SISTEME DE ÎNCAPSULARE A UNOR COMPUŞI

UNIVERSITATEA DE TIINE

AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR, CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I

BIOTEHNOLOGII

DOMENIUL: BIOTEHNOLOGII

REZUMATUL

TEZEI DE DOCTORAT

SISTEME DE NCAPSULARE A UNOR COMPUI BIOACTIVI EXTRAI DIN ULEIURI VEGETALE

MONICA TRIF

Ing. Dipl. Biotehnolog

CONDUCTOR TIINIFIC:

PROF. Dr. Dr. h.c. HORST A. DIEHL

2009

Sisteme de ncapsulare a unor compui bioactivi extrai din uleiuri vegetale ________________________________________________________________________________________

II

CUPRINS

I. INTRODUCERE. SCOP I OBIECTIVE............................................................................ III

PARTEA II. CONTRIBUII PROPRII (ORIGINALE) ......................................................... IX

CAPITOL II. CARACTERIZAREA ULEIURILOR FUNCIONALE UTILIZATE LA BIONCAPSULARE ............................................................................................................... IX

II.1. MATERIALE I METODE ......................................................................................... IX

II.2. REZULTATE I DISCUII.......................................................................................... X

II.3. CONCLUZII .............................................................................................................. XIV

CAPITOLUL III. BIONCAPSULAREA ULEIURILOR: PROTOCOALE DE PREPARE A CAPSULELOR I CARACTERIZAREA LOR.................................................................... XV

III.1. MATERIALE I METODE...................................................................................... XV

III.2. REZULTATE I DISCUII .................................................................................... XVI

III.3. CONCLUZII............................................................................................................XXII

CAPITOL IV. EFICIENA NCAPSULRII I STUDII DE ELIBERARE A ULEIURILOR DIN CAPSULE....................................................................................................................XXII

IV.1. MATERIALE I METODE....................................................................................XXII

IV.2. REZULATTE I DISCUII ................................................................................. XXIII

IV.3. CONCLUZII ......................................................................................................... XXVI

CAPITOL V. CARACTERIZAREA FTIR A OXIDRII ULEIURILOR .....................XXVII

V.1. MATERIALE I METODE ..................................................................................XXVII

V.2. REZULTATE I DISCUII..................................................................................XXVII

V.3. CONCLUZII.........................................................................................................XXVIII

CONCLUZII GENERALE ................................................................................................ XXIX

BIBLIOGRAFIE SELECTIV ......................................................................................... XXXI

PUBLICAII PE DURATA STAGIULUI DOCTORAL SI PARTICIPARI LA SIMPOZIOANE I CONFERINE NATIONALE I INTERNAIONALE............... XXXIV


III

I. INTRODUCERE. SCOP I OBIECTIVE

BIONCAPSULAREA reprezint o tehnologie nou, bazat pe inseria i imobilizarea moleculelor bioactive, n suporturi specifice (matrici). Tehnologia ncapsulrii este bine dezvoltat i utilizat n industria farmaceutic, chimic, cosmetic, alimentar precum i n cea tipografic (Augustin et al., 2001; Heinzen, 2002). Potenialul bioncapsulrii s-a concretizat tot mai mult n domeniile biotehnologiei, mai ales n cele agricole i alimentare. n ultimele decenii, ncapsularea compuilor activi a devenit o tehnologie de mare interes i nsemntate, fiind adecvat att pentru ingredienii alimentari ct i pentru cei chimici, farmaceutici sau cosmetici.

Aplicarea acestei metode de success, de bioncapsulare a compuilor bioactivi extrai din uleiuri vegetale ar putea permite stabilirea combinailor i a calitailor optime ale acestor substane. Este de luat n considerare c o asemenea metod i anume bioncapsularea, aplicat n aria comercial, ar avea beneficii semnificative pentru industria farmaceutic, alimentar i cosmetic. n afar de aceasta este de consemnat faptul c, cercetarea i dezvoltarea n aceste domenii este semnificativ mai ales n ceea ce privete conservarea compuilor naturali bioactivi extrai din plante.

Scopul acestei tezei const n utilizarea diferitelor matrici naturale pentru bioncapsularea moleculelor bioactive prin metoda gelrii ionice (ionotropically crosslinked gelation), precum i n evaluarea diferenelor de calitate i a eficienei parametrilor pentru produii ncapsulai i nu n ultimul rnd a eliberrii controlate a moleculelor bioactive din matrici.

Structura tezei. Prima parte a acestei teze este reprezentat de un studiu de literatur, partea a doua include rezultatele experimentale: materiale i metode, rezultate i discuii, concluzii.

Prima parte (Studiul de literatur) este compus din patru capitole (I-IV):

Capitolul I. Bioncapsularea: definiie, principii, aplicaii, metode i tehnici

Capitolul II. Uleiuri vegetale funcionale: caracterizarea fizic, chimic i autentificarea

Capitolul III: ncapsularea uleiurilor: matrici, metode i tehnici de ncapsulare, evaluarea eficienei i a stabilitii

Capitolul IV. Metode pentru caracterizarea capsulelor

Partea a doua a tezei (Contribuiile proprii) include patru capitole, dupa cum urmeaz:

Capitolul V. Caracterizarea uleiurilor funcionale utilizate pentru bioncapsulare. Aceast parte caracterizeaz patru uleiuri funcionale (ulei de cnepa, ulei de dovleac, ulei extra virgin de msline i ulei de ctin) analizate i apoi ncapsulate prin diferite tehnici: spectroscopie de absorbie n ultraviolet (UV), cromatografie de gaze (GC) cu detecie prin ionizare n flacr (FID) i spectroscopie n infrarou cu transformant fourier echipat cu reflectan atenuat orizontal (FTIR-ATR), determinrile chimice fiind realizate n conformitate cu metodele descrise n A.O.A.C. i IOOC.


IV

Capitolul VI. Optimizarea protocoalelor de obinere a caspsulelor utiliznd matrici naturale i caracterizarea capsulelor ce conin ulei ncapsulat. Acest capitol descrie protocoalele pentru: sinteza capsulelor goale de diferite mrimi i concentraii, sinteza capsulelor de diferite mrimi i concentraii ce ncorporeaz ulei, caracterizarea capsulelor goale i a celor ce conin uleiuri (n funcie de mrime i morfologie), cuprinznd de asemenea i analiza FTIR-ATR i termic a capsulelor.

Capitolul VII. Studierea eficienei ncapsulrii i a eliberrii uleiurilor ncapsulate. Acest capitol conine studii cu privire la eficiena ncapsulrii uleiurilor funcionale n diferite matrici, determinarea ratei de eliberare a uleiurilor din capsule n timp i n diferii solveni, precum i eliberarea in vitro a uleiurilor din capsule.

Capitolul VII. Caracterizarea FTIR-ATR a oxidrii uleiurilor. Acest capitol include analize comparative a uleiurilor libere i ncapsulate supuse oxidrii n timp n condiii UV.

Planul experimental se bazeaza pe urmatoarele obiective:

Utilizarea diferitelor matrici naturale (precum alginatul, alginatul n complex cu k- caragenan i gume: xantan i guar, i chitosan) n scopul ncapsulrii uleiurilor funcionale (ulei de dovleac, ulei extra virgin de msline, ulei de cnep i ulei de ctin)

mbuntirea i optimizarea metodelor de bioncapsulare pentru uleiurile vegetale cu proprieti funcionale

Investigarea morfologiei diferitelor capsule obinute (microscopie electronic de scanare), caracterizarea capsulelor (suprafa, diametru, perimetru, elongaie, sfericitate i compactitate), analize FTIR

Investigarea uleiurilor funcionale bioncapsulate: eficiena i stabilitatea ncapsulrii, eliberarea controlat a uleiurilor ncapsulate, materialul i funcionalitatea capsulelor obinute, caracterizarea FTIR a uleiurilor libere, a capsulelor obinute i oxidarea uleiurilor libere i ncapsulate.

Cercetrile prezentate au fost efectuate la Departamentul de Chimie i Biochimie din cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Cluj-Napoca, n colaborare cu Universitatea Tehnic Berlin (TU Berlin), Germania, Departamentul de Tehnologie a Enzimelor, sub supravegherea Prof. Dr. rer. nat. Marion Ansorge-Schumacher. A dori de asemenea s mulumesc n mod special sponsorilor (Deutsche Bndestiftung Umwelt (DBU) Germany i EU COST 865) ce au facut aceste cercetri posibile, acordndu-mi cele dou burse pentru studiile doctorale.


V

INTRODUCERE

Microncapsularea este procesul de producere a capsulelor la o scar micrometric sau milimetric, fiind cunoscute sub numele de capsule.

Bioncapsularea beneficiaz de principiile fundamentale ale ncapsulrii i implic nvelirea efectiv a unei forme vii ntr-o membran care este inert, non-toxic pentru celul, i stabil la condiiile interioare ale reaciilor biochimice precum agitarea (Muralidhar R.V. et al., 2001).

Microcapsula este o capsul mic, iar procedura de preparare a acesteia este numit microncapsulare. Aceasta poate ncorpora diferite tipuri de forme materiale pentru a suplimeta funciile secundare i/sau pentru a compensa n diferite condiii de mediu.

Microcapsulele pot fi clasificate n trei categorii de baz n funcie de morfologia acestora: mononuleare, polinucleare sau de tip matrice.

Microcapsulele mononucleare conin membrana care protejeaz compusul bioactiv; n Fig.1. sunt prezentate cteva tipuri de capsule.

Fig. 1. Diferite tipuri de capsule utilizate (Birnbaum D.T. i Brannon-Peppas L., 2003)

Capsulele polinucleare prezint mai muli compui bioactivi ncorporai n interiorul

unei membrane. ncapsularea de tip matrice conine cmpusul bioactiv distribuit omogen pe toat suprafaa interioar.

Scopul microncapsulrii

n general exist numeroase motive pentru care substanele ar trebui ncapsulate (Li S.P. i col., 1988; Finch C.A., 1985; Arshady, R., 1993):

Cretera stabilitii pentru protejarea compuilor activi de mediul extern Pentru convertirea componenilor lichizi activi ntr-un sistem solid uscat Pentru separarea componenilor incompatibili din punct de vedere funcional Pentru a masca proprietile nedorite a componenilor activi Pentru a proteja mediul extern al microcapsulelor de componeni activi Pentru a controla eliberarea compuilr activi de procesel de eliberare ntrziat sau

eliberarea susinut Separarea omponenilor incompatibili


VI

Conversia lichidelor n solide Mascarea mirosului, activitii, etc. n scop farmaceutic

Tehnologia de ncapsulare este foarte bine dezvoltat fiind acceptat n multe industrii precum: farmaceutic, chimic, cosmetic, alimentar (Augustin et al., 2001; Heinzen, 2002).

n industria alimetar, grsimile i uleiurile, compuii aromatizani i oleorezinele, vitaminele, mineralele, coloranii i enzimele au fost deja ncapsulate (Dziezak, 1988; Jackson i Lee, 1991; Shahidi i Han, 1993).

Alegerea unei tehnici adecvate de bioncapsulare depinde de utilizarea final a produsului i de condiiile de procesare implicate n obinerea produsului final. Bioncapsularea i gsete aplicaie din ce mai mult aplicabilitate n domeniul biotehnologiilor i n special n alimentaie i agricultur. n ultimele decenii, ncapsularea compuilor activi a devenit un process de mare interes i nsemntate, fiind adecvat att pentru ingredienii alimentari ct i pentru cei chimici, farmaceutici sau cosmetici.

Pfutze S. (2003) consider c tehnologiile de ncapsulare pot fi divizate n dou categorii: formarea matricea capsulelor: un ingredient activ i protector formeaz granule

omogene. Produsul activ este uniform distribuit n granul fiind nconjurat din abunden de material protector, formnd matricea activ.

formarea nveliului capsulelor: materialul activ este granulat i acoperit de un strat protector. Materialul activ i protector este bine separat. Obiectivul principal este construirea unei bariere ntre particulele componente i

mediu. Aceast barier reprezint o protecie mpotriva oxigenului, apei, luminei; evitarea contactului cu alte particule sau ingrediente; sau controlul eliberrii lor n timp. Protecia compuilor bioactivi pe parcursul procesrii i pstrrii, precum i eliberarea controlat n tractusul gastrointestinal este o prioritate n exploatarea potenialului benefic al multor compui bioactivi.

Tehnicile utilizate la bioncapsulare necesit un material drept nveli i o substan protejat. Materialul utilizat trebuie aprobat de Administraia Alimentaiei i Farmacie (US) sau de Autoritatea European pentru Securitatea Alimentelor (Europa) (Amrita i col., 1999).

Coacervarea: ncapsularea lichidelor

Coacervarea complexelor (sau faza de separare), este prima aplicaie la scar larg a tehnologiei de microncapsulare. Coacervarea este un proces care are loc n soluii coloidale i de multe ori privit ca metoda original de ncapsulare (Risch, 1995).

Aplicabilitate coacervrii complexelor este enorm dar are i limite datorit costurilor ei ridicate, n unele aplicaii. Aceasta include ncapsularea:

aromelor vitaminelor cristaleor lichide pentru dispozitivele de display sisteme de imprimare


VII

ingredieni activi pentru industria farmaceutic bacteri i celule

Matricile materiale pentru ncapsulare

Exist diferite materiale ce pot fi utilizate pentru ncapsulare precum: polielectrolii sintetici (Sukhorukov i col., 1998; Donath i col., 1998), polielectrolii naturali (Shenoy i col., 2003), nanoparticule anorganice (Caruso i col., 2001), grsimi (Moya i col., 2000), colorani (Dai i col., 2001), ioni polivaleni (Radtchenk i col., 2005), i biomacromolecule (Yang i col., 2006).

n general trei clase de materiale au fost utilizate: materiale naturale derivate (colaen alginat), matrici tisulare acelulare (submucoase intestinale) i polimeri sintetici (acid poliglicolic, etc.). Aceste clase de biomateriale au foste testate n concordan cu biocomapatibilitatea lor (Pariente i col., 2002).

Biopolimerii sunt polimeri care provin din surse naturale, sunt biodegradabili, i nontoxici. Pot fi produi de sisteme biologice (ex: microorganisme, plante i animale), sau chimic sintetizate din materiale biologice (ex: amidon, grsimi sau uleiuri, etc.).

Polimeri naturali i derivai ai acestora: polimeri anionici: acid alginic, pectin, caragenan; polimeri cationici:chitosan, polilizin; polimeri amfipatici: colagen (and gelatin), chitin; polimeri neutri: dextran, agaroz, pululan.

Guma guar (E412, numit i guaran) este extras din seminele leguminoaselor din familia Cyamopsis tetragonoloba. Guma guar prezint vscozitate sczute dar este un bun agent de ntrire. Fiind un polimer non-ionic, nu este influenat de pH, dar este influenat de temperaturi extreme la anumite pH-uri (ex: pH=3 la 50C).

Alginatul (E400-E404) este produs extras din algele brune (Phaeophyceae, n special Laminaria). Proprietile de gelifiere depind de interacia cu unii ioni (Mg2+


VIII

Uleiul de msline conine trigliceroli i cantiti mici de acizi grai liberi, glicerol, pigmeni, compui aromatizani, steroli, tocoferoli, fenoli, componeni rinoi neidentificai, etc.(Kiritsakis A., 1998).

Uleiul de dovleac este foarte sntos, de caliate superioar, fiind n clasamentul primelor 3 uleiuri nutritive. Seminele de dovleac au un gust intens i sunt bogate n acizi grai polinesaturai. Uleiul brun are un gust amrui. Coninutul n tocoferoli ai uleiurilor oscileaz de la 27,1 la 75,1 g/g de ulei pentru -tocoferol, de la 74.9 la 492.8 g/g pentru -tocoferol, i de la 35.3 la 1109.7 g/g pentru -tocopherol (Stevenson i col., 2007)

Uleiurile de ctin conin o cantitate ridicat de acizi eseniali, linoleic i alfa linoleic (Chen i col., 1990), care sunt precursori ai altor acizi grai polinesaturai cum ar fi acidul arahidonic sau eicosapentanoic. Este stocat n organitele extracitoplasmatice numite vezicule de ulei, o form natural de ncapsulare (Socaciu et all, 2007, 2008). Uleiul din pulpa frutelor de ctin este bogat n acid palmitoleic i acid oleic (Chen i col., 1990).

Uleiurile conin de asemenea flavonoizi (Chen i col., 1991), carotenoizi, steroli liberi i esterificai, triterfenoli i izoprenoli (Goncharova i Glushenkova, 1996). Coninutul n carotenoizii variaz de asemenea n funcie de sursa de provenien a uleiului.

Proprietile fizice i chimice ale uleiurilor funcionale

Proprietile fizice i chimice ale uleiurilor, incluznd indicele de iod, de saponificare i valorile de aciditate i pentru peroxizi, indicele de refracie, densitate i materia nesaponificabil sunt determinate conform procedurilor standard. Indicele de iod msoar gradul de nesaturare al uleiurilor. Valoarea acestuia sub 100 demonstraz c uleiul prezint un grad redus de saturare (Pa Quart, 1979; Pearson, 1981). Indicele de saponificare este un indicator al mediei masei moleculare a acizilor grai prezeni n ulei (AOAC, 1980; Pearson, 1981). Indicele de peroxid este frecvent utilizat pentru msurarea stadiului de oxidare al uleiului. Acesta indic oscilarea oxidativ a uleiului (deMan, 1992).

Tehnicile pentru caracterizarea i autentificarea uleiurilor funcionale

Exist diferite tehnici pentru caracterizarea i autentificare produselor alimetare. Metodele de autentificare aplicate pentru uleiuri i grsimi pot fi clasificate ca i chimice (de separative) sau fizice (non-separative).

Spectrometrele de infrarou cu transformant fourier (FTIR) prezint multe avantaje n comparaie cu instrumentele convenionale de dispersie, printr-o excelent reproductibilitate i acuratee a lungimilor de und, precisa manipulare spectral i utilizarea unor programe chemometrice pentru calibrare. Accesoriile HATR au fost de asemenea larg utilizate n dezvoltarea metodelor FTIR pentru analizarea uleiurilor i a grsimilor, deoarece acestea pot oferi mijloace convenable i simple pentru o manipulare uoar (Sedman i col., 1999). Spectroscopia infrarou de mijloc (MIR) poate fi utilizat pentru identificarea compuilor organici deoarece unele grupe de atomi prezint proprieti ale frecvenei de absorbie a vibraiilor n regiunea infraroie a spectrului electromagnetic. Reflectana orizontal total atenuat (HATR) este accesoriul cel mai des utilizat in metoda FTIR pentru analizele uleiurilor i a grsimilor (Sedman i col., 1999).


IX

O larg varietate de alimente utilizeaz pentru ncapsulare aromatizani, acizi, baze, ndulcitori artificiali, colorani, antioxidani, ageni cu arome nedorite, mirosuri, etc. Acetia i pstrez bioactivitatea i rmn accesibili agenilor externi.

Fitosterolii, flavonoizii i compusii organici cu sulf, reprezint trei grupe de compui caracteristici fructelor i legumelor, care ar putea prezenta importan n reducerea riscului de ateroscleorz. (Howard i Kritchevsky, 1997). Unele substane fitochimice, cu ar fi acidul ascorbic, carotenoizii, vitamina E, fitofenoli, izoflavoni i fitosteroli, au fost evideniate ca ingredieni fiziologic activi ce mbuntesc rezistena la anumite boli.

ncapsularea poate fi utilizat pentru condiionarea uleiurilor n forme solide sau solubile n ap, extinznd utilizarea lor n multe alte aplicaii. ncapsularea uleiurilor include ca metode i tehnici: spray-drying, spray-chilling, fluid bed encapsulation, extrusion encapsulation i ncapsularea prin coacervare.

Extrudarea este utilizat pentru ncapsularea mineralelor i vitaminelor n uleiuri (grsimi saturate) ntr-o matrice de tip polizaharidic (Van Lengerich i Lakis, 2002). Protecia mpotriva oxidrii metil-linoleatului ncapsulat cu gum acacia prin metoda spray drying i freeze drying, depinde de umiditatea relativ a mediului (Minemoto i col., 1997).

n majoritatea cazurilor matricile utilizate pentru ncapsularea uleiurilor i grsimilor sunt gume (acacia, arabic), proteine, carbohidrai (cazein/zaharuri), maltodextrin, beta-ciclodextrine, alginat de sodiu, gelatin.

PARTEA II. CONTRIBUII PROPRII (ORIGINALE) CAPITOL II. CARACTERIZAREA ULEIURILOR FUNCIONALE UTILIZATE LA BIONCAPSULARE

Uleiurile extrase din plante (floarea-soarelui, dovleac, soia, rapita, etc.) sunt foarte utilizate in domeniul alimentar, dar si in alte industrii (cosmetic, farmaceutic, etc.). Prezint o deosebita insemnatate datorita numerosilor componeni benefici care intr n alctuirea lor. Calitatea i autenticitatea acestor uleiuri se realizeaz prin diferite tehnici. Cele mai utilizate trei tehnici n vederea caracterizrii acestor uleiuri sunt: spectrometriA UV-Vis, cromatografia gaz cu detecie prin ionizare n flacr FID, i spectroscopia infrarou cu transformant fourier (FTIR).

II.1. MATERIALE I METODE

Au fost alese n vederea ncapsulrii patru uleiuri de mare interes: ctin (SBO) extras din fructele de catina, colectate din regiunea Clujului (Transilvania, nordul Romaniei), ulei de msline extra virgin (EVO) din Italia, cnep (HP) i dovleac (PK) din Romania.

Analizele chimice au fost determinate conform metodelor descrise de: A. O. A. C. i IOOC sau de Comisia Uniunii Europene (EU): aciditatea i indicele de iod. Toate probele au fost analizate n triplicat. Aciditatea a fost calculat lundu-se n considerare coninutul de


X

acizi grai liberi ale uleiurilor analizate, determinat prin titrare conform metodei oficiale Ca 5a-40. Indicele de iod a fost determinat prin metoda AOCS Cd 1c-85 (1997).

II.2. REZULTATE I DISCUII

Determinarea aciditii i a indicelui de iod

Rezultatele analizelor chimice prezentate n Tabelul II.1. au demonstrat o bun corelaie a valorilor obinute cu cele publicate n literatur.

Tabel II.1. Caracteristicile chimice i fizice ale uleiurilor analizate n comparaie cu literatura

Ulei de Cnepa Ulei de msline extra virgin

Ulei de dovleac Ulei de ctin

Caracteristicile fizice si chimice

Aciditate

(mg KOH/g ulei)

1.93 / 4.0* 2.64 / 6.6* 1.32 / 4.0* 3.7 / 4.0*

Indicele de iod** 162 / 145-166* 87 / 75-95* 130 / 116-133* 71 / 98-119*

**Indicele de Iod a fost calculat cu metoda AOCS Cd 1c-8

* Date din literatura

Aceste date demonstreaz faptul c valorile acestor uleiuri corespund cu indicii de calitate ai iodului din Codex, excepie uleiul de ctin, a crui valori n cazul aciditii nu corespund intervalelor aciditii precizate n literatur.

Determinarea amprentei uleiurilor prin spectrometrie ultra violet/visibil (UV-Vis)

Caracterizarea spectral (fingerprintul) specific fiecrui ulei analizat prin UV-Vis este prezentat in Fig. I.1. Diferenele dintre un ulei autentic si un ulei falsificat a fost demonstrate prin poziia i absorbana peakurilor caracteristice fiecrui ulei (Socaciu C. et al., 2005).

Ulei de cnep (Cannabis sativa L)

Amprenta spectral UV-Vis caracteristic uleiului de cnep n conformitate cu datele precizate de OMLC, este dat de coninutul ridicat n pigmeni clorofilici, avnd absorbana maxim la 411 nm (Fig.II.1.A.).


XI

A. B

C. D.

Fig.II.1. Spectrele UV-Vis ale uleiurilor analizate (amprenta specific n regiunea 350-600 nm continnd detalii referitoare la maximul absorbantei peakului specific: A. Ulei de cnep; B.

Ulei de msline extra virgin (EVO); C. Ulei de dovleac (PK); D. Ulei de ctin (SB)

Ulei de msline extra virgin (Olea europaea )

Culoarea caracteristic uleiului de msline depinde de majoritatea pigmenilor coninui, n principiu acest ulei avnd un coninut ridicat n carotenoide i clorofile. Uleiul provenit din mslinele ajunse la maturitate prezint o culoare galben datorit continutului n pigmeni carotenoidici galbeni. n general culoarea acestui ulei variaz i este datorat combinaiei i diferetelor proporii de pigmeni. Exista o simpl ecuaie: Culoarea= clorofil (verde) + carotenoide (galben) + ali pigmeni.

Coninutul n pigmeni clorofilici se diminueaza odat cu atingerea maturitii fructelor. Fingrprintul specific uleiului de msline analizat este atribuit ecuaiei culorii menionat anterior (Fig.II.1.D.).

Ulei de dovleac (Cucurbita pepo)

Amprenta spectral (fingerprintul) a acestui ulei este acceptat ca avand doua umere, unul la 418 nm cu absorban mai mic, i unul la 435 nm cu absorban mai mare


XII

(Fig.II.1.C.), n cazul falsificrii sau oxidrii, acest ulei prezint absorbanele celor dou umere schimbate (Lankmayr i col., 2004).

Uleiul de ctin (Hippophae rhamnoides)

Spectrului acestui ulei demonstreaz ca fingrprintul este dat de cele trei umere care dau spectrul, care sunt caracteristice carotenoidelor, mai exact beta-carotenului, intre 400 i 500 nm (Fig.II.1.A.), acesta fiind compusul principal al acestui ulei (Lichtenthaler i Buschmann, 2001).

Analiza uleiurilor prin spectroscopia infrarosu cu furie transformata (FTIR)

Studiile FTIR ale uleiurilor analizate au demonstrate existenta relatiei intre fecventele si absorbantele benzilor specifice si compozitia acestora. Aceste frecvene i valoarea absorbanei lor, au fost utilizate n continuare pentru evaluarea oxidarii uleiurilor (Guillen, M. D. i Cabo, N, 1997, 1998, 1999, 2000, 2002).

n conformitate cu aceste spectre au fost identificate principalele benzi i frecvente n domeniul infrarou ale uleiurilor analizate ( Tabel II.2.).

Tabel.II.2. Benzile infrarou relevante ale uleiurilor investigate

Nr. banda

HP

(cm-1)

EOV

(cm-1)

PK

(cm-1)

SB

(cm-1)

Grupul functional Modul de vibratie

1 3008 3005 3008 3006 =C-H (cis-) de ntindere

2 2956 2956 2956 2956 -C-H (CH3) de ntindere (asimetric)



5 1742 1742 1742 1742 -C=O (ester) de ntindere

6 1654 1653 1653 1653 -C=C- (cis-) de ntindere

7 1463 1464 1464 1464 -C-H (CH2, CH3)

8 1456 1456 1456

9 1418 1417 1418 1417 =C-H (cis-) de deformare

10 1396 1402 1398 1402 de deformare

11 1377 1377 1377 1377 -C-H (CH3) de deformare (simetric)

12 1317 1319 de deformare

13 1236 1238 1238 1238 -C-O, -CH2- de ntindere, de deformare


XIII

14 1155 1159 1157 1161 -C-O, -CH2- de ntindere, de deformare

15 1120 1118 1120 1116 -C-O de ntindere

16 1097 1097 1099 1095 -C-O de ntindere

17 1028 1028 1029 1033 -C-O de ntindere

18 958 962 968 -HC=CH- (trans-) de deformare nafara planului

19 914 914 -HC=CH- (cis-) de deformare nafara planului

20 721 721 721 721 -(CH2)n-, -HC=CH- (cis-)

de deformare ( rocking)

Spectrele uleiurilor analizate par a fi in principiu similare, ns diferenele n intensitatea benzilor ca de altfel i a frecvenelor fac posibil diferenierea foarte clar a compoziiei acestor uleiuri (see Fig. II.2.).

Fig.II.2. Spectrul FTIR-ATR al zonei de fingerprint (1700-800 cm-1) a uleiurilor analizate HP= cnep, EVO (EOV) = msline extra virgin; PK= dovleac; SB= ctin


XIV

Profilul acizilor grai prin cromatografia gaz

Compoziia acizilor grasi analizai prin GC-FID in acest studio sunt evidentiati in Tabelul II.3. Profilul acizilor grai a fost comparat cu al uleiurilor din literature.

Tabel.II.3. Compoziia procentual a acilor grai din uleiurile analizate

Acizi grasi % Ulei de Canepa Ulei de masline extra virgin

Ulei de dovleac Ulei de catin

Palmitic (16:0) 7.48 7.28 6.29 7.76

Stearic (18:0) 1.66 2.67 3.64 0.3

Arachidic (20:0) 1.06 - - 0.11

saturati % 10.02 9.95 9.93 8.17

Palmitoleic (C16:1)

Oleic

(C18:1) Linoleic

(C18:2)

Linolenic

(18:3n3)

Eicosadienoic (C20:2)

-

14.94

72.6

-

0.55

-

36.81

43.14

0.93

-

-

42.44

46.71

0.92

-

5.4

6.3

-

0.8

-

nesaturati % 87.54 80.88 90.07 12.5

C18:1/C18:2 0.21 0.85 0.91 6.3

omega 3 : omega 6 acizi grasi - 0.022 0.02 -

II.3. CONCLUZII

Prin GC-FID, s-a determinat compoziia n acizi grai a uleiurilor analizate i s-a facut comparaia cu datele din literatur. n urma acestei analize s-au concluzionat urmatoarele:

compoziia uleiului de cnep nu corespunde cu valorile precizate n literatur pentru acizii grai, acesta avand un coninut mai sczut. Acidul oleic se incadreaz in intervalul prevzut in literatur

principalii acizi grai n uleiul de msline extra virgin sunt acidul oleic i linoleic, i de asemenea n cantitate mai mic acidul lonoleic


XV

n cazul uleiului de dovleac, compoziia n acizi grai corespunde cu valorile precizate n litaratura, excepie facnd acizii palmitic i stearic care sunt prezeni in concentrii mai mici

profilul acizilor grai a uleiului de ctin a demonstrat faptul c acest ulei provine din pulpa/pielea fructelor i nu din semine, fiind foarte bogat in acidul palmitic i oleic

CAPITOLUL III. BIONCAPSULAREA ULEIURILOR: PROTOCOALE DE PREPARE A CAPSULELOR I CARACTERIZAREA LOR

III.1. MATERIALE I METODE n vederea realizrii parii experimentale din acest capitol s-au utilizat urmatoarele:

matrici pentru ncapsulare: alginat, k-caragenan, chitosan, gum xantan i gum guar, procurate de la Sigma Aldrich

solvenii si reactanii necesari de asemenea de la Sigma Aldrich uleiurile utilizate la ncapsulare au fost prezentate in capitolul anterior

Protocol pentru sintetizarea capsulelor goale de diferite mrimi i concentraii

Diferite concentratii de alginat (1%, 1.5%, 2% w/v), amestec de: alginat si caragenan, alginat si guma xantha, alginat si guma guar au fost dizolvate in apa deionizata pentru ~ 30 minute. Diferite concentratii de chitosan (1%, 1.5%, 2% w/v) au fost dizolvate 0.7% v/v acid acetic glacial.

Alginatul i amestecul de alginat au fost pipetate ntr-o solutie de 2% CaCl2 n apa (ca i baie de ntrire), utiliznd o pompa peristaltica cu un injector de 0.4 x 20mm, iar capsulele au fost formate instantaneu.

Chitosanul a fost pipetat in 5% (w/v) solutie de NaTPP in apa (ca si baie de intarire), utiliznd pipeta pentru control.

Dupa ~ 1h, capsulele au fost separate din baia de intarire i transferate n placi Petri pentru protecie si conservare.

Protocol pentru sintetizarea capsulelor de diferite mrimi i concentraii cu uleiri ncorporate

S-au luat n considerare doar concentraiile de matrici care au prezentat emulsiile cele mai stabile. De asemenea vscozitatea soluiilor a fost considerat un factor principal n vederea alegerii concentraiilor de matrici. Protocolul pentru obinerea capsulelor a fost descris anterior.


XVI

Evaluarea microscopica a emulsiilor naintea ncapsulrii

Evaluarea microscopic a emulsiilor naintea ncapsulrii a fost determinat utiliznd un microscop Olimpus optical microscope BX51M, echipat cu camera digital.

Caracterizarea capsulelor: dimensiuni i morfologie, analize FTIR i termice

Parametri luai in considerare n vederea caracterizrii capsulelor, precum dimensiune, arie, perimetru, elongaie si compactitate, au fost determinai utiliznd UTHSCSA ImageTool ca i software.

Morfologia suprafeei capsulelor a fost determinat utilizndu-se microspia electronic scanat (Hitachi S-2700, iMOXS, cu detector BSE). Capsulele analizate au fost suflate i nvelite n aur naintea supunerii analizelor microscopice.

III.2. REZULTATE I DISCUII

Evaluarea microscopica a emulsiilor naintea ncapsulrii

Stabilitatea emulsiilor este un factor cheie n evaluarea n condiii de temperatura n vederea pstrrii timp mai ndelungat a produselor pe baze de emulsii.

Mrimea picturilor de ulei dispersate in structura matricilor dizolvate care au fost comparate in vederea evaluarii stabilitatii emulsiilor obtinute. Emuliile cu cea mai bun stabilitate n timp au fost utilizate mai departe pentru ncapsulare. Mrimea picturilor de uleiuri au fost dispersate uniform in matrici, n funcie de stabilitatea matricei, uniformitatea crescnd odat creterea concentraiei matricilor (Fig.III.1.).

Caracterizarea capsulelor

Dupa obtinerea emulsiilor, si pipetarea lor in baile de intarire, datorita interactiilor cu ionii de legare in vederea formarii gelurilor.

Capsulele continand uleiuri au avut o forma aproximativ sferica, culoare variind intre alb-galbui si portocaliu.

Lundu-se in considerare toate caracteristicile capsulelor obtinute, si facand o comparatie intre aceste caracteristici ale capsulelor goale i a celor continand uleiuri, s-a constatat ca incorporarea uleiurilor n capsule modifica aceste caracteristici (Fig.III.2.). Compararea capsulelor ntre ele continand uleiuri, a demonstrat ca sfericitatea i compactitatea nu au fost prea mult afectate de incorporarea uleiurilor. Insa in cazul diametrului, ariei, elongatia, au fost clar determinate diferente foarte mari.


XVII

A. B.

C. D.

Fig. III.1. Imagini microscopice ale diferitelor emulsii: A. alginat 2%; B. alginat 1%; C. complex alginat-gum guar; D. complex alginat-gum xantan. Scala reprezint 5 m.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

AG-C

AR (0

.5:0.5

)

AG-C

AR (0

.75:0.

75)

AG-X

G (0.75:0

.75)

AG-X

G (0.5:0.

5)

AG-G

G (0.75

:0.75

)

AG-G

G (0.5:

0.5)

AGoil

2%

AGoil

1.5%

AGoil

1%

CHoil

2%

CHoil

1.5%

CHoil

1%

Samples/Probele

Para

met

er v

alue

s/Va

loar

ea p

aram

etril

or

Area / Aria (cm2)

Perimeter / Perimetru

Elongation (axes ratio)/Elongatia (raportul axelor)Roundness (up to 1) /Sfericitatea val. max. 1 Diameter / Diametrul (cm)

Compactness (up to 1)/Compactitatea (val. max. 1)

Fig.III.2. Reprezentarea grafic comparat a caracteristicilor capsulelor din complexul alginat cu k-caragenan,

gume xantan i guar, alginat i chitosan continnd ulei: AG-CAR (0.5:0.5) = complex alginat-k-carrageenan (raport 0.5:0.5) continnd ulei; : AG-CAR (0.75:0.75) = complex alginat-k-carrageenan (raport 0.75:0.75)

continnd ulei; AG-XG (0.75:0.75) = complex alginate-guma xantan (raport 0.75:0.75) continnd ulei; AG-XG (0.5:0.5) = complex alginate-guma xantan (raport 0.5:0.5) continnd ulei;AG -GG (0.75:0.75) = complex

alginate-guma guar (raport 0.75:0.75) continnd ulei; AG -GG (0.5:0.5) = complex alginate-guma guar (raport 0.5:0.5) continnd ulei; AGoil2% = capsule alginat 2% continnd ulei; AGoil1.5% = capsule alginat 1.5%

continnd ulei; AGoil1% = capsule alginat 1% continnd ulei; ; CHoil2% = capsule chitosan 2% continnd ulei; CHoil1.5% = capsule chitosan 1.5% continnd ulei; CHoil1% = capsule chitosan 1% continnd ulei


XVIII

Microscopia electronic scanat (SEM)

Scopul acestor analize a fost de a evalua si caracteriza topologia capsulelor obtinute continand uleiuri. Suprafata capsulelor a fost non-regulara, aceasta datorita picaturilor de ulei prezente, exceptand chitosanul care prezinta o suprafata mult mai mata (Fig.III.3.A).

Fotografiile SEM ale capsulelor nu prezint porozitate (Fig.III.3.).

A. B.

Fig.III.3. Morfologia suprafetei diferitelor capsule obtinute continand uleiuri utilizand microscopia electronica de scanare: A. alginat-caragnan complex; B. chitosan. Bara indicand scala este reprezentata in fiecare poza.

Magnificatia 70x.

Analizele FTIR

Caracterizarea FTIR a matricilor

n urma analizelor FTIR-ATR s-a realizat caracterizarea matricilor utilizate la ncapsulare, realizndu-se astfel o comparaie ntre matrici (AG, CAR, CH, GG, XG). Principalele frecvene caracteristice matricilor n vederea identificrii individuale sunt: 3244-3302 cm-1 (O-H stretch), 1400-1474 cm-1 (CH2 bending), 1000-1200 cm-1 (C-O i C-C stretch), 924-1000 cm-1 ( poly OH i CH2 twist), 776-892 cm-1(glycoside).

Vibraiile i grupurile funcionale

AG CAR GG XG CH

OH intindere 3244 3514

grupul poliOH

3299 3302 3289

O-H +

N-H de ntindere


XIX

CH ntinderea grupului CH2 2926 2953, 2911, 2894 2884 - 2935

C-O de ntindere ( COOH) 1597 - 1636 - 1651

deformarea gruprii CH2 1408 1474, 1400 1408 1400 1428

O-H deformare - 1223 ( S=O vibraia de ntindere a sulfet

esterului)

1350 1247 -

C-O i C-C ntindere 1200-1000 - 1145 1150 1151

CH2OH modul de ntindere 1054 1063 1054 1061

Gruparea COH alcolic

(C-O ntinderea zaharidelor)

1024 1024 - 1025 1024

CH2 vibraie 948, 902,

Provenite de la acizii: guluronic i maluronic

924, 910

Gruprile polihidroxi

1016 - -

legaturile glicozidice 809 842

Sulfatul galactozic, legatura glicozidic

866,777

(1,4; 1,6) legatura galactozei i

manozei

785

C-H de deformare

C-C ntindere

892,

776

FTIR characterization of different beads containing oils

Spectrele matricelor, ale capsulelor goale, capsulelor continand uleiuri au fost analizate. Concentratia matricelor nu a influentat caracteristicile capsulelor prin FTIR. Un exemplu concludent este reprezentat in Fig.III.4., spectrele uleiului de ctin (SB) i ale capsulelor din alginat 2% coninand ulei SB.

n urma ncapsulrii uleiului de SB n capsule de alginate, se produce o cretere a intensitii absorbanei la 3400 cm-1 (care este direct proporional cu creterea concentraiei de alginate utilizat la ncapsulare) precum i o shiftare a unor peakuri spre valori i frecvene mai sczute n regiunea 1000-1500 cm-1, regiune specific uleiului de SB

Spectrele amestecului de uleiuri si capsule au demonstrat prezenta peakurilor specifice uleiurilor in doua zone distuncte (2800-2900 cm-1 i 1700-900 cm-1), confirmndu-se astfel prezena uleiurilor n capsule.


XX

Fig.III.4. Spectru FTIR-ATR nregistrat pentru: A. Capsule de alginat 2% coninnd SB; B. pudr alginat; C.

ulei SB; D. capsule goale de alginat 2%

Analize termice

Analize DSC

Termogramele DSC ale uleiurilor libere si ale diferitelor capsulelor continand uleiuri, au fost masurate.

Cateva dintre peakurile endotermice, ca si exemplu ale uleiului de catina, si ale unor capsule continand ulei de catina, sunt prezentate in reprezentarea grafica din Fig.III.5.; temperature peakurilor cerste direct proportional cu cresterea temperaturii, fiecare peak fiind characteristic fiecrui tip de capsula obinut.

Analize termogravimetrice

Termogramele TGA ale uleiurilor libere si ale diferitelor capsulelor continand uleiuri, au fost masurate.

Cateva rezultate referitoare la pierderea in masa a diferitelor tipuri de capsule obtinute, este prezentata in graficul din Fig.III.6.. Pierderea n greutate, reprezentata in figura anterioara, demonstreaza ca aceasta se datoreaza continutului ridicat in apa a unor capsule. Uleiurile nu influenteaza foarte mult pierderea in greutate, la un ulei liber aceasta fiind de 99.44%. Dar in timpul procesului de oxidare aceste uleiuri pierd din greutate, datorita reactiilor oxidarii.


XXI

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

AG 2% AG 1.5%

Alginate 1%

AG-CAR(0.75%)

CH 2% CH 1% AG-GG AG-KG SB

Tem

pera

ture

(C

)

Fig. III.5. Reprezentarea grafica a peakurilor endotermice ale unor tipuri de capsule

DSC si TGA au fost in ultimul timp foarte mult utilizate in monitorizarea stabilitatii, a comportamentului termic, a parametrilor de cinetica in diferite uleiuri (Jayadas et al., 2006; Milovanovic et al., 2006; Bahruddin et al., 2008). n acest studiu analizele termice au fost efectuate pana la temperatura de 300C. Diferenele nu foarte mari ntre probe se datoreaza tocmai acestei temperature, deoarece conform cu literatura, oxidarea uleiuriloe prin metode termice se poate determina la expunerea probelor la o temperatura mai mare de 300C, iar pierderea in greutate poate fi pana la 10%, aceasta depinznd de natura uleiului (Jayadas et al., 2006; Milovanovic et al., 2006; Bahruddin et al., 2008).

0

20

40

60

80

100

120

AG 2% AG 1.5% AG-CAR(0.75%)

AG-GG AG-KG SB

Rest

mas

s %

Fig.III.6. Reprezentarea grafic a pierderii de mas % a probelor analizate TGA

Scopul acestor analize termice a fost acela de a analiza i a determina stabilitatea termic a capsulelor obinute continnd diferite uleiuri, n vederea viitoarelor aplicaii ale acestora n domeniul alimentar i cosmetic. n astfel de aplicaii se cunoate necesitatea


XXII

sterilizrii probelor sau expunerea la presiuni nalte n vederea evitrii biohazardului sau contaminrii, aceste tratamente fiind facute n timpul proceselor tehnologice.

III.3. CONCLUZII

Studiile experimentale realizate, cu scopul bioncapsulrii unor uleiuri funcionale n matrici naturale, utiliznd ca i metod ionotropically crosslinked gelation, au demonstrate posibilitatea utilizrii acestei tehnici n vederea bioncapsulrii unor compui naturali i eliberarea lor condiionat.

Cele mai bune matrici n vederea bioncapsulrii uleiurilor s-au dovedit a fi: alginatul i chitosanul n concentrii de 2%, 1.5% i 1%, complexele alginatului cu k-caragenan, i gume guar i xantan n raport de concentraie 0.75:0.75.

Rezultatele au artat faptul c bioncapsularea uleiului a afectat diametrul capsulelor, acesta crescnd direct proporional cu cantitatea de ulei utilizat pentru ncapsulare. De asemenea i ceilali parametri masurai n vederea caracterizrii capsulelor au fost influenai i de cantitatea de ulei utilizat.

Prin analizele FTIR-ATR, diferitele capsule coninnd uleiuri au prezentat peakuri care sunt atribuite atat uleiurilor ct i capsulelor goale (regiunile dintre 2800-2900 cm-1 i 1700-900 cm-1). Astfel se demonstreaz prezena uleiurilor n capsule, deci ncapsularea acestora.

CAPITOL IV. EFICIENA NCAPSULRII I STUDII DE ELIBERARE A ULEIURILOR DIN CAPSULE

IV.1. MATERIALE I METODE

Eficina ncapsulrii e uleiurilor n capsule

ncapsularea uleiurilor a fost determinat calculnd cantitatea de beta-caroten sau cantitatea de carotenoid care este principalul component major al fiecrui ulei analizat nainte i dup ncapsulare. Aceast determinare a fost realizat spectrofotometric, iar eficina ncapsulrii (EE%) a fost calculat conform ecuaiei:

EE% = C1/C2 x 100, C1= concentraia carotenoid din ulei iniial

C2= concentraia carotenoid din ulei dup ncapsulare


XXIII

Msurarea ratei de eliberare a uleiurilor din capsule

Eliberarea controlat a uleiurilor din capsule a fost determinata de asemenea spectrofotometric, utiliznd un spectrofotometru CarWin 50 UV-VIS. Msurtorile au fost facute n triplicat la temperatura camerei, utilizndu-se cuvete de cuar de 2 mm.

Eliberarea in vitro a uleiurilor din capsule

Stimularea fluidului gastric a fost realizat conform urmatorul protocol:

timp de o ora la pH 1.2 intr-o solutie de 0.1N HCl cusi 5 ml Sanzyme (sirop de enzime continand 80 mg papaina, 40 mg pepsina and 10 mg sanzyme 2000)

in urmatoarele 2-3 ore capsulele au fost transferate in intr-o solutie in vederea stimulatii fluidului intestinal pH 4.5 tot asa cusi fara enzyme

urmatoare ore au fost transferate in solutie stimuland fluidul intestinal la pH 7.4, aceasta fiind formata din KH2PO4 1.074g in 30 ml de 0.2N NaOH, si pancreatina 275 mg (utilizand Triferment)

toate testrile s-au efectuat la 37C cu barbotare continu de CO2

IV.2. REZULATTE I DISCUII

Eficina ncapsulrii e uleiurilor n capsule

Eficiena ncapsulrii este reprezentata n graficul din Fig.IV.1. pentru diferite tipuri de capsule. Valorile prezentate sunt ale uleiului de ctin, nsa pentru toata uleiurile analizate aceasta eficien a prezentat aceleai valori.

Dup cum se poate observa i n graficul prezentat, eficiena ncapsulrii este direct proporionala cu creterea concentraiei matricilor. Dintre toate matricile i complexele de matrici utilizate, dup cum se poate observa i in graficul din Fig.IV.1., s-a obinut cea mai bun eficiena a ncapsulrii utiliznd ca i matrici: alginatul n concentraie de 2%, chitosanul in aceeai concentraie, urmate de concentraiile de 1.5%, i de alginatul n complex cu k-caragenan i gume n raport de 0.75:0.75%.


XXIV

Fig.IV.1. Reprezentarea grafica comparata a eficientei incapsularii a uleiurilor in capsule din complexul alginat cu k-caragenan, gume xantan si guar, alginat si chitosan : AG2% = capsule alginat 2% ; CH2% = capsule

chitosan 2% ; CH1.5% = capsule chitosan 1.5% ; AG1.5% = capsule alginat 1.5% ; AG-CAR (0.75:0.75) = complex alginat-k-carrageenan (raport 0.75:0.75) ; AG-XG (0.75:0.75) = complex alginate-guma xantan (raport

0.75:0.75); CH1% = capsule chitosan 1%; AG -GG (0.75:0.75) = complex alginate-guma guar (raport 0.75:0.75) ; AG1% = capsule alginat 1% ; AG -CAR (0.5:0.5) = complex alginat-k-carrageenan (raport 0.5:0.5); AG -GG (0.5:0.5) = complex alginate-guma guar (raport 0.5:0.5); AG-XG (0.5:0.5) = complex

alginate-guma xantan (raport 0.5:0.5)

Msurarea ratei de eliberare a uleiurilor din capsule

Ca i sisteme de eliberare s-au luat in considerare 3 solveni: tetrahidrofuran (THF), metanol si hexan. n toate cazuri s-a evidentiat o rapida eliberare in THF ca si solvent din toate capsule obtinute, si o mai lenta eliberare in cazul metanolului si o foarte slaba in cazul hexanului (vezi Fig.IV.2., graficele fiind parte din lucrarea publicata in revista Chemick Listy Journal (IF=0.683)). THF este considerat i n litaratura ca fiind solventul cel mai eficient n extracia carotenoidelor, lucru dovedit i n acest studiu. Rata de eliberare a uleiurilor din capsule depinde de difuzitatea i solubilitatea uleiului n matrice.

Eliberarea uleiurilor din capsule a demonstrat faptul ca alginatul, complexul dintre alginat cu k-caragenan i gume, precum i chitosanul, sunt matrici pretabile la ncapsularea uleiurilor vegetale.


XXV

A.

B.

Fig.IV.2. Reprezentarea grafica a eliberarii in timp din diferitele capsule in metanol si hexan, ca si solventi

Eliberarea in vitro a uleiurilor din capsule

n cazul mimrii mediului digestiv s-a demosntrat stabilitatea capsulelor la pH 1.2 si pH 4.5, dizolvarea acestora si eliberarea continutului realizandu-se la pH 7.4, atat in cazul solutiilor continand enzime cat si a celor fara continut enzimatic n cazul capsulelor din alginat i alginat n complex cu k-caragenan i gume (Fig.IV.3.), ceea ce demonstreaza aplicabilitatea viitoare a acestor capsule continand ulei de catina ca si nutraceutice sau in industria farmaceutica. Capsulele de chitosan nu s-au dizolvat la nici unul dintre pH-urile testate.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 100 200 300 400

Wavelenght (nm)

Abso

rban

ce (a

.u.) Chitosan 1.5% in methanol

Chitosan 1% in methanolChitosan 1% in hexaneChitosan 1.5% in hexaneAlginate 2% in methanolAlginate 2% in hexane

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 100 200 300 400

Wavelenght (nm)

Abs

orba

nce

(u.a

.)

Alginate-carrageenancomplex in hexaneAlginate-carrageenancomplex in methanolAlginate 2% in methanol

Alginate 2% in hexane


XXVI

A. B.

C. D.

Fig.IV.3. Eliberarea in vitro a uleiului de catina din capsulele de alginate 2% de la stanga la dreapta in fiecare poza fluidele stimulatoare fara enzyme si cu adios de enzyme (Sanzyme): A. capsulele obtinute; B. dupa 1 ora in stimulatul fluid gastric la pH 1.2; C. dupa 3 ore in mixul dintre fluidul gastric si fluidul intestinal la pH 4.5; D. in

stimulatul fluid intestinal pH 7.4 dupa 30 minute

IV.3. CONCLUZII

Studiile referitoare la eficiena ncapsulrii i stabilitatea capsulelor coninnd uleiuri au demonstrat:

1. Creterea concentraiei matricilor sau a complexului de matrici determin obinerea unei mai bune eficiene la ncapsulare. s-a obinut cea mai bun eficiena a ncapsulrii utiliznd ca i matrici: alginatul n concentraie de 2%, chitosanul in aceeai concentraie, urmate de concentraiile de 1.5%, i de alginatul n complex cu k-caragenan i gume n raport de 0.75:0.75%.

2. Rata de eliberare a uleiurilor din capsule depinde de difuzitatea i solubilitatea uleiului n matrice. Eliberarea a fost mai lent in cazul hexanului, mai ridicat n cazul metanolului i cea mai buna eliberare fiind in THF, indiferent de matricea sau concentraia utilizat la ncapsulare.

3. Stabilitatea capsulelor la pH 1.2 si pH 4.5, dizolvarea acestora i eliberarea continutului realizandu-se la pH 7.4.


XXVII

CAPITOL V. CARACTERIZAREA FTIR A OXIDRII ULEIURILOR

V.1. MATERIALE I METODE

Analiza spectrala in domeniul IR s-a utilizat spectrofotometru FT-IR Shimadzu Prestige-21, echipat cu Reflectanta Totala Atenuata Orizontala (HATR), cu accesoriu de ZnSe. Masuratorile au fost efectuate in domeniul infrarosu 650-4000 cm-1, 100 scanari fiecare proba la rezolutia 2 cm-1. Dupa fiecare proba accesoriul a fost spalat cu acetona.

Uleiurile libere si capsulele cu uleiuri au fost supuse in vederea oxidarii la temperatura de 105C, si la iradiere UV (254m) timp de o ora, 4 ore si 6 ore.

S-au inregistrat spectrele FTIR-ATR dupa fiecare oxidare, atat la uleiul liber cat si extras din capsule. In cazul analizelor FTIR-ATR au fost posibile inregistrarea spectrelor capsulelor cu ulei, nefiind necesara extracia uleiului din capsule.

V.2. REZULTATE I DISCUII

n cazul analizelor FTIR-ATR a fost stabilit stadiul oxidrii, calculandu-se raportul ntre intensitile principalele peakuri considerate markeri ai oxidarii conform literaturi (Guilln and Cabo, 1999, 2000, 2002): A2853/A3005, A1746/A3006, A1474/A3006, A1377/A3006 and A1163/A3006, nainte i dup tratamentul UV.

S-a constat ca uleiul liber avea un stagiu mai avansat al oxidarii 2 sau 3, in timp ce uleiul incapsulat se afla in stagiu 1 al oxidarii. S-a demosntrat astfel ca uleiul de catina incapsulat in diferitele capsule obtinute din matricile utilizate a fost mult mai protejat impotriva oxidarii in urma diferitelor tratamente, comparativ cu uleiul liber (ex: la uleiul de ctin, Fig.V.1.).

Cea mai bun protecie mpotriva oxidrii a fost asigurat de urmatoarele capsule formate din matrcile i concentraiile urmatoare: alginat 1%, chitosan 1.5%, complexele alginate-gum gum i alginat-gum xantan n raport 0.5:0.5, i alginat-k-caragenan complex n raport 0.75:0.75.


XXVIII

0

1

2

3

4

5

6

7

8

A B C D E A B C D E A B C D E

After 1h UV/Dupa 1hUV



Types of ratios on time/Tipul rapoartelor in timp

Rat

io v

alue

s/Va

loar

ea r

apor

telo

rOil free/Ulei liber

Oil from AG 1%/Ulei din AG 1%

Oil from AG 1.5%/Ulei din AG 1.5%

Oil from AG 2%/Ulei din AG 2%

Fig. V.1. Reprezentarea grafica a uleiului de canepa liber si incapsulate (in diferite capsule de alginate) in timpul oxidarii

(A= A2853/A3005-3008, B= A1744/ A3005-3008, C= A1464/ A3005-3008, D= A1377/ A3005-3008, E= A1160/ A3005-3008)

V.3. CONCLUZII

Uleiurile ncapsulate prezint o mai buna stabilitate mpotriva oxidrii provocate de diferite conditii comparativ cu uleiurile libere.

Cea mai bun protecie mpotriva oxidrii a fost asigurat de urmatoarele capsule formate din matrcile i concentraiile urmatoare: alginat 1%, chitosan 1.5%, complexele alginate-gum gum i alginat-gum xantan n raport 0.5:0.5, i alginat-k-caragenan complex n raport 0.75:0.75.

Spectroscopia FTIR este considerat o foarte buna tehnic de monitorizare a oxidrii uleiurilor libere i ncapsulate, dovedindu-se totodat a fi o tehnic rapid, acurat i simpl.


XXIX

CONCLUZII GENERALE

n conformitate cu scopul si obiectivele acestei teze de doctorat, s-a realizat bioncapsularea a patru uleiuri funcionale din plante n diferite matrici naturale, precum i evaluarea eficienei ncapsulrii, stabilitatea i eliberarea uleiurilor din capsulele obtinute.

S-a realizat o evaluare comparativ si sistematic a calitii celor patru uleiuri funcionale din plante naintea ncapsulrii lor: uleiul de cnep (HP), uleiul extra virgin de msline (EVO), uleiul de dovleac (PK) i uleiul de ctin (SB) (de provenien din Romnia i Italia).

Avnd n vedere obiectivele propuse s-a realizat:

I. S-au identificat caracteristicile uleiurilor nainte de ncapsulare, stabilindu-se markeri de calitate si autenticitate:

1. Majoritatea uleiurilor analizate prezint indicele de iod n conformiatte cu specificaiile din CODEX 210, excepie uleiul de ctin care prezint a valoare mai scazut.

2. Spectrele UV-Vis ale uleiurilor au relevant peakurile specifice, ca i markeri ai autenticitii.

3. Studiile FTIR-ATR au demonstrat relaia dintre benzile aparute n spectre i compoziia specific fiecarui ulei, putndu-se astfel stabili fingerprintul specific uleiurilor studiate.

4. Analizele GC-FID au demonstrate faptul rpofilul acizilor din compoziia uleiurilor analizate este n conformitate cu datele din literatur.

II. Studiile experimentale utiliznd ca i metod gelarea ionicde numit:ionotropically crosslinked gelation, n vederea bioncapsulrii uleiurilor funcionale n matrici naturale, au demonstrat stabilitatea i eliberarea controlat a uleiurilor bioncapsulate

1. S-a reusit obinerea diferitelor tipuri de capsule utiliznd matrici naturale i complexe dintre acestea, fiind incorporate uleiuri

2. Caracteristicile capsulelor obinute (aria, perimetrul, compactitatea, sfericitatea i elongaia), n special mrimea lor, au fost influenate de coninutul de uleiuri ncapsulate.

3. Cele mai bune matrici pentru bioncapsularea uleiurilor au fost: alginat 2%, chitosan 2%, i alginate n complex cu k-caragenan, gum guar i gum xantan n raport de 0.75:0.75.

III. Caracterizarea capsulelor a fost realizat prin diferite metode: SEM, FTIR, analize DSC i TGA

1. Suprafata capsulelor analizat prin SEM, a fost non-regulara, aceasta datorita picaturilor de ulei prezente, exceptand chitosanul care prezinta o suprafata mult mai mata


XXX

2. Prin analizele FTIR-ATR, diferitele capsule coninnd uleiuri au prezentat peakuri care sunt atribuite atat uleiurilor ct i capsulelor goale (regiunile dintre 2800-2900 cm-1 i 1700-900 cm-1).

3. Termogramele DSC au artat faptul c temperature peakurilor crete direct proportional cu cresterea temperaturii, fiecare peak fiind characteristic fiecrui tip de capsula obinut.

4. Analizele TGA au demonstrate ca pierderea n greutate se datoreaza continutului ridicat in apa a unor capsule. ncapsularea uleiurilor nu afecteaz pierderea n greutate a capsulelor.

IV. Evaluarea eficienei ncapsulrii

1. Creterea concentraiei matricilor sau a complexului de matrici determin obinerea unei mai bune eficiene la ncapsulare. s-a obinut cea mai bun eficiena a ncapsulrii utiliznd ca i matrici: alginatul n concentraie de 2%, chitosanul in aceeai concentraie, urmate de concentraiile de 1.5%, i de alginatul n complex cu k-caragenan i gume n raport de 0.75:0.75%.

2. Rata de eliberare a uleiurilor din capsule depinde de difuzitatea i solubilitatea uleiului n matrice. Eliberarea a fost mai lent in cazul hexanului, mai ridicat n cazul metanolului i cea mai buna eliberare fiind in THF, indiferent de matricea sau concentraia utilizat la ncapsulare.

3. Stabilitatea capsulelor la pH 1.2 si pH 4.5, dizolvarea acestora i eliberarea continutului realizandu-se la pH 7.4.

V. Protecia bioncapsulrii a uleiurilor mpotriva

1. Uleiurile ncapsulate prezint o mai buna stabilitate mpotriva oxidrii provocate de diferite conditii comparativ cu uleiurile libere.

2. Cea mai bun protecie mpotriva oxidrii a fost asigurat de urmatoarele capsule formate din matrcile i concentraiile urmatoare: alginat 1%, chitosan 1.5%, complexele alginate-gum gum i alginat-gum xantan n raport 0.5:0.5, i alginat-k-caragenan complex n raport 0.75:0.75.


XXXI

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. AOAC, 1980, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemistry. 13th Ed., AOAC, Washington DC

2. AOAC, 1984, Iodine absorption number of oils and fats. In AOAC official methods of analysis (14th ed.). Washington, DC, 506

3. BAETEN, V., AND APARICIO, R., 2000, Edible oils and fats authentication by Fourier transform Raman spectrometry, Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 4 (4), 196203.

4. BAETEN, V., AND PIERNA, J. A. F., 2005, Detection of the presence of hazelnut oil in olive oil by FTRaman and FT-MIR spectroscopy, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 6201-6206.

5. BENITA S., 2006, Microencapsulation-Methods and Industrial Applications, 2nd edition, Taylor&Francis, CRC Press, New York.

6. BIRNBAUM, D.T., AND BRANNON-PEPPAS, L., 2003, Molecular weight distribution changes during degradation and release of PLGA nanoparticles containing epirubicin HCl, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 14 (1), 87-102.

7. CODEX ALIMENTARIUS, CODEX STANDARD FOR OLIVE OIL, VIRGIN AND REFINED, AND FOR REFINED OLIVE-POMACE OIL CODEX STAN 33-1981 (Rev. 1-1989), 25-39.

8. CODEX-STAN 210, CODEX STANDARD FOR NAMED VEGETABLE OILS, (Amended 2003, 2005), 1-13.

9. CODEX-STAN 210, Other quality and composition factors Commission Regulation (EEC) no. 2568/91, J. Eur. Commun., No. L, 248, 5.9.91, CODEX STANDARD FOR OLIVE OIL, VIRGIN AND REFINED, AND FOR REFINED OLIVE-POMACE OIL CODEX STAN 33-1981 (Rev. 1-1989).

10. DAI, Z., VOIGT, A., DONATH, E., MHWALD, H., 2001, Novel Encapsulated Functional Dye Particles Based on Alternately Adsorbed Multilayers of Active Oppositely Charged Macromolecular Species, Macromolecular Rapid Communications, 22 (10), 756 762.

11. DE MAN J.M., 1992, Chemical and physical properties of fatty acids, In: Chow CK (ed) Fatty Acids in Foods and Their Health Implications. Marcel Dekker Inc. New York, 18 46.

12. DHANIKULA AB, AND PANCHAGNULA R., 2004, Development and Characterization of Biodegradable Chitosan Films for Local Delivery of Paclitaxel, The AAPS Journal, 6 (3), Article 27.

13. DULIEU, C., PONCELET, D., NEUFELD, R., 1999, Encapsulation and immobilization techniques, In: Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, W.M. Khtreiber, R.P. Lanza and W.L. Chick, eds., Birkhuser, Boston, 3-17

14. DZIEEZAK, J.D., 1988, Microencapsulation and encapsulated ingredients, Food Technol. 45(4), 136.

15. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 1997, Characterization of edible oils and lard by Fourier transform infrared spectroscopy. Relationships between composition and frequency of concrete bands in the fingerprint region, J. Am. Oil Chem. Soc., 74 (10), 12811286.

16. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 1997, Infrared Spectroscopy in the Study of Edible Oils and Fats, J Sci Food Agric., 75, 1-11.

17. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 1998, Relationships between the composition of edible oils and lard and the ratio of the absorbance of specific bands of their Fourier


XXXII

transform infrared spectra. Role of some bands of the fingerprint region, J. Agric. Food Chem., 46 (5), 17881793.

18. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 1999, Usefulness of the frequencies of some Fourier transform infrared spectroscopic bands for evaluating the composition of edible oil mixtures. Fett-Lipid, 101 (2), 71 76.

19. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 1999, Usefulness of the frequency data of the Fourier transform infrared spectra to evaluate the degree of oxidation of edible oils, J. Agric. Food Chem., 47 (2), 709 719.

20. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 2000, Some of the most significant changes in the Fourier transform infrared spectra of edible oils under oxidative conditions, J. Sci. Food Agric., 80 (14), 2028 2036.

21. GUILLEN, M. D. AND CABO, N., 2002, Fourier transform infrared spectra data versus peroxide and anisidine values to determine oxidative stability of edible oils, Food Chem., 77 (4), 503510.

22. GUILLEN, M.D., CARTON, I., GOICOECHEA, E. AND URIARTE, P.S., 2008, Characterization of Cod Liver Oil by Spectroscopic Techniques. New Approaches for the Determination of Compositional Parameters, Acyl Groups, and Cholesterol from 1H Nuclear Magnetic Resonance and Fourier Transform Infrared Spectral Data, J. Agric. Food Chem., 56, 90729079.

23. HEINZEN, C., 2002, Microencapsulation solve time dependent problems for foodmakers. European Food and Drink Review, 3, 2730.

24. KRAJEWSKA, B., 2005, Membrane-based Processes Performed with use of Chitin/Chitosan Materials, Separation & Purification Technology, 41, 305312.

25. LAPITSKY, Y. AND KALER, E. W., 2006, Surfactant and polyelectrolyte gel particles for encapsulation and release of aromatic oils, Soft Matter, 2, 779-784.

26. LICHTENTHALER H.K., BUSCHMANN C., 2001, Chlorophylls and carotenoids: measurement and characterization by UV-VIS spectroscopy. Curr. Prot. Food Anal. Chem. F4.3.1 F 4.3.8.

27. MADDUR NAGARAJU SATHEESH KUMAR, SIDDARAMAIA, 2007, Thermogravimetric Analysis and Morphological Behavior of Castor Oil Based PolyurethanePolyester Nonwoven Fabric Composites, Journal of Applied Polymer Science, 106, 35213528.

28. MATEA, C.T., NEGREA, O., HAS, I., IFRIM, S., BELE, C., 2008, Tocopherol and fatty acids contents of selected Romanian cereals grains, Chem. Listy, 99, 1234-2345.

29. OZEN, B. F. AND MAUER, L. J., 2002, Detection of Hazelnut Oil Adulteration Using FT-IR Spectroscopy, J. Agric. Food Chem., 50 (14), 38983901.

30. OZEN, B. F., WEISS, I., et al., 2003, Dietary supplement oil classification and detection of adulteration using Fourier transform infrared spectroscopy, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 5871-5876.

31. PARTANEN, R., YOSHII, H., KALLIO, H., YANG, B. AND FORSSELL, P., 2002, Encapsulation of sea buckthorn kernel oil in modified starches. Journal of the American Oil Chemists' Society (JAOCS), 79 (3), 219-223.

32. PEREIRA, L., SOUSA, A., COELHO, H., AMADO, A.M., RIBEIRO-CLARO, P.J.A., 2003, Use of FTIR, FT-Raman and 13C-NMR spectroscopy for identification of some seaweed phycocolloids, Biomolecular Engineering, 20, 223-228.

33. PFUTZE, S., 2003, Encapsulatation and granulation, XI International Workshop on Bioencapsulation, 3-6.

34. PONCELET D., 2006, Microencapsulation: Fundamentals, methods and applications, in Surface Chemistry in Biomedical and Environmental Science ( Brlitz J. and Gunko K. eds), NATO Science Series, Springer verlag, 23-34.


XXXIII

35. SOCACIU C., C., MIHIS, A., NOKE, 2008, Oleosome Fractions Separated From Sea Buckthorn Berries: Yield And Stability Studies. in : Seabuckthorn, A Multipurpose Wonder Plant, ed. V.Singh, vol.III, Indus International, India, ISBN: 978-81-7035-520-525, 322-326,.

36. SOCACIU C., C.MIHIS, M.TRIF, H.A.DIEHL, 2007, Seabuckthorn fruit oleosomes as natural, micro-encapsulated oilbodies:separation, characterization, stability evaluation, Proc.15th Int. Symposium on Bioencapsulation, 6-8 Sept, Univ. Viena, Austria, P3-19, 1-3.

37. SOCACIU C., RANGA F., DIEHL, H., 2005, UV-VIS spectrometry applied for the quality and authenticity evaluation of edible oils from Romania, Buletin USAMV-CN, 62, 1454-2382.

38. TRIF M., M.ANSORGE-SCHUMACHER, C.SOCACIU, H.A.DIEHL, 2007, Application of FTIR spectroscopy to evaluate the oxidation of encapsulated seabuckthron oil, 15th Int. Symposium on Bioencapsulation, Universitatea din Viena, Austria, P3-07, 1-3

39. TRIF M., M.ANSORGE-SCHUMACHER, CHEDEA, V., SOCACIU, C., 2007, Release rates measurement of encapsulated castor oil using alginate as microencapsulation matrix, Proc.Int.Symp., Nanotech Insight, 10-17 martie, Luxor, Egipt, 157-159.

40. TRIF, M., 2007, Determination of encapsulated seabuckthorn oil oxidation usiing FTIR-ATR spectroscopy, 63-64, Buletin USAMV-CN, 06-51, 1-3.

41. ZELLER, B.L., SALEEB, F.Z., LUDESCHER, R.D., 1999, Trends in Development of Porous Carbohydrate Food Ingredients for Use in Flavor Encapsulation. Trends in Food Science & Technology, 9, 389-394


XXXIV

PUBLICAII PE DURATA STAGIULUI DOCTORAL SI PARTICIPARI LA SIMPOZIOANE I CONFERINE NATIONALE I INTERNAIONALE

2009

1. Socaciu C., Trif. M, A. Baciu, T. Nicula, A. Nicula, Encapsulation of plant oleosomes and oleoresins in mixed carbohydrate matrices, COST865, Spring Meeting "Microcapsule property assesment", Luxemburg 2009, Proceeding

2008

1. Monica Trif, Ansorge-Schumacher M., Socaciu C., Diehl H.A. Bioencapsulated seabuckthorn oil: controlled release rates in different solvents, Bull. USAMV-CN, 65/2008, ISSN 1454-2382, Romania

2. Pece Aurelia, D. Vodnar, Monica Trif, C. Coroian, Camelia Raducu, G. Muresan, Study of the physico-chemical parameters from buffalo raw milk during different lactations, Bull. USAMV-CN, 65/2008, ISSN 1454-2382, Romania

3. Pece Aurelia, D. Vodnar, Monica Trif, Corelation between microbiological and physico-chemical parameters from buffalo raw milk during different lactations, Bull. USAMV-CN, 65/2008, ISSN 1454-2382, Romania

4. Carmen Socaciu, Baciu A., Trif M., Oleosome-rich pectin network as a new, natural bioencapsulation matrix, XVI International Conference on Bioencapsulation Dublin, Ireland ; September 2008, Proceeding

5. Monica Trif, Carmen Socaciu, Andreea Stanila, The evaluation of encapsulated Seabuckthorn oil properties usind FTIR, CIGR - International Conference of Agricultural Engineering XXXVII Congresso Brasileiro de Engenharia Agrcola, Processing Conference - 4th CIGR Section VI International Symposium On Food And Bioprocess Technology, September 2008, Iguaccu, Brazil, ISSN 1982-3797

6. Andreea Stanila and Monica Trif, Antioxidant activity of carotenoide extracts from HIPPOPHAE RHAMNOIDES, CIGR - International Conference of Agricultural Engineering XXXVII Congresso Brasileiro de Engenharia Agrcola, Processing Conference - 4th CIGR Section VI International Symposium On Food And Bioprocess Technology, September 2008, Iguaccu, Brazil, ISSN 1982-3797

7. Monica Trif, Carmen Socaciu and Horst Diehl, Evaluation of effiency, release and oxidation stability of seabuckthorn encapsulated oil using FTIR spectroscopy, 7th Joint Meeting of AFERP, ASP, GA, PSE & SIF, August 2008, Athens, Greece, Book of Abstracts, pg.39

8. Monica Trif and Carmen Socaciu, Evaluation of effiency, release and oxidation stability of Seabuckthorn microencapsulated oil using Fourier Transformed Infrared Spectroscopy, 4th Meeting on Chemistry and Life, and accepted to be published in Chemick Listy Journal (current IF=0.683)


XXXV

2007

1. Monica Trif, Marion Ansorge-Schumacher, Veronica S. Chedea, Carmen Socaciu, Release rates measurement of encapsulated castor oil using alginate as microencapsulation matrix, The International Conference on Nanotechnology: Science and Application (NanoTech Insight), Luxor, 10-17 March 2007, Egipt

2. Chedea V.S., Kefalas P., Trif M. and Socaciu C. Stability studies of encapsulated carotenoid extract from orange waste using pullulan as microencapsulation matrice, Nano Tech Insight, Luxor, 10-17 March 2007, Egipt

3. Monica Trif, Marion Ansorge-Schumacher, Carmen Socaciu, Application of FTIR Spectroscopy for determination of oxidation of encapsulated sea buckthorn oil, Proc.XV International workshop on Bioencapsulation and COST865 Meeting, 2007, Wien, Austria, published in extenso

4. Carmen Socaciu, Cristina Mihis, Monica Trif, Horst A. Diehl, Seabuckthorn fruit oleosomes as natural, microencapsulated oilbodies: separation, characterization, stability evaluation oil, Proc. XV International workshop on Bioencapsulation and COST865 Meeting, 2007, Wien, Austria, published in extenso

5. Socaciu C., Trif M., Ranga F., Fetea F., Bunea A., Dulf F., Bele C. and Echim C. Quality and authenticity of seabuckthorn oils using succesive UV-Vis, FT-IR, NMR spectroscopy and HPLC-, GC- chromatography fingerprints, 3rd Conf. Int. Seabuckthorn Assoc., 2007, Quebec, Canada

6. Monica Trif, Ansorge-Schumacher M., Socaciu C., Diehl H.A. Determination of encapsulated Sea buckthorn oil oxidation using FTIR-ATR spectroscopy, Bull. USAMV-CN, 63-64/2007, ISSN 1843-5262, Romania

2006

1. Monica Trif, Seabuckthorn oleosomes as stabilized bioactive nanostrustures with applications in microencapsulation nutraceuticals, Symposium IRC Transylvania Innovations in Agriculture, Biotechnologies, Animal Breeds and Veterinary Medicine, 2006, USAMV Cluj-Napoca, Romania

2004

1. Veerle Minne, Monica Trif, J.M.C. Geuns, Corina Catana, Steviozide and steviol determination in callus culture of Stevia rebaudiana Bertoni, Bull. USAMV-CN, 61/2004, ISSN 1454-2382, Romania

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL

SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE, CLUJ-NAPOCA

FACULTY OF ANIMAL BREEDS

AND BIOTECHNOLOGY

BIOTECHNOLOGY FIELD

PHD THESIS

BIOENCAPSULATION SYSTEMS OF BIOACTIVE COMPOUNDS EXTRACTED FROM PLANT OILS

(SUMMARY)

MONICA TRIF Dipl. Eng. Biotechnologist

SCIENTIFIC SUREVISOR: PROF. Dr. Dr. h.c. HORST A. DIEHL

2009

Bioencapsulation systems of bioactive compounds extracted from plants oils ________________________________________________________________________________________

II

TABLE OF CONTENTS

I. INTRODUCTION. AIMS AND OBJECTIVES .................................................................. III

PART II. ORIGINAL CONTRIBUTIONS .............................................................................. X

CHAPTER II. CHARACTERIZATION OF FUNCTIONAL OILS USED FOR BIOENCAPSULATION........................................................................................................... X

II.1. MATERIALS AND METHODS................................................................................... X

II.2. RESULTS AND DISCUSSIONS.................................................................................. X

II.3. CONCLUSIONS......................................................................................................... XV

CHAPTER III. BIOENCAPSULATED OILS: BEADS PREPARATION PROTOCOLS AND CHARACTERIZATION. ............................................................................................. XVI

III.1. MATERIALS AND METHODS ............................................................................. XVI

III.2. RESULTS AND DISCUSSIONS ...........................................................................XVII

III.3. CONCLUSIONS ................................................................................................... XXIII

CHAPTER IV. ENCAPSULATION EFFICIENCY AND RELEASE STUDIES............ XXIII

IV.1. MATERIALS AND METHODS .......................................................................... XXIII

IV.2. RESULTS AND DISSCUSIONS ......................................................................... XXIV

IV.3. CONCLUSIONS ..................................................................................................XXVII

CHAPTER V. FTIR CHARACTERIZATION OF OIL OXIDATION ..........................XXVIII

V.1. MATERIALS AND METHODS .........................................................................XXVIII

V.2. RESULTS AND DISCUSSIONS.........................................................................XXVIII

V.3. CONCLUSIONS .................................................................................................... XXIX

GENERAL CONCLUSIONS............................................................................................. XXX

SELECTED BIBLIOGRAPHY ........................................................................................XXXII

PUBLICATIONS RELEASED DURING PhD..................................................... .........XXXVI


III

I. INTRODUCTION. AIMS AND OBJECTIVES

BIOENCAPSULATION is a novel technology which use bioactive molecules to be inserted , immobilized on specific supports ( matrices). Encapsulation technology is now well developed and accepted within the pharmaceutical, chemical, cosmetic, foods and printing industries (Augustin et al., 2001; Heinzen, 2002). It appears that bioencapsulation has a strong potential in most biotechnology fields and especially in agriculture and food. The encapsulation of active components has become a very attractive process in the last decades, being adequate for food ingredients as well as for chemicals, drugs or cosmetics.

The application of a successful method to bioencapsulate bioactive compounds extracted from plant oils could enable the optimum combinations and qualities of these substances to be established. It is envisaged that such a combination be bioencapsulated into a commercial field would have significant benefits for the pharmaceutical, food and cosmeceutical industry. Furthermore, research and development in these fields are of significant benefits for the preservation of natural bioactive compounds extracted from plants.

The aim of this thesis was to use different natural matrices to bioencapsulate of bioactive molecules (plant oils) using as method ionotropically crosslinked gelation, and to evaluate different quality and efficiency parameters for the bioencapsulated products, as well the controlled release of bioactive molecules from the matrix.

Thesis structure. The first part of the thesis is a bibliographic report and the second part contains the experimental procedures: material and methods, results and discussions, and conclusions. The first part (Literature studies) includes four chapters (I-IV):

Chapter I. Bioencapsulation: definition, principles, applications, methods and techniques

Chapter II. Functional plant oils: physical and chemical characterization and authentification

Chapter III. Oil encapsulation: matrices, encapsulation methods and techniques, efficiency and stability evaluation

Chapter IV. Methods for beads characterization

Part two (Original Contribution) is included in four chapters as follows:

Chapter V. Characterization of functional oils used for bioencapsulation. This part characterize the functional fourth oils (hemp oil, pumpkin oil, extra virgin olive oil and seabuckthorn oil) analyzed and encapsulated by different techniques: ultraviolet (UV) spectrometry, Gas-Chromatography (GC) with Flame Ionization Detection (FID) and Fourier transformed Infrared spectroscopy equipped with horizontal attenuated total reflectance (FTIR-ATR), and chemical determinations were carried out according to the methods described in the A. O. A. C. and IOOC.

Chapter VI. Bioencapsulated oils: beads preparation protocols and characterization. This chapter describes the protocols: for synthesis of empty beads of different sizes and concentrations and for synthesis of beads of different sizes and concentrations incorporating small oil droplets, characterizes the beads empty and containing oils (by sizes, morphology) and analyses the beads by FTIR and thermal (differential scanning calorimetry and termogravimetric).


IV

Chapter VII. Encapsulation efficiency and release studies. This chapter includes the studies regarding encapsulation efficiency of functional oils encapsulated in different matrices, release rate measurements of oils from beads on time and in different solvents, and in vitro release oils from the beads.

Chapter VIII. FTIR characterization of oil oxidation. This chapter includes the comparative analysis of oil free and encapsulated oxidized on time under UV conditions.

The experimental work is focused on following objectives:

Use of different natural matrices (such as alginate, alginate in complex with k-carrageenan and gums: xanthan and guar, chitosan) to encapsulate functional oils (pumpkin oil, extra virgin olive oil, hemp oil and seabuckthorn oil)

Improvement and optimization of bioencapsulation methods for vegetable oils with functional properties

Investigations of different obtained beads: morphology (scanning electron microscopy), characterization of beads (area, diameter, perimeter, elongation, compactness), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis

Investigations of bioencapsulated functional oils: encapsulation efficiency and stability, control release of oils encapsulated, material and functionality of the beads obtained , FTIR characterization of: free oils, obtained beads and oxidation of free and encapsulated oils

The work presented was carried out in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine (USAMV), Cluj-Napoca, Romania, in collaboration with the Technical University Berlin (TU Berlin), Germany, Department of Enzyme Technology, under supervision of Prof. Dr. rer. nat. Marion Ansorge-Schumacher. I would like to thank the sponsors who made this work possible providing scholarships to pursue doctoral studies: Deutsche Bndestiftung Umwelt (DBU) Germany and EU COST 865.


V

INTRODUCTION

Microencapsulation is a process to produce capsules in the micrometer to millimeter range known as microcapsules.

A microcapsule is a tiny capsule and its preparation procedure, called microencapsulation, can endow various traits to the core material in order to add secondary functions and/or compensate for shortcomings.

Microcapsules can be classified in three basic categories according to their morphology as mono-cored (mononuclear), poly-cored (polynuclear), and matrix types.

The schematic presentation of different types of microcapsules is shown in the following figure Fig.1.:

Fig. 1. Variations on microcapsules formulation

(Birnbaum D.T. and Brannon-Peppas L., 2003)

Mono-cored (mononuclear) microcapsules contain the shell around the core. Poly-

cored (polynuclear) capsules have many cores enclosed within the shell. In matrix encapsulation, the core material is distributed homogeneously into the shell material.

Purposes of microencapsulation

Generally, there are a numbers of reasons why substances should be encapsulated (Li S.P. et a.l, 1988; Finch C.A., 1985; Arshady, R., 1993):

Increasing stability to protect reactive substances from the environment. To convert liquid active components into a dry solid system. To separate incompatible components for functional reasons. To mask undesired properties of the active components. To protect the immediate environment of the microcapsules from the active

components. To control release of the active components for delayed (timed) release or long-acting

(sustained) release. Separation of incompatible components. Conversion of liquids to free-flowing solids. Masking of odor, activity, etc. Protection of immediate environment. Targeting of drugs.


VI

Encapsulation technology is now well developed and accepted within the pharmaceutical, chemical, cosmetic, foods and printing industries (Augustin et al., 2001; Heinzen, 2002).

It appears that bioencapsulation has a strong potential in most biotechnology fields and especially in agriculture and food. The encapsulation of active components has become a very attractive process in the last decades, being adequate for food ingredients as well as for chemicals, drugs or cosmetics.

The main objective is to build a barrier between the component in the particle and the environment. This barrier may protect against oxygen, water, light; avoid contact with other ingredients, e.g. a heavy meal; or control diffusion. The preservation of bioactive food ingredients through product processing and storage, and their controlled release in the gastrointestinal tract is yet a major obstacle for the full exploitation of the health potential of many food bioactive components. Challenges facing introduction of bioactive compounds into foods are not limited solely to their inclusion in free flowing powder or solution.

In food products, fats and oils, aroma compounds and oleoresins, vitamins, minerals, colorants, and enzymes have been encapsulated (Dziezak, 1988; Jackson and Lee, 1991; Shahidi and Han, 1993).

The choice of appropriate bioencapsulation technique depends upon the end use of the product and the processing conditions involved in the manufacturing product.

All bioencapsulation techniques require a core material and an enveloping solution. The material has to be approved by the Food and Drug Administration (US) or European Food Safety Authority (Europe) (Amrita et al., 1999).

Pfutze S. (2003) considers that the technologies to accomplish encapsulation can be divided into two groups: formation of matrix capsules : an active and protective ingredient form homogeneous

granules. The active is well distributed within the granule and is enclosed by the abundance of the protective material, forming a matrix for the active.

formation of defined shell capsules : the active material is granules and coated with a protective layer. Active and protective material is clearly separated.

Coacervation: encapsulation of liquids

Complex coacervation, (or phase separation), is the first large application of a microencapsulation technology. Coacervation, which is a phenomenon occurring in colloidal solutions, is often regarded as the original method of encapsulation (Risch, 1995).

The applicabilit

Documents

SISTEME DE ÎNCAPSULARE A UNOR COMPUŞI