Universitatea de Medicin i Farmacie Craiova

TEZ DE DOCTORAT

STUDIUL ANGIOGENEZEI N ACCIDENTELE VASCULARE CEREBRALE DE TIP ISCHEMIC

- REZUMAT -

COND. T.

DRD.

Prof. univ. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA

MRGRITESCU OTILIA CLARA

CRAIOVA 2012

CUPRINS

INTRODUCERE 1

PARTEA GENERAL

Capitolul I 3 Vascularizaia cerebral- anatomie i fiziologie

Capitolul II 21 Etiopatogenia accidentelor vasculare cerebrale (AVC)

Capitolul III 30 Clasificarea i prognosticul accidentelor vasculare cerebrale

CERCETRI PERSONALE

Motivaia studiului 45 Capitolul IV 46 Material i metod

Capitolul V 59 Rezultate

Capitolul VI 127 Discuii

Capitolul VII 158 Concluzii 158

Bibliografie 161

Lista cu lucrri publicate 177

1

INTRODUCERE

Accidentul vascular cerebral (AVC) este una din cele

mai importante probleme de sntate public, cu un puternic impact socio-economic la nivel mondial, fiind totodat i o cauza major a disabilitilor n rile nalt dezvoltate. Astfel, s-a estimat o prevalen general de circa 0,2%, 30% din aceti pacieni preconizndu-se c vor deceda, iar 30% vor supravieui cu sechele neuro-funcionale. De asemenea, la nivel mondial se preconizeaz c, pn n anul 2015, numrul pacienilor cu un prim AVC va crete la circa 18 milioane, cifr care ar crete n 2030 la 23 de milioane. Dac n prezent rata mortalitii prin AVC este de 10%, pentru anul 2030 se estimeaz c va ajunge a doua cauz major de deces.

Datele oficiale raportate pentru Romnia indic faptul c suntem pe locul 10 n lume n ceea ce privete incidena AVC, iar potrivit raportului pe anul 2008 al Comisei Europene i al Organizaiei pentru Dezvoltare i Cooperare Economic (OCED) ocupm locul doi ca i rata a mortalitii.

n ultimele decenii s-au nregistrat numeroase progrese n nelegerea mecanismelor moleculare i celulare care stau la baza dezvoltrii AVC. Unul din evenimentele cheie n procesul de regenerare la nivelul unui esut ischemic este angiogeneza. Acest fenomen ce presupune formarea de noi vase de snge din cele preexistente s-a dovedit a avea loc i adiacent zonelor de lichefacie i, chiar mai mult, densitatea acestor noi vase se coreleaz cu timpul de supravieuire dup instalarea unui AVC.

Studiul realizat a avut ca obiective stabilirea tabloului morfo-clinic al AVC ischemice de la subiecii umani, precum i extinderea cunotiinelor legate de procesul de angiogenez ce are loc n evoluia acestei patologii.

2

Cuvinte cheie: accident vascular cerebral, ischemie,

angiogenez, factorul de cretere al endoteliului vascular, microdensitate vascular, receptorii 1 i 2 ai factorului de cretere al endoteliului vascular.

I. STADIUL CUNOATERII Capitolul I - Vascularizaia cerebral- anatomie i

fiziologie- descrie elemente clasice de anatomie macro- i microscopic a vascularizaiei de la nivel cerebral. n continuare sunt redate cele mai noi date privind fiziologia vascularizaiei cerebrale, respectiv mecanismele care guverneaz schimburile de la nivelul barierei hemato-encefalice.

Capitolul II - Etiopatogenia accidentelor vasculare

cerebrale ischemice- sunt prezentate cele mai noi date cu privire la factorii de risc incriminai n producerea accidentelor vasculare cerebrale i, respectiv, patogenia leziunilor care au loc, n evoluia acestor boli.

n capitolul III - Clasificarea i prognosticul accidentelor vasculare cerebrale- sunt prezentate datele clasice privind clasificrile anatomo-clinice a accidentelor vasculare cerebrale i sunt introduse cele mai noi achizitii privind prognosticul i evoluia acestei patologii umane.

3

II. CERCETRI PERSONALE

Dei s-au fcut numeroase progrese n nelegerea mecanismelor moleculare i celulare ce stau la baza dezvoltrii AVC, multe din evenimentele intrinseci ale acestora i, mai ales, modul lor de evoluie i interconectare nu sunt nc pe deplin elucidate. nc din 1993 s-a evideniat faptul c la subiecii umani decedai prin stroke, la cteva sptmni de la instalare a crescut densitatea capilarelor sanguine din aria peri-infarct, iar aceasta s-a corelat cu timpul de supravieuire al acestor bolnavi. De atunci, numeroase studii experimentale de stroke dezvoltate pe animale de laborator au evideniat existena unui proces de angiogenez implicat n evoluia acestei patologii.

Totui, aceste modele animale de stroke au limitri majore, ele nereuind s reproduc fidel heterogenitatea aspectelor legate de severitatea, patologia i comorbiditile asociate acestei boli, dezvoltate la subiecii umani i, implicit, toate rezultatele experimentale obinute trebuiesc privite i interpretate cu circumspecie atunci cnd vrem s le translaionm la om. n acest sens, studiul ntreprins de noi i propune s elucideze unele din aspectele angiogenezei din AVC ischemice dezvoltate la subiecii umani. Astfel, am nceput studiul prin caracterizarea ct mai complet epidemiologic, clinic i imagistic a unui numr de 127 de cazuri de AVC de tip ischemic. Apoi, pe un lot restrns de 22 de pacieni decedai cu stroke ischemic am investigat morfologic toate aspectele lezionale, inclusiv pe cele legate de angiogenez. n continuare, studiul s-a axat pe cercetarea intit la nivel celular i molecular a procesului de angiogenez post-stroke ischemic dezvoltat la 15 subieci umani. Preconizm ca rezultatele astfel obinute s ilustreze implicaiile patogenice ale angiogenezei n AVC de tip ischemic cu posibilitatea ca prin cercetri viitoare s fie identificate noi inte prognostice i terapeutice n aceast patologie uman.

4

Capitolul IV intitulat Materiale i metode are ca prim obiectiv descrierea materialului de studiu precum i a tehnicilor folosite.

Materialul cercetat a fost material uman, provenind din Clinica de Neurologie a Spitalului Clinic de Urgen, Nr. 1, Craiova i a fost reprezentat de un numr de 154 de AVC diagnosticate n intervalul de timp 2008-2011 (30 septembrie). n evaluarea ulterioar clinico-morfologic au fost investigai numai pacienii cu AVC ischemice n evoluie (127 de cazuri), excluzndu-se pacienii cu AVC hemoragice, pe cei cu AVC ischemice tranzitorii, lacunare i pe cei cu AVC dezvoltat n teritoriul arterei bazilare. Materialul histopatologic a provenit de la un numr de 22 de cazuri de AVC ischemic n care a survenit decesul la diverse intervale de timp, iar din acestea s-au selectat 15 cazuri care au fost procesate i imunohistochimic.

Mai nti s-a efectuat o prelucrare i interpretare clinico-epidemiologic i imagistic a datelor, principalele variabile urmrite fiind: incidena AVC ischemice, distribuia AVC ischemice n funcie de vrst i sex, rata general a mortalitii prin AVC ischemic i particularitile sale n funcie de: decadele de vrst i sex, principalii factori de risc implicai n patologia ischemic cerebral i diversele lor asocieri, particularitile clinico-topografice ale AVC ischemice investigate, precum i aspectele sugestive pentru diagnostic al investigaiei imagistice de tipul tomografiei computerizate (CT)

Prelucrarea i interpretarea histopatologic a datelor s-a efectuat prin tehnica histopatologic clasic de includere la parafin, utiliznd ca i coloraii: hematoxilina eozina, tricromic Mallory, Cresyl violet i Luxol Fast Blue - Periodic acid-Schiff Albastru de Toluidin. S-a urmrit evidenierea leziunilor instalate la nivelul parenchimului cerebral n evoluia AVC ischemice comparativ cu zonele controlaterale i zonele corespondente de la subieci decedai prin alte cauze dect cele ischemice cerebrale.

Prelucrarea imunohistochimic s-a desfurat pe dou direcii: cu detecie enzimatic i respectiv, cu detecie fluorescent. Tehnica utilizat a fost cea indirect cu LSAB (Labelled Streptavidin-Biotin2 System), iar panelul de anticorpi folosit este redat in tabelul de mai jos:

5

Anticorpi utilizai n studiul AVC ischemice Nume Clon Diluie Demascare Productor

CD68 oarece, IgG1k 1:100 0.1 M citrat Dako

CD105 Iepure, policlonal 1:50 0.1 M citratThermo Scientific

GFAP Iepure, policlonal 1:20.000 0.1 M citrat Dako

NeuN Iepure, IgG1 1:1000 0.1 M citrat, Millipore

VEGF Iepure, IgG2

1:200 (cromogenic)

1:30 (fluorescen)

0.1 M citrat Santa Cruz

VEGF Iepure, policlonal 1:50 0.1 M citrat Santa Cruz

VEGFR1 Iepure, policlonal 1:50 0.1 M citrat Sigma Aldrich

VEGFR2 Iepure, policlonal 1:50 0.1 M citrat Abcam

CNP-aza

oarece, IgG1 1:20 0.1 M citrat

Thermo Scientific

Ki-67 Iepure, policlonal 1:25 0.1 M citrat Neomarkers

Anticorpii folosii n acest studiu s-au adresat: identificrii specifice a diverselor subpopulaii celulare

din parenchimul cerebral normal i, respectiv, cu infarcte ischemice (NeuN - neuroni, CD68 microglii i macrofage, GFAP- astrocite, CNP-aza- oligodendrocite i celulele Schwann);

vizualizrii vaselor de angiogenez (CD105); evaluarea potenialului angiogen din AVC ischemice:

evidenierea expresiei i a localizrii VEGF i a receptorilor si VEGFR1 i VEGFR2 prin reacii duble de imnofluorescen (cealalt int vizat fiind tipul de celul nervoas care exprim markerii proangiogeni respectivi);

aprecierii microdensitii vasculare (CD105) i a neovaselor active (dubla CD105/Ki-67);

6

Capitolul V - Rezultate i Capitolul VI - Discuii redau principalele rezultate obinute n antitez cu datele existente n literatur.

n studiul nostru, n intervalul de timp 2008-2011 (30 septembrie), AVC ischemice au reprezentat aproximativ 82,47% din totalul accidentelor vasculare cerebrale investigate. Acestea au predominat uor la sexul masculin, cu un raport de 1,15:1 n favoarea brbailor. Grupa de vrst cea mai afectat a fost decada a VII-a, fiind diagnosticate aproximativ 25% din AVC ischemice investigate. Potrivit estimrilor OMS, n anul 2002 s-a preconizat o inciden global a AVC de 15,3 milioane, din care mai mult de o treime (5,5 milioane) s-a estimat c ar evolua spre deces (Reinhardt, 2005). Cercetrile efectuate asupra populaiilor din Europa au artat c procentul populaiei cu vrsta de peste 65 de ani la care se dezvolt, de regul, AVC va crete de la 20% n 2000 la 25% n 2050, iar vrsta medie va crete de la 37,7 ct era n 2000 la 47,7 n 2050 (World Population Prospects, 2004). Att incidena ct i prevalena AVC este mai mare la brbai dect la femei n marea majoritate a rilor i cresc cu naintarea n vrst.

Pe cazuistica noastr, studiul incidenei primului AVC n funcie de factorii de risc asociai a evideniat prevalena ndeosebi a persoanelor cu HTA, de regul de sex masculin i cu vrsta mai mare de 50 de ani (22,85% din totalul cazuisticii). Pe locul doi s-au situat persoanele ce au asociat dislipidemii (14,17%), urmate de cele cu fibrilaie atrial (4,73%) i, respectiv, diabet zaharat (0,8%). n Anglia, 50% din AVC ischemice au fost cauzate de HTA (Hankey i Warlow, 1994). Se estimeaz c riscul dezvoltrii de-a lungul vieii a unui AVC se reduce la jumtate la cei cu valori ale tensiunii arteriale de

7

Potrivit clasificrii lui Mena i colab. a infarctelor cerebrale n raport cu cronologia modificrilor morfologice, pe cazuistica investigat de noi, majoritatea AVC ischemice (63%) au fost diagnosticate n faza de organizare. Prima modificare morfologic dezvoltat n AVC ischemice investigate de noi a fost leziunea neuronal, respectiv moartea neuronilor. Astfel de neuroni au fost observai iniial n centrul AVC ischemice, prezentnd aspectul necrozei de coagulare, iar mai trziu n evoluia infarctelor au fost prezeni i n zona de penumbr sub form de celule necrotice sau apoptotice. Numeroase studii au artat c moartea neuronal se produce prin trei mecanisme majore: apoptoz, autofagie i necroz de coagulare, toate cele trei putndu-se dezvolta n accidentele ischemice cerebrale (Lipton, 1999; Taoufik i Probert, 2008). n studiul nostru, n afara leziunilor neuronale am mai consemnat ca i leziuni celulare, necroza de coagulare a microgliilor, oligodendrocitelor i astrocitelor din centrul zonei de infarct cerebral, precum i proliferri i activri ale unor astfel de celule n zona de penumbr.

Studiul efectuat de noi a evideniat existena unui proces de angiogenez n imediata vecintate a ariilor de lichefacie constnd n apariia de noi vase de regul imature, de calibru mic, neacoperite de pericite i cu defecte ale membranei bazale. O serie de studii efectuate pe modele animale de ischemie cerebral vin s confirme dezvoltarea de noi vase la marginea zonei de infarct cerebral, vase care au ns o morfologie profund alterat (Morris i colab., 2003).

n premier am efectuat evaluarea microdensitii vasculare (MVD) de la nivelul ariilor de infarct ischemic cerebral dezvoltate la om prin cuantificarea vaselor marcate cu CD105. n studiul nostru, MVD a fost mai crescut n aria perilezional la subiecii cu AVC instalat de cel puin 5 zile, valorile cele mai mari nregistrndu-le la cei cu AVC mai vechi de 7 zile. Marea majoritate a studiilor din literatur au artat c MVD a crescut numai n teritoriul ischemic adiacent zonelor necrotice (Manoonkitiwongsa i colab., 2001), fenomenul de angiogenez post-ischemic neextinzndu-se n tot parenchimul cerebral deservit de artera cerebral medie obstruat (Zhang i colab., 2002).

8

Studiul nostru este primul care caracterizeaz distribuia spaial a semnalului de fluorescen privind imunoreactivitatea pentru VEGF la nivel lezional i perilezional comparativ cu zona de lichefacie i aria corespondent controlateral. n esuturile lezionale post-stroke, cea mai intens reactivitate pentru VEGF am observat-o la nivelul neuronilor, aceast reactivitate crescnd cu vrsta leziunii i dinspre zona de lichefacie spre esuturile adiacente aparent normale. n modelele experimentale animale de ischemie cerebral s-a observat o cretere a expresiei VEGF la nivelul emisferului cerebral ischemiat la mai puin de 3 ore de la instalarea leziunii, expresia meninndu-se crescut timp de 3 (Marti i colab., 2000) pn la 7 zile (Wei i colab., 2001).

Investigaiile noastre de colocalizare fluorescen au evideniat existena unei reactiviti pentru VEGFR1 mai ales n ariile adiacente zonelor de lichefacie, acest receptor fiind exprimat la nivel neuronal, n astrocitele gemistocitice, n macrofagele spumoase ce invadeaz aria necrotic i la nivelul endoteliilor vaselor pre-existente i de neoangiogenez adiacente zonelor necrotice. Kovacs i colab. au evideniat expresia imunohistochimic a lui VEGFR-1 n celulele endoteliale din aria cerebral de infarct i la periferia acesteia, maximum de reactivitate fiind nregistrat la 7 zile de la producerea ocluziei arterei sylviene la obolan (Kovacs i colab., 1996).

n studiul nostru am remarcat prezena unei reactiviti pentru VEGFR2 limitat la nivelul neuronilor din vecintatea ariilor de necroz, a gemistocitelor, macrofagelor spumoase i a endoteliilor vaselor de angiogenez. Marti i colab. au constatat pierderea expresivitii pentru VEGFR-2 n zonele de infarct i meninerea acesteia n restul zonelor cerebrale la mai mult de 24 de ore de instalarea ocluziei arterei cerebrale medii (Marti i colab., 2000). La 48 de ore de la instalarea ocluziei, autorii au raportat inducerea expresiei ARN-ului mesager al VEGFR-2 la marginea zonelor de lichefacie i n membrana pial adiacent, maximum de expresivitate fiind nregistrat la 72 de ore.

9

n Capitolul VII sunt redate concluzii studiului nostru. Astfel, studiul epidemiologic al cazuisticii AVC

nregistrate n Spitalului Clinic Judeean de Urgen, Nr. 1, Craiova de-a lungul intervalului de timp 2008-2011 a scos n eviden prevalena accidentelor de tip ischemic (82,5%), dezvoltate mai frecvent la brbaii (raportul pe sexe 1,15:1) de peste 60 de ani (75%) i care au cumulat ca i factori de risc HTA i dislipidemii (24%).

Rezultatele studiului clinic au artat prevalena sindroamelor de afectare a arterei cerebrale medii (80%), mai mult de jumtate din aceti pacieni prezentnd la momentul instalrii AVC ischemic, sindromul afectrii teritoriului superficial al arterei sylviene, avnd ca simptom dominant hemiplegia facio-brahial contro-lateral. Pe locul doi ca i inciden s-au situat pacienii cu AVC ischemice produse ca urmare a interesrii mai multor teritorii arteriale cerebrale, iar pe ultimul loc cele produse prin afectarea arterei cerebrale posterioare (3%).

Studiul imagistic a artat c tomografia computerizat convenional i-a adus un real aport diagnostic n primele 24 de ore de la instalarea AVC ischemice n sub 41% din cazuri, acurateea sa diagnostic crescnd la 70% prin repetare n cazurile neconfirmate la examenul iniial. Examinarea dup administrarea substanei de contrast s-a dovedit a fi util, mai ales, n cazurile n care CT convenional a fost needificator, acurateea sa diagnostic, dar i de localizare topografic a leziunilor s-a dovedit, ndeosebi, dup 24 de ore de la instalarea AVC ischemic.

Rata general a mortalitii a fost de circa 42%, fiind ceva mai crescut la brbai (44% versus 39%) i cu valori maxime ndeosebi n rndul bolnavilor cu vrsta de peste 80 de ani. Cea mai nalt rat a mortalitii am consemnat-o n grupul pacienilor ce au prezentat asocieri de mai multe sindroame de afectare a ramurilor arteriale cerebrale (85%), n timp ce la polul opus s-au situat pacienii diagnosticai cu AVC ischemice produse n teritoriul arterei cerebrale posterioare (11%).

10

Investigaia histopatologic a evideniat heterogenitatea leziunilor cu interesarea tuturor compartimentelor celulare din parenchimului cerebral ischemiat. Totodat, aceste leziuni au prezentat o anumit cronologie ca dezvoltare i evoluie. Astfel, moartea neuronal debuteaz din primele minute i continu zile n ir, dar procesul este limitat spaial de o reacie inflamatorie care debuteaz din prima zi i care, evolutiv, i schimb caracterul din acut n unul de tip cronic i se finalizeaz printr-o cicatrice ntr-un interval de timp mergnd de la circa 2 sptmni la luni i ani de zile. n cazuistica noastr, majoritatea AVC ischemice necropsiate au fost diagnosticate n faza de organizare (63%).

n limitarea distruciilor neuronale un rol hotrtor l joac procesul de angiogenez care potrivit studiului nostru debuteaz ncepnd din a 3-a zi, valorile maximale ale microdensitii vasculare (MVD) precum i existena unei reacii proliferative endoteliale nregistrndu-se n zilele 6-7 post-stroke.

Studiul morfologic al procesului de angiogenez n AVC ischemice a evideniat faptul c:

topografic, procesul este prezent n imediata vecintate a ariilor de lichefacie, respectiv adiacent cicatricei gliale n formare;

se prezint sub forma unor reele de neovase cu arhitectonic haotic, cu un pattern extrem de complex, cu numeroase puncte de ramificaie, multiple arcade vasculare i un aspect tortuos evident;

neovasele au avut diverse grade de maturitate, cele mai imature fiind plasate adiacent ariilor necrotice au avut un calibru mai mic, nu au fost acoperite de pericite, lipsindu-le chiar membrana bazal i, nu rareori, am evideniat i celule endoteliale izolate. Ceva mai la distan de ariile necrotice i pe msur ce leziunile evolueaz n timp, gradul de imaturitate al acestor neovase a sczut;

de regul, aceste neovase, indiferent de topografie, au prezentat grosimi variabile ale membranei bazale, neregulariti de contur, discontinuiti, discoeziuni ale celulelor endoteliale cu membrana bazal i un numr redus de contacte cu procesele astrocitelor nconjurtoare;

11

Investigaia expresiei imunohistochimice a VEGF n AVC ischemice a evideniat prezena unei reactiviti n compartimentul neuronal, care a crescut cu vrsta leziunii i dinspre zona de lichefacie spre esuturile adiacente aparent normale. n plus, n vecintatea zonelor de lichefacie am mai consemnat reactivitate pentru VEGF la nivelul astrocitelor gemistocitice i a microgliilor activate non-fagocitice. Deasemenea, am mai consemnat o bun reactivitate i din partea macrofagelor spumoase prezente n ariile necrotice i adiacent acestora i din partea endoteliilor vaselor de angiogenez.

n studiul ntreprins de noi, imunoreactivitatea pentru VEGFR1 s-a suprapus temporo-spaial cu cea pentru VEGF, nregistrnd reactivitate n neuronii adiaceni ariei necrotice, n astrocitele gemistocitice, n macrofagele spumoase ce invadeaz aria necrotic, precum i la nivelul endoteliilor vaselor pre-existente i a celor de angiogenez adiacente zonelor necrotice.

O reactivitate aproape similar am consemnat-o i pentru VEGFR2, cu meniunea c doar endoteliile vaselor de angiogenez au fost pozitive pentru acest marker i c nu am consemnat nici un fel de reactivitate n zonele cerebrale neafectate ipsi- i contralaterale i nici n specimenele recoltate de la subiecii martori care nu au prezentat patologie vascular cerebral.

Un astfel de pattern al expresiei VEGF i a receptorilor si sugereaz existena unor mecanisme de tip autocrin i paracrin care la nivel neuronal i astrocitar au efect protectiv n faa agresiunii ischemice, limitnd procesele distructive i favoriznd recuperarea funcional a structurilor persistente. n plus, coexpresia VEGF i a receptorilor si la nivelul vaselor de angiogenez este martorul activitii i funcionalitii acestor vase n vederea limitrii leziunilor ischemice.

Acest profil proangiogen dovedete potenialele efecte benefice pe care le poate aduce o terapie bazat pe administrarea de ageni agoniti ai celor doi receptori VEGFR1 i VEGFR2 n tratamentul bolnavilor cu AVC ischemice care supravieuiesc mai mult de 72 de ore de la instalare.