Ribonukleinsäure-Abbau in Milz- und Thymuszellen von Ratten nach Ganzkörperröntgenbestrahlung

Zbl. Vet. Med. A, 28,327-337 (1981) @ 1981 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0300-871 l/InterCode: ZVRAAX

Arbeitsgruppe Radiologie Leiter: Prof. Dr. K . Tempel

am Institut f u r Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Vorstand: Prof. Dr. D. Hegner

der Tierarztlichen Fakultat der Universitat Miinchen

Ri-bonukleinsaure-Abbau in Milz- und Thymuszellen von Ratten nach Ganzkorperrontgenbestrahlung

Von

K. TEMPEL::

Mit 6 Abbildungen

(Eingegangen am 1 . April 1981)

Einleitung Die Mechanismen des mitoseunabhangigen Strahlentodes von Zellen

(unter dem Begriff ,,Interphasetod" zusammengefaflt) lieflen sich bisher nicht vollstandig aufklaren (13, 35. 38). Im allgemeinen gelten solche Veranderun- Ken als auffallig, die innerhalb der ersten Minuten oder Stunden nach Exposi- tion und/oder nach verhaltnismaflig kleinen Strahlendosen (Groflenordnung 5 1 bis einige Gy) auftreten. Fur lymphatisches Gewebe seien in diesem Zu- sammenhang morphologische Veranderungen - wie Kernverdichtungen, wandstandiges Chromatin, vakuolare Erweiterung des perinuklearen Raumes (4) -, Storungen der ,,unprogrammierten" (reparaturbedingten) (10) und - soweit teilungsaktive Zellen betroffen - der semikonservativen (24, 30, 36) Desoxyribonukleinsaure (DNA)-Synthese, Chromatinlabilisierung und Chro- matinabbau - mit Freisetzung von Histonen und Auftreten von DNA-Frag- menten (2, 12, 21, 27, 32, 39) -, Abfall des Adenosindiphosphat (ADP)-, Adenosintriphosphat (ATP) (3, 6, 22, 39)- und Nicotinamid-Adenin-Dinu- cleotid (NAD) (28-31)-Gehalts, Einflusse auf den Ribonukleinsaure (RNA)- und Protein-Stoffwechsel (7, 23, 25, 34) und Membranveranderungen (1, 15, 17, 18, 20, 38) genannt. Die empfindlichsten Veranderungen konnen sich innerhalb der ersten 15-30 min nach Exposition entwidceln und bereits nach Dosen von einigen Hundertstel Gy manifest werden.

'$ Frau M. WULFFIUS-KOCK bin ich fur hervorragende tedmische Mitarbeit zu grodem Dink verpflichter.

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328 K. TEMPEL

Aus der ,,Unabhangigkeit des strahleninduzierten Interphasentodes menschlicher Go-Lymphozyten in vitro von Fraktionierung, Protrahierung, Strahlenqualitat und Radikalfangern" folgerten VIRSIK und Mitarbeiter (35) jungst, dai3 der Interphasentod nicht - oder doch nicht allein - durch Wir- kungen auf die D N A zu erklaren sei. Verschiedene Befunde verweisen in diesem Zusammenhang auf andere Schadigungsmechanismen, von denen strahleninduzierte Membranveranderungen, wie die Hemmung des Na+-abhangigen Aminosauretransports ( 1 7, 18) oder eine Reduktion der Oberflachenladung (20), oder Storungen im RNA- und Protein-Umsatz (7, 23, 25, 34) insbeson- dere an Thymozyten bzw. T-Zellinien nachgewiesen wurden.

GERACI und Mitarbeiter (9) berichteten 1974 uber verstarkten RNA-Ab- bau in Rattenthymozyten nach Rontgenbestrahlung in vitro. Die Eff ekte setz- ten etwa 1 h nach Exposition ein und nahmen dosisabhangig (Bereich 0,5-10 Gy) zu. Aus der Ahnlichkeit der Dosis-Wirkungs-Kurven hinsichtlich des RNA-Abbaus und der zellularen Oberlebensrate folgerten die Autoren auf ursachliche Bedeutung der Reaktion fur den Interphasentod. In diesem Fall ware allerdings zu fordern, dai3 der RNA-Abbau - relativ - schadigungs- spezifisch ist, auch in anderen ,,Interphasezellen" - etwa Milzzellen - auf- tritt und in vitro wie in vivo nachgewiesen werden kann. Zur Prufung dieser Fragen wurde vorliegend der Abbau von DNA und RNA einer Milzzell-Pra- paration von Ratten unmittelbar sowie 2 h nach Ganzkorperrontgenbestrah- lung (GKB) untersucht.

Als Ausdruck von Nukleinsaureabbau wurde - in Anlehnung an die Methode von GERACI und Mitarbeiter (9) - der in vitro gemessene Aktivi- tatsverlust einer DNA- und einer RNA-Fraktion nach vorheriger intrazellularer Markierung mit T h ~ m i d i n - ~ H (TdR-3H) bzw. Uridin-I4C (U-14C) ge- wahlt. Die semikonservative DNA-Synthese wurde durch den Ribonucleo- tidreductase-Hemmstoff Hydroxyharnstoff (HU) unterdruckt.

Orientierende Untersuchungen galten einer Thymuszellpraparation von Ratten 1 h nach GKB.

Material und Methodik Fur die Untersuchungen standen mannliche Wistar-Ratten aus institutseigener konveii-

tioneller Zucht im Gewicht von 200-250 g zur Verfiigung. Die Tiere wurden in Kafiggruppen zu je 3-4 bei Raumtemperaturen zwischen 22-24 'C gehalten. Sie erhielten Altromin?- Fertigfutter und Trinkwasser ad libitum. Die jeweils benotigten Versuchstiere wurden unter laboriiblicfien Bedingungen (Kristalloflex 4 der Fa. Siemens u. Halske, Scheitelspannung 60 kV, Rohrenstrom 30 mA, Energiedosisleitung 0,8 Gy min-', Halbwertsschicht 0,16 mm Cu, Filrr- rung rnit 0,16 mm Cu, Fokus-Objekt-Abstand 20 cm) rnit Dosen von 0,5-10 G y (die Ener- giedosis von 10 G y entsprach etwa der DL50/30) ganzkorperrontgenbestrahlt. Die Kontrollen wurden einer Scheinbestrahlung unterzogen. Unmittelbar bzw. 1 oder 2 h nach GKB wurden die Tiere in Athernarkose dekapitiert und entblutet.

Milz- und Thymuszellen wurden in Anlehnung an die Methode von KOCW und Mit- arbeiter (14) bzw. nach einer bereits an anderer Stelle (33) ausfuhrlicher beschriebenen Mechode gewonnen.

Einzelansatze von 107-108 Zellen pro ml (Inkubationsmediurn: C a + +- und Mg+ +-freic Hank's-Losung) wurden - zur Hemmung der semikonservativen DNA-Synthese - zunachst 30 min rnit lo-* Mol/l H U - und anschlienend zur intrazellularen Markierung - gleichfalls in Gegenwart von H U - entweder rnit [3H]-Methylthymidin (3H-TdR, 1,5-2,2 TBq bzvr. 40-60 C i pro mmol, AMERSHAM BUCHLER TRK. 418, 185 kBq bzw. 5 u C i pro rnl Z e h s p e n s i o n ) oder mit [2-14C]-Uridin ("C-U, 2 1,85 GBq bzw. 2 50 mCi pro mmol, N E W E N G L A N D NUCLEAR, NEC-167, 1,85-3,7 kBq bzw. 0,05-0,l !cCi pro ml Zell- suspension) aerob bei 37 'C inkubiert. Nach AbschluC der 40 rnin dauernden Markierungs- phase wurden die Zellen dreimal mit warmer Hank's-Losung gewaschen und im Anschlug daran entweder in Gegenwart von 100 pgglml unmarkierten T d R (nach vorherigem Einbau von TdR-'H) oder in Gegenwart von 1000 pg/ml unmarkierten U (nach vorheriger Markie-

Ribonukleinsaure-Abbau in Milz- und Thymuszellen von Ratten 329

rung durch U-I'C) im allgemeinen 8 min - 2 h weiterinkubiert. Zum gewiinschten Versuchs- zeitpunkt wurden die 3H-Aktivitat (eines RNA-freien) rnit Perchlorsaure (Endkonzentration 6 O/o) fallbaren Sediments oder die l4C-Aktivitat eines RNA-haltigen zellularen Extrakts dcs zuvor gewonnenen Perddorsaureprazipitats bestimmt und auf den DNA- bzw. RNA-Gehalt der markierten Fraktionen bezogen. Im einzelnen wurde dabei folgendermafien vorgegangen:

Zur Extraktion der RNA (5) wurde das mehrmals mit 6 O/oiger Perchlorsaure gewaschene Sediment in 5,O ml einer wafirigen NaOH-Losung (1 mol/l) 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert, wobei sowohl die D N A als auch die RNA in Losung gehen. D u r h anschliegenden Zu- satz von 1,0 ml HCI (6 mol/l) und 10 min dauernde Zentrifugation des Reaktionsgemisches bei 900 g wurde die DNA-Fraktion erneut gefallt, wahrend das RNA-Hydrolysat im Ober- stand verblieb. Seine "C-Aktivitat wurde fliissigszintillationsspektrometrisch, sein RNA-Gehalt mit der Orcin-Reaktion (26) gemessen.

Nach Wiederholung des RNA-Extraktionsvorganges, erneurer Fallung mit HC1 und nochmaliger Waschung mit 6 O/oiger Perchlorsaure wurde das 3H-markierte DNA-haltige Sediment 15 min bei 90 OC in 6 O/oiger Perhlorsaure hydrolysiert. Nach Abtrennung des unloslich gebliebenen Sediments wurde das Hydrolysat gleichfalls fliissigszintillationsspektrometrisch auf seine Radioaktivitat und spektrophotometrisch (Messung der Extinktionsdifferenz zwischen 260 und 280 nm) auf seinen Nukleinsauregehalt hin gepriift.

Ergebnisse und Diskussion Zu den wesentlichsten methodischen Voraussetzungen des Nachweises von

Abbauvorgangen an Nukleinsauren nach intrazellularer Markierung gehort die Hemmung des weiteren Einbaus der no& vorhandenen markierten Nu- kleinsaurevorstufen. Als zuverlassig hat sich dabei die Verdunnung des Tracers durch die entsprechende unmarkierte Nukleinsaurebase erwiesen (9) . Die semikonservative DNA-Synthese wurde im vorliegenden Versuch uberdies durch Zusatz von mol/l HU unterdruckt.

60

50

40 8 r-7 r

P 30

'B 25

20 I - E

10

A B

Abb. 1. In vitro-Einbau von TdR-3H (Kreuz) bzw. U-"C (Punkt) in die D N A bzw. RNA von Milzzellen. - A:

1 In Abhangigkeit von der '-+-+ Inkubationszeit. - B: Bei

40 min. Inkubation nach Markierung in Gegenwart der inaktiven Nukleinsaure- basen TdR bzw. U konzen-

16 32 64 li5 trationsabhangig. - Jeder Mefiwert stellt den Mittel-

TdR btr. U [porn1 -'I wert aus drei Ansatzen dar

Aus Abbildung 1 A ergibt sich, dai3 der Einbau von TdR-S H in die DNA und die Inkorporation von U-14 C in die RNA von Rattenmilzzellen mit der Inkubationszeit zunimmt. Die zu Markierungsbeginn vorhandenen Aktivitaten betrugen 185 bzw. 1,85 kBq (5 bzw. 0,05 pCi) pro ml Ansatz, entsprechend lo-' mmol TdR-3 H bzw. 10-6 mmol UJ4 C pro ml. Die uber den Markie- rungszeitraum gemittelten Einbauraten erreichten rund 11,l bzw. 22,2 Bq (0,3

Zbl. Vet. Me&, Reihe A, Bd. 28, Heft 4 23

330 K. TEMPEI

bzw. 0,6 nCi) min mg-' D N A bzw. RNA, entsprechend 6 lo-'? mmol TdR bzw. 12 10-8mmol U pro min und mg Nukleinsaure. Der Einbau von TdR in die D N A von Milz-bzw. Thymuszellen (Verhaltnis des semikonservativen TdR-3 H-Einbaus etwa wie 1 : 16) war unter diesen Bedingungen gegenuber den HU-frei inkubierten Zellen zu 84,4 bzw. 90,5 O / o gehemmt, was auf den grundsatzlich hoheren Anteil mitoseaktiver Zellen in der Thymuszellprapara- tion hinweist.

Wurden die Zellen nach Abschlui3 der Markierungsphase in Gegenwart der unmarkierten Vorstufen 60-120 min weiterinkubiert, ergab sich bei TdR- bzw. U-Konzentrationen 2 16 pg (2 64 mmol) pro ml - bei 30- bzw. 40 O/oigem Aktivitatsabfall gegeniiber den Ausgangswerten - weitgehende Aktivitatskonstanz (Abb. 1 B). Analog zu den Ergebnissen von GERACI und Mitarbeiter (9) (rund 99 O/oige Verdrangung des markierten U im Uridintri- phosphat-Pool durch 90 min Inkubation mit IOOO p g U pro ml Ansatz) kann somit davon ausgegangen werden, dai3 die weitere Utilisierung bzw. Reutili- sierung der intrazellular noch vorhandenen radioaktiv markierten Nuklein- saurevorstufen nicht mehr ins Gewicht fallt.

Die Hemmung des Einbaus von Vorstufen in die Nukleinsauren gehort zu den besonders haufig untersuchten strahlenbiologischen Eff ekten (24, 30, 36 u. a.). Dem Umfang nach wird die DNA-Synthese (24, 30) dabei im allgemeinen starker gehemmt als die Synthese der R N A (7,36), was sich auch aus den vorliegenden Untersuchungen ergab (Abb. 2 und 3). Der TdR-3 H-Einbau war bereits 1/2-1 h nach GKB mit 5 G y signifikant und nach Ablauf einer weiteren Stunde dosisabhangig gehemmt (Abb. 2 ) . Wurde die RNA markiert, ergaben sich signifikante Hemmeffekte erst 2 h nach Exposition (Abb. 3). Die sowoh1

LL r !

L 0.062 0.125 0.25 1.00 5.00 10.00

Slrahlendosir [Gy]

Abb. 2 . In vitro-Einbau von TdR-3H in die D N A von Milzzellen von Rat- ten 2 h nach GKB in Abhangigkeit von der Strahlendosis; 40 min. Inku- bation i n Gegenwart von moll1 HU - Einbau in Prozent, bezogen auf die scheinbestrahlten Kontrollen. - 11 -- 4 (Dosen: 5 und 10 Gy) bzw.

6 (ubrige Dosen)

an den Milz- als auch den Thymuszellen etwa 1 h nach Strahleneinwir- kung nachweisbare kurzfristige Erhohung des U-lQ C-Einbaus in die R N A ist - zumindest fur Rattenthymuszellen - bekannt und im Sinne einer Er- hohung der Chromatin-Starter-Aktivitat fur den Transkriptionsvorgang ge- deutet worden (34).

Werden quantitative Aussagen uber das Verhalten der Nukleinsauresyn- these verlangt, bleiben Einbauversuche solange problematisch, als potentielle

Ribonukleinsaure-Abbau in Milz- und Thymuszellen von Ratten 33:

150

100

- &

H Y I

*V 50 r

a

t

- 0 0.625 1.25

I Abb. 3. In vitro-Einbau von U-14C in die RNA von Milzzellen von Ratten 2 h narh GKB in Abhangigkeit von der Strahlendosis. - Aneaben im 2.50 5.00 10.00

Strahlmdosir [Gy] iibrigen wie in Abb.>

Veranderungen des endogenen (inaktiven, nicht-markierten) Vorstufen-Pools nicht mitberucksichtigt werden. DONOFRIO und Mitarbeiter (8) beispielsweise konnten zeigen, dai3 die PoolgroBen der Nukleinsaurevorstufen ATP, GTP, dATP und dTTP in Thymuszellen der Maus mehr als 9 O o / o unter den ublicherweise in Saugetierzellen ermittelten Werten liegen. Bereits kleine Anderungen dieser PoolgroBen konnten somit ausreichen, um Eff ekte auf Nukleinsauresyntheseraten vorzutauschen. Demgegenuber ist allerdings fest- zustellen, dai3 Untersuchungen des Stoffwechsels von Nukleinsaurevorstufen nach Einwirkung ionisierender Strahlen bisher zu widerspruchlichen Aussagen fuhrten. Wahrend sich an Zellen des Chinesischen Hamsters z. B. in den ersten Stunden nach Rontgenbestrahlung mit Dosen von 10 bzw. 8 Gy weder eine Expansion des dTTP-, dATP- und dGTP-Pools (37) noch ein Strahleneffekt auf den TdR-Transport (1 1) nachwiesen lieBen, war der TdR-Transport in EHRLICH-Ascites-Zellen 15-20 min nach Rontgenbestrahlung mit 50 Gy zu 30-35 O / o gehemmt (16) und - unter diesen Bedingungen - etwa fur die Halfte der strahleninduzierten ,,DNA-Synthesehemmung" verantwortlich zu machen.

Die in vitro - Messung von Nukleinsaureabbau aus dem Aktivitatsver- lust nach Strahlenexposition in vivo ist somit - nach hoheren Strahlendosen und in einem Zeitraum von 1-2 h nach Exposition - durch unterschiedliche Markierungsraten belastet. Wahrend diese methodische Einschrankung durch Wahl geeigneter Strahlendosen und eines moglichst fruhen Aufarbeitungszeit- punktes - zumindest fur die RNA - iiberbrudrt werden kann, zeigt der in den Abbildungen 5 und 6 wiedergegebene Aktivitatsverlust in Milz- und Thy- muszellen von Kontrollratten, dal3 der so bestimmte RNA-Abbau nicht strah- lenspezifisch ist. Vergleichbare Ergebnisse an Thymuszellen der Ratte fuhrten zu dem SchluB, dai3 die Hemmung der Nukleinsauresynthese generell einen verstarkten Nukleinsaure (hier : RNA)-Abbau zur Folge hat. Ein unmitttelbarer Einflui3 von H U auf die R N A ist nach dem vorliegenden Schrifttum unwahr- scheinlich.

Gegenuber den unbestrahlten Kontrollen war der DNA-3 H-Verlust in Milzzellen von Ratten 2 h nach GKB mit 10 Gy signifikant vermindert, wah-

23"

332 K. TEMPEL

Abb. 4. Verhalten der TdR-3H- Aktivitat der D N A von Rat- tenrnilzzellen in Gegenwart von 100 ,ug/rnl (unrnarkierten) T d R nach Abschlui3 der 40 rnin. Mar- kierungsphase. - Punkt: Kon- trollen, Kreuz: Entnahrne der Milz 10rnin nach GKB rnit 10 Gy, Kreis: Entnahrne der Milz 2 h nach GKB rnit 10 Gy.

- n = 4-6

rend sich unmittelbar im Anschlui3 an Bestrahlung keine Differenz gegenuber der Vergleichsgruppe ergab (Abb. 4). Dieser Befund ist angesichts der von verschiedenen Untersuchergruppen ubereinstimmend mitgeteilten strahleninduzierten Chromatinlabilisierung (2, 12, 21, 27, 32, 39 u. a.) zunachst uberra- schend. Die naheliegendste Erklarung ist in der Annahme zu sehen, dai3 die verhaltnismai3ig fruh einsetzende DNA-Synthese-Hemmung in der Nachbe- strahlungsperiode den Einbau von inaktivem TdR verlangsamt. Abgesehen davon, dai3 der tatsachliche DNA-Abbau unter den gewahlten Bedingungen somit unterschatzt wird, bleibt festzuhalten, dai3 die fur den Interphasetod lymphatischer Zellen typischen Abbauvorgange am DNA-Protein-Komplex insgesamt in der Regel erst einige Stunden nach dem Strahleninsult deutlich werden und damit der hier gewahlten Versuchsperiode zeitlich etwas nachge- ordnet sind. - In der regenerierenden Rattenleber zeigten sich ins Gewicht fallende H-Verluste der D N A nach intrazellularer Markierung erst 1 h nach Lokalbestrahlung mit Dosen von 120Gy, wahrend 60 und 30 Gy unter den gleichen Bedingungen wirkungslos blieben (19).

Im Unterschied zum Verhalten der H-Aktivitat war der Abfall der U-I4 C-Aktivitat 2 h nach GKB mit 10 Gy gegenuber den Kontrollen beschleu- nigt (Abb. 5 ) . Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Versuchs-Zel- len ergaben sich allerdings erst nach einer mindestens zweistundigen Inkuba- tionsperiode. Wird die zu diesem Zeitpunkt gegebene strahlenbedingte Ver- minderung der Utilisierung des inaktiven U in Rechnung gestellt (Abb. 3), folgt, dai3 der tatsachliche RNA-Abbau mit der gewahlten Methode - ahnlich wie im Fall von TdR-3 H - unterschatzt wird. Mit dieser Einschrankung hinsichtlich der Aufstellung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung ergaben orientierende Versuche, dai3 sich vermehrter RNA-Abbau bereits nach Strahlendosen von 0,5-1 Gy nachweisen lafit. Somit deutet sich eine ahnliche Dosis-Wir- kungs-Beziehung an, wie sie von GERACI und Mitarbeiter (9 ) fur Thymuszellen nach Bestrahlung in vitro erarbeitet wurde.

Zum Vergleich mit den Untersuchungen von GERACI und Mitarbeiter ( 9 ) wurde im Rahmen der hier mitgeteilten Versuche auch der RNA-Abbau in Thymuszellen von Ratten nach GKB gemessen. Signifikante Veranderungen


100

Abb. 5. Verhalten der U-"C-Aktivi- tat der RNA von Rattenmilzzellen in Gegenwart von 1000 pg/ml (unmar- T I , , kierten) U nach AbschluS der 40min. Markierungsphase. - Punkt: Kontrol- len, Kreuz: Entnahme der Milz 2 h

nach GKB mit 10 Gy. - n = 4-6

f 70

30 60 120

tnkubation*loit [min]

30 00 120

Inkubalionrzail [min]

Abb. 6. Verhalten der U-"C-Aktivitat der RNA von Rattenthymuszellen in Gegenwart von 1000 pg/ml (unmarkierten) U nach Abschlui3 der 40min. Markierungsphase. - Punkt: Kon- trollen, Kreuz: Entnahme des Thymus

1 h nach GKB mit 10 Gy. - n = 4

ergaben sich dabei bereits 1 h nach Exposition (Abb. 6 ) : Wahrend der Einbau von U-14 C in die RNA-Fraktion um etwa 15 O / o erhoht war, nahm die Radio- aktivitat in der Nachmarkierungsphase nach Strahleneinwirkung rascher ab als bei den Kontrollen. Gegenuber den Verhaltnissen in der Milz sowie in vitro ergaben sich somit keine grundsatzlichen Unterschiede.

Als Ursachen fur die strahleninduzierte Freisetzung von DNA-Bruch- studten bzw. DNA-Untereinheiten in der Phase der Chromatinlabilisierung

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konnten enzymatische Vorgange wahrscheinlich gemacht werden (1 2, 27, 32 u. a.). Demgegenuber bleibt die Frage des Mechanismus des RNA-Abbaus nach Einwirkung ionisierender Strahlen offen. 1971 berichteten SOROTA und Mitarbeiter (25) uber Polysomenzerfall im Rattenthymus 18-48 h nach GKB rnit 26 Gy. Die Veranderungen gingen mit der Aktivierung einer neutralen RNase einher. Es ist naheliegend, auch fur den RNA-Abbau in der fruhen Nachbestrahlungsphase enzymatische Mechanismen anzunehmen.

Die Frage nach dem Stellenwert des RNA-Abbaus fur die Erklarung des Interphasetods mui3 vorlaufig offenbleiben. Im Zusammenhang mit dem Ver- such strahlengeschadigter Zellen, den DNA-Protein-Komplex der Zellkerne wiederherzustellen, konnte die Bedeutung verstarkten RNA-Abbaus in der Storung der Synthese essentieller Nukleoproteine liegen. Zu ahnlichen Schlus- sen fuhrte u. a. die strahleninduzierte Hemmung des Na+-abhangigen Aminosauretransports in Thymozyten bzw. T-Zellen in vitro in den ersten Stunden nach Bestrahlung mit Dosen im Bereich von 0,5-100 G y (17, 18). Der RNA-Abbau ist somit im Zusammenhang mit der Bedeutung der Synthese von Nukleoproteinen fur die Restitution des strahlengeschadigten DNA- Protein-Komplexes zu sehen.

Zusammenfassung Unmitttelbar sowie 1 und 2 Stunden nach Ganzkorperrontgenbestrahlung

(GKB, 0,s-10 Gy) wurden Milzzellen von Ratten in vitro rnit Thymidin- "H (TdR-3H) oder Ur id in- lT (U-llC) markiert. Nach Abschlui3 einer 40 min dauernden Markierungsphase wurde der Abbau der Desoxyribonukleinsaure (DNA) und der Ribonukleinsaure (RNA) mithilfe des Aktivitatsverlusts der entsprechenden Nukleinsaurefraktionen gemessen. Orientierende Versuche galten dem RNA-Abbau in Thymuszellen.

Ergebnisse: 1. Durch GKB wurde der Einbau von TdR-3H in die D N A fruher und nach kleineren Strahlendosen gehemmt als die Inkorporation von U - l C in die RNA. 2. Wurden Milz- und Thymuszellen in Gegenwart von Hydroxyharnstoff inkubiert, kam es zu Abbauvorgangen an den Nuklein- sauren, welche die R N A starker betrafen als die DNA. 3. Durch Rontgenbe- strahlung wurde der RNA-Abbau verstarkt. 4. Vermehrter RNA-Abbau konnte uber eine Storung der Nukleoproteinsynthese die Restitution des Chro- matins hemmen und in diesem Sinne den Interphasentod strahlengeschadigter Zellen mitbedingen.

Summary Ribonucleic acid breakdown in spleen and thymus cells of rats

after whole-body X-irradiation Immediately and 1 and 2 hours after whole-body X-irradiation (GKB,

0.5-10 Gy) the spleen cells of rats were marked in vitro with thymidine 3H (TdR-3H) or uridine-14C (U-14C). After a 40 min marking phase the breakdown of D N A and R N A was measured by the use of loss of activity of the corresponding nucleic acid fractions. Orientating studies were carried out on R N A breakdown in thymus cells.

Results: 1. Incorporation of TdR-3H into D N A was more rapid after irradiation of the whole body and after smaller doses was inhibited more than was incorporation of U-I4C into RNA. 2. If spleen and thymus cells were incubated, in contrast, with hydroxy-urea the process of breakdown of nucleic acids affected the R N A more than the DNA. 3. Irradiation intensified RNA breakdown. 4. Increased R N A breakdown can inhibit the restitution of chromatin by damaging nucleic acid synthesis and in this sense also conditions interphase death of irradiation-damaged cells.


RisumC DCmantklement de l’acide ribonucliique

dans des cellules de la rate e t du thymus chez des rats dont tout Ie corps a C t C soumis aux rayons X

Des cellules de la rate de rats ont k tk marqukes in vitro avec thymidine-sH (TdR-3H) ou uridine-14C (U-14C) immkdiatement a p r b 1 et 2 heures d’exposition du corps entier des animaux aux rayons X. A la fin d’une phase de marquage de 40 min., on a mesurk le dkmandlement de l’acide dksoxy- ribonuclkique (ADN) et de l’acide ribonuclkique (ARN) par la perte d’ac- tivitk des fractions d’acide nuclkique correspondantes. D’autres recherches ont concern6 la degradation d’ARN dans des cellules du thymus.

Rksultats: 1. L’incorporation de TdR-sH dans I’ADN fut inhibke plus rapide avec l’irradiation du corps entier et aprks de plus petites doses d’irradiation en comparant avec l’incorporation de UJ4C dans I’ARN. 2. Si les cellules de la rate et du thymus sont incubkes en prksence d’hydro- xyurke, des processus de dkmant&lement des acides nuclkiques apparaissent et atteignent plus fortement 1’ARN que I’ADN. 3. La dkgradation de I’ARN fut plus forte avec l’irradiation aux rayons X. 4. Un dkmantdement multi- plik d’ARN pourrait inhiber la restitution de la chromatine par un dCrange- ment de la synthkse des nuclkoproteines et conditionner ainsi la mort des interphases des cellules endommag6es par irradiation.

Resumen Des in tegradn del icido ribonucleico

en las cilulas del bazo y del timo de ratas tras irradiaci6n X de todo el cuerpo

Inmediatamente despuCs de la irradicaci6n de todo el cuerpo (ITC, 0,5- 10 Gy) y a1 cab0 de 1 y 2 horas, se marcaron las cklulas esplknicas de ratas in vitro con timidina 3H (TdR-SH) o uridina-14C (U-I4C). Despuks de una fase de marcaje, que durb 40 minutos, se midi6 la desintegracibn del icido desoxirribonucleico (DNA) y del icido ribonucleico (RNA) con ayuda de la pkrdida de actividad de las fracciones de icidos nucleicos correspondientes. Se llevaron a cabo ensayos de orientaci6n en la desintegracibn del RNA cn 10s timocitos.

Resultados: 1. Mediante la ITC se inhibi6 antes la incorporacidn de TdR-SH en el D N A y tras dosis de radiaci6n inferiores que la incorporaci6n de U-I4C en el RNA. 2. A1 incubar cklulas de bazo y timo en presencia de hidroxiurea se produjeron procesos de desintegraci6n en 10s Lcidos nucleicos, 10s cuales afectaron m& al R N A que al DNA. 3. Por medio de la irradiacibn X se refuerza la desintegracibn del RNA. 4. La desintegracibn incrementada del R N A podria inhibir la restituci6n de la cromatina a travCs de una alteracibn de la sintesis de las n6cleoproteinas, condicionando en este sentido la muerte interfisica de las celulas daliadas por la irradiacibn.

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Adresse des Autors: Prof. Dr. K. TEMPEL, Institut fur Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierarztlichen Fakultat der Universitat Miinchen, KoniginstraSe 16, D-8000 Munchen 22.

425-435.

31,119-131.

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Ribonukleinsäure-Abbau in Milz- und Thymuszellen von Ratten nach Ganzkörperröntgenbestrahlung