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CROMATOGRAFÍA

FUNDAMENTO TEÓRICO

Las técnicas cromatográfícas se utilizan actualmente para la separación, aislamiento,

purificación e identificación de sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas.

Todos los métodos cromatográfícos se basan en las diferentes afinidades de los

componentes de una muestra por las fases inmiscibles con las que están en contacto.

Según sea el proceso de separación, los métodos cromatográfícos se clasifican en:

1. Cromatografía de adsorción

Las propiedades responsables de la separación son las fuerzas de adsorción. Si una mezcla

de sustancias disuelta en una fase se pone en contacto con otra fase, las sustancias se concentrarán

más o menos en la superficie de la otra fase; esto se llama adsorción. Según las fases que

intervienen puede ser:

• Cromatografía de adsorción líquido-gas. La fase fija es un líquido y la fase móvil

un gas.

• Cromatografía de adsorción sólido-gas. La fase fija es un sólido y la móvil un gas.

• Cromatografía de adsorción sólido-líquido. La fase fija es un sólido y la móvil un

líquido. Es la más usual, se puede hacer en columna o en capa fina.

2. Cromatografía de partición.

La separación se basa en la distinta solubilidad de las sustancias en dos fases diferentes.

Esta diferencia de solubilidad se expresa mediante coeficientes de reparto.

Puede ser de dos tipos:

• Cromatografía de partición líquido-líquido. La fase fija es la fase acuosa que está

sujeta en un sólido, y la fase móvil es la orgánica. Según el tipo de soporte, puede ser

de varios tipos:

Papel: el soporte es la celulosa.

Columna o capa fina: el soporte es silicagel, almidón, etc.

• Cromatografía de partición líquido-gas. La fase fija es un líquido orgánico no

volátil soportado en un sólido, y la móvil un gas inerte.

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3. Cromatografía de cambio iónico

Sólo se puede aplicar a sustancias con carga eléctrica, intrínseca o inducida, en disoluciones

acuosas. Cuando sustancias que forman iones en disolución acuosa se ponen en contacto con

resinas cambiadoras de iones, hay una interacción entre las cargas de los grupos funcionales de los

cambiadores iónicos y las cargas de los iones. La fuerza de atracción varía con la fuerza iónica y el

pH del medio. La fase fija son cambiadores, naturales o sintéticos, y la fase móvil es la disolución.

Los iones de mayor carga son retrasados más durante el paso a través de la columna y así se

verifica la separación.

4. Cromatografía de permeación

La separación se basa en la diferencia de tamaños y pesos moleculares de las distintas

sustancias. Las sustancias de pequeño tamaño tienden a penetrar en el interior de los poros y son

retrasadas en la elución respecto a las más grandes. Hay dos técnicas:

• Cromatografía de vidrio poroso.

• Filtración por gel

También se realizan otros tipos de clasificaciones entre las que cabe destacar la clasificación por

aplicaciones:

• Cromatografía analítica: para identificar sustancias.

• Cromatografía preparativa: para separar sustancias y aislarlas.

Cromatografía de adsorción en columna

El equipo consta de una columna de vidrio provista de una llave en la parte inferior. Esta

columna se llena con el adsorbente adecuado, hay diferentes métodos de llenado de las columnas,

pero es muy importante que el llenado sea perfecto, que no queden burbujas de aire porque la

separación sería mala. El método de empaquetado más usual consiste en formar una papilla entre el

adsorbente y el disolvente adicionándola poco a poco. Una vez finalizado el empaquetamiento, se

puede proceder a la separación.

La mezcla que se quiere aislar y purificar se disuelve en la mínima cantidad posible de

disolvente (el mismo del llenado de la columna) y se adiciona por la parte superior de la columna.

A continuación se va pasando disolvente, para eluir las sustancias adsorbidas. Se puede usar un

único disolvente, o mezclas de disolventes de polaridad creciente, dependiendo del tipo de

sustancias a separar. La adsorción y la velocidad de migración depende de:

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• Polaridad del disolvente

• Polaridad del producto

• Actividad del adsorbente

Los disolventes ordinarios se pueden ordenar según su polaridad creciente: éter de petróleo,

tetracloruro de carbono, ciclohexano, éter, acetona, benceno, diclorometano, cloroformo, acetato de

etilo, piridina, etanol, metanol, agua, ácido acético.

La actividad de los adsorbentes aumenta en el siguiente orden: celulosa, almidón, azúcar,

silicagel, sulfato calcico, fluorisil, magnesia, alúmina, carbón activo.

La secuencia de elución de compuestos, en orden de elución creciente: hidrocarburos,

olefinas, éteres, compuestos halogenados, aromáticos, cetonas, aldehidos, alcoholes y aminas,

ácidos y bases débiles.

Se van recogiendo las fracciones y luego se analiza el contenido de cada fracción.

Cromatografía en capa fina cualitativa

Sirve para identificar los distintos componentes de una mezcla. Se realiza usando unas

microplacas (portaobjetos de un microscopio) que se cubren con el adsorbente adecuado al que se

añade agua para formar la papilla. Una vez extendida la papilla, se deja secar y luego se mete a la

estufa para activar el adsorbente. Una vez secas, se aplica la muestra en disolución en la parte

inferior con un capilar. Se introduce la placa en una cubeta con el eluyente adecuado y se deja

desarrollar el cromatograma. Si los productos son coloreados, la separación podrá observarse

directamente; en caso contrario, se usan reveladores.

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Cromatografía en capa fina preparativa

Sirve para separar y aislar los distintos componentes de una mezcla. Se usan placas (20x20

cm) de cristal. El procedimiento de preparar las placas es similar al anterior. La aplicación se hace

en forma de franja y no de punto.