TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS

VIRUS DE L’HEPATITIS C (VHC)

Table 25-1. Estimated prevalence and number infected according to world population (2003)

AFRICA 857087413 5.17 44311419.25

ASIA 3816573388 3.55 135488355.3

AMERICA 867610839 1.93 16744889.19

EUROPE 728996759 1.75 12757443.28

Total (2003) 6302188157 2.856 209902198.5

http://www.census.gov/cgi-bin/ipc/idbagg

Population 2003 Prevalence of HCV (%)*

Infected population 2003

OCEANIA 31919758 1.88 600091.4504

Quer J, Esteban JI Capt 25 Epidemiology HCV 3rd edition Viral Hepatitis Ed..H.Thomas, A. Zuckermann and S. Lemon. Pp407-425

Fig. 25-3 HCV prevalence (%) General Population cohorts

Mauritania 1.1

Somàlia 1.5

Kenya 0.9

Sudan2.8

Mozambique 2.8

Tanzania 3.2

Rwanda 4.1Burundi 11.3

Malawi 0.7 Zambia 0.2

Zimbabwe 2.0

South Africa 0.1

CAR 2.4

Camero

on 1.9-13.8

Chad4.8

Niger1.8Nigeria 2.1

Benin 1.6

Togo 3.9

Ghana 1.7

Egypt8.7- 51

Saudi Arabia 0.9-5.3

Yemen 2.1-2.58

Israel 0.44

India0.0012-5.5

China 2.1 Korea 1.4

Japan 0.98-2

Taiwan 0.13-17

Vietnam Ho Chi Minh 9

Australia 0.4-1.1

New Zealand 0.49

Hong Kong 0.5

Paki

stan

6.5

Italy 0.48-14.4

Spain 1.0-2.64USA 0.1-1.8

Madagascar 2.1

DRCongo 4.3-6.4

Uganda 6.6

Gabon 9.2

Equatoria

l Guinea

1.7Cote d’Ivoire 3.3

Senegal 2.2

Eritrea 1.9

Burkina Faso 4.9Guinea 5.5

Libya7.9

Tunisia 0.4

Portugal 0.46

France 0.3-1.73

Turkey 0.1

Uzbekistan6.5

Japan (Shizuoka) 5.1-49

Papua New Guinea 1-12

Sweden 0.3Iceland 0.2

Kiribati 4.8Vanautu <1

Nicaragua <0.01Venezuela <0.01

Mexico0.7

Canada 1.2

Peru <0.01

< 1%

1%-2,5%

2,5%-5%

5%-10%

>10%Brazil

3.0

Greece 1.95-2.3

Hungary 2.7

Germany 0.4

Jordan 0.65

Swaziland 1.5

Gambia 2.4Ehiopia 1.9

Southern Taiwan 17

England & Wales1.07

Philippines 1.6Thailand 2.0Vietnam Hanoi 4

Catalunya 1.0-2.64Asturias 1.2

San Diego 2.5

Jamaica <0.01

Russia 1.3-5.3

Quer J, Esteban JI Epidemiology. Capt 25 pp 407-425. In: Viral Hepatitis 3rd edition. Ed. H.C.Thomas, S.Lemon &

A.J.Zuckerman. Blackwell Publishing. Oxford 2005.

MECANISMES DE TRANSMISSIÓ DEL VHC

A. PARENTERAL:

1. Percutània:

2. Nosocomial

3. IVDU

• Transfusió

• Receptors de derivats sanguinis (factors coagulació -hemofíl·lics-, concentrats de plaquetes, IVIG)

•Hemodiálisis

•Trasplantaments d’òrgans

B. APARENMENT NO-PARENTERAL:

1. Tatuatges

2. Acupuntura

3. Treballadors sanitaris

C. NO PARENTERAL:

1. Vertical

2. Sexual, convivència

3. Drogaaddictes no IV.

INFECTATS A CATALUNYA (1-2.64%):

70000 –185000

TRASPLANTATS DE FETGE:

> 51% degut a infecció crònica per HCV (100% es reinfecten i el 35% pateixen cirrosis als 5 anys)

HEPATOCARCINOMA:

Incidència 7.5casos /100000hab. dels quals el

65-75% infectats per HCV

Pacients amb cirrosis: 2.5% HCC per any

DADES HCV

RESPOSTA AL TRACTAMENT

IFN + Ribavirina

G134%

66%

SVR

noSVR

noG1

78%

22%

SVR

noSVR

PROMIG RESPONEDORS AL TRACTAMENT: 50%

CATALUNYA: 70000 INFECTATS amb 50% RESPOSTA 35000 persones que requeriran trasplantament en els propers anys

F.Penin et al Hepatol 2004;39:5-19

Taxes de mutació(mutacions / nucleòtid / cicle de replicació)

RNA RNAMANCA DE MECANISMES DE CORRECCIÓ D’ERRORS

10-3 - 10-5

VIRUS (104 nts i taxa mut. de 10-4) = 1 mutació/genoma

RNA polimerasa

Sequència consens

Els virus de RNA tenen una estructura en QUASISPÈCIESE

spectre d

e mu

tants

Sequència master

Quasispecies diversity, pathogenesis and cooperative interactions

Vignuzzi M, et al. Nature 2005

C P2 P3

G64S

C P2 P3

Isolation tissuesIV inoculation

IV inoculation Isolation tissues

Isolation brainIV inoculation

RT-PCRSac digestion

+C P2 P3

G64S

C P2 P3

G64S

C P2 P3C P2 P3

Wild type RBV resistant mutant

Barreja de mutants relacionats entre sí, que estan replicant i sotmesos a procesos de mutació, competició i selecció natural.

Quasispècies

Estudis d’epidemiologia molecular:

Objectiu:

Quan es detecta una hepatitis provocada per virus (HCV o HBV), determinar quan i com es va produir la infecció per evitar que torni a ocórrer.

ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULARA. Estudi epidemiològic:

A1- Demostrar infecció (virus, genotip).

A2- Buscar possible font d’infecció.

B. Demostrar la font d’infecció

1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció.

2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics.

3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR)

4.-Seqüenciació

5.-Estudi fil·logenètic








4.-Seqüenciació


A1- DEMOSTRAR INFECCIÓ:VHC?

Genotip?

Mètodes Serològics Mètodes Virològics

Detecta Anticossos RNA

Sensibilitat >95% >98%

Especificitat Variable >98%

Detecció post-exposició 2-6 mesos 2-6 setmanes

Us Screening. DiagnòsticDiagnòstic, monitorització evolución infecció aguda i

tractament antiviral

DETECCIÓ DEL VIRUS DE L’HEPATITIS C

Chevaliez S, et al. Int J Med Sci 2006; 3:35-40Forns X, et al. J Hepatol 2006; 44:S35-S39Ferreira-Gonzalez A, et al. Semin Liver Dis 2004; 24 (suppl 2):9-18

EIA-3EIA-2

HCV RNA

ALT

EIA-1

ALT

800

700

600

500

400

300

200

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 8 10 12 2 4 6 8 weeks months years

liver HCV RNAE2 100%c22 95-100%c33 95-100%NS5 40-80%c100-3 30-90%

PCR

(polymerase chain reaction)

Múltiples còpies ADNdoble cadena

Múltiples còpies ARNcadena simple

1 sonda detecció x còpia amplificada

1 sonda detecció x còpia amplificada

Múltiples sondes marcades x diana

Primers, buffers, enzims Sondes i ADN ramificat

TMA

(transcription-mediated Amplification)

b-DNA

(branched-DNA)

TÈCNIQUES DETECCIÓ RNA VHC

Primers, buffers, enzims

TÈCNIQUES DETECCIÓ I QUANTIFICACIÓ ARN VHC

• QUALITATIVES

• Basades en PCR o TMA

• Més sensibles que majoria tècniques quantitatives (10-50 UI/mL)

• Excel·lent especificitat i reproducibilitat

• Essencials pel diagnòstic i monitorització tardana de la resposta al tractament

• QUANTITATIVES

• Basades en amplificació de diana (RT-PCR competitiva i RT-PCR en temps real) o

amplificació de senyal (DNA ramificat)

• Menor sensibilitat (excepte PCR en temps real)

• Menor reproducibilitat (CV entre laboratoris 10-80%)

» Diferències mètode extracció

» Deficient estandardització genotip no1

» Molt sensible a variacions qualitat de la mostra

• Pobre correlació entre diferents tècniques (especialment genotip no1)Pawlotsky JM. Gastroenterology 2002; 122:1554-68 Morishima C, et al. J Clin Microbiol 2004; 42:421-5Ferreira A, et al. Semin Liver Dis 2004; 24:9-18 Caliendo AM, et al. J Clin Microbiol 2006; 44:1726-32Halfon P, et al. J Hepatol 1996; 25:307-11 Sarrazin C, et al. J Clin Microbiol 2006; 44:729-37

Tests DNA HBVbranched DNA 1UI = 5.2 còpies/mL

COBAS Monitor 5.6

COBAS Taqman 5.8

ARN VHC (UI/mL)

Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0 (Roche)

Versant HCV RNA 3.0 (Bayer)

10 102 103 104 105 106 107 108

LCx HCV RNA assay (Abbott)

Cobas Taqman HCV Test (Roche)

Rango carga viral 95 % Hepatitis C no tratada

Abbott real time HCV Test (Abbott)

RANG DINÀMIC TÈCNIQUES COMERCIALS QUANTITATIVES

COBAS AMPLIPREP AUTOMATED EXTRACTION

PLATFORM

AUTOMATITZACIÓ EXTRACCIÓ RNA- AMPLIFICACIÓ TEMPS REAL

COBAS TAQMAN (real time PCR)

A1- DEMOSTRAR INFECCIÓ:VHC?

Genotip?

Genotips/Subtipus Confirmats HCV

Genotipo Locus/Aïllat(s) Nombre (s) d’Accés

Genotipo 11a HPCPLYPRE, HPCCGAA M62321, M674631b HPCJCG, HPCHUMR D90208, M583351c HPCCGS, AY051292 D14853, AY051292 Genotipo 22a HPCPOLP, JFH-1 D00944, AB047639 2b HPCJ8G, JPUT971017 D10988, AB030907 2c BEBE1 D504092k VAT96 AB031663 Genotipo 33a HPCEGS, HPCK3A D17763, D28917 3b HPCFG D49374 3k HPCJK049E1 D63821 Genotipo 44a HCV4APOLY Y11604Genotipo 55a EUH1480, SA13‡ Y13184, AF064490 Genotipo 66a HCV12083, 6a33 Y12083, AY858526 6b Th580 D84262 6d VN235 D84263 6g HPCJK046E2 D63822 6h VN004 D84265 6k VN405 D84264

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

DETERMINACIÓ GENOTIP VHC

• Mètodes comercials serològics

• EIA competitiu detecció anticossos epítops no estructurals genotip-específics (Murex HCV genotyping 1-6, Abbott)

• Detecció genotip 90% inmunocompetents

• Reactivitat creuada, falsos positius

• Mètodes comercials moleculars

• Seqüenciació directa 5’NC o NS5B (Truegene, Bayer)

• Hibridació inversa 5’NC sondes tipus-específiques (InnoLipa HCV II, Innogenetics; Versant HCV genotyping assay, Bayer)

• Detecció correcta 6 genotips >95% casos

• Error subtipat 10-25% casos

Pawlotsky JM. Semin Liver Dis 2003; 23:3-11

Simmonds P, et al. Hepatology 2005; 42:962-73

HEPATITIS CRONICA C

genotipo VHC y carga viral basal

Peg-IFN + RBV 12-16 semanas

Genotipo 2

ARN fin tratamiento y finseguimiento

(técnica sensible < 50 UI/ml)

Respuesta fin de tratamientoRespuesta virológica

sostenida

-

Genotipo 1,4,5,6

Cuantificación ARNa las 12 semanas

Interrumpir tratamientoTratamientos alternativos

en ensayos clínicos

Completar 48 semanas detratamiento

ARN fin tratamiento y finseguimiento

(técnica sensible < 50 UI/ml)

Respuesta fin de tratamientoRespuesta virológica

sostenida

Continuar tratamiento

ARN a las 24semanas

-+

ARN VHC > 2 log ARN VHC < 2 log

Genotipo 3

ARN > 8x105 ARN < 8x105

Peg-IFN + RBV24 semanas

Peg-IFN + RBVCuantificación ARN

a las 4 semanas

> 600 UI/mL < 600 UI/mL

Mangia A, et al. N Engl J Med 2005; 352:2609-17Von Wagner M, et al. Gastroenterology 2005; 129:522Zeuzem S, et al. J Hepatol 2006; 44:97-103

G134%

66%

SVR

noSVR

noG1

78%

22%

SVR

noSVR

GENOTIPS i RESPOSTA a IFN 2a+Ribavirina 800mg/day

34%66%

78%22%








4.-Seqüenciació


A2- BUSCAR POSSIBLE FONT D’INFECCIÓ.

1.-Entrevista exhaustiva:

•Possibles factors de risc descrits.

•Possibles factors de risc no descrits però que involucrin risc de contacte amb productes infectats.

2.-Pacients amb VHC que hagin coincidit amb el pacient infectat.

3.-Obtenció de mostres de sèrum dels pacients possible font d’infecció








4.-Seqüenciació


L’HCV és un virus de RNA. El RNA es degrada fàcilment, sobretot per acció de les RNases. Una font de RNases molt important son les mans del manipulador, per la qual cosa, a més de treballar en un ambient lliure de RNases (material esterilitzat 4h a 180ºC, ...) cal treballar sempre amb guants.

SÈRUM o PLASMA:•Recollida en Vacutainer sense additiu (sèrum) o amb CitratNa (plasma) evitant EDTA i heparina (segons el tipus d’extracció de RNA) doncs son inhibidors de la PCR

•Centrifugació i separació sèrum/plasma < 3 hores

•Congelació - 40º C (- 70º C emmagatzament perllongat)

•Evitar cicles de congelació-descongelació

BIÒPSIA de FETGE (fresca):Guardar la mostra de teixit en un reactiu estabilitzador: RNAlater (Ambion #7020, Qiagen #76104).

- 1 dia a 37ºC

- 1 setmana a 18-25ºC (Tª ambient)

- 1 mes a 2-8ºC

- Indefinit a –80º si després de 24h en RNAlater, es passa el teixit a criotub sense reactiu.

BIÒPSIA (congelada directament en nitrogen líquid o a –80ºC):Abans d’extracció, incubar la mostra en RNAlater ice 16h a –20ºC.

BIÒPSIA en parafina:Tamany promig de RNA viral obtingut: 650nts

1.-RECULLIDA i CONSERVACIÓ de la MOSTRA








4.-Seqüenciació


RNA / DNA

1.- Extracció amb Tiocianat de guanidini i Fenol/cloroform (Chomczynski 1987).

2.- Columnes amb membranes de gel de silici: QIAGEN (Izasa), Ambion:

2a.- En cas de teixits cal passar per un pas previ d’homogeneïtzació

2b.- Kits per extracció de DNA i/o RNA total, mRNA, RNA viral, etc....

3.- Automatització

2.- EXTRACCIÓ d’ÀCIDS NUCLEICS

2a.HOMOGENEÏTZACIÓ de TEIXITS, LLEVATS, BACTERIS...

1.-Homogeneïtzador (potter)

2.- Manual (vidres esmerilats...)

3.- Automàtic:

•Fastprepwww.qbiogene.com (Pacisa-Giralt)

•MagNA lyser www.roche-applied-science.com

http://www.qbiogene.com/




http://www.roche-applied-science.com/








2a.HOMOGENEÏTZACIÓ AUTOMÀTICA de TEIXITS

3.- Automàtic:

•Fastprepwww.qbiogene.com (Pacisa-Giralt)

Consisteixen en una centrífuga que duu un rotor que a més de girar oscil·la de manera que agita el contingut del tub (up & down).

Els tubs estèrils on s’afegeix la mostra a homogeneïtzar contenen boles de ceràmica o de vidre. Es pot dur a terme en fred per evitar degradació dels àcids nucleics o proteïnes o be usar el primer buffer dels kits d’extracció de RNAtotal (RLT), RNAviral (AVL) o DNA (ATL).

Temps: 30-40”





www.qiagen.com

www.ambion.com

2b. EXTRACCIÓ RNA. Columnes de gel de silici.

http://www.qiagen.com/




http://www.ambion.com/




EXTRACCIÓ RNA-HCV

Plasma, sèrum o líquids: Qiamp RNA viral (50952904 / 06 Qiagen- Izasa)

Biòpsia de (fetge) conservat en RNAlater:

1. Homogeneïtzar amb Fastprep (Qbiogene-Pacisa Giralt) boles Lysing matrix D (tap color verd) 6913-050

2. Extracció amb RNeasy mini kit (50974104) duu Tiocianat de Guanidini que ajuda a trencar cèl·lules

Limfòcits: RNeasy mini kit (50974104)

Biòpsia en parafina:

1. Tallar el bloc en 2-4 fragments de 5-10micres i desparafinar amb Xilè.

2. Extracció amb el kit: Recover all RNA (cat.1975 Ambion)

Recomanacions. EXTRACCIÓ DNA-HBV

Plasma, sèrum, sang, etc...: Qiamp DNA mini kit (50951304 Qiagen- Izasa)

Biòpsia de (fetge) conservat en RNAlater: Biòpsia s'homogeneïtza amb Lysing matrix A (DNA) o D (RNA). Extracció amb Qiamp DNA mini kit.

Biòpsia en parafina: Desparafinar amb Xilè i extreure amb Qiamp DNA mini kit







3.-Amplificació del RNA per doble PCR (RT-Nested-PCR). REGIÓ VIRAL A ANALITZAR 4.-Seqüenciació


RT-PCR

1.- Fase de còpia de RNA a cDNA. Transcripció reversa

RNA +

Hibridació “primer” 3’ (down)

Síntesi de la primera cadena (cDNA) amb MMuLV-RT (42º 45min)

RNA +

cDNA cadena -

RT- PCR1.- Fase de còpia de RNA a cDNA. Transcripció reversa

2.- Fase d’amplificació del DNA. PCR

Desnaturalització 95ºC

Hibridació “primer” 5’ (up) 50º-55ºC

Polimerització 72ºC. Taq DNA polimerasa

Final cicle 1 = 2 molècules de DNA

Desnaturalització 95ºC

Polimerització 72ºC. Taq polimerasa



Final cicle 4 = 16

AMPLIFICACIÓ EXPONENCIAL. 35 cicles

Hibridació “primer” 5’ (up) 50º-55ºC








4.-Seqüenciació


ABI PABI PRISMRISMTMTM 310 310

Sistema de Análisis Genético por Sistema de Análisis Genético por Electroforesis CapilarElectroforesis Capilar

Sequenciació Productes de PCRSequenciació Productes de PCRSequenciació Productes de PCRSequenciació Productes de PCR

Eliminar primers & dNTPs de la reacció PCR. Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel-Cultek)

Seqüenciació CíclicaSeqüenciació Cíclica

Valoració de la qualitat

(gel d’agarosa)

Quantificació (nanodrop)

A T T GC G

250

T T GC GC T C A C

260

T GC C C GC T T T

270

C CA G T C G GG A

280

A A C C T G T C GT

290

GC CA G C T G C A

300

T T A A T G A A T C

310

G GC CA A C G C G

320

C G G GG A G A G G

330

C G G T T T G C G T

340

A T T G G G C

GCG TTG

250

CG CT CA CT GC

260

CCGCT T T CCA

270

GT CG GG A A A C

280

CT GT CGTG CC

290

A GCT GCAT T A

300

A TG A AT CGGC

310

CA ACGCGCGG

320

GG AG AGGCGG

330

T T T GCGT A TT

340

G GGCGCT CT T

350

CCG CT TC CT C

360

GCT CA C

TG CG CT CA C

250

T GCCCGCT T T

260

CCA G T CGG G A

270

A ACCT G T CG T

280

G CCA GCT GCA

290

T TA A TG A ATC

300

G GC CA A CG CG

310

CGG GG AG ANG

320

CG GT T TG CG T

330

A T TGG GCGCT

340

CT T CCGCT T C

350

CT CGC TCA CT

360

GA C

Rhodamine FS Terminator

dRhod Terminator

BigDye Terminator

p21 gp35 gp70 p7 p23 p70-72 p8-10 p27 p68-70

5' cccccccccuccc

AUG

UU

UU

U

U

C

CC

Py-II

Py-I

I

II

III

IV

AUG

p7

3'UTR

19

0/1

38

3/4

74

6/7

80

9/1

0

10

24

/5

16

57

/81

71

1/2

19

72

/3

24

20

/1

5'UTR

Envelopeglycoproteins

RNA bindingNucleocapsid Zn metallo-

proteinase

2+

Ser Protease/Helicase NTP

CofactorSer/Prot ?

Replicasefunction

RNA-dependentRNA polymerase

Cleavagesites (aa)

Protein size (KDa)

Function

STRUCTURAL NON STRUCTURAL?

3'UTR

UUU...UUU UUUCU...UUCUUTGA

p56-58

C E1 E2 2 3 4B 5A 5B4A

REGIÓ DE L’HCV A ANALITZAR?

p7

3'UTR5'UTR

STRUCTURAL NON STRUCTURAL

CE1 E2 2 3 4B 5A 5B4

A

PERCENTATGE D’HOMOLOGIA entre GENOTIPS a nivell de NUCLEÒTIDS (AMINOÀCIDS) al llarg del genoma de l’HCV.

Genotipat

92-9

8 81-9

1 (9

5-99

)55

-75

(51-

79)

65-7

2 (7

0-78

)(Okamoto J.Virol 1992)

67-7

1 (6

6-77

)

70-8

0 (8

0-92

)

65-7

9 (7

2-87

)

66-7

9 (6

9-84

)

26-7

9

Homologia nts (aa)

Estudi epitops Resposta Immune

Estudis epidemiologia molecular

p7

Mu

tan

t sp

ectr

um

Master sequence

Consensus sequence

En el sèrum i en el fetge d’un pacient infectat, trobem una població de virus tots ells diferents (persistència viral, dificultat en obtenció de vacunes, ...).

Nosaltres emprem la variació per demostrar que un pacient s’ha infectat a partir d’un altre. Estudis d’epidemiologia molecular.








4.-Seqüenciació


ARBRES FIL·LOGENÈTICS

DISTÀNCIA GENÈTICA:

Comparant seqüències de nucleòtids entre si s’obtenen matrius que indiquen lo distants que estan unes amb les altres.

ARBRES FIL·LOGENÈTICS

Son representacions gràfiques de les distàncies genètiques i s’obtenen emprant una sèrie d’algoritmes.

RELACIÓ FIL·LOGÈNICA

? ???

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html

Phylogeny Programs

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.pars.html






http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.dist.html

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.etc1.html








































































http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.serv.html












Clustalw.exe

GENEDOC.EXE.lnk

Paquet de programes construcció arbres

fil·logenètics

PHYLIPW http://evolution.gs.washington.edu/

phylip.html

Tac2006.pir

Tac2006.phy

Programa d’alineament de seqüències CLUSTALW

Programa per manipulacio de seqüències GENEDOC

MEGA 3.1 Matrius de distàncies genètiques

Clique.exe Consense.exe Contml.exe Contrast.exe Dnacomp.exe Dnadist.exe

Dnainvar.exe Dnaml.exe Dnamlk.exe Dnamove.exe Dnapars.exe Dnapenny.exe

Fitch.exe Kitsch.exe Neighbor.exe Protdist.exe

Protpars.exe Seqboot.exe Infile TreefileOutfile

Fontfile

Restml.exe

Factor.exe

TreeView (2).lnk

Treeview Observació arbresMEGA 3.1.lnk Dnasp.exe

DNASP Càlcul diversitat

http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html




100

HC-J1

HCV1

Q1a

LC3

LC4

LC2

LC1

937

MAN

WOMAN

998

707

1000

455

663

938

Quer et al. Sex.Transm.Dis. 2003; 30:470-471

ARBRE FIL·LOGENÈTIC E2-PePHD. SEQÜÈNCIA DIRECTA DEL PRODUCTE DE PCR.

ARBRE FIL·LOGENÈTIC NS3. SEQÜÈNCIES CONSENS AL LLARG DEL TEMPS i de CLONS del Pacient A (crònic) i B (aguda)

1000

A-10/1993

A-10/1993dA-1/1996

A-10/1997

B1B4

B2B10

A3B7

B-9/1998

B3B12B5

B8B6

B11B9

3703

9636

A4A5

A2

A17654

A-10/1998

A10

A6A12

A8A7

82887444

7601

7858

6234

3153

9564

7071

4776

A11A9

9997

A-5/20019704

4604

6971

9950

4467

3817

Pacient B clons (WOMAN)

Pacient A clons

(MAN)

Patient A class II: DR1, DR15; DR51; DQ5, DQ6; class I: A2, A28; B7, B14; Cw7, Cw8

Patient B class II: DR4, DR11; DR52; DR53; DQ3; class I: A66, A69; B41, B55; Cw1

Quer J, et al. J Virol 2005; 79:15131-41 ESTUDI D’EVOLUCIÓ

CASOS CLÍNICS








4.-Seqüenciació


DIAGNÒSTIC

PACIENT 2004. Es detecta un pacient amb Hepatitis Aguda. ICTERICIA.

Hepatitis?

RESULTAT ANÀLISI

VHC +

G1b

A1- DEMOSTRAR INFECCIÓ (VIRUS, GENOTIP).

TRANSMISSIÓ NOSOCOMIAL VHC

Anti-HCV - + + + + + + + + + + + + + + + HCV RNA + - + + + - - - - - -

Peg-IFN 2b

CT scan Colonoscopy

CTA1a CTA1b CTA1c

Perfil de transaminases i detecció HCV (serologia i RNA). Pacient amb hepatitis aguda


ENTREVISTA EXHAUSTIVA:

Operacions, proves clíniques realitzades, comportaments de risc...

VHC +

Unes setmanes abans, el pacient CTA havia estat sotmès a ENDOSCÒPIA amb BIÒPSIA.

El pacient anterior era VHC+.

ENDOS

G1b

1. EXTRACCIÓ D’ARN

SÈRUM ARN VIRAL

Gel d’ Agarosa

PM PM2. AMPLIFICACIÓ

D’ÀCIDS NUCLEICS PCR.(polymerase chain reaction)

PCR tradicional

PCR Quantitativa

Fragment 650 pbFragment 200 pb

http://es.wrs.yahoo.com/_ylt=A0Je56HFKRVEZMAAsZyV.Qt.;_ylu=X3oDMTA2bTQ0OXZjBHNlYwNzcg--/SIG=1e89urva8/EXP=1142324037/**http%3A//es.search.yahoo.com/search/images/view%3Fback=http%253A%252F%252Fes.search.yahoo.com%252Fsearch%252Fimages%253Fp%253DAPPLIED%252B2700%2526ei%253DUTF-8%2526fr%253DFP-tab-img-t%2526x%253Dwrt%26w=188%26h=220%26imgurl=www.ebiotrade.com%252Fadf%252Fabi%252F2700pcr.jpg%26rurl=http%253A%252F%252Fwww.ebiotrade.com%252Fadf%252Fabi%252Fabi-gene.htm%26size=4.1kB%26name=2700pcr.jpg%26p=APPLIED%2B2700%26type=jpeg%26no=6%26tt=13%26ei=UTF-8

p7

3'UTR1

90

/1

38

3/4

74

6/7

5'UTR

STRUCTURAL NON STRUCTURAL?

C E1 E2 2 3 4B 5A 5B4A

80

9/1

0

10

24

/5

16

57

/81

71

1/2

19

72

/3

24

20

/1

Regió E2-PePHD per Estudis d’epidemiologia molecular

PePHD

38

3/4

74

6/7

E2

659

670

(Taylor et al 1999; 285: 107-109)

65-72% (70-78)Percentatge d’homologia entre genotips =

310 Genetic Analyzer 24/24 24/24 hourshours, 7/7 , 7/7 daysdays

3. SEQÜENCIACIÓ DNA

100

G1b

X1BENO

X1BKOR

X1BAUST

XAUS21000

235

SR1bPR9

X1BOKA224

NR1bPR7

X1BXIN

X1BAIZ487

22

NR1bRb2

NR1bPR1185

X1BTAK

NR1bNULL6164

13

NR1bNULL2

SR1bRVR3

X1BGRM251

89

LC17250

NR1bNULL7

NR1bNULL1

NR1bNULL5442

SR1bPR4

LC18

LC19989

400

119

76

6

SR1bRVR10

SR1bRVR21262

X1BHON

SR1bRVR5

LC14

SR1bPR8290

171

75

21

3

4

14

11

65

1000

ENDOSCÒPIA?

PACIENT INFECTAT CTA1

PACIENT HCV+ PREVI ENDOSCÒPIA ENDOS

100

G1b

X1BENO

X1BKOR

X1BAUST

XAUS21000

235

SR1bPR9

X1BOKA224

NR1bPR7

X1BXIN

X1BAIZ487

22

NR1bRb2

NR1bPR1185

X1BTAK

NR1bNULL6164

13

PACIENT HCV+ PREVI ENDOSCÒPIANR1bNULL2

SR1bRVR3

X1BGRM251

89

LC17

PACIENT INFECTAT

250

NR1bNULL7

NR1bNULL1

NR1bNULL5442

SR1bPR4

LC18

LC19989

400

119

76

6

SR1bRVR10

SR1bRVR21262

X1BHON

SR1bRVR5

LC14

SR1bPR8290

171

75

21

3

4

14

11

65

1000

ENDOSCÒPIA?


CTA1-Genbank / CTA1-LC = 7.8-14.7%

CTA1- ENDOS = 12.4%

CTA1

ENDOS


VHC +

El pacient CTA, també es va sotmetre a un TAC amb CONTRAST. No s’ha descrit cap cas de transmissió per aquesta via.

Coincidència amb que el pacient anterior era VHC+.

G1b

100

G1b

X1BENO

X1BKOR

X1BAUST

XAUS21000

235

SR1bPR9

X1BOKA224

NR1bPR7

X1BXIN

X1BAIZ487

22

NR1bRb2

NR1bPR1185

X1BTAK

NR1bNULL6164

13

EBA0105

NR1bNULL2

SR1bRVR3

X1BGRM251

89

LC17

PACIENT INFECTAT

PACIENT PREVI TAC MOSTRA AGOST

PAC. PREVI TAC MOSTRA NOV

PAC PREVI TAC MOSTRA DES.1000

1000

1000

250

NR1bNULL7

NR1bNULL1

NR1bNULL5442

SR1bPR4

LC18

LC19989

400

119

76

6

SR1bRVR10

SR1bRVR21262

X1BHON

SR1bRVR5

LC14

SR1bPR8290

171

75

21

3

4

14

11

65

1000

TAC amb CONTRAST ?


CTA1-Genbank / CTA1-LC = 7.8-14.7%

CTA1- TAC = 0.6%

CTA1

TAC

CRITERIS OBJECTIUS DE VALORACIÓ

Divergència genètica:

Nucleòtids Aminoàcids

Genotip (genoma): 31-34% 30%

Subtipus (genoma): 20-23%

Quasispecies (envolta) 10%

Inòcul compartit (consens envolta) 1%

Pawlotsky JM, Trends Microbiol 2004; 12:96-102

Documents

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS