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TECNICAS INTELIGENTES EN BIOINFORMATICA
Modelizacion de la regulacion genica en procariotasEl Operon Lactosa
Mario de J. Perez JimenezGrupo de investigacion en Computacion Natural
Dpto. Ciencias de la Computacion e Inteligencia ArtificialUniversidad de Sevilla
Master Universitario en Logica, Computacion e Inteligencia Artificial
Curso 2013-14
Introduccion
Cantidad de proteınas que produce un gen activo por unidad de tiempo: varıasegun las necesidades de la celula.
El nivel de expresion de los genes variara segun las condiciones ambientales, elnivel de diferenciacion de la celula etc.
Sıntesis de proteınas: alto coste energetico (hay que regular este proceso).
La regulacion se puede dar a nivel de la transcripcion o de la traduccion
? Lo mas directo es regular su tasa de transcripcion del gen en moleculas de RNAm, por parte de la
RNA-polimerasa.
Diferencias importantes entre los sistemas de regulacion de genes:
? En celulas procariotas varios genes pueden ser codificados por un unico RNAm (policistronicos).
? En celulas eucariotas un RNAm solo puede codificar un gen (monocistronicos).
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Sistemas de regulacion
? Positivo: una molecula efectora activa un promotor (no hay que anularningun inhibidor).
? Negativo: un inhibidor (represor) puede evitar la transcripcion y, para latranscripcion, es necesario inhibir al inhibidor (mediante un inductor);todas las ordenes de regulacion son negativas.
Un sistema pueder estar regulado, a la vez, positiva y negativamente.
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Concepto de operon
Un operon es un conjunto de genes cuya expresion esta regulada por losmismos elementos de control (promotor y operador) y los mismos genes.
Elementos que constituyen un operon:
I Los genes estructurales: son los genes cuya expresion esta regulada. Los operones bacterianos suelen
contener varios genes estructurales (policistronicos). Los operones eucarioticos suelen contener un solo gen
estructural (monocistronicos).
I El promotor (P): es un elemento de control, una region del DNA que es reconocida por la RNA polimerasa
para comenzar la transcripcion. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales.
I El operador (O): es otro elemento de control, una region del DNA con una secuencia que es reconocida
por la proteına reguladora. Esta situado entre la region promotora y los genes estructurales.
I El gen regulador: secuencia de DNA que codifica la proteına reguladora. Suele estar situado cerca de los
genes estructurales del operon pero no inmediatamente al lado.
I Proteına reguladora: proteına codificada por el gen regulador y suele unirse al operador del operon.
I Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresion de los genes estructurales.
Un operon se transcribe en una sola cadena de RNAm a partir de un unico
promotor.
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Promotores de un operon
El inicio de la transcripcion puede estar regulado por una proteına represora.
I Ejemplo: la sıntesis del triptofano en la bacteria E. coli.
• La proteına represora necesita al triptofano para unirse al operador e inhibir el proceso.
Promotores de un operon:
I Fuerte: en ausencia del represor, la tasa de union de la RNA-polimerasaes muy alta.
I Debil: en ausencia del represor, no son capaces de iniciar la transcripcion
por sı solos de forma efectiva.
• Necesitan una proteına activadora.
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El Operon Triptofano
Tiene cinco genes estructurales: trpE-trpD-trpC-trpB-trpA (¡en este orden!).
I Las enzimas codificadas por estos cinco genes actuan en la ruta metabolica de sıntesis del triptofano en el
mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma.
El promotor y el operador estan al lado de los genes estructurales
I Primero el promotor y despues el operador.
El gen regulador (trpR) codifica para la proteına reguladora.
I Este gen se encuentra en otra region del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del operon.
Existe un represor: el propio triptofano (correpresor).
El inductor del sistema es la lactosa
I El operon lactosa tambien esta bajo control positivo, ya que existe otra proteına que estimula la
transcripcion de los genes estructurales.
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Estrutura del Operon Triptofano
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En ausencia del triptofano (o cuando hay muy poco), la proteına reguladorano es capaz de unirse al operador de forma que la RNA-polimerasa puedeunirse a la region promotora y se transcriben los genes del operon triptofano.
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En presencia del triptofano, este se une a la proteına reguladora o represoracambiando su conformacion, de manera que ahora sı puede unirse a la regionoperadora y como consecuencia la RNA-polimerasa no puede unirse a la regionpromotora y no se transcriben los genes del operon triptofano.
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El Operon Lactosa
Los genes estructurales del operon lactosa son los siguientes:
I El gen z+: codifica la β-galactosidasa (Lac Z) que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa mas
galactosa.
I El gen y+: codifica la galactosido permeasa (Lac Y) que transporta b-galactosidos al interior de la celula
bacteriana.
I El gen a+: codifica la transacetilasa (LacA) que no parece estar relacionada con el metabolismo de la
lactosa.
El promotor y el operador estan al lado de los genes estructurales
I Primero el promotor y despues el operador.
El gen regulador es el gen i que codifica la proteına reguladora (en este caso,represora): LacI compuesta de 300 aminoacidos.
El inductor del sistema es la lactosa (en realidad es la alolactosa, un derivado)
I La alolactosa inhibe la accion de la proteına represora: se une a una region del LacI
cambiando su conformacion.
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Estrutura del Operon Lactosa (I)
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Estrutura del Operon Lactosa (II)
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Control de expresion de genes en el Operon Lactosa
Anadiendo un nuevo sustrato al cultivo se puede inducir la formacion deenzimas capaz de matabolizar este sustrato.
• Por ejemplo, en un cultivo de E. coli alimentado por glucosa cuando se transfiere algunas celulas a un
medio conteniendo lactosa tiene lugar una serie de eventos reveladores.
• En primer lugar, las celulas estan quiescentes (no metabolizan lactosa, se ralentizan otras actividades
metabolicas y la division celular se detiene) pero estan produciendo tres enzimas: LacY (galactosido
permeasa) que transporta la lactosa desde el cultivo al interior de la celula a traves de la membrana
plasmica, LacZ (β-galactosidasa) que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa, y LacA (transacetilasa)
cuya funcion no es conocida aun.
• Sin embargo, el cultivo empieza a crecer y la lactosa es consumida rapidamente
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El Operon Lactosa. Represion
I La proteına represora del operon lactosa se llama LacI.
I Parte de la molecula LacI se une al operador impidiendo la union de laRNA-polimerasa al promotor.
I El inductor del sistema es la alolactosa, un derivado de la lactosa:
represor del represor.
I La alolactosa inhibe la accion de la proteına represora: se une a una region del LacI
cambiando su conformacion e impidiendo que LacI se una al operador.
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El Operon Lactosa. Activacion
I La inhibicion del represor LacI es condicion necesaria pero no suficientepara la transcripcion de los genes estructurales.
I El complejo proteınico CRP-cAMP es un activador que propicia la unionde la RNA-polimerasa al promotor.
I La presencia de glucosa en el medio inhibe la sıntesis de dicho complejoproteınico: represion catabolica.
• La molecula EIIA∼P:
? Ayuda al transporte de la glucosa por el interior de la bacteria (en ese transporte, la
glucosa es fosforilada).
? Activa la enzima AC que, a su vez, regula la produccion de cAMP.
? Inhibe a la enzima LacY que transporta lactosa al interior de la bacteria.
• En medios ricos en glucosa, los niveles de cAMP son bajos.
• Para que se transcriban los genes del operon lactosa es necesario niveles alto de cAMP: cuando no
hay glucosa en el medio, la molecula EIIA∼P esta libre y se sintetiza cAMP.
• Cuando la E. coli crece en un medio sin glucosa pero rica en lactosa, los niveles de cAMP son
altos: El cAMP se une al receptor CRP y el complejo proteınico CRP-cAMP2 propicia la union de
la RNA-polimerasa al promotor, estimulando la transcripcion de los genes estructurales.
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Estrutura del Operon Lactosa (III)
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Operon Lactosa en E. coli
Mediante la degradacion de la lactosa, las bacterias obtienen energıa.
La bacteria E. coli es capaz de seleccionar la fuente de energıa cuando tienevarias a su alcance.
• En un medio que contiene glucosa, la E. coli prefiere a esta como fuente de energıa.
• Los operones que producen las enzimas necesarias para obtener energıa de otros azucares, estan
bloqueados.
El Operon lactosa esta sujeto simultaneamente a un control negativo y a uncontrol positivo:
I Control negativo: la proteına reguladora Lac I (producto del gen i) es un represor que impide la expresion
de los genes estructurales en ausencia del inductor.
I Control positivo: existe un complejo proteınico (CRP-cAMP2) que estimula la transcripcion de los genes
estructurales.
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Operon Triptofano versus Operon Lactosa
Operon Triptofano:
I La proteına represora solo se puede unir al operador cuando previamente esta unido al triptofano.
I El promotor es fuerte ya que la transcripcion esta regulado por un represor (Lac I), un activador de este
(lactosa) y por un represor de este (triptofano).
Operon Lactosa:
I La proteına represora solo se puede unir al operador en ausencia de lactosa.
I El promotor es debil ya que la transcripcion esta regulado por un represor (Lac I) y un complejo activador
(CRP-cAMP2).
I La presencia de glucosa en el medio inhibe la sıntesis del complejo activador.
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En ausencia de la lactosa, la proteına represora se encuentra unida al operadore impide la union de la RNA-polimerasa a la region promotora y, comoconsecuencia, no se transcriben los genes estructurales (ahorro energetico).
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En presencia de la lactosa, esta se une a la proteına reguladora quecambia su conformacion y se suelta de la region operadora dejando que laRNA-polimerasa se una a la region promotora y se transcriban los genesestructurales.
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Transcripcion del Operon Lactosa en E. Coli (I)
I Caso 1: Ausencia de glucosa y lactosa.
? Existiran muchos complejos CRP-cAMP2 que asistiran a la RNA-polimerasa para que se una al
promotor del operon pero NO se activara la transcripcion ya que el represor Lac I impedira esa
union.
I Caso 2: Presencia de glucosa y ausencia de lactosa.
? Existira un bajo numero de complejos CRP-cAMP2 pero NO se activara la transcripcion ya que el
represor Lac I impedira esa la union del complejo al operador.
I Caso 3: Presencia de glucosa y presencia de lactosa.
? Existira un bajo numero de complejos CRP-cAMP2 pero ahora SI se activara la transcripcion ya
que el represor Lac I esta inhibido por la presencia de la lactosa. Se producira, pues, un nivel bajo
de transcripcion (en este caso, no se necesita degradar lactosa para obtener energıa).
I Caso 4: Ausencia de glucosa y presencia abundante de lactosa.
? Existiran muchos complejos CRP-cAMP2 que asistiran a la RNA-polimerasa para que se una al
promotor del operon y SI se activara la transcripcion ya que el represor Lac I esta inhibido. Se
producira, pues, un nivel alto de transcripcion.
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Transcripcion del Operon Lactosa en E. coli: Modelo basado en sistemas P
En una bacteria E. coli existen dos regiones relevantes:
I La superficie celular de la bacteria que contiene un conjunto de proteınas que controlan el movimiento delas moleculas y detectan senales.
I El lumen bacteriano o interior acuoso de la bacteria donde una serie de proteınas estan involucradas enprocesos celulares especıficos.
En nuestro modelo vamos a considerar tres membranasI La primera esta etiquetada con s y representa la superficie celular. Los objetos que describen las entidades
moleculares asociadas a la membrana piel se localizaran en esta region, ası como las reglas que especificanlos procesos de seleccion de sustancia del entorno y de senalizacion (receptor-senal).
I La segunda esta etiquetada con c, esta contenida en la membrana s y describe el medio acuoso del interiorde la bacteria. Contiene los objetos y cadenas que especifican las proteınas y otras entidades molecularessituadas en dicho medio. Las reglas describen las interaccions que tienen lugar dentro de la bacteria.
I La tercera membrana esta etiquetada por e, contiene a la membrana s y describe el medio cultivo.Dependiendo de los recursos de azucares, la E. coli exhibira un comportamiento diferente. En nuestromodelo usaremos esta region para codificar esos recursos a traves de la multiplicidad de ciertos objetos. Lamembrana e delimitara la frontera de nuestro sistema.
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Entidades moleculares
Las proteınas y enzimas involucradas en la seleccion de azucares del medio y ensu metabolismo, seran representadas por sımbolos de un alfabeto: Oprot .
I Por ejemplo, se puede considerar que las moleculas EIICB y β–galactosidasa son entidades individuales sin
estructura interna.
El alfabeto Oprot es el siguiente conjunto:
{EIIA, EIIA∼P, EIICB, EIICB–EIIA∼P, EIICB∼P, Gluc, Gluc∼P, EIICB∼P–Gluc, Lact, LacY,
Lact-LacY, AC, AC–EIIA, AC–EIIA∼P, ATP, AC–EIIA∼P–ATP, LacY-EIIA, β–Galac, Lact,
β–Galac–Lact, Allolact, LacI, LacI–Alloct, CRP, CRP–cAMP, CRP–cAMP2, RNAP}
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Symbol MoleculeEIICBEIICB∼P
Glucose Transporter Enzyme IICBand its phosphorylated state
EIIAEIIA∼P
Glucose Transporter Enzyme IIAand its phosphorylated state
EIICB–EIIA∼P Complex transporter enzymes IICB and phophorilated IIAGluc Gluc∼P Glucose and its phosphorylated stateEIICB∼P–Gluc Complex transporter IICB phosphorylated and glucose
Lact LactoseLacY Lactose permease
Lact-LacY Complex lactose permease and lactoseLacY-EIIA Complex lactose permease and transporter enzyme IIA
ATPcAMP
Adenosine triphosphate andcyclic adenosine monophosphate
AC Adelynate CyclaseAC–EIIAAC–EIIA∼PAC–EIIA∼P–ATP
ATP and AC complexes with and ATP
β–Galacβ–Galac–Lact
β–Galactosidase and its complex with lactose
Allolact Allolactose, the inducerLacI LacI–Alloct The lac repressor and its complex with allolactose
CRPCRP–cAMPCRP–cAMP2
cAMP Receptor Protein, the activator,its complex with cAMP and its dimer
RNAP RNA polymerase
Mas tarde se detallaran las funciones de estas proteınas cuando se analice la especificacion de los procesos celulares
en el sistema de regulacion del operon lactosa usando reglas de reescrituras.
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Representacion de genes, RNAm y sitios
I Los genes que intervienen aparecen en una estructura lineal en donde el orden es esencial (orden en el quelos genes son expresados).
I La estructura lineal de los genes y del RNAm seran especificadas a traves de cadenas.
I Los sitios relevantes en el operon lactosa y en el RNAm seran representados usando sımbolos de losalfabetos Odna y Orna , resp.
I El alfabeto Odna es el siguiente conjunto:
{cap, capCRP−cAMP2 , op, opLacI , lacZs , lacZm, lacZe , lacYs , lacYm, lacYe , lacAs , lacAm, lacAe}
I El alfabeto Orna es el siguiente conjunto:
{Rib, op, lacZs , lacZm, lacZe , lacYs , lacYm, lacYe , lacAs , lacAm, lacAe}
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Sımbolos que indican los sitios relevantes
Symbol Sitecap Free CAP site where the activator CRP-cAMP2 binds
capCRP−cAMP2 CAP site occupied by the activator CRP-cAMP2 binds
op Free operator site where the repressor LacI binds
opLacI Operator site occupied by the repressor LacI bindslacZslacYslacAs
Sites marking the start point of the lacZ, lacY andlacA gene respectively
lacZmlacYmlacAm
Sites located in the middle of the lacZ, lacY andlacA gene respectively
lacZelacYe
Sites located in the final point of the lacZ andlacY gene respectively.
lacAeSite marking the end of gene lacA which coincideswith the transcription termination site of the lac operon
op Site marking the starting point of the mRNA transcript
lacZs lacZe
lacYs lacYe
lacAs lacAe
Sites marking the beginning and end of the reading framesin the mRNA for the genes lacZ, lacY and lacA respectively
lacZm
lacYm
lacAm
Sites located in the middle of reading frames of lacZ, lacY andlacA gene respectively
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La cadena s3 representa el operon lactosa en E. coli:
〈 cap. op .
30︷ ︸︸ ︷lacZs .lacZm. · · · .lacZm.lacZe .
12︷ ︸︸ ︷lacYs .lacYm. · · · .lacYm.lacYe .
6︷ ︸︸ ︷lacAs .lacAm. · · · .lacAm.lacAe 〉
La RNA polimerasa ocupa alrededor de 100 nucleotidos y, por ello, cada sımbolo 〈 lacZi 〉, 〈 lacYi 〉 y 〈 lacAi 〉with i = s,m, e, representa una sucesion de 100 nucleotidos del correspondiente gen, en lugar de solo uno.
Por tanto, tenemos unicamente 30 sitios lacZ, 12 lacY y 6 lacA que representan los 3000, 1200 y 600 nucleotidosde los correspondientes genes.
El lugar de enlace de CAP y el operador es representado por 〈 cap 〉 y por 〈 op 〉.
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Reglas que describen el transporte de glucosa
La recepcion de glucosa desde el entorno comienza con el reclutamiento de la proteına EIIA∼P del citoplasma atraves de al proteına transmemmbrana EIICB (regla r1).
Este proceso es reversible: EIIA∼P puede ser enviada al citoplasma (regla r2).
r1: EIICB [ EIIA∼P ]cc1→EIICB–EIIA∼P [ ]c , c1 = 0.235 molec−1sec−1
r2: EIICB–EIIA∼P [ ]cc2→ EIICB [ EIIA∼P ]c , c2 = 2× 10−4 sec−1
Una vez que la proteına EIIA∼P ha sido reclutada, puede interactuar produciendo la fosforilizacion de EIICB en lasuperficie celular y enviar EIIA al citoplasma (regla r3).
r3: EIICB–EIIA∼P [ ]cc3→ EIICB∼P [ EIIA ]c , c3 = 0.0706 sec−1
Una vez que la proteına EIICB∼P esta presente en la superficie celular la glucosa comienza a ser transportada alinterior de la celula enlazando con EIICB∼P (regla r4). Ahora bien, esta interaccion es reversible (regla r5).
Por otra parte, la glucosa puede ser transportada al interior de la bacteria y enviada al citoplasma (regla r6). Eneste proceso, la glucosa es fosforilada, Gluc∼P.
r4: Gluc [ EIICB∼P ]sc4→ [ EIICB∼P–Gluc ]s , c4 = 6.96× 10−3 molec−1sec−1
r5: [ EIICB∼P–Gluc ]sc18→ Gluc [ EIICB∼P ]s , c5 = 1.04× 10−2 sec−1
r6: EIICB∼P–Gluc [ ]cc6→ EIICB [ Gluc∼P ]c , c6 = 0.128 sec−1
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Reglas que describen el transporte de lactosa
El transporte de la lactosa en el interior de la bacteria se especifica por el mismo tipo de reglas que con la glucosa,si bien ahora el transporte es mas simple ya que no implica transferencia de un grupo fosforilo.
La entrada de la lactosa al interior de la bacteria necesita la presencia de LacY en la superficie celular. AunqueLacY es sintetizada en el citoplasma, ella se mueve a la superficie celular (regla r7).
r7: [ LacY ]cc7→ LacY [ ]c , c7 = 0.02sec−1
La recepcion de la lactosa, Lact, presente en el entorno se lleva a cabo en dos pasos. En el priemro, la lactosaenlaza con la permeasa (regla r8) y, entonces, la permeasa es transportada y enviada al citoplasma (regla r9).
r8: Lact [ LacY ]sc8→ [ Lact-LacY ]s , c8 = 5.12× 10−3molec−1sec−1
r9: Lact-LacY [ ]cc9→ LacY [ Lact ]c , c9 = 5.12× 10−3sec−1
La recepcion de la lactosa es inhibida por EIIA que enlaza a LacY produciendo el complejo LacY-EIIA (regla r10).
La lactosa no puede enlazar a este complejo sobre la superficie celular bloqueando el transporte de la lactosa por elinterior de la celula. El complejo LacY-EIIA se puede disociar en sus componentes (regla r11).
r10: LacY [ EIIA ]cc10→ LacY-EIIA [ ]c , c10 = 10−4 molec−1sec−1
r11: LacY-EIIA [ ]cc11→ LacY [ EIIA ]c c11 = 10−3 sec−1
Estas interacciones moleculares son importantes en la represion catabolica: un alto numero de EIIA no fosforiladaen el citoplasma es consecuencia de la presencia de glucosa en el entorno. Durante su transporte, la glucosa esfosforilada con un grupo fosforilo que es transferido desde EIIA∼P a EIIBC y, finalmente, a la glucosa. Por tanto,en presencia de glucosa, EIIA∼P es consumida en el citoplasma y EIIA se produce en alto numero, lo que inhibe lapermeasa LacY y la recepcion de lactosa.
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Reglas que describen la actividad de la β–Galactosidasa
La β–galactosidasa escinde la lactosa en glucosa y galactosa.
La produccion de la glucosa a partir de la lactosa no es crucial en la regulacion de la expresion de los genes en eloperoon lactosa.
La produccion de la alolactosa es un paso importante en la regulacion ya que actua como inductor.
• La alolactosa se obtiene de la interaccion entre la β–galactosidasa y la lactosa.
• Es una enzima que en primer lugar forma un complejo con la lactosa (regla r12) y despues interactua con elpara producir alolactosa (regla r13).
r12: [ β–Galac + Lact ]cc12→ [ β–Galac–Lact ]c , c12 = 3.92× 10−4 molec−1sec−1
r13: [ β–Galac–Lact ]cc13→ [ β–Galac + Allolact ]c , c13 = 3.92× 10−4 molec−1sec−1
La β–Galactosidasa se degrada en el citoplasma a traves de la maquinaria celular (regla r14).
r14: [ β–Galac ]cc14→ [ ]c , c14 = 1.93× 10−4 sec−1
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Reglas que describen la actividad de la Alolactosa
La Alolactosa es una senal de la presencia de lactosa en el entorno.
Actua como inductor del sistema de regulacion de genes del operon lactosa mediante la inhibicion del represor,LacI, con una interaccion directa (regla r15).
Un cambio de conformacion se induce en el represor cuando la alolactosa se enlaza a el, impidiendo su enlace con eloperador del sistema.
La alolactosa se degrada tambien en el citoplasma (regla r16).
r15: [ LacI + Allolact ]cc15→ [ LacI-Allolact ]c , c15 = 0.01molec−1sec−1
r16: [ Allolact ]cc16→ [ ]c , c16 = 5.58× 10−5sec−1
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Reglas que describen la actividad de la Adenylate Cyclasa
La Adenylate Cyclase (AC) regula la produccion de las moleculas de cAMP, cuyo numero es inversamenteproporcional al numero de moleculas de glucosa en el entorno.
Para la sıntesis de cAMP, la AC recluta del citoplasma a la fosforilada EIIA∼P (regla r17). Esta interaccion esreversible (regla r18).
r17: AC [ EIIA∼P ]cc17→ AC–EIIA∼P [ ]c , c17 = 2.35× 10−5molec−1sec−1
r18: AC–EIIA∼P [ ]cc18→ AC [ EIIA∼P ]c , c18 = 0.01sec−1
El complejo AC–EIIA∼P recluta ATP del citoplasma (regla r19) y lo transforma en cAMP que es enviado alcitoplasma (regla r20).
r19: AC–EIIA∼P [ ATP ]cc19→ AC∼P–EIIA∼P–ATP [ ]c , c19 = 2.35× 10−3molec−1sec−1
r20: AC–EIIA∼P–ATP [ ]cc20→ AC∼P–EIIA∼P [ cAMP ]c , c20 = 0.02sec−1
Como hemos indicado, el numero de moleculas no fosforiladas de EIIA es un indicador de la presencia de glucosa enel entorno.
Como parte del mecanismo de represion catabolica, EIIA inhibe la produccion de cAMP mediante el enlace con ACen la membrana celular (reglas r21 y r22).
Esto inhibe la activacion del operon lactosa mediante la represion de la actividad del AC y, por tanto, de laproduccion de cAMP y el activador CRP-cAMP2.
r21: AC [ EIIA ]cc21→ AC–EIIA [ ]c c21 = 2.35× 10−3molec−1sec−1
r22: AC–EIIA [ ]cc22→ AC [ EIIA ]c , c22 = 0.02sec−1
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Reglas que describen la formacion del activador CRP-cAMP2
La proteına CRP no puede enlazar con el promotor a menos que interactue con cAMP para producir el complejoCRP-cAMP que, a su vez, formara un dımero CRP-cAMP2 (regla r23 y r24).
Este dımero es capaz de enlazar con el promotor e incrementar la tasa de transcripcion de los genes codificados enel operon lactosa.
r23: [ CRP + cAMP ]cc23→ [ CRP-cAMP ]c , c23 = 5× 10−3molec−1sec−1
r24: [ CRP-cAMP + CRP-cAMP ]cc24→ [ CRP-cAMP2 ]c , c24 = 5× 10−3molec−1sec−1
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Reglas que describen la activacion y represion del operon lactosa
La tasa de transcripcion del operon lactosa viene determinada por el estado del lac operon switch.
Este switch lo integra el CAP site, 〈cap〉, donde enlaza el activador y el operador, 〈op〉, en donde enlaza el represor.
El switch tiene cuatro posibles configuraciones que dependen de la ocupacion del CAP site y del operator:
〈cap.op〉, 〈cap.opLacI 〉, 〈capCRP−cAMP2 .op〉 y 〈capCRP−cAMP2 .opLacI 〉.
Estas configuraciones se alcanzan mediante enlaces y disociacion de las reglas de factores de transcripcion.
En ausencia de lactosa el represor LacI se activara y enlazara con el operador inhibiendo la transcripcion del operonlactosa (regla r25). No obstante, ocasionalmente LacI se cae del operador permitiendo la produccion basal deproteınas (regla r26).
r25: [ LacI + 〈 op 〉 ]cc25→ [ 〈 opLacI 〉 ]c , c25 = 0.2molec−1sec−1
r26: [ 〈 opLacI 〉 ]cc26→ [ LacI + 〈 op 〉 ]c , c26 = 5sec−1
En ausencia de glucosa existe un gran numero de moleculas cAMP que produciran un elevado numero deactivadores, CRP-cAMP2. El activador enlaza reversiblemente con el CAP site 〈 cap 〉 (reglas r27 y r28).
r27: [ CRP-cAMP2 + 〈 cap 〉 ]cc27→ [ 〈 capCRP−cAMP2 〉 ]c , c27 = 0.01molec−1sec−1
r28: [ 〈 capCRP−cAMP2 〉 ]cc28→ [ CRP-cAMP2 + 〈 cap 〉 ]c , c28 = 5sec−1
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Reglas que describen el comienzo de la transcripcion en el operon lactosa
El primer paso en la transcripcion del operon lactosa consiste en el enlace de la RNA polimerasa (RNAP) al lacoperon switch.
La afinidad entre el lac operon switch y la RNAP depende de la configuracion del.
• Por una parte, cuando el CAP site esta libre, 〈 cap 〉, la RNAP rara vez enlaza con el lac operon switchproduciendo una tasa de transcripcion basal (rule r29).
• Por otra parte, cuando el activador CRP-cAMP2 ocupa el CAP site, 〈 capCRP−cAMP2 〉, se produce unincremento en la tasa de transcripcion de aproximadamente 40m veces (regla r30).
r29: [ RNAP + 〈 cap 〉 ]cc29→ [ 〈 cap.RNAP 〉 ]c , c29 = 5× 10−4molec−1sec−1
r30: [ RNAP + 〈 capCRP−cAMP2 〉 ]cc30→ [ 〈 capCRP−cAMP2 . RNAP 〉 ]c , c30 = 0.02molec−1sec−1
La RNAP inicia la transcripcion produciendo los nucleotidos complementarios del sitio del operador 〈 op 〉 (reglar31).
El sitio 〈 op 〉 marca el comienzo de la transcripcion de un mRNA.
Observese que tras la aplicacion de la regla r31 la subcadena 〈 op 〉 queda libre y, entonces, otra RNAP puedecomenzar la transcripcion incluso antes de que la primera RNAP acabe de transcribir el operon. Por tanto, estamossimulando la transcripcion por diferentes polimerasas como un proceso concurrente.
r31: [ 〈 RNAP.op 〉 ]cc31→ [ 〈 op. op. RNAP 〉 ]c , c31 = 2sec−1
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Reglas que describen la elongacion del mRNA en el operon lactosaDurante las primeras etapas de la elongacion del mRNA, la RNAP se mueve a lo largo del gen lacZ transcribiendoloen mRNA.La RNAP comienza transcribiendo los primeros nucleotidos del gen lacZ representado por 〈 lacZs 〉 y une los
ribonucleotidos complementarios especificados por 〈 lacZs 〉 al mRNA, 〈 op 〉 (regla r32).
La subcadena 〈 lacZs 〉 representa el RBS (ribosome binding site) para este gen. Una vez producido este sitio, unaregla de enlace de ribosoma puede ser aplicada y la traduccion puede comenzar antes de que finalice latranscripcion. Por ello, en nuestra simulacion, los procesos de transcripcion y traduccion tienen lugar en paralelo.
r32: [ 〈 op. RNAP. lacZs 〉 ]cc32→ [ 〈 lacZs .op.lacZs .RNAP 〉 ]c , c32 = 2sec−1
Durante la transcripcion se produce una cadena complementaria de mRNA que es descrita por la produccion delRNA site 〈 lacZm 〉 que se une al mRNA representado por la subcadena 〈 op.w 〉, w ∈ O∗
rna , mientras el DNAtranscrito 〈 lacZm 〉 se queda atras (regla r33I.
r33: [ 〈 op.w .RNAP.lacZm 〉 ]cc33→ [ 〈 lacZm .op.w .lacZm .RNAP 〉 ]c , c33 = 2sec−1
Cuando la RNAP alcanza el final del gen LacZ une al sitio 〈 lacZe 〉 a la subcadena 〈 op.w 〉, w ∈ O∗rna , que
describe el crecimiento del mRNA (regla r34).
La cadena 〈 lacZe 〉 representa un sitio de terminacion de la traduccion. Luego cuando los ribosomas alcanzan estesitio, se disocian dejando la proteına codificada por le gen lacZ, β-galactosidasa.
r34: [ 〈 op.w.RNAP.lacZe 〉 ]cc34→ [ 〈 lacZe .op.w.lacZe .RNAP 〉 ]c , c34 = 2sec−1
Las siguientes reglas describen la transcripcion de los genes lacY y lacA, de forma similar al caso del gen lacZ.
r35: [ 〈 op.w . RNAP. lacYs 〉 ]cc35→ [ 〈 lacYs .op.w.lacYs .RNAP 〉 ]c , c35 = 2sec−1
r36: [ 〈 op.w . RNAP. lacYm 〉 ]cc36→ [ 〈 lacYm.op.w.lacYm.RNAP 〉 ]c , c36 = 2sec−1
r37: [ 〈 op.w . RNAP. lacYe 〉 ]cc37→ [ 〈 lacYe .op.w.lacYe .RNAP 〉 ]c , c37 = 2sec−1
r38: [ 〈 op.w . RNAP. lacAs 〉 ]cc38→ [ 〈 lacAs .op.w.lacAs .RNAP 〉 ]c , c38 = 2sec−1
r39: [ 〈 op.w . RNAP. lacAm 〉 ]cc39→ [ 〈 lacAm.op.w.lacAm.RNAP 〉 ]c , c39 = 2sec−1
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Regla que describe el final de la transcripcion del operon lactosa
La transcripcion del operon lactosa finaliza cuando la RNAP alcanza el sitio de terminacion de la transcripcion, alfinal del gen lacA. Este sitio esta representado por la cadena 〈 lacAe 〉.
Cuando la RNAP alcanza este sitio, enlaza los ribonucleotidos, 〈 lacAe 〉 al mRNA 〈 op.w. 〉, w ∈ O∗rna , y lo
disocia del operon, liberando el mRNA (regla r40).
r40: [ 〈 op.w.RNAP.lacAe 〉 ]cc40→ [ RNAP + 〈 lacAe 〉 ; 〈 op.w.lacAe 〉 ]c , c40 = 2sec−1
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Reglas que describen el inicio de la traduccion
La traduccion comienza cuando los ribosomas, Rib, reconoce el RBS de los genes lacZ, lacY y lacA, representadospor las cadenas 〈 lacZs 〉, 〈 lacYs 〉 y 〈 lacAs 〉 (reglas r41, r42 y r43).
r41: [ Rib + 〈 lacZs 〉 ]cc41→ [ 〈 Rib.lacZs 〉 ]c , c41 = 0.16molec−1sec−1
r42: [ Rib + 〈 lacYs 〉 ]cc42→ [ 〈 Rib.lacYs 〉 ]c , c42 = 0.16molec−1sec−1
r43: [ Rib + 〈 lacAs 〉 ]cc43→ [ 〈 Rib.lacAs 〉 ]c , c43 = 0.16molec−1sec−1
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Reglas que describen la traduccion y la disociacion de los ribosomas
Durante la traduccion, los ribosomas se mueven a lo largo de los sitios en el mRNA representado por lassubcadenas 〈 lacZm 〉, 〈 lacYm 〉 y 〈 lacAm 〉 (reglas r44, r45, r47, r48, r50 y r51).
Cuando los ribosomas alcanzan el lugar de terminacion, lacZe , lacYe or lacAe , se disocian del the mRNAabandonando las proteınas β-galactosidase, LacY or LacA (reglas r46, r49 y r52).
r44: [ 〈 Rib.lacZs 〉 ]cc44→ [ 〈 lacZs .Rib 〉 ]c , c44 = 0.3sec−1
r45: [ 〈 Rib.lacZm 〉 ]cc45→ [ 〈 lacZm .Rib 〉 ]c , c45 = 0.3sec−1
r46: [ 〈 Rib.lacZe 〉 ]cc46→ [ β−Galac + Rib + 〈 lacZe 〉 ]c , c46 = 0.3sec−1
r47: [ 〈 Rib.lacYs 〉 ]cc47→ [ 〈 lacYs .Rib 〉 ]c , c47 = 0.3sec−1
r48: [ 〈 Rib.lacYm 〉 ]cc48→ [ 〈 lacYm .Rib 〉 ]c , c48 = 0.3sec−1
r49: [ 〈 Rib.lacYe 〉 ]cc49→ [ LacY + Rib + 〈 lacYe 〉 ]c , c49 = 0.3sec−1
r50: [ 〈 Rib.lacAs 〉 ]cc50→ [ 〈 lacAs .Rib 〉 ]c , c50 = 0.3sec−1
r51: [ 〈 Rib.lacAm 〉 ]cc51→ [ 〈 lacAm .Rib 〉 ]c , c51 = 0.3sec−1
r52: [ 〈 Rib.lacAe 〉 ]cc52→ [ LacA + Rib + 〈 lacAe 〉 ]c , c52 = 0.3sec−1
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Reglas que describen la degradacion del mRNA
El mRNA se degrada cuando ciertas enzimas enlazan con el RBS, 〈 lacZs 〉, strlacYs y 〈 lacAs 〉, eliminandolos afin de evitar que nuevos ribosomas inicien la traduccion (reglas r53, r54 y r55).
r53: [ 〈 lacZs 〉 ]cc53→ [ ]c , c53 = 0.2sec−1
r54: [ 〈 lacYs 〉 ]cc54→ [ ]c , c54 = 0.2sec−1
r55: [ 〈 lacAs 〉 ]cc55→ [ ]c , c55 = 0.2sec−1
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Un modelo basado en sistemas P
Πlac = (O, {e, s, c}, [ [ [ ]3 ]2 ]1,M1,M2,M3, Re , Rs , Rc ) (1)
en donde:
I El alfabeto O contiene los objetos que representan las entidades moleculares, proteınas, lugares del DNA yRNA involucrados en el sistema del operon lactosa.
O = Oprot ∪ Odna ∪ Orna
I Las etiquetas {e, s, c} identifican los tipos de compartimentos definidos por la estructura de membranasen Πlac : entorno, superficie celular y citoplasma.
I Las estructura de membranas consta de tres membranas que definen las tres regiones relevantes en elsistema: la membrana 1 representa el entorno, la membrana 2 representa la superficie celular y lamambrana 3 representa el citoplasma.
I Los multiconjuntos iniciales M1, M2 y M3 son parte de los parametros de nuestro sistema de especificacionΠlac . La etiqueta e se asocia a la membrana 1, la etiqueta s se asocia a la membrana 2 y la etiqueta c seasocia a la membrana 3.
I Los conjuntos de reglas de reescrituras sobre multiconjuntos de objetos y de cadenas, Re , Rs y Rc , estanasociados a las regiones relevantes. Estas reglas describen las interacciones moleculares que tienen lugar enlos compartimentos especificados.Re = {r4, r8}Rs = {r2, r3, r5, r6, r9, r11, r18, r20, r22}Rc = {r1, r7, r10, r12, r13, r14, r15, r16, r17, r19, r21, r23, . . . , r55}
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Parametros del sistema
Parametros de nuestro sistema de especificacion P(Πlac ): los multiconjuntos iniciales y las constantes estocasticasasociadas a las reglas.
P(Πlac ) = (M0(Πlac ), C(Πlac ))
I En nuestro caso, las constantes estocasticas tendran unos valores fijos (de un conjunto C). Se handetrerminado gracias a que el sistema del operon lactosa es el ejemplo canonico de regulacion de genes enprocariotas.
I Los multiconjuntos iniciales constituyen los parametros actuales del sistema: especificaremos el numero deobjetos y cadenas presentes inicialmente en cada compartimento. Obviamente, diferenetes escenarios seranrepresentados a traves de diferentes multiconjuntos iniciales. Para los multiconjuntos iniciales del sistema(M1,M2,M3), consideraremos cuatro posibles escenarios iniciales en el entorno {M1
1 , M21 ,M3
1 ,M41}, y
un unico escenario inicial en la superficie celular {M2} y en el citoplasma {M3}.
• Ausencia de glucosa y de lactosa en el entorno: M11 = (e, λ, λ).
• Abundante glucosa y ausencia de lactosa en el entorno: M21 = (e, Gluc300000, λ).
• Ausencia de glucosa y abundancia de lactosa en el entorno: M31 = (e, Lact300000, λ).
• Abundancia de glucosa y de lactosa en el entorno: M41 = (e, Gluc300000 + Lact300000, λ).
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Para la superficie celular hay un unico escenario inicial:
M2 = (s, EIICB2500 + EIICB ∼ P15000 + AC10000 + LacY3000}, λ)
Para el citoplasma hay un unico escenario inicial: M3 = (c,w3, s3), en donde w3 representa los objetos iniciales
w3 = RNAP300 + Rib3000 + EIIA2000 + EIIA ∼ P13000 + ATP1000000 + β − Galac3000 +LacI1500 + CRP10000
y s3 la cadena inicial que representa el operon lactosa:
〈 cap. op .
30︷ ︸︸ ︷lacZs .lacZm. · · · .lacZm.lacZe .
12︷ ︸︸ ︷lacYs .lacYm. · · · .lacYm.lacYe .
6︷ ︸︸ ︷lacAs .lacAm. · · · .lacAm.lacAe 〉
Estos parametros producen una familia, Flac (Πlac ; (M0, C)), que consiste de cuatro diferentes sistemas P quecorresponden a los distintos escenarios considerados.
1. PSM1 = (Πlac ; (M11 ,M2,M3), C)
2. PSM2 = (Πlac ; (M21 ,M2,M3), C)
3. PSM3 = (Πlac ; (M31 ,M2,M3), C)
4. PSM4 = (Πlac ; (M41 ,M2,M3), C)
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Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (I)
PSM1: comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno
Cuando la glucosa no esta presente en el entorno, EIIA∼P no es consumido y, por ello, se activa AC sobre lasuperficie celular.
Una vez activado el AC se produce un elevado numero de moleculas de cAMP, como muestr la figura siguiente.
cAMP enlaza con la proteına CRP y produce el complejo CRP-cAMP que por dimerizacion produce el activadorCRP-cAMP2.
0 100 200 300 400 500 6000
20000
40000
60000
80000
100000
120000
time
cAM
P
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Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (I)
PSM1: comportamiento del sistema sin glucosa y sin lactosa en el entorno
El CAP site sera ocupado por moleculas CRP-cAMP2 que asistiran a la RNA polymerase para que enlace con elpromotor.No obstante, como no hay lactosa en el entorno, no se producira alolactosa en el citoplasma y, por tanto, elrepresor estara activo y colapsara el operador.En estas condiciones un estado caracterıstico del operon lactosa (representado por una cadena) se obtiene ennuestro simulador.
cap-CRP-cAMP 2 RNAP op-LacI lacZ s lacZ m –op Rib–lacZ s –lacZ m RNAP lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m
lacZ m lacZ m lacZ m –op Rib –lacZ s –lacZ m –lacZ m–lacZ m –lacZ m –lacZ m –lacZ m–lacZ m –lacZ m RNAPlacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m
lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m
lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ m lacZ e
lacY s lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m lacY m
lacY m lacY m lacY m lacY m lacY e lacA s lacA m lacA m
lacA m lacA m lacA e
(2)
Observese que el CRP-cAMP2 esta en el CAP site asistiendo a la RNAP para enlazar al promotor del operonlactosa. Una vez enlazado, la RNA esta lista para la transcripcion siempre que el represor libere al operador, si nobloquera el inicio de la transcripcion.
En resumen, la configuracion del lac operon switch en este escenario, 〈 capCRP-cAMP2 .RNAP.opLacI 〉, produce
un leve incremento en la expresion de genes codificados en el operon lactosa: sin azucar en el entorno la bacteria
procede a la produccion basal de lactosa.
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Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (II)
PSM1: comportamiento del sistema con abundante glucosa y sin lactosa en el entorno
Al no haber lactosa en el entorno, no se producira lactosa en el citoplasma y el represor estara activo enlazandoseal operador del operon.
En estas condiciones la configuracion del switch sera 〈 cap.opLacI 〉 que unicamente permite la transcripcion deloperon lactosa a muy bajos niveles como puede observarse en el bajo numero de RNAP transcribiendo el operonque aparece en la siguiente figura.
0 100 200 300 400 500 6000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
time
Act
ive
RN
AP
Al estar presente la glucosa en el entorno hay poca necesidad de metabolizar lactosa.48 / 51
Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (III)
PSM1: comportamiento del sistema sin glucosa pero con abundante lactosa en el entorno
En estas condiciones:• Por una parte, la ausencia de glucosa en el entorno permite que el enzima EIIA∼P interactue con AC para
sintetizar un elevado numero de cAMP, lo que producira un alto numero de activadoras CRP-cAMP2. Porello, el CAP site sera ocupado propiciando el reclutamiento de RNAP, lo cual potenciara la transcripcion.
• Por otra parte, puesto que la lactosa es abundante en el entorno sera transportada por LacY, expresada anivel basal, en el citoplasma. La β-galactosidasa tambien esta presente en el citoplasma a nivel basalpermitiendo la escision de la lactosa en galactosa y glucosa, dando lugar a la alolactosa que actuara comoinductor enlazando al represor LacI. En la siguiente figura se observa como los represores activos soninhibidos rapidamente cuando la lactosa es abundante.
Bajo estas condiciones, el operon lactosa sera, a la vez, inducido (ningun represor se unira al operador) y activado
(el activador se enlazara al CAP site). Por tanto, la configuracion del switch sera 〈 capCRP-cAMP2 .op 〉 y losgenes codificados en el operon se transcribiran masivamente, como se deduce del numero de RNAP que estantranscribiendo el operon (figura izq.). Esto provocara un incremento en el numero de moleculas deβ−galactosidasa y LacY (figura der.).
0 100 200 300 400 500 600 700 8000
500
1000
1500
2000
2500
3000
time
Act
ive
Rep
ress
ors
0 100 200 300 400 500 600 700 8000
5
10
15
20
25
30
35
40
time
Act
ive
RN
AP
0 100 200 300 400 500 600 700 8002500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
time
Gal
acto
sida
se
0 100 200 300 400 500 600 700 8000
50
100
150
200
250
300
350
400
time
Cyt
opla
smic
Lac
Y
49 / 51
Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (IV)
PSM1: comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno
La presencia de glucosa produce un bajo numero de activadores y el operon lactosa no sera activado. Por tanto,incluso conla presencia de lactosa, los genes codificados por el operon seran transcritos a muy bajos niveles.Tambien existira poca absorcion de lactosa desde el entorno y el LacY sera inhibido.Observese en la siguiente figura que el numero de moleculas de glucosa en el entorno decrece mientras que lalactosa permanece casi constante, lo cual indica que pocas moleculas de lactosa son transportadas al interior de labacteria.
GlucoseLactose
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50250000
255000
260000
265000
270000
275000
280000
285000
290000
295000
300000
time
Num
ber
of m
olec
ules
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Analisis de la regulacion de genes en el operon lactosa (IV)
PSM1: comportamiento del sistema con abundante glucosa y abundante lactosa en el entorno
No obstante, alguna lactosa estra presente ne el citoplasma y producira alolactosa, inhibiendo al represorpermitiendo la transcripcion a bajos niveles.Ası pues, en estas condiciones, la configuracion del lac operon switch sera 〈 cap.op 〉. Luego el operon lactosa serainducido pero ningun activador CRP-cAMP2 se unira al CAP site: no habra transcripcion o se producira a bajosniveles como puede verse en la siguiente figura donde el numero de moleculas de galactosidasa y LacY comienza acrecer muy lentamente.
0 100 200 300 400 500 6002840
2860
2880
2900
2920
2940
2960
2980
3000
time
Gal
acto
sida
se
0 100 200 300 400 500 6000
20
40
60
80
100
120
time
Cyt
opla
smic
Lac
Y
En tanto que la bacteria puede metabolizar glucosa, tiene poca necesidad de metabolizar lactosa. No obstante,puesto que la lactosa esta presente, la bacteria no ignorara completamente ese azucar adicional.
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