatrmtr. 8.1. mmnolojik Tan Yntemleri Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) lem aadaki basamaklar ierir: a)zel bir organizmaya ait molekln varlnn belirlenmesi istenen rnek plastik bir mikrotitere balanr.

b)Balanan materyale zgn antikor (birincil antikor-1o Ab-) eklenir ve balanmayan antikorlar ykama ile uzaklatrlr.

c) 1o Ab' ye zgn ikincil antikor (2o Ab) eklenir. 2o Ab alkalin fosfataz, peroksidaz ya da ureaz gibi renksiz bir sbstratn renkli bir rne dnn katalizleyen bir enzime baldr. d)kincil antikora bal enzimin substrat ilave edilerek balanmann olup olmad oluan renk reaksiyonu ile belirlenir. 8.2. DNA Tan Yntemleri Bir biyolojik karakteri belirleyen nkleotid dizisi DNA hidridizasyonu ile belirlenebilir . Bu ilemin basamaklar aadaki gibidir: a)Tek sarmall hedef DNA bir zara balanr. b)Uygun fiziksel koullarda tek zircirli, iaretli DNA probu ile hibridizasyon gerekletirilir. c)Balanmayan problar ykama ile uzaklatrlr ve hibridizasyon X-n filmi zerine grnt olarak drlr. 8.3. Non-radyoaktif molekler tan yntemleri

Radyoaktif yntemle yaplan tanlarda kullanlan 32P nin ksa yar mr ve potansiyel tehlikeleri nedeniyle eitli non-radyoaktif hibridizasyon yntemleri gelitirilmitir. Bu ilem; a)Biyotin ile iaretli probun hedef DNA ile hibridizasyonu b)Yumurta beyazndan elde edilen avidin ya da onun bakteriyel analogu olan streptavidin eklenmesi c)Alkalin fosfataz ya da peroksidaz gibi biyotinle iaretli bir enzimin eklenmesi d)Biyotin ile iaretli enzimin trne gre renk veren (kromojenik) ya da chemiluminescent (kemilminessent) sbstrat eklenerek rn ya da n belirlenmesinden oluur.

16

Dr. Zeki Topu 8.4. Genetik Hastalklarn Molekler Tans: DNA analizi kaltmsal hastalklarn tayclarn belirlemede, prenatal tanda ve semptomlarn oluumundan nce hasltalklarn erken tansnda kullanmaktadr. Bir rnekle

belirtmek gerekirse, orak hcre anemisi (Sickle-cell anemia) hemoglobin (Hb)' in zincirindeki alt nolu valin (Val) amino asidinin yerine glutamik asidin (Glu) gemesinden kaynaklanmaktadr. Bu deiiklik Cvn restriksiyon enziminin tanma dizisini kapsayan iki primer setinin eklenmesi ile rnek DNA, PCR ile oaltlr. Oluan rnler ethidium bromide (EtdBr) ile boyanan agaroz jeli zerinde ayrtrlr. Cvn tanma dizisinin varl ya da yokluuna bal olarak normal ve mutant DNA farkl byklkte DNA fragmanlar verecektir. 8.5. PCR/OLA Teknii Hastalklara neden olan genetik yap deiiklikleri her zaman restriksiyon enzimi tanma dizilerini deitirmezler. Byle durumlarda PCR-Oligo Ligasyon Assay (PCR/OLA) uygulanmaktadr. Varsayalmki normal bir genin 106 nolu nkleotidi A:T baz iftinden oluurken mutant gende bu G:C baz iftinden olumaktadr. 106 nolu pozisyondaki baz sras bilgisinden iki set ksa primerler hazrlanr. ekilde prob X olarak gsterilen bu primerlerden bir tanesi 3'-ucunda 106 nolu pozisyondaki normal nkleotide komplementer zellikte, dieri ise (Prob Y) 106 nolu nkleotidin hemen yanndaki nkleotide komplementer zelliktedir. PCR ile oaltlan DNA bu primerler ile hibridizasyona tabi tutulduktan sonra eklenen DNA Ligaz enzimi prob X ile prob Y nin balanmasn salayacaktr. te yandan bu iki prob mutant DNA ile hibridize edildiinde prob X in 3'-ucu baz iftlemesine katlmayacak, ligaz enzimi X ve Y problarn balayamayacaktr. Ligasyonun gerekleip gereklemediini prob X i 5' ucunda biotin ile, prob Y yi ise 3'-ucunda digoxigenin ile iaretleyerek ve D ve E basamaklarndaki ileme tabi tuturak belirlenebilir. Hibridizasyon ve ligasyon basamaklarndan sonra DNA moleklne hibridize olmu problar serbest brakmak iin denatre edilir ve reaksiyon ierii streptavidin ile kaplanm plastik bir ortama alnr. Plastiin ykanmas balanmayan materyalin uzaklatrlmasn, sadece biyotin iaretli probun balanmasn salar. Daha sonra eklenen alkalin fosfataz enzimine bal anti-digoxigenin antikoru renksiz bir sbstratn eklenmesi ile oluan renk reaksiyonu ile belirlenir. Eer renk oluumu gereklemez ise ligasyon olmamtr, bir baka ifade ile DNA mutantr. 9. GEN TERAPS 9.1. Non-viral Gen Terapisi: Non-viral gen terapisi saflatrlm DNA veya DNA formlasyonlarnn hastaya direk olarak verilmesidir. Bu metod gen alarnn gelitirilmesinde kullanlan bir yaklamdr. Bu terapi ynteminde yaygn olarak kullanlan ekil plazmid DNA snn katyonik lipidlerle birlikte verilmesidir. Bunlarn prototipleri 1,2-dioleyloxypropyl-3-trimetil amonyum bromid (DOTMA) ve dioleyl fosfatidil etanolamin (DOPE) yaplardr. DOTMA formlasyonlarnn hayvan modellerinde pulmonar epitel hcrelerde expressiyonu salanmtr. Gnmzde -antitripsin eksikliinde bu terapi kullanlmaktadr. DOTMA ve DOPE analoglar olan der

formlasyonlardan (3N-(N,N-dimetilaminoetan)carbamilkolesterol (DC-CHOL), ve 1,2-dioleyloxy-3-trimetilamino)propan (DOTAP) gibi yaplar sistik fibrosisin tedavisinde kullanlmaktadr. Non-viral yntemler gvenlik ve maliyetlerinin greli olarak dk olmalar ve toksisite gstermemeleri nedeniyle nemli avantajlara sahiptir. Sistemin eksiklii akcier ve karacier gibi nemli somatik hedeflerde uygulanmasnda gzlenen dk verimlilik ve expressiyon dzeyinin istenenden az olmasdr.

17

Dr. Zeki Topu 9.2 Somatik vs Germinal Hcre Gen Terapisi

Gen terpisinin soma hcreleri ile snrl olmasnn eitli nedenleri vardr. Terapinin sonraki nesile tanaca nedeniyle gen terapisi uygulanmayan ancak baz lkelerde aratrma amac ile yaplan almalarn sonularnn dikkatle izlendii bir yntemdir. Genin doru ekilde insersiyonu bu terapide soma hcre terapisine gre daha fazla nem tar. Yarataca sonular hayatn balangcndan sonuna kadar etkili olacandan daha gelimi teknikler ve zen isteyen bir uratr. Teorik olarak soma hcre terapisine gre daha az tekrar isteyecei ve maliyetinin dk olaca ne srlm olsada biyolojik olarak mkemmel artifact lar (eugenik yaplar) oluturma olasl etik olarak sorgulanmaktadr. Fransa ve Almanya gibi baz Avrupa lkelerinde aratrma amac ile de olsa deneysel almalar yasaklanmtr. Bunun yannda soma hcre terapisinde germinal hcreler zerinde oluabilecek yan etkilerde sorgulanan bir baka konudur. Buna kar bir baka gr ise benzeri yan etkilerin kemoterapide de olabilecei ve remenin bir zorunluluk olmayp birey tarafndan kontrol edilebilir bir aktivite olduu gereidir. 9.3. Preimplantasyon Tan (PID) Germinal hcre maniplasyonuna alternatif olarak iftlere sunulan bir yntemdir. Gnmze kadar birka yz tane embriyo transferi gerekletirilmi ve bunun 100 e yakn baarl hamilelikle sonulanmtr. Bu almalar CF, Tay Sach ve X-kromozumuna bal eitli hastalklar tayan iftler zerinde yaplmtr. PID yntemleri esas olarak: -Polar cisimcik analizi: yumurta hcresinin ilk polar cisimciinin analizi ile yumurta genotipinin belirlenmesi eklinde yaplmaktadr. -Embryo Biopsy: Blastula aamasnda zigottan alnan tek hcre den PCR ile DNA amplifikasyonu ve restriksiyonel DNA analizi -Tropectoderm Biopsy: Extra-embriyonik hcrelerde DNA analizi eklinde gerekletirilmektedir. PID riskleri tan hatalar ve in vitro fertilizasyonun (IVF) yaratt rahatszlklar olarak zetlenebilir. Yine IVF ilemi iin gereken sperovulasyon sonucu ovariumun ar uyarlmasna bal olumsuzluklar da deerlendirilen parametreler arasndadr. Baz Avrupa lkelerinde embriyoda genetik defektin belirlenmesi sonucu annenin hamilelie son verme konusunda artan eilimi nedeniyle PID uygulamalar snrlanmtr.