Thomas Scheper TCI Technische Chemie Institut für · Membran Thomas Scheper Institut für TCI Technische Chemie. Thomas Scheper Institut für ... Bioreaktor Thomas Scheper Institut

Ein wenig Mikrobiologie

Dr. Frank StahlDr. Frank Stahl

Thomas ScheperInstitut für Institut für Technische ChemieTechnische ChemieInstitut für Institut für Technische ChemieTechnische ChemieTCITCITCITCI

Einteilung

PflanzenPflanzen BotanikBotanik

Tiere Tiere ZoologieZoologie

Bakterien, Bakterien, MikrobiologieMikrobiologieViren, BakteriophagenViren, Bakteriophagenmit Einschränkungen.mit Einschränkungen.evtl. Pilzeevtl. Pilze


Einteilung nach Nahrungs- und Energiequelle

Licht phototrophEnergiequelle

Licht phototroph

Chemie chemotrophChemie chemotroph

organotroph lithotroph

K hl t ff ll

autotroph

Kohlenstoffquelleheterotroph


P k tProkaryonten

Bakterien BlaualgenBlaualgen (Cyanobakterien)

A h b kt i E b kt iArchaebakterien(Extremophile)methanogen, halo,

thermo acido

Eubakterien

thermo-acido

Gram negativ Gram positiv

Sporenbildner, z.B. Bacillus


Viren / Bakteriophagen



Prokaryonten

B B kt i (B d W l b O i )B B kt i (B d W l b O i )z.B. Bakterien (Boden, Wasser, leb. Organismen) z.B. Bakterien (Boden, Wasser, leb. Organismen)

undund ArchaeaArchaea (Sümpfe, Tiefsee, Salzlake, saure(Sümpfe, Tiefsee, Salzlake, saureund und ArchaeaArchaea (Sümpfe, Tiefsee, Salzlake, saure (Sümpfe, Tiefsee, Salzlake, saure

Quellen)Quellen)

-- kein Kern, einfach, kleinkein Kern, einfach, klein

-- Unterteilung nach Form und Färbbarkeit nach Unterteilung nach Form und Färbbarkeit nach

Gram (gramGram (gram positiv oder grampositiv oder gram negativ)negativ)Gram (gramGram (gram--positiv oder grampositiv oder gram--negativ)negativ)


Färbung von Bakterien nach Gram

Die nach dem dänische Mikrobiologen benannte Die nach dem dänische Mikrobiologen benannte

Färbung (1884) beruht auf Dicke der Zellwand (bestehtFärbung (1884) beruht auf Dicke der Zellwand (bestehtFärbung (1884) beruht auf Dicke der Zellwand (besteht Färbung (1884) beruht auf Dicke der Zellwand (besteht

aus Peptidoglycan/Murein)aus Peptidoglycan/Murein)

GramGram negative Bakterien besitzen auch äußerenegative Bakterien besitzen auch äußereGramGram--negative Bakterien besitzen auch äußere negative Bakterien besitzen auch äußere

MembranMembran








Antibiotika Resistenzen


Bakterien

KokkenKokken (kugelförmig)(kugelförmig)itiiti St tSt t St h lSt h lgramgram--positiv: positiv: StreptococcusStreptococcus, , StaphylococcusStaphylococcus

gramgram--negativ: negativ: NeisseriaNeisseriaStäbchenStäbchen gestreckt zylinderförmiggestreckt zylinderförmigStäbchenStäbchen, gestreckt zylinderförmig, gestreckt zylinderförmig

gramgram--positiv: positiv: BacillusBacillusgramgram--negativ:negativ: PseudomonasPseudomonas,, EscherichiaEscherichiagramgram negativ: negativ: PseudomonasPseudomonas, , EscherichiaEscherichia

Gekrümmte StäbchenGekrümmte Stäbchen/flexible Zellen/flexible Zellengramgram--positiv:positiv:gramgram--negativ: negativ: SpirelliumSpirellium

SondergruppenSondergruppen: gleitende Bakterien, Bakterien mit : gleitende Bakterien, Bakterien mit Anhängseln, parasitische Bakterien, Bakterien ohne Zellwand Anhängseln, parasitische Bakterien, Bakterien ohne Zellwand ((MycoplasmaMycoplasma--Gruppe), Gruppe), phototrophephototrophe Bakterien (betreiben Bakterien (betreiben Photosynthese z.B.Photosynthese z.B. CyanobakterienCyanobakterien/Blaualgen)/Blaualgen)


Photosynthese z.B. Photosynthese z.B. CyanobakterienCyanobakterien/Blaualgen)/Blaualgen)



Einsatzgebiete von BakterienEinsatzgebiete von Bakterien

•Landwirtschaft (Bioinsektizide, Futtermittelkonservierung)

•Umweltbiotechnologie (Entschwefelung von Kohle, Reinigung von Abwässer Abluft)Reinigung von Abwässer, Abluft)

•Gentechnik (Standardorganismus E. coli)Gentechnik (Standardorganismus E. coli)

•Pharma (Antibiotika, Insulin, Vitamine, Steroide)

•Chemie (Aceton, Butanol, Aminosäuren)

•Sonstige (Waschmittelenzyme, Kosmetik)


Extremophile

ArchaeaArchaea („(„ExtremophilesExtremophiles“)“)

MethanogeneMethanogene BakterienBakterienMethanogeneMethanogene BakterienBakterien

HalobakterienHalobakterien

thermothermo--acidophileacidophile BakterienBakterien


Eukaryonten

Metazoa

Protozoa

Metazoa

(einzellige Eukaryonten, Protisten)

Flagellata,z.B. Euglena

Rhizopoda,z.B. Amöbe

Sporozoa,z.B. Plasmodium

Ciliata,z.B. Pantoffeltierchen


Algen und Protozoen

Algen: können als primitive Pflanzen angesehen Algen: können als primitive Pflanzen angesehen werden, sind hochkomplexe organische werden, sind hochkomplexe organische Verbindungen, nutzen Sonnenenergie ubiquitärVerbindungen, nutzen Sonnenenergie ubiquitär

Protozoen: können als einfache Tiere angesehen Protozoen: können als einfache Tiere angesehen werden (oft pathogen z B afrikanischewerden (oft pathogen z B afrikanischewerden (oft pathogen z.B. afrikanische werden (oft pathogen z.B. afrikanische Schlafkrankheit), Amöben zählen auch zu dieser Schlafkrankheit), Amöben zählen auch zu dieser Gruppe (sind interessant bei Abwasserbehandlung)Gruppe (sind interessant bei Abwasserbehandlung)Gruppe (sind interessant bei Abwasserbehandlung)Gruppe (sind interessant bei Abwasserbehandlung)


Gegenüberstellung Unterschiede Gegenüberstellung Unterschiede g gg gProPro-- und und EukaryontenEukaryonten

Prokaryonten Bakterien und Cyanobakterien

Eukaryonten Protisten, Pilze, Pflanzen und

TiereTiereDNA als ringförmig

geschlossener Strang frei im Cytoplasma

echter Zellkern mit Chromosomen

Cytoplasmakeine Organellen Organellen (Mitochondrien,

Chloroplasten, Endoplasmatisches p

Retikulum) kleine Ribosomen große Ribosomen

morphologisch gering differenziert

Zunehmender Diffenrenzierungsgrad von Einzelzelle zu Organismus


e e e u O ga s us

Gegenüberstellung Unterschiede Gegenüberstellung Unterschiede g gg gProPro-- und und EukaryontenEukaryonten

Prokaryonten Bakterien und Cyanobakterien

Eukaryonten Protisten, Pilze, Pflanzen und

TiereTiereZellgröße 1-10 µm 10-100 µm

Anaerob und aerob aerob

meist einzellig meist vielzellig mitmeist einzellig meist vielzellig mit Zelldifferenzierung in

verschiedene Zelltypen RNA und Protein werden im

gleichen Kompartiment synthetisiert

RNA wird im Kern, Protein im Cytoplasma synthetisiert


synthetisiert


Mikrobielles Wachstum

EinflußgrößenEinflußgrößenEinflußgrößenEinflußgrößen

pHpH--Wert, Temperatur, Scherkräfte, Wert, Temperatur, Scherkräfte, pp pp

chemische Komponenten, chemische Komponenten,

SauerstoffkonzentrationSauerstoffkonzentration

W h t tW h t tWachstumstypenWachstumstypen

Kohlenstoffquelle Energiequelle Quelle derKohlenstoffquelle Energiequelle Quelle derKohlenstoffquelle, Energiequelle, Quelle der Kohlenstoffquelle, Energiequelle, Quelle der

ReduktionsäquivalenteReduktionsäquivalente



Zellzyklus ZellvermehrungZellzyklus ZellvermehrungZellzyklus, ZellvermehrungZellzyklus, ZellvermehrungMitose/MeioseMitose/Meiose


Mitose


Mitose: Vorgang der Kenteilung, führt bei der Teilung einer Zelle zu zwei genetisch gleichen Tochterzellen. Die Bildung von Körperzellen erfolgt durch MitMitose.

Meiose: 2 ReifeteilungenMeiose: 2 ReifeteilungenVorgang der Kenteilung, führt bei der Teilung einer Zell mit doppeltem Chromosomensatz zu Tochterzellen mit einfachem Chromosomensatz. Sie führt zu Bildung der Geschlechtszellenführt zu Bildung der Geschlechtszellen


Intermediärstoffwechsel:

Vollständiger Umsatz der Hauptnahrungsbestandteile (Kohlenhydrate, Fette und Proteine) zu Energie (ATP) und(Kohlenhydrate, Fette und Proteine) zu Energie (ATP) und Reduktionsäquivalenten (NADH)

Zunächst unterschiedliche Abbauwege:

Kohlenhydrate: Glycolyse: Verbindungen aus 3 C AtomenKohlenhydrate: Glycolyse: Verbindungen aus 3 C-AtomenFett: ß-Oxidation: Bruchstücke aus 2 C-Atomen in CitratcyklusProteine: Desaminierung: Carbonsäure geht in Citratcyklus

Dann gemeinsamer oxidativer Endabbau über Citratcyklus und At k tt CO d H OAtmungskette zu CO2 und H2O


Die wichtigsten Stoffwechselwege im Extraktg g

Gl l Abb d P l /M h id C3 Kö• Glycolyse: Abbau der Poly/Monosccharide zu C3-Körpern

Pyruvat: Decarboxylierung unter 02 zu Acetyl-Coenzym A

• Citratcyclus: Abbau des Essigsäurerestes zu CO und H• Citratcyclus: Abbau des Essigsäurerestes zu CO2 und H

• Atmungskette: Oxidation des H zu H2O, Energiegewinnung

• Glucose wird in tierischen Zellen vollständig zu CO2 und H2O umgesetzt


umgesetzt


Glycolysey yPolysaccharide und Zucker werden zu Verbindungen, die aus 3 C-Atomen bestehen, abgebautg

Verläuft im Cytosol – Glucose wird zu 2 Pyruvat unter Bildung von 2 ATP und 2 NADH umgewandeltg

Funktion: Glucoseabbau zur ATP-Erzeugung und B it t ll K hl t ff ü t fü Bi thBereitstellung von Kohlenstoffgerüsten für Biosynthesen

Schrittmachender Kontrollpunkt ist die katalytische WirkungSchrittmachender Kontrollpunkt ist die katalytische Wirkung der Phosphofructokinase (Fructose- 6- Phosphat wird zu Fructose- 1,6- Bisphosphat umgewandelt)


Glukose Glukose 6-phosphat Fruktose 6-phosphat

ATP ATP Phosphofructokinase

Fuktose 1,6-bisphosphat Glycerinaldehyd 3-phosphat

ATP

2x

Ph h t2

Phosphofructokinase

Dihydroxyaceton-Phosphat

NADH 2x

Phosphat 2x

1,3-Bisphosphylglycerat 3-Phosphylglycerat

ATP

A

2x 2x

2-Phosphylglycerat Phosphoenolpyruvat Pyruvat

ATP

ATP

2x 2x 2x

2x

Schematische Darstellung der Glykolyse.

ATP 2x


Umsetzung der GlucoseGlukose

2 ATP 2 NAD+

Fructose 1 6Fructose- 1,6- bisphosphat

2 Pyruvat

A b A b A bAnaerobe Aerobe Anaerobehomolactische Oxidation alkoholische Fermentation Gährung

Zitronensäure- zyklus

2 NADH 2 NADH 6 O2 2 NADH

OxidativeOxidativePhosphorylierung

2 NAD+ 2 NAD+ 2 NA

2 Lactat 6 CO + 6 H O 2 CO + 2 EtOH2 Lactat 6 CO2 + 6 H2O 2 CO2 + 2 EtOH Abbaumöglichkeiten der Glukose Funktionelle Anoxybiose


ySauerstoffschuld

Muskelkater:

Funktionsbedingte AnoxybioseFunktionsbedingte Anoxybiose

Bei zeitweiser extremer Belastung wird der O2 VerbrauchBei zeitweiser extremer Belastung wird der O2 Verbrauch derart gesteigert, dass die O2 Versorgung nicht aufrechterhalten werden kann. Im Muskel der Wirbeltiere wir dann die Glykolyse bis zum Pyruvat durchlaufen. Dies ist nur möglich, wenn für die gebildeten Reduktionsäquivalente ein WasserstoffrezeptorReduktionsäquivalente ein Wasserstoffrezeptor vorhanden ist: deshalb wird Pyruvat zu Lactat (2 ATP) umgewandelt, dass sich unter anaeroben Bedingungenumgewandelt, dass sich unter anaeroben Bedingungen als Endstoff ansammelt: der Muskel übersäuert.


Citratcyclus

Findet in den Mitochondrien statt – Oxidation von Acetyl CoA

Pyruvat + Coenzym A Acetyl-CoA + CO2y y y 2

V ll tä di O id ti li f t 1 GTP 3 NADH 1 FADHVollständige Oxidation liefert 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH2

Liefert auch Zwischenprodukte für Biosynthese wie SuccinylCoA für Porphyrinaufbau



PentosephosphatwegPentosephosphatweg

Andere Möglichkeit des GlucoseabbausAblauf dieser Reaktionsserie im Cytosol

Zwei Aufgaben:

1) NADPH E fü d kti Bi th1) NADPH Erzeugung für reduktive Biosynthesen

2) Bildung von Ribose – 5 – Phosphat für

Nucleotidsynthese


GluconeogeneseGluconeogenese

Glucoseaufbau in der Leber aus Lactat, Glycerin und AS

Glycogen-Abbau: Reservestoff von Glucose –y gverzweigtes Polymer aus Glucoseeinheiten

Beides findet bei suboptimaler Nahrungsversorgung / Hungerperioden stattHungerperioden statt


Wi hti K t ktWichtige Knotenpunkte

•Glucose 6 Phosphat (Eingang Glykolyse)

P t (A Gl k l )•Pyruvat (Ausgang Glykolyse)

•Acetyl CoA (Eingang Citratcyklus)Acetyl CoA (Eingang Citratcyklus)

Energiebilanz:

Ei M l Gl k li f t 36 M l ATPEin Mol Glukose liefert 36 Mol ATP

nach vollständiger Oxidation



Probleme bei der Nutzung von Bakterien in Probleme bei der Nutzung von Bakterien in der Produktion:der Produktion:

ExotoxineExotoxine und und EndotoxineEndotoxine

ExotoxineExotoxine werden von den werden von den BaketrienBaketrien aktiv abgegeben aktiv abgegeben g gg gz.Bz.B bei den Erregern von Diphterie, Tetanus und bei den Erregern von Diphterie, Tetanus und Botulismus; können durch Erhitzen abgetötet werdenBotulismus; können durch Erhitzen abgetötet werden

EndotoxineEndotoxine sind Bestandteile der sind Bestandteile der MemebranoberflächeMemebranoberflächegram negativer Bakterien, sie sind hitzeresistentgram negativer Bakterien, sie sind hitzeresistent


EndotoxineEndotoxineLipopolysaccharide LPSLipopolysaccharide LPS

Lipid ALipid A

O

PO OH

OH

OHN

O OH

[C14]

OHN

OOH

O

HOO[C14]

[C14]

OO

OO

O

[C12]

[C14]

[ 14]

X O

OO

O

PO

OH

OH[C14]

X


OOH

Elimination von Endotoxinen:

- Ultrafiltrationd lk li h H d l- saure oder alkalische Hydrolyse

- Oxidation mit wasserstoffperoxidAlk li- Alkylierung

- Adsorption an Aktivkohle oder Asbest- chromatographische Verfahren,

(hier insbesondere Affinitätschromatographie, Anionenaustauschchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie)


Tierische und pflanzliche ZellkulturenTierische und pflanzliche ZellkulturenppBeispiele für Einsatz von Tierzellkulturen zur Produktion von Beispiele für Einsatz von Tierzellkulturen zur Produktion von

therapeutisch wichtigen Proteinen und anderen biologisch aktiventherapeutisch wichtigen Proteinen und anderen biologisch aktiventherapeutisch wichtigen Proteinen und anderen biologisch aktiven therapeutisch wichtigen Proteinen und anderen biologisch aktiven SubstanzenSubstanzen

Protein Wirkung/Anwendung

Erythropoitin vermehrte Erythrozytenproduktion

G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor,) gesteigerte Leukozytenbildung

Insulin Diabetes

Faktor VIII Hämophilietherapie

t-PA Herzinfarkte

Interleukine Krebstherapie


Medizinische Biotechnologie

• Wirkstoffe, Proteine und Impfstoffe für Diagnostik , p gund Therapie

• Gentherapie

• Tissue engineering / Regenerative Medizin


Lebensmittelwissenschafteninklusive

Zell-, Molekular-, Entwicklungsbiologiemolekulare Genetik, Biochemie

Immunologie

Tissue Engineeringg gZellkulturtechnik

MaterialwissenschaftenBioverfahrenstechnik

Klinische Disziplinenmedizinische Grundlagenfächer

experimentelle Chirurgie

• Ziel: in vitro Generation von vitalem autologen Gewebe zurR k t kti hädi t G b E h lt dRekonstruktion geschädigtem Gewebes, zur Erhaltung oderVerbesserung der Funktion geschädigter oder erkrankterOrgane


g

MethodikMethodik

• in vitro Kultivierung von autologen Zellenauf organischen, natürlichen oder

th ti h M t isynthetischen Matrices

• in vitro Kultivierung von autologenin vitro Kultivierung von autologenZellen auf xenogenen Matrices

• Gewebezüchtung unter Verwendung embryonaler StammzellenStammzellen


Strategien

• Zellinjektion („Zelltherapie“)j ( p )

hl t l S t• geschlossenes extracorporales System

• offenes System - biodegradables Polymer/Matrixgerüst


Was braucht man?

ZellenZellen

PhysikalischePhysikalischeStimulation

Zell-Zell-Kontakte

Matrix Wachstumsfaktoren

Bioreaktor


Prinzip des Tissue Engineeringp g g

Zellen * Matrix undFaktoren**

“In-vitro”Kultivierung

*** Patient

Neuronen

Hornhaut Endothelgewebe/Blutgefäße

Haut

Faktoren Kultivierung

Herzklappen

Niere

MilzLeber

Knochenmark

MuskelnBauchspeicheldrüse

Knochen

Knorpel

*Gewebezellen, Stammzellen oder embryonale Stammzellen (autolog oder allogen)**Natürlich, synthetisch oder xenogenisch, Wachstums/Differenzierungs/Vaskularisierungsfaktoren, Cytokine y g g g y***statisch, unter Rühren oder dynamische Fliessbedingungen


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