ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SALMONELLA DARI BAHAN PANGAN

I. Tujuan Mahasiswa mampu mengisolasi dan mengidentifikasi Salmonella pada bahan pangan.II. Dasar TeoriKarakteristik SalmonellaGenus Salmonella yang termasuk famili Enterobacteriaceae: basil lurus, 0.7-1.5 x 2.0-5.0 m, gram negatif, biasanya motil, flagella tipe peritrik, bersifat fakultatif anaerobik. Patogen bagi manusia, menyebabkan demam enterik, dan gastroenteritis. (Brenner et al., 1923)Isolasi dan Identifikasi SalmonellaPre-enrichment pada Lactose BrothLactose Broth untuk kultivasi Salmonella dan bakteri koliform sampel. Pre-enrichment (media nonselektif) untuk regenerasi, mengencerkan substansi inhibitorik, menyediakan nutrisi bagi Salmonella.Selective Enrichment pada Selenite Cystine (SC) Broth dan Tetrathionate (TT) BrothSelenite Cystine Broth untuk enrichment selektif Salmonella. Pencernaan secara enzimatik (kasein, protein hewani) menyediakan nitrogen dan vitamin dalam broth. Karbohidrat (laktosa dan buffer) yang digunakan disodium fosfat. Sodium Selenit agen seletif bakteri gram positif dan bakteri enterik gram negatif.Tetrathionate Broth dengan iodine untuk pemulihan Salmonella spp., enrichment selektif terhadap Salmonella spp. dalam jumlah kecil (Hartman& Minnich. 1981). Selektivitas oleh kombinasi sodium thiosulfat dan tetrathionat menyupresi organisme intestinal. Terbentuk pada media setelah penambahan iodine dan potassium iodide,jika memiliki enzim tetrathionat reduktase dapat tumbuh. Bile salt, selektif supresi koliform dan bakteri gram positif. Kalsium karbonat menetralkan dan menyerap metabolit racun.Isolasi Salmonella Isolasi Salmonella dari kedua media enrichment dilakukan pada media selektif diferensial agar diperoleh bakteri Salmonella pada bentuk koloni murni.Hektoen Enteric (HE) AgarHektoen Enteric (HE) Agar media kompleks untuk menyeleksi dan mendiferensiasi Salmonella dan Shigella dari spesies lainnya. Didasari oleh kemampuan memfermentasi laktosa, sukrosa, atau salisin, dan mereduksi sulfur menjadi H2S. Sodium thiosulfat sebagai sumber sulfur teroksidasi. Besi amonium sulfat sebagai sumber besi untuk indikator H2S. Garam empedu untuk menghambat organisme gram positif. Bromthymol Blue dan acid fuchsin untuk indikator perubahan pH medium (Leboffe dan Pierce, 2012). Diferensiasi dengan hasil warna yang berbeda dari koloni pada media. Bakteri enteric memproduksi asam dari fermentasi menghasilkan warna kuning sampai pink. Salmonella dan Shigella bukan spesies yang mampu memfermentasi gula, namun mendegradasi pepton sehingga meningkatkan pH media dan memberikan warna koloni agak biru kehijauan. Salmonella mereduksi sulfur menjadi hidrogen sulfida sehingga koloni berwarna hitam.Bismuth Sulfat AgarBismuth Sulfat Agar adalah media yang sangat seletif untuk isolasi Salmonella spp. terutama Salmonella Typhi dari sampel makanan dan klinis. Dalam media ini, ekstrak beef dan pepton menyediakan nitrogen, vitamin, dan mineral. Bismuth sulfit indikator dan brilliant green adalah inhibitor bagi bakteri gram positif dan kelompok koliform, sedangkan kelompok Salmonella tumbuh. Besi sulfat berfungsi mendeteksi hidrogen sulfida. Ketika ada, besi akan mengendap menghasilkan koloni positif hitam dengan kilap logam. Kolono Salmonella Typhi akan berwarna hitam dengan zona hitam berukuran berapa kali lipat lebih lebar.Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) AgarXylose Lysine Desoxycholate Agar digunakan untuk isolasi dan diferensiasi bakteri patogen enterik. Sodium Desoxycholate berfungsi sebagai agen seleksi terhadap bakteri gram positif. Xylosa dapat difermentasi oleh semua bakteri enterik, kecuali Shigella. Lysin ditambahkan untuk membedakan Salmonella. Setelah Salmonella kehabisan Xylosa, lisin didegradasi oleh Salmonella dengan lisin dekarboksilasi mengakibatkan reaksi balik kenaikan pH sehingga warna kuning akibat suasana asam fermentasi menjadi merah (Taylor, 1965). Sodium thiosulfat dan besi sulfat memiliki fungsi yang sama seperti dua media sebelumnya, yaitu untuk diferensiasi Salmonella dengan penampakan koloni merah dengan warna hitam di tengahnya, sedangkan golongan koliform menghasilkan warna kuning.

Uji BiokimiaSulfur-Indole-Motility (SIM) TestUji ini digunakan untuk menentukan tiga aktivitas organisme uji, yaitu: reduksi Sulfur, produksi Indol dan Motilitas. Uji dilakukan pada medium semisolid yang mengandung kasein dan jaringan hewan sebagai sumber asam amino, campuran yang mengandung besi dan sulfur dalam bentuk natrium thiosulfat. Apabila organisme uji dapat mereduksi sulfur, organisme tersebut akan menghasilkan hidrogen sulfida (H2S) yang akan bereaksi dengan besi dan membentuk presipitat hitam. Jika organisme uji mampu menghasilkan indol dari kasein dan jaringan hewan, ketika diberi reagen Kovacs, reagen tersebut akan berubah warna menjadi merah. Uji motilitas menggunakan medium ini didasarkan pada bentuk medium yang semisolid. Apabila organisme uji bersifat motil, maka organisme tersebut dapat bergerak bebas dalam medium dan tumbuh di seluruh bagian medium selain tempat organisme tersebut diinokulasi (Leboffe dan Pierce, 2012).

2.2.4.2 Methyl Red, Voges-Proskauer (MRVP) TestUji MR untuk mendeteksi organisme yang mampu memfermentasi asam campuran yang mampu melampaui efektivitas buffer fosfat yang terkandung dalam medium dan menurunkan pH sehingga mengubah warna larutan. Asam yang diproduksi organisme-organisme tersebut bersifat cenderung stabil sementara asam yang diproduksi organisme pada umumnya bersifat labil sehingga diubah menjadi produk yang lebih netral. Sementara itu uji VP untuk mendeteksi organisme yang mampu mendeteksi glukosa dan dengan cepat mengubahnya menjadi acetoin dan 2,3-butadienol. Uji VP positif apabila setelah inkubasi dan penambahan reagen VP ke dalam medium terbentuk lapisan merah di atas medium (Leboffe dan Pierce, 2012).2.2.4.3 Simmons Citrate Agar TestSimmons Citrate Agar (SCA) mengandung karbon, satu-satunya organisme yang dapat tumbuh pada medium ini adalah organisme yang memiliki enzim sitrat permease. Satu-satunya sumber nitrogen dalam medium ammonium dihidrogen fosfat, jika organisme tumbuh dengan substrat asam sitrat, berarti menggunakan garam ammonia, menjadi ammonia dan ammonium hidroksida yang mengubah media menjadi alkali, memberikan warna biru pada indikator pH bromthymol blue (Leboffe dan Pierce, 2012)..2.2.4.4 Triple Sugar Iron Agar Ketika TSIA diinokulasi bakteri pemfermentasi glukosa, asam menurunkan pH dan mengubah media menjadi kuning. Ketika glukosa habis, organisme yang berada di bagian aerobic (slant) mendegradasi asam amino menghasilkan ammonia sehingga pH naik. Proses ini disebut reversion karena bagian slant menjadi merah kembali (Leboffe dan Pierce, 2012).Slant kuning dan butt kuning setelah 24 jam inkubasi mengindikasi organisme memfermentasi glukosa dan atau kedua gula lainnya. Gas yang dihasilkan oleh fermentasi teramati dengan kejadian agar terangkat dari dasar tabung. Hidrogen sulfida terbentuk dari reduksi tiosulfat dalam medium atau dari degradasi sistein dari pepton. Besi sulfat bereaksi dengan hidrogen sulfida membentuk endapan hitam. (Leboffe dan Pierce, 2012).2.2.4.5 Lisin Iron AgarLisin Iron Agar untuk diferensiasi mikroorganisme berdasarkan dekarboksilasi lisin dan produksi H2S. Pencernaan gelatin menghasilkan karbon, nitrogen, dan asam amino untuk pertumbuhan organism. Dekstrosa gula yang tersedia. L-Lisin substrat untuk mendeteksi lisin dekarboksilase dan lisin deaminase. Besi ammonium sulfat indikator produksi H2S. Thiosulfat sebagai sumber sulfur. Indikator Bromcresol purple berwarna kuning pada pH di bawah 5,2 ; berwarna ungu pada pH di atas 6,8. Aktivitas lisin dekarboksilase ditandai slant ungu dan butt ungu, sedangkan lisin eaminase ditandai slant berwarna merah.2.2.4.6 Gram StainingPewarna primer pada pewarnaan ini adalah crystal violet. Iodin kemudian ditambahkan sebagai mordant untuk memperjelas pewarnaan crystal violet dengan membentuk kompleks crystal violet-iodin. Pencucian dengan alkohol, sel-sel gram negatif tercuci oleh larutan ini sehingga warna ungu akan hilang sementara sel-sel gram positif tidak akan tercuci. Sampel kemudian diberi counterstain safranin. (Leboffe dan Pierce, 2012).Skema Kerja Pengayaan selektifPengayaan selektif

Penyiapan sample dan pengayaanTelur ayam Dimasukkan secara steril dan dipecahkanTSBDiinkubasi 37oC selama 24 jam.

TSB (setelah inkubasi) diadukSC dan TT broth (@10 ml)1 ml TSB dimasukkanDiinkubasi 37oC selama 24 jam.

Pengamatan cawan

Selective plattingXLDBSHEKoloni biru kehijauan dengan bintik hitam Koloni coklat kehitaman Koloni merah muda dengan bintik hitam Diambil 100 L dan dipindahSampel SC dan TT

Media BS, XLD, HE

Diinkubasi 37oC selama 24 jam.

Melakukan enrichment koloni Memastikan koloni

Diinkubasi 37oC selama 24 jam.SalmonellaMedia BS, XLD, HEDipastikan dengan ditumbuhkanDiambil 2 koloni dan diinokulasikan Pengamatan uji metabolik

IndolLIATSIAWarna merah dislant, kuning di butt Warna ungu Hasil uji negatif (tidak terbentuk cincin merah) SCAVPMRHasil uji positif (warna merah) Hasil uji negatif (warna tidak berubah) Hasil uji positif (warna biru) Diberi 3-5 tetes Reagen Kovacs Diberi 3-5 tetes metil redDiberi 5-10 tetes barrit A dan BMedia SC dan TTMedia TSADiinkubasi 37oC selama 24 jam. Inokulasi ke media uji metabolik

Kultur TSI, LIA, SIM, MR-VP, SCADitanamDiinkubasi 37oC selama 24 jam.

Daftar PustakaBrenner, Don J., Noel R. Krieg, & James T. Staley. 1923. Bergeys Manual Of Systematic Bacteriology Second Edition. Springer.De Vos, Paul. Garrity, George M. Jones, Dorothy. Krieg, Noel R. Ludwig, Wolfgang. Rainey, Fred A. Schleifer, Karl-Heinz dan William B. Whitman. 2009. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology Second Edition. New York: Springer.Hartman, P. A., and S. A. Minnich. 1981. Automation for rapid identification of Salmonellae in foods. J. Food Prot. 44:385-386. Leboffe, Michael J. dan Pierce, Burton E. 2012. Microbiology Laboratory Theory & Application Second Edition. Morton Publishing Company.Schaechter, Moselio. 2009. Encyclopedia of Microbiology Third Edition. New York: Elsevier Inc.Taylor, W.I. 1965. Isolation of shigellae. I. Xylose lysine agars; new media for isolation of enteric pathogens. Am. J. Clin. Pathol., 44:471-475.