Toxicologie des nanoparticules : influence de la taille ... ?· Toxicologie des nanoparticules : influence…

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    16-Sep-2018

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  • Toxicologie des nanoparticules : influence de la taille, de la composition chimique et de la ractivit de surface sur leurs effets pulmonaires et rnaux ( NANOTOX) P1 : Laboratoire de Cytophysiologie et Toxicologie Cellulaire Universit Paris Diderot Paris 7: Francelyne Marano PU coordinatrice, Armelle Baeza MCU, Sonja Boland IR, Rodolphe Hamel IE, Salik Hussain doctorant P2 : Laboratoire de Physiologie Cellulaire Respiratoire : Roger Marthan PUPH, Arnaud Courtois MCU, Isabelle Baudrimont MCU P3 : Physiopathologie et Epidmiologie de lInsuffisance Respiratoire : Jorge Boczkowski DR INSERM , Sophie Lanone CR INSERM, P4: INERIS : Ghislaine Lacroix IR INERIS, Franoise Rogerieux Tech INERIS P5 : Laboratoire de Biologie Cellulaire, Groupe dtude de physiologie et de physiopathologie rnales : Jean Cambar PU, Batrice LAzou MCU, Patrick Brochard PU PH P6: LEPI et Mdecine et Sant au travail Paris 12 : Jean-Claude Pairon PUPH, Marie-Annick Billon-Galland IR, Laurent Martinon IR, Laurence Kheuang Tech, Jocelyne Fleury MCU PH, P7 : Laboratoire de Pollution Atmosphrique et Sol (LPAS), Ecole Polytechnique Fdrale de Lausanne (Suisse) : Jean-Michel Rossi DR , Jean-Jacques Sauvain (IST), Ari Setyan Doctorant(IST) A.Introduction : Lexposition humaine des particules atmosphriques ultrafines (PUF< 100 nm) est devenue au cours des dernires annes une question importante de sant publique, mise en lumire par lanalyse de la composition des particules atmosphriques et de leurs effets biologiques (Peters et al 1997). Celles-ci, en milieu urbain, peuvent tre formes de plus de 80% de suies fines (

  • L'objectif gnral tait d'valuer en fonction des caractristiques physico-chimiques des NP : (1) les capacits et les mcanismes de leur accumulation par les principales cellules cibles de lappareil respiratoire

    (pithliums respiratoire, macrophages, endothlium) (2) leurs effets oxydatifs et inflammatoires susceptibles de conduire des pathologies inflammatoires du poumon. (3) leurs effets sur des sujets atteints de pathologies pulmonaires telles que lasthme et la BPCO en utilisant des

    modles animaux (4) leurs effets sur le rein, lieu privilgi dlimination qui peut constituer une cible majeure des NP

    B. Matriel et mthodes : 1. Nanoparticules : Notre tude toxicologique a concern des NP carbones et mtalliques dont les caractristiques physico-chimiques sont indiques dans le tableau 1. Afin dapprofondir et de mtre au point les tudes de linternalisation des NP, des billes fluorescentes de diffrentes tailles et de diffrentes charges ont galement t utilises Les NP tudies tant fortement lectrostatiques, lors de leur pese nous utilisons des coupelles en aluminium et un appareil permettant de diminuer les charges lectrostatiques (Ionisateur static line, Haug Biel AG). Ces NP sont mises en suspension dans du milieu DMEM/F12 2 mg/ml puis elles sont soniques 3 fois 20 secondes 60 kW laide dune sonde influence (Ultrasonic processor, Bioblock Scientific). La morphologie des NP de carbone mises en suspension dans le milieu de culture selon le protocole dcrit ci-dessus a pu tre tudi en Microscopie Electronique Transmission (MET, en collaboration avec le LEPI). Aprs leur mise en suspension, les NP ont t filtres sur un filtre en polycarbonate de porosit 0.2 m afin dobtenir une concentration de 1 g/cm pour les NP (Fw2, P60) et de 10 g/cm pour les Fr101. En raison dune forte sdimentation, les concentrations en NP ont t exprimes en unit de surface (g/cm)

    Tab. 1. Caractristiques des nanoparticules de carbone et des nanoparticules mtalliques utilises. Leur diamtre arodynamique (), leur surface (S) et leur pH ont t indiqus par les fournisseurs. Les caractristiques spcifiques en particulier BET ont t dtermines.Les nanosuies ont t spcifiquement fabriques et caractrises pour le projet par lquipe de lEPFL(Suisse)

    .g

    Nanoparticules:nanosuies

    noir de carboneTiO 2, ZnO

    P7: production et caractrisation des

    nanosuies et noir de carbone

    P6: m icroscopie lectronique et analyse chim ique lm entaire

    Screening de toxicit (in v itro)

    In vitro:C ellules pithlia les bronchiques 16 HBE P1

    C ellules pithlia les alvolaires A549 P1M acrophages THP-1 P3

    C ellules m usculaires lisses (C ulture prim aire) P3Cellules endothliales dartres pulm onaires (rat) P2

    Cellules rnales tubu laires (LLC P-K 1) P5Cellules rnales glom rulaires (IP-15) P5

    In vivo (rat):M odle dasthm e

    allergiqueRat Brow n Norw ay

    P4

    M odle de B PC OR atP3

    Ex vivo: vaisseaux pulm onaires isols (rat, souris) P2

    viabilit cellulairestress oxydantcytokines

    16 HBE P1 A549 P1 THP-1 P3endothliales P5LLCP-K1 P5IP -15 P5

    Accum ulationcellulaire, t issulaire, organe P1 P2 P3 P4 P5

    Localisation, quantification et m canism es im pliquesTechniques: M icroscopie confocale et NP fluorescentes P1 P2cytom trie de flux

    M ET nanosuies, NP m talliques P6ICP/OES ICP /M S NP m talliques P5

    M inralisation nanosuies P6

    Stress oxydant -Dtection Altrations (M D A, HNE)Expression de gnes(NOS, N ADPH oxydase, SO D, C AT, GPX)

    Rponse inflam m atoireVoies de signalisation actives

    (EGFR, M APKinases) Elisa, w estern b lo t

    Facteurs de transcription (Prot ines/ADN array, ge ls retard)

    Cytokines (m acroarray, RT-PCR, E lisa)

    (pour le dtail des techniques se reporter au rapport final et aux publications)

    (nm) S (m/g) pH Composition Fournisseur Nanoparticules de carbone

    FW 2 13 350 2.5 Carbone Degussa P60 21 115 10 Carbone Degussa

    Fr101 95 20 7 Carbone Degussa Nanoparticules de titane : TiO2

    Ti15 15 190-290 n.d. Dioxyde de titane Sigma Ti50 25-75 20-25 n.d. Dioxyde de titane Sigma

    Nanoparticules de zinc : ZnO Zn 50-70 15-25 n.d. Oxyde de zinc Sigma

  • C. Rsultats principaux

    1. Synthse et caractrisation des nanoparticules. Les particules testes ont t les mmes pour lensemble des partenaires du projet. Pour les suies, elles ont

    t synthtises, caractrises( M.Rossi, J.J.Sauvain, quipe de physico-chimistes de lEcole Polytechnique et de lUniversit de Lausanne) Par ailleurs, nous avons utilis des NP de noir de carbone de diffrentes granulomtries (Dgussa) enfin, des NP mtalliques dj utilises dans lindustrie, le dioxyde de titane et l'oxyde de zinc. Au cours de ce travail une nouvelle mthode de caractrisation de nanoparticules a t mise en oeuvre. Elle se base sur la raction chimique dun gaz de sondage avec des groupes fonctionnels prsents sur la surface de nanoparticules. La consommation du gaz de sondage en prsence de nanoparticules est dtecte quantitativement par spectromtrie de masse jusqu la saturation de la capture du gaz de sondage et mis en relation avec la surface externe mesure par mtrologie. Cette dernire sest effectue par la mesure de la surface interne et externe BET (selon Brunauer-Emmett-Teller). Les rsultats sont exprims en nombre de molcules ou monocouches molculaires par unit de surface de nanoparticule pour chaque gaz de sondage et reprsente la premire tape de ltude de la ractivit des nanoparticules en milieu biologique, soit en phase condense. Cette mthode en effet rapporte une cartographie de la ractivit chimique linterface envers des gaz de sondage de diffrentes ractivits en plus de la caractrisation spectroscopique de nanoparticules. Les nanoparticules examins taient trois types de carbone amorphe (suie), soit FS101, Printex 60 et FW2, un chantillon de rfrence de suie (SRM 2975, standard reference material du NIST), un chantillon de terrain (Diesel TPG) collect dun filtre particules Diesel des Transports Genevois, ainsi que deux suies de laboratoire produites sous conditions contrles partir de flamme de diffusion alimentes lhexane. En outre, trois chantillons de TiO2 ont t tudis soit TiO2 15, TiO2 50 et TiO2 P25. Les gaz de sondage utiliss sont la trimethylamine ((CH3)3N), lhydroxylamine (NH2OH), lacide trifluoroactique (CF3COOH), lacide chlorhydrique (HCl), lozone (O3) et le dioxyde dazote (NO2). Le (CH3)3N enregistre la densit des sites acides voire des groupes carboxyliques de la surface dun arosol organique tandis que NH2OH sonde la densit des groupes carbonyl (ctones, aldehydes). Ces deux sondes dmontrent le caractre oxyd et partiellement oxyd de la surface de larosol en question. Les acides CF3COOH et HCl sont les tmoins de la densit des groupes basiques linterface tandis que O3 et NO2 dmontrent la capacit de la surface de subir une oxydation par un oxydant fort (O3) et faible (NO2). Les rsultats et sur la capture saturation des gaz de sondage (densit des groupes fonctionnels interfaciales) et leur probabilit de raction sont en annexe. En bref, nous avons fait les observations suivantes : la surface des tous les arosols examins est multifonctionnelle, ce qui veut dire que linterface rpond en gnral tous les gaz de sondage en proportions diffrentes. Le carbone amorphe Printex 60 avait la plus petite densit de groupes fonctionnels, tandis que la suie Diesel TPG en avait la plus grande. La prsence doxydes basiques a t enregistre sur la surface des trois chantillons de carbone amorphe. Les suies produites par combustion dhexane dune flamme riche et pauvre, respectivement, ainsi que le carbone amorphe FS101 sont caractrises par leur grande tendance dtre oxydable. TiO2 15 se montre le plus pauvre en densit en groupes fonctionnels linterface malgr la taille la plus petite de ses particules primaires. Nos rsultats montrent une grande variabilit de la composition de surface pour les suies et les nanoparticules de TiO2 qui pourrait se traduire en rponses biologiques trs diffrentes. Une caractrisation des NP dans les mileux de cultures a galement t effectue par le Partenaire 6 Cette caractrisation sest faite au Microscope lectronique transmission en dposant sur des grilles des nanoparticules traites de la mme faon que pour lexposition des cultures cellulaires, en particulier dans le milieu de culture, et ceci afin dobserver si elles restaient isoles ou si elles formaient des agrgats.

    Fig.1. Photographies des NP de carbone obtenues en MET. Les figures A, B et C sont des photos des NP de carbone Fw2, P60 et Fr101 obtenues en MET avec un grossissement de 5000. Les pores des filtres apparaissent sous forme de cercles blancs et les NP de carbone se prsentent sous forme dagrgats de couleur grise noire et de tailles varies. Il est possible de distinguer que les agrgats sont forms dlments de base de trs petite taille pour les NP Fw2 et P60 et quils sont de taille beaucoup plus grosse pour les NP Fr101. Les cellules seront donc exposes des NP de carbone dont la taille est bien dfinie mais qui tendent former des agrgats de tailles diverses dans le milieu.

  • 2. Etude in vitro de la cytotoxicit des Nanoparticules.

    Cette premire tape des recherches a port sur la dtermination de la cytotoxicit des NP caractrises par P6 et P7. La taille des NP allant de 13 95 nm (carbone, dioxyde de titane, oxyde de zinc) (Voir tab. 1). Les tudes ont t ralises sur diffrentes lignes reprsentatives des organes cibles : cellules pithliales bronchiques humaines (ligne 16 HBE), les macrophages pulmonaires (THP1) les fibroblastes pulmonaires( RMC5), les cellules endothliales, les cellules rnales ( LLCP-K1 et IP-15) Les tests de cytotoxicit utiliss ont t 1) le test WST-1 (Water Soluble Ttrasolium) qui est un test colorimtrique bas sur la transformation dun sel de ttrasolium en un substrat color (formazan) par des dshydrognases mitochondriales 2) le test IP, liodure de propidium (IP) qui est un marqueur dexclusion colorant uniquement les cellules mortes en sintercalant entre les bases nucliques. Deux exemples de rsultats sont prsents ci dessous : Fig 2 a : Evaluation de la cytotoxicit par la mesure de lactivit mtabolique des cultures (test WST-1). Les cellules 16HBE sont traites avec des NP de NC (13 nm, 21 nm, 95nm) ou TiO2 (15nm, 50nm) de 5 160 g/cm2 pendant 24h (n= 6 en A et n=3 en B). # Significativement diffrent du tmoin (p

  • et endothliales donnant une rponse intermdiaire. Ceci apparat clairement si on compare les tests de toxicit raliss dans les mmes conditions sur les cellules glomrulaires et sur les cellules tubulaires proximales.

    Une dtermination de la mort cellulaire par ncrose et/ou par apoptose sur les cellules bronchiques humaines (P1) et sur les cellules rnales (P5) a donn des rsultats diffrents : les cellules rnales meurent par ncrose alors que les cellules bronchiques meurent essentiellement par apoptose.

    3. Etude de l'accumulation des nanoparticules au niveau cellulaire, tissulaire et dans l'organisme. Cette tude a t ralise In vitro, sur les cellules pithliales bronchiques, sur des cellules endothliales vasculaires pulmonaires et les cellules rnales. L'accumulation a t suivie par cytomtrie de flux pour une approche quantitative. Elle a t complte par des observations en Microscopie lectronique transmission de l'accumulation de NP de carbone et de NP mtalliques. Une quantification de laccumulation a t ralise. In vivo, elle sest faite chez le rat normal aprs instillation intratrachale. La recherche de particules dans le lavage bronchoalvolaire (LBA) et les tissus a t ralise aprs fixation et observation au MET. Les mcanismes d'accumulation ont t recherchs sur la ligne de cellules bronchiques humaines 16HBE et sur les cellules rnales: endocytose par vsicule recouverte ou non, mdie ou non par des rcepteurs, autres mcanismes dinternalisation, accumulation spcifique dans certains organites ex: mitochondrie, noyau a t recherche 3.1 Mesure de laccumulation des NP par cytomtrie de flux : A B

    0

    500

    1000

    1500

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    2500

    0 5 10 20

    Log

    diffr

    actio

    n

    90

    NC (13nm)NC (21nm)NC (95nm)

    # *

    g.cm- 20

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    actio

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    90

    TiO2(15nm)TiO2(50nm)

    # *g.cm-2

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    3500

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    TiO2(15nm)TiO2(50nm)

    #

    g.cm-2

    Fig 3 : Mesure en cytomtrie en flux de la diffraction de la lumire 90 indicative de la granularit des cellules. Les cellules 16HBE sont exposes aux NP de (A) Noir de Carbone (13 nm, 21 nm, 95nm) ou (B) TiO2 (15nm, 50nm) de 5 20 g/cm2 pendant 24h (n=3). # Significativement diffrent du tmoin (p

  • sombres sur la photo B. Les microtubules sont marqus en rouge et les noyaux apparaissent en bleu. b)Microscopie lectronique transmission Trois 3 types de NP [noirs de carbone P60 et TiO2; dose unique de 5 g/cm pendant 24h] ont t valus dans 3 types cellulaires : 16HBE, CE et LLCPK. Une tude de la cintique de linternalisation avec valuation de la relation dose-effet a ensuite t effectue dans deux lignes respiratoires humaines : lune pithliale (16HBE), lautre fibroblastique (MRC5) ( temps de traitement des cellules de 6h, 24h et 48h ; doses de NP sont de 0,5, 5 et 10 g/cm2) Les observations on...

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