TERRENI DI

COLTURA

Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare

nelle condizioni di laboratorio

Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e

quali condizioni fisiche essi richiedono

COLTIVAZIONE DEI BATTERI

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “terreni di coltura” con i quali si

cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare

le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare

I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo

La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare

Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi, in quantità notevoli: si tratta di quelle che sono necessarie per le biosintesi, e che entrano quindi a far parte delle principali

componenti strutturali della cellula, come carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici Queste

sostanze vengono definite: “Macronutrien

ti” CARBONIO

AZOTO

OSSIGENO

IDROGENO

ZOLFO

FOSFORO

servono per la sintesi dei

componenti strutturali della

cellula

In un secondo gruppo di macronutrienti si trovano gli elementi usati in quantità

relativamente elevate rispetto agli altri sali. La maggior parte di queste sostanze è necessaria a

tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali soltanto per alcune specie o in particolari

momenti

Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue: generalmente le tracce contenute in sali o nell’acqua sono sufficienti a

garantire la crescita del microrganismo

Se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri, questi elementi devono essere aggiunti ai

terreni sotto forma di soluzioni bilanciateQueste sostanze vengono definite:

“Micronutrienti”

Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all’interno della cellula: l’unico

composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula batterica, è

l’acqua

TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA

la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo

energia

L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall’ idrolisi di

ATP

TRASPORTO ATTIVO

Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del microrganismo) questo

processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di

membrana (le permeasi)

TRASPORTO FACILITATO

contenere tutti i nutrienti necessari alla crescita dai batteri da coltivare

l’acqua disponibile (Aw) deve essere adeguata (per la maggior parte dei microrganismi l’ideale è superiore a 0,98) il pH deve essere intorno a 7,2 a meno di richieste particolari, e il potenziale redox idoneo

Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi

I terreni che si usano in batteriologia devono:

Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR

Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100°C ma resta liquefatto fino a 45°C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare

Inoltre:

non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

i microrganismii microrganismi

invisibili ad occhio nudoinvisibili ad occhio nudo

(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo (<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o replicazione su substrato solido o

liquidoliquido

Preparazione dei terreni

1. Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.

2. Determinazione del pH ed eventuale correzione.

3. Distribuzione in contenitori idonei.4. Sterilizzazione

In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono

classificati come: Sintetici (o definiti) Complessi

Terreni sintetici o definiti

I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere.

Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.

sono quei terreni di cui non si conosce in

maniera dettagliata la composizione chimicaQuesti mezzi di coltura risultano di estrema

utilità in quanto permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro

Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute

Terreni complessi

Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono:Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature);Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.

COLONIE SU AGAR

ACCRESCIMENTO SU AGAR A BECCO DI CLARINO

ACRESCIMENTO SU BRODO NUTRITIZIO

ACCRESCIMENTO PER INFISSIONE IN GELATINA

I caratteri colturali forniscono indizi utili per l’identificazione

Caratteristiche visive dell’avvenuto accrescimento in brodo

Crescita in terreni solidi (piastre Petri)

Crescita in substrati solidi (agar becco di clarino)

POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI

La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti

specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed

in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).COLTURE MISTE

Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule

derivate tutte da un’unica cellula madre

Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento

dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di

laboratorio

PER STUDIARE I DIVERSI BATTERI CHE COLONIZZANO UN HABITAT O PER ISOLARE UN PATOGENO BISOGNA ISOLARE E COLTIVARE IN

FORMA PURA IL MICRORGANISMO

Terreni elettiviSono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico.

Terreni selettiviSono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie.

Terreni differenzialiSono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata.

Terreni di arricchimentoSono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.

Classificazione qualitativa dei terreni

emolisi su piastra di agar sangue

ESEMPIO DI TERRENO DIFFERENZIALE

selettivi perché favoriscono la crescita di determinate specie batteriche inibendone altre

differenziali perché permettono la crescita di colonie dello stesso genere ma di specie diverse

Terreni selettivi e differenziali

ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE

Fermentazione del

mannitolo in piastra

di MSA

ASETTICITA'

Le finalità : ottenere e mantenere pure le colture di

microrganismi Una “coltura pura” è costituita solo da

una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell’aria.

volgere il lavoro in un laboratorio di microbiologia in sicurezza

Le regole fondamentali di asetticità sono:

la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm

quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente

sterilizzare la vetreria e il materiale usati

disinfettare e pulire il banco da lavoro accuratamente

sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto