应用基础研究

［收稿日期］　２０１６０９０７　［修回日期］　２０１６１０３１［基金项目］　国家“重大新药创制”科技重大专项（编号：２００９ＺＸ０９１０２－２４１）［作者简介］　叶　璐（１９８３－），女，成都人，硕士，主治医师，主要从事胸部与腹部肿瘤的临床研究与综合治疗。

［通讯作者］　△邓洪新，教授，Ｅｍａｉｌ：ｄｅｎｇｈｏｎｇｘ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

人肺腺癌 ＳＰＣＡ１荷瘤裸鼠中 ＲＮＡｉ靶向沉默 ＦＡＫ的作用

叶　璐１，母　丹１，付　波１，王　敏１，杨　莉１，邓洪新２△

（１．核工业４１６医院肿瘤科，成都 ６１００５１；２．四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室／２０１１计划“生物治疗协同创新中心”，成都６１００４１）

［摘要］　目的：通过用脂质体包裹靶向局部粘着斑激酶（ｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｋｉｎａｓｅ，ＦＡＫ）基因的短发夹ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）质粒（ｓｈＲＮＡＦＡＫ），探讨该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌ＳＰＣＡ１的抑制效果。方法：用脂质体包裹ｓｈＲＮＡＦＡＫ，并通过尾静脉注射治疗荷瘤裸鼠，通过肿瘤生长曲线和重量，肿瘤组织形态学，肿瘤中的ＦＡＫ蛋白表达情况、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ、ＰＣＮＡ和ＴＵＮＥＬ检测，分析该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌 ＳＰＣＡ１的抑制效果。结果：荷瘤裸鼠经过脂质体ｓｈＲＮＡＦＡＫ治疗后，肿瘤生长速度明显缓于对照组（Ｐ＜００５），肿瘤重量明显低于对照组（Ｐ＜００５）。肿瘤组织的免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＴＵＮＥＬ检测显示与对照组相比，治疗组ＦＡＫ蛋白表达降低（Ｐ＜００５）、血管生成和细胞增殖均减少（Ｐ＜００５）、凋亡细胞增加（Ｐ＜００５），荷瘤裸鼠主要脏器形态学正常。结论：ＦＡＫ特异性的小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）能够在体内阻断ＦＡＫ蛋白的表达，使组织内ＦＡＫ蛋白的表达相应地减少，并进一步诱导肿瘤细胞的凋亡，最终导致肿瘤的生长速度减缓。

［关键词］　ＲＮＡ干扰 ；局部粘着斑激酶 ；凋亡；ＳＰＣＡ１［中图分类号］Ｒ７３４２；Ｒ７３３５；Ｒ７３０２３１　 ［文献标志码］Ａ　 ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１６７４０９０４２０１６０６００２

ＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＴａｒｇｅｔｉｎｇＦｏｃａｌＡｄｈｅｓｉｏｎＫｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＧｒｏｗｔｈｏｆＨｕｍａｎＬｕｎｇＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＳＰＣＡ１

ＹｅＬｕ，ＭｕＤａｎ，ＦｕＢｏ，ｅｔａｌ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．４１６ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＮｕｃｌｅａｒＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００５１，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｋｉｎａｓｅ（ＦＡＫ）ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｉｎｌｉｐｏｓｏｍｅｏｎｈｕｍａｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＳＰＣＡ１ｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅｂｅａｒｉｎｇｔｕｍｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｎｕｄｅｍｉｃｅｂｅａｒｉｎｇｔｕｍｏｒｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｓｈＲＮＡＦＡＫｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｉｎｌｉｐｏｓｏｍｅｔｈｒｏｕｇｈｔａｉｌｖｅｉｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｏｆｈｕｍａｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＳＰＣＡ１ｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｗｅｉｇｈｔ，ｔｕｍｏｒｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ＦＡＫｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＤ３１，ＶＥＧＦ，ＰＣＮＡａｎｄＴＵＮＥＬｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｓｐｅｅｄｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｌｏｗｅｒｉｎｔｈｅｎｕｄｅｍｉｃｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｌｉｐｏｓｏｍａｌｓｈＲＮＡＦＡＫｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｔｕｍｏｒｗｅｉｇｈｔｉｎｔｈｅｎｕｄｅｍｉｃｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｌｉｐｏｓｏｍａｌｓｈＲＮＡＦＡＫｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄＴＵＮＥＬａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＡＫｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜００５），ｔｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）ｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｏｒｇａｎｓｏｆｔｈｅｎｕｄｅｍｉｃｅｂｅａｒｉｎｇｔｕｍｏｒｗｅｒｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｎｏｒｍａｌ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＦＡＫｓｐｅｃｉｆｉｃｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｃａｎｓｕｐｐｒｅｓｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＡＫｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｉｖｏ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＡＫｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｉｓｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｕｓｉｎｄｕｃｅｓｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｅｃｅｌｅｒａｔｅｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　 ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＦｏｃａｌＡｄｈｅｓｉｏｎＫｉｎａｓｅ（ＦＡＫ）；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ＳＰＣＡ１

　　肺癌目前仍是全球恶性肿瘤发病率和病死率第一的肿瘤［１］。其中，非小细胞肺癌（ｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）占 ８７０５％ ［２］，约 ８０％ＮＳＣＬＣ患者被确诊时为晚期，目前以化疗为主的治疗方案中

·３０３·

位生存期不超过 １年，多种化疗方案并未提高疗效［３］。肿瘤细胞的侵袭生长必须黏附于细胞外基质，

进而影响细胞的黏附、运动与迁移。局部粘着斑激酶

（ｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｋｉｎａｓｅ，ＦＡＫ）介导的信号转导系统是依赖于蛋白酪氨酸激酶（ｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＰＴＫ）活性的细胞外基质信号转导中最为重要的细胞信号

转导途径之一［４］。因此在理论上使ＦＡＫ低表达或不表达就有可能干扰细胞外基质对侵袭性生长的调控，

进而达到抑制肿瘤生长的目的。

１　材料与方法

１１　材料ｓｈＲＮＡ表达载体购自 ｐＧｅｎｅｓｉｌ（武汉 ＧｅｎｅＳｉｌ生

物技术有限公司）。ＳｈＲＮＡＦＡＫ根据已公布的ＦＡＫｓｉＲＮＡ序列［５］设计目标 ｍＲＮＡ序列５′ＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴ３′（图１），ＳｈＲＮＡＨＫ序列是一个与任何人类和小鼠基因没有同源性的序列（５′ＧＡＣＴＴＣＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＣ３′），用于对照。大肠杆菌（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｈｅｃｈ）。ＳＰＣＡ１细胞株［ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）］。裸鼠（ＢＡＬＢ／ｃＡｎｕ）：４～６周龄，１８只（中国科学院上海实验动物中心）。用于体内动物实验的ＤＯＴＡＰＣｈｏｌ阳离子脂质体的制备参考文献［６］并略有改动。将阳离

子脂质成份ＤＯＴＡＰ与中性成分胆固醇（Ｃｈｏｌ）按１∶１的摩尔比进行混合，并将混合物用ＨＰＬＣ级的氯仿进行溶解，置于旋转蒸发仪上４０℃下旋蒸１小时后成膜，真空干燥过夜。利用超声将所形成的膜打碎，然

后高压均质，将样品取出后溶解于５％的葡萄糖溶液中，然后在５５℃水浴条件下震荡１小时，将混合物转到试管中，并通过２２０ｎｍ聚碳酸酯膜挤压５～６次，最后将混合物溶解在适量的５％的葡萄糖溶液中，得到浓度为５ｍｇ／ｍｌ的 ＤＯＴＡＰＣｈｏｌ阳离子脂质体混悬液，储藏在４℃备用。质粒小量快速提取试制盒［道普生物科技（北京）有限公司］。无内毒素质粒提取

试剂盒ＥｎｄｏＦｒｅｅｐｌａｓｍｉｄＧｉｇａＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）。细胞凋亡检测试剂盒 ＤｅａｄＥｎｄＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＴＵＮＥＬＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。蛋白质定量试剂（ＢＩＯＲＡＤ）。ＤＡＢ显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ化学发光检测试剂盒（ＰＩＥＲＣＥ公司）。蛋白酶抑制剂ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）。兔抗人ＦＡＫ单克隆抗体 ＩｇＧ２ｂ（Ｓｉｇｍａ）。小鼠抗人 ＧＡＰＤＨ单克隆抗体（Ｓｉｇｍａ）。辣根过氧化物酶 ＨＲＰ标记的羊抗兔ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（北京中山生物公司）。１２　实验主要方法１２１　细胞培养及荷瘤模型的建立　人肺腺癌

ＳＰＣＡ１细胞株使用 ＲＰＭＩ１６４０培养基培养，收集对数生长期的ＳＰＣＡ１细胞，用无血清、无抗生素的ＲＰＭＩ１６４０培养液洗涤、计数。无菌条件下将２×１０６个细胞皮下接种于小鼠肋腹侧。待肿瘤体积达７０～１００ｍｍ３时，将小鼠随机分为３组（６只／组）进行治疗。葡萄糖组（ＧＳ组）：每只小鼠尾静脉注射（５％葡萄糖溶液１００μＬ／次），每周３次，共１０次。脂质体空载质粒组（ＨＫ组）：每只小鼠尾静脉注射１００μＬ／次：５μｇ空载质粒，脂质体１５μｇ溶于５％葡萄糖溶液中并充分混匀，总体系１００μＬ，给药时间同上。脂质体ｓｈＲＮＡＦＡＫ组（ｓｈＲＮＡＦＡＫ组）：每只小鼠尾静脉注射１００μＬ／次：５μｇ质粒，脂质体１５μｇ溶于５％葡萄糖溶液中并充分混匀，总体系１００μＬ，给药时间同上。从开始治疗起每３天用游标卡尺测量肿瘤的长径（Ｌ）和短径（Ｄ），计算肿瘤体积：肿瘤体积Ｖ（ｍｍ３）＝０５２×Ｌ×Ｄ２。治疗结束后第３天，处死裸鼠。取小鼠的心、肝、脾、肾固定于福尔马林溶液中，取各组小鼠的肿瘤

组织进行称重。并计算抑瘤率，抑瘤率＝（对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）／对照组平均瘤重×１００％。

图１　质粒ｐＧｅｎｅｓｉｌｓｈＲＮＡ质粒图谱Ｆｉｇｕｒｅ１　ＰｌａｓｍｉｄｐＧｅｎｅｓｉｌｓｈＲＮＡｐｌａｓｍｉｄｍａｐ

１２２　肿瘤组织及裸鼠主要脏器形态学观察　肿瘤组织及裸鼠心、肝、脾、肾用１０％的中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片机切片，厚度为 ３～５μｍ。Ｍａｙｅｒ氏苏木素及伊红染色，中性树胶封片，显微镜（×２００）下观察并照相。１２３　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ　提取总蛋白进行 ＦＡＫ蛋白表达情况的检测。组织在液氮中加入蛋白酶抑制剂

ｃｏｃｋｔａｉｌ１０μｇ／ｍＬ，ＲＩＰＡ裂解液（１ｍＬｐｅｒ１０７ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍｄｉｓｈ／１５０ｃｍ２ｆｌａｓｋ，单位细胞量使用的裂解液），研磨组织至粉末状。以１５０００ｒｐｍ于４℃离心１０ｍｉｎ，将上清液转入新的 ＥＰ管中，用蛋白质定量试剂对各样品的总蛋白进行定量，即以牛血清白蛋

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白（ＢＳＡ）为标准，采用ＢＩＯＲＡＤ公司蛋白质定量试剂（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ）比色测定蛋白质的含量，根据公式Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝１４５×Ａ２８０－０７４×Ａ２６０计算蛋白质的浓度，蛋白样品置于 －８０℃保存。取各组的总蛋白５０μｇ用ＴｒｉｃｉｎｅＰＡＧＥ分离，以１００Ｖ、５０ｍｉｎ转移至聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜。室温下将 ＰＶＤＦ膜在含有５％脱脂奶粉的 ＴＢＳ中使用摇床封闭 １～２ｈ。ＴＢＳ室温下漂洗 ＰＶＤＦ膜１０ｍｉｎ×２次，ＴＢＳＴ室温下漂洗１０ｍｉｎ。将ＰＶＤＦ膜在含有兔抗人ＦＡＫ单克隆抗体的ＴＢＳＴ（１∶５００）中于室温孵育１～２ｈ，或者于４℃孵育过夜。同时使用小鼠抗人 ＧＡＰＤＨ单克隆抗体（１∶５０００）孵育作为对照。ＴＢＳ室温下漂洗ＰＶＤＦ膜 １０ｍｉｎ×２次，ＴＢＳＴ室温下漂洗 １０ｍｉｎ。ＨＲＰ标记的山羊抗兔 ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（用于 ＦＡＫ），山羊抗小鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（用于ＧＡＰＤＨ），在ＴＢＳＴ中稀释（１∶１００００），再与 ＰＶＤＦ膜于室温下在摇床上孵育１～２ｈ。ＴＢＳＴ室温下漂洗 ＰＶＤＦ膜５ｍｉｎ×３次。将两种化学发光底物等体积混合，于暗室中进行适

时曝光；在Ｘ光医用冲洗机上显影，ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件进行数据分析，以 ＦＡＫ／ＧＡＰＤＨ的ＩＯＤ比值作为ＦＡＫ的蛋白相对表达量。１２４　肿瘤组织免疫组化、抗血管生成和细胞增殖　将石蜡切片置于６５℃孵箱中加热２ｈ，随后二甲苯脱蜡１５ｍｉｎ×２次；再先后用１００％、９５％、８０％、７０％酒精浸泡各２ｍｉｎ；无菌去离子水洗涤５ｍｉｎ×２次。用３％过氧化氢处理（室温）切片２５ｍｉｎ以阻断内源性过氧化氢酶的作用；ＰＢＳ室温下漂洗组织切片５ｍｉｎ×２次；将切片置于 ００１Ｍ柠檬酸缓冲液（ｐＨ６０）中，煮沸后高压加热１０ｍｉｎ进行抗原修复（ＦＡＫ）或枸橼酸缓冲液（ｐＨ６０）高压加热１０ｍｉｎ修复（ＣＤ３１或ＰＣＮＡ）；自然冷却至室温，无菌去离子水洗片５ｍｉｎ×２次；以３％的与第二抗体同源血清处理切片，室温或３７℃２０ｍｉｎ，之后用滤纸吸去多余血清；滤纸吸去血清后直接滴加ＦＡＫ蛋白免疫前的兔血清或兔抗人 ＦＡＫ抗血清（１∶１０００），或小鼠抗人ＣＤ３１和ＰＣＮＡ一抗（１∶５００），置湿盒内于３７℃孵育３０ｍｉｎ，然后４℃冰箱过夜；ＰＢＳ室温下漂洗组织切片５ｍｉｎ×２次；滴加生物素标记的山羊抗兔第二抗体（１∶２００，以ＰＢＳ稀释）５０μＬ，置湿盒内于３７℃孵育４０ｍｉｎ；ＰＢＳ室温下漂洗组织切片５ｍｉｎ×２次；酶标链亲和素复合物（１∶２００，以ＰＢＳ稀释）５０μＬ，置湿盒内于３７℃孵育４０ｍｉｎ；ＰＢＳ室温下漂洗组织切片５ｍｉｎ×２次；滤纸吸去切片周围液体，滴加新鲜配制ＤＡＢ工作液［００１ＭＰＢＳ１ｍＬ中加入 ＤＡＢ贮存液（２５ｍｇ／

ｍＬ）２０μＬ、３％过氧化氢１０μＬ］显色，镜下观察，适时终止显色，流水充分冲洗；苏木素复染，室温４ｍｉｎ，流水充分冲洗后用１％盐酸酒精（８０％酒精９９ｍｌ中加入浓盐酸１ｍｌ）分色３０ｓ左右，流水冲洗返蓝１５ｍｉｎ；脱水、透明，用中性树胶封片，光镜下观察并照相。

１２５　ＴＵＮＥＬ检测　肿瘤组织的细胞凋亡采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的 ＤｅａｄＥｎｄＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＴＵＮＥＬ（ＴｄＴｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰＮｉｃｋＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ，原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法）Ｓｙｓｔｅｍ检测，参照试剂盒提供的方法进行。在荧光显微镜下全面观察每一张切

片，随机选择３个高倍（×４００）视野，每个视野内计数红色荧光细胞和绿色荧光细胞的数量，计算出肿

瘤组织细胞的凋亡指数（凋亡指数 ＝凋亡细胞数／总细胞数×１００％）。１３　统计学方法

实验数据应用 ＳＰＳＳ２００软件，各组间比较采用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ），计量采用 ｔ检验；检验水平为α＝００５。

２　结　果

２１　ｓｈＲＮＡＦＡＫ治疗后对荷瘤小鼠瘤重和肿瘤体积的影响

　　治疗第２０ｄ，以颈椎脱臼法处死裸鼠。取各组裸鼠的肿瘤组织进行称重并计算体积。结果发现

ｓｈＲＮＡＦＡＫ能明显抑制肿瘤生长，到治疗终止时肿瘤的生长在治疗组（ｓｈＲＮＡＦＡＫ组）和阴性对照组（ＨＫ组）之间差异有统计学意义（Ｐ＜００５），而空白组（ＧＳ组）与阴性对照组（ＨＫ组）之间差异没有统计学意义（图２、图３），表明了实验中所采用的靶向 ｓｈＲＮＡＦＡＫ能有效抑制体内肿瘤细胞的生长。治疗组（ｓｈＲＮＡＦＡＫ组）抑瘤率为 ５６５０％，与阴性对照组（ＨＫ组）比较，差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（表１）。

图２　各组的肿瘤重量Ｆｉｇｕｒｅ２　Ｔｕｍｏｒｗｅｉｇｈｔｏｆｄｉｓｓｅｃｔｅｄｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｘｅｎｏｇｒａｆｔ

ｆｒｏｍｅａｃｈｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓＰ＜０．０５，ｓｈＲＮＡＦＡＫｖｓＧＳａｎｄＨＫｇｒｏｕｐ

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图３　各组的肿瘤生长曲线Ｆｉｇｕｒｅ３　ＴｈｅｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓｂｙｇｒｏｕｐｓＰ＜０．０５，ｓｈＲＮＡＦＡＫｖｓＧＳａｎｄＨＫｇｒｏｕｐ

表１　各组裸鼠瘤重及抑瘤率比较Ｔａｂｌｅ１　Ｔｕｍｏｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｔｕｍｏｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ

组别 ｎ 瘤体重量（ｇ） 抑瘤率％

ＧＳ ６ １７７±０２４ ———

ＨＫ ６ １４３±０２６ １９２１％

ｓｈＲＮＡＦＡＫ ６ ０７７±０１４ ５６５０％△

　　注：治疗组（ｓｈＲＮＡＦＡＫ组）瘤重与空白组（ＧＳ组）比较，Ｐ＜

００５；阴性对照组（ＨＫ组）瘤重与空白组（ＧＳ组）比较，差异无统计

学意义；治疗组（ｓｈＲＮＡＦＡＫ组）抑瘤率与阴性对照组（ＨＫ组）比

较，△Ｐ＜００５。

２２　肿瘤模型中的ＲＮＡ干扰效果经 ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，ＧＳ组、ＨＫ组和 ｓｈＲＮＡ

ＦＡＫ组的相对 ＦＡＫ蛋白质表达量分别为 ７８３６％±１６７％，７９９４％ ±８９０％和 ３８３７％ ±１８５％。ＨＫ组相对于 ＧＳ组，未见 ＦＡＫ蛋白含量下调，而在ｓｈＲＮＡＦＡＫ组中，ＦＡＫ蛋白含量明显下调，与 ＧＳ组相比差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（图４）；肿瘤组织ＦＡＫ免疫组织化学分析显示，ＨＫ组相对于ＧＳ组，未见 ＦＡＫ蛋白含量下调，而在 ｓｈＲＮＡＦＡＫ组中，ＦＡＫ蛋白含量明显下调（图５Ａ）。ＧＳ组与阴性对照组（ＨＫ组）的肿瘤细胞形态完整，没有出现明显的坏死区域。ｓｈＲＮＡＦＡＫ治疗组的肿瘤组织内部可以见到较为明显的免疫细胞浸润甚至细胞核固

缩现象，而各对照组则很少有免疫细胞浸润 （图

５Ｂ）。肿瘤组织 ＴＵＮＥＬ染色显示 ｓｈＲＮＡＦＡＫ治疗组中阳性染色细胞（凋亡细胞）明显增加，ＧＳ组和ＨＫ组未见明显的凋亡细胞（图５Ｃ１），差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（图 ５Ｃ２）。在 ｓｈＲＮＡＦＡＫ组中，肿瘤组织血管明显减少，而在ＧＳ组和ＨＫ组中，未见肿瘤组织血管减少（图５Ｄ１），差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（图５Ｄ２）；肿瘤组织 ＶＥＧＦ、ＰＣＮＡ免

疫组织化学分析显示，在 ＧＳ组和 ＨＫ组中，未见ＶＥＧＦ、ＰＣＮＡ蛋白含量下调（棕黄色为阳性），而在ｓｈＲＮＡＦＡＫ组中，ＶＥＧＦ、ＰＣＮＡ蛋白含量明显下调（图５Ｅ１、Ｆ１），差异有统计学意义（Ｐ＜００５）（图５Ｅ２、Ｆ２）。

图４　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＳＰＣ－Ａ１细胞中ＦＡＫ蛋白表达Ｆｉｇｕｒｅ４ ＦＡＫｏｆＳＰＣＡ１ｃｅｌｌｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ

Ａ．ＳＰＣＡ１细胞中 ＦＡＫ蛋白表达电泳图；Ｂ．ＳＰＣＡ１细胞中

ＦＡＫ蛋白的相对表达水平，ｓｈＲＮＡＦＡＫ组与 ＧＳ组和 ＨＫ组比较，

Ｐ＜０．０５。

Ａ．ＦＡＫｏｆＳＰＣＡ１ｃｅｌｌｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂ．Ｒｅ

ｓｕｌｔｏｆＦＡＫＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙ．ｓｈＲＮＡＦＡＫｇｒｏｕｐｖｓＧＳｇｒｏｕｐａｎｄＨＫ

ｇｒｏｕｐ，Ｐ＜０．０５。

２３　不良反应观察随着肿瘤逐渐增大，各组荷瘤鼠摄食都出现减

少，活动迟缓，体重减轻，精神变差。后期出现肿瘤

恶病质表现。治疗结束后颈椎脱臼法处死小鼠，取

出心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行常规Ｈ＆Ｅ染色，显微镜下观察各组织器官的细胞形态在对照组和治

疗组中均未出现明显异常的形态学差异（图６）。

３　讨　论

在这项研究中，我们通过ｓｈＲＮＡＦＡＫ抑制荷瘤小鼠肿瘤组织的 ＦＡＫ蛋白表达，诱导肺腺癌 ＳＰＣＡ１细胞凋亡，抑制肺腺癌肿瘤的生长。结果表明，在荷瘤小鼠中，ＦＡＫ蛋白的表达抑制对于控制人肺腺癌ＳＰＣＡ１的生长是有效的，与对照组相比，肿瘤体积明显减小，差异具有统计学意义。因此，在该肿

瘤模型中，ｓｈＲＮＡＦＡＫ成功地抑制了肿瘤的生长，ＦＡＫ或可成为肺腺癌的有效靶点。

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图５　各组肿瘤组织中蛋白表达情况与细胞凋亡分析Ｆｉｇｕｒｅ５　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ

Ａ．各组肿瘤组织中ＦＡＫ蛋白的表达，ＳＰ×４００；Ｂ．Ｈ＆Ｅ染色，ＳＰ×２００；Ｃ１．肿瘤细胞凋亡，ＳＰ×２００，Ｃ２．ｓｈＲＮＡＦＡＫ组与 ＧＳ组和ＨＫ组比较，Ｐ＜０．０５；Ｄ１．ＣＤ３１的表达，ＳＰ×４００，Ｄ２．ｓｈＲＮＡＦＡＫ组与ＧＳ组和ＨＫ组比较，Ｐ＜０．０５；Ｅ１．ＶＥＧＦ的表达，ＳＰ×４００，Ｅ２．ｓｈＲＮＡＦＡＫ组与ＧＳ组和ＨＫ组比较，Ｐ＜０．０５；Ｆ１．ＰＣＮＡ的表达，ＳＰ×４００，Ｆ２．ｓｈＲＮＡＦＡＫ组与ＧＳ组和ＨＫ组比较，Ｐ＜０．０５。

Ａ．ＦＡＫｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ＳＰ×４００；Ｂ．Ｈ＆Ｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ＳＰ×２００；Ｃ１．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＳＰ×２００，Ｃ２．ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｅｘｉｎｓｈＲＮＡＦＡＫｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＧＳａｎｄＨＫｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）；Ｄ１．ＭｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓＳＰ×４００，Ｄ２．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｅｓｓｅｌｓ（Ｎｏ．ｏｆｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ）．Ｃｏｌｕｍｎｓ，ｍｅａｎ（ｎ＝５）；ｂａｒｓ，ＳＥ．Ｐ＜０．０５ｆｒｏｍｃｏｎｔｒｏｌｔｒｅａｔｅｄｍｉｃｅ；Ｅ１．ＶＥＧＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ＳＰ×４００，Ｅ２．ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶＥＧＦｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｌｕｍｎｓ，ｍｅａｎ（ｎ＝５）；ｂａｒｓ，ＳＥ．Ｐ＜０．０５ｆｒｏｍｃｏｎｔｒｏｌｔｒｅａｔｅｄｍｉｃｅ．Ｆ１．ＶＥＧＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ＳＰ×４００，Ｆ２．ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＮＡｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｌｕｍｎｓ，ｍｅａｎ（ｎ＝５）；ｂａｒｓ，ＳＥ．Ｐ＜０．０５ｆｒｏｍｃｏｎｔｒｏｌｔｒｅａｔｅｄｍｉｃｅ．

　　在许多恶性肿瘤中 ＦＡＫ均过表达，包括卵巢癌［７］，甲状腺癌、乳腺癌［８］、结肠癌［９］、头颈部肿

瘤［１０］。ＦＡＫ是关键的非受体激酶，ＦＡＫ与一些信号及细胞骨架分子结合后磷酸化，传递来自细胞外

基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的信号或传递来自可溶性生物活性因子的信号［１１］。ＦＡＫ在细胞迁移、存活和增殖中起关键调节作用［１２］。ＦＡＫ也是细胞存活和细胞凋亡的重要介质；ＦＡＫ表达水平的升高

与人肿瘤细胞侵入电位高度相关［１３］。当细胞受到

紫外线照射，或接触到依托泊苷、过氧化氢时，ＦＡＫ的过表达能使细胞免受这类应激反应的伤害。但是

以前的报告表明 ＦＡＫ活性的抑制并不一定诱导细胞凋亡［１４－１５］。在体外实验中，抑制 ＦＡＫ活动没有影响胰腺癌细胞的增殖，也未诱导细胞凋亡［１６］。细

胞在体外单层培养时，ＦＡＫ基因沉默不诱导细胞凋亡，而它在裸鼠中抑制肿瘤的生长，这表明，抑制

·７０３·

ＦＡＫ表达进而抑制体内肿瘤生长可能体现在失巢凋亡上：即凋亡的形成是由于ＦＡＫ基因沉默导致与细胞外基质信号传导缺失的缘故。

图６　各组裸鼠主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肾脏）Ｈ＆Ｅ染色Ｆｉｇｕｒｅ６　Ｈ＆Ｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｔｉｓ

ｓｕｅｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ，ＳＰ×２００．

与ｓｉＲＮＡ［１７］相比，在质粒中表达ｓｈＲＮＡ可更方便地以低成本进行扩增，并且ｓｈＲＮＡ非常稳定。本研究中，我们采用了质粒表达 ｓｈＲＮＡ来特异性抑制ＦＡＫ基因的功能，并在体内应用时用脂质体包裹表达质粒以延缓其在血清中的半衰期，取得了比较理

想的抗肿瘤效果。病毒ＤＮＡ载体表达的ｓｈＲＮＡ也已经用于对特定基因的沉默［１８］。但是，病毒载体在

全身给药时能激起机体的免疫反应［１９］，特别是可能

会因为病毒基因组的插入而导致其他疾病（如白血

病），使其进一步的临床应用受到限制［［２０－２１］。Ｃａｒｄｏｓｏ等［２２］研究发现，由转铁蛋白、脂质体和 ｓｉＲＮＡ三者构成的复合体更加稳定且靶向性和安全性好；

利用聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）修饰的免疫脂质体（ｐｅｇｙｌａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＰＩＬ）包裹表达ｓｈＲＮＡ的质粒不仅增加了表达质粒在体内的稳定性，而且能靶向性地透过血脑屏障［２３］，使 ＲＮＡｉ质粒能够到达肿瘤部位。总之，使用ｓｈＲＮＡ为人类进行治疗，很大程度上依赖于安全而有效的输送系

统。ＦＡＫ在肿瘤进展中起着关键性的作用［２４］，未来

或将有更多的使用 ｓｈＲＮＡ靶向 ＦＡＫ的治疗方案，比如使用特定抗体缀合载体、组织特异性基因启动

子载体或细胞特异性基因启动子载体以抑制 ＦＡＫ激酶活性。

总之，体内实验表明，通过脂质体包裹的 ｓｈＲＮＡＦＡＫ质粒使ＦＡＫ低表达可抑制肺腺癌 ＳＰＣＡ１肿瘤的生长和诱导肿瘤细胞凋亡。基于 ｓｈＲＮＡ的优点和对ＦＡＫ现有的研究，我们认为在未来ｓｈＲＮＡ和ＦＡＫ仍会是研究的热点，如何更有效地将 ＲＮＡｉ导入哺乳动物体内，进行基因功能研究和基因治疗，

值得进一步探索。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论

文出现的不端行为承担相应责任。

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利

益冲突。

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中

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同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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《肿瘤预防与治疗》２０１７年征订启示

《肿瘤预防与治疗》是中国科技论文统计源期刊（即中国科技核心期刊），ＣＮ５１－１７０３／Ｒ，ＩＳＳＮ１６７４－０９０４，大１６开，双月刊，双月２５日出版。

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究，临床研究，临床经验与技术交流，预防研究，综述与讲座，短篇与个案报道等。所征稿件内容：肿

瘤流行病学、基础研究、肿瘤病理、临床诊治经验、病例报告、国外研究动态等。

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