TRAPIANTO DI CELLULE

STAMINALI

EMOPOIETICHE

La cellula staminale emopoietica (CSE)

E’ in grado di:

automantenersi (self-renewal)

differenziare

mobilizzare al di fuori del midollo osseo

andare incontro ad apoptosi

Sorgenti di CSE

Autologhe Midollo osseo

Sangue periferico

AllogenicheMidollo osseo

Sangue periferico

Sangue placentare

TCSE: donatori Gemello identico (singenico)

Donatore volontario non correlato (matched unrelated donor – MUD – volunteer unrelated donor – VUD -):HLA-identico

HLA-mismatched per 1/2 Ag

Donatore familiare aploidentico

adulto

sangue cordonale

Fratello HLA-identico (sibling)

Searching and identifying an alternative HSCT donor

U-BMT U-CBT HAPLO

Median search time 3-4 mths <1 mth 0

Donors identified but not available 10-20% 1% 0%

Rare haplotypes represented 2-10% 20% 100%

Limiting factors to graft acquisition HLA match Cell dose Donor mobil./TCD

Viral transmission to recipient Yes No Yes

Risk to donor Yes No Yes

T-cell related GVL effect Yes Yes No

NK related GVL effect Rarely No ? In some cases

Potential for DLI Yes No Limited

Memory T-cells Yes No No

TCSE autologo: manipolazione in laboratorio

• Purging (LAL, LAM)

• Selezione (tumori solidi):selezione positiva (CD34+)

selezione negativa (GD2 in NB)

• Deeritrocizzazione• Deplasmazione• T-deplezione• Valutazione del contenuto in CD34+• Prove di vitalità• Prove di clonogenicità

TCSE allogenico: manipolazione in laboratorio

Incompatibilità AB0 maggiore:donatore riceventeA, B, AB 0

A BA AB

B A B AB

Incompatibilità ABO minore:

0 A, B, AB

Deeritrocizzazione

Deeritrocizzazione +Deplasmazione

Deplasmazione

TCSE allogenico: manipolazione in laboratorio

• T-deplezione (aploidentico)

• Selezione positiva delle CD34+ (aploidentico)

• Valutazione del contenuto in CD34+

• Prove di vitalità

• Prove di clonogenicità

TCSE: regimi di condizionamento

Regime di condizionamento convenzionale

Regime di condizionamento ad intensità ridotta

Regime di condizionamento non mieloablativo

Regime di condizionamento convenzionale

Associazione chemio-radioterapica alla massima dose tollerabile in funzione di una tossicità extramidollare allo scopo di:

• Creare lo spazio midollare per l’attecchimento dell’inoculo

(++++Allo; + Auto)

• Determinare un’immunosoppressione tale da impedire il rigetto del trapianto (++++ Allo)

• Eradicare il clone neoplastico (++ Allo; ++++ Auto)

Regime di condizionamento a intensità ridotta

Associazione chemioterapica, contenente in genere fludarabina, a scopo immunosoppressivo, ma scarsamente mieloablativo.

In caso di rigetto del trapianto, consente una ripresa dell’emopoiesi autologa, anche se in tempi più lunghi rispetto ad un regime non mieloablativo.

Regime di condizionamento non mieloablativo

Radioterapia o associazione di chemioterapici a

scopo immunosoppressivo, non mieloablativo con

l’obiettivo di:

• Garantire l’attecchimento dell’inoculo

• Potenziare l’effetto GvT esercitato dai linfociti del donatore

• Ridurre tossicità e mortalità trapianto correlate

TCSE non mieloablativo

Convenzionale:

Immunosoppressivo per evitare il rigetto e consentire l’attecchimento

Mieloablativo per eliminare cellule maligne residue

Mieloablativo per creare spazio all’interno del midollo

Non-mieloablativo:

Immunosoppressivo per evitare il rigetto e consentire l’attecchimento

Non-mieloablativo: effetto Graft versus Tumor

Non-mieloablativo: effetto Graft versus Marrow

TCSE autologo: razionale

Ricostituzione di una normale funzione ematopoietica alterata da:

Patologia a carico della cellula staminale emopoietica

Occupazione del tessuto osseo da parte di malattia neoplastica

LAM in I/II RC, LAL in II RC dopo ric. extra-BM

Linfomi ric. o res., invasione midollare da parte di cellule neoplastiche

TCSE autologo: razionale

Controllo della patologia:• Neuroblastoma IV stadio• Sarcoma di Ewing alto rischio• Tumori solidi in fase avanzata:

tumori cerebrali

rabdomiosarcoma

tumore di Wilms

tumori a cellule germinali

• Malattie autoimmuni

TCSE allogenico: razionale

Ricostituzione di una normale funzione ematopoietica alterata da:

Patologia a carico della cellula staminale emopoieticaleucemie acute e croniche

aplasia midollare

anemia di Blackfand-Diamond

anemia falciforme

beta-talassemia

SCID

WAS

errori congeniti del metabolismo

Sindrome di HurlerSindrome di HunterSindrome di Lesch NyhanOsteopetrosi

TCSE allogenico: razionale

Controllo della patologia: Controllo della crescita neoplastica Immunoterapia

leucemie acute e croniche

linfoma di Hodgkin

linfomi non Hodgkin

tumori solidi in fase avanzata:

neuroblastoma IV stadio

sarcoma di Ewing alto rischio

rabdomiosarcoma

Graft versus Tumor

La reazione GvT è mediata dai linfociti T del donatore ed è legata a differenze tra donatore e ricevente nell’ambito degli antigeni del sistema HLA e degli antigeni minori di istocompatibilità.

Tali antigeni sono tuttavia espressi anche su tessuti normali dell’ospite: GvH.

Un ulteriore possibile meccanismo potrebbe includere una reazione dei linfociti nei confronti di non ben definiti antigeni tumore specifici (Tumor-Associated Antigen -TAA).

Graft versus Tumor

Anche le cellule NK, che appartengono al compartimento dell’immunità innata, possono rivestire importanza nell’induzione della GvT, essendo attivate da un’alterata o assente espressione delle molecole HLA di classe I alla superficie cellulare: ipotesi del “missing self”.

In questo modo, le NK non sarebbero coinvolte nella genesi della GvH, non attaccando i tessuti con normale espressione di molecole HLA di classe I, ma solo della GvT.

Le NK esprimono gruppi differenti di recettori, inibitori ed

attivatori. Tra questi, i KIR riconoscono epitopi (ligandi

KIR) condivisi da gruppi di alleli HLA di classe I.

La mancata espressione del corretto ligando KIR di classe I

sulle cellule allogeniche mis-matched scatena

l’alloreattività NK.

In particolare, gli alleli HLA-C hanno dimostrato un ruolo

primario del meccanismo di protezione delle cellule dalla

citotossicità NK.

Cellule Natural Killer

TCSE aploidentico

Probabilità e rapidità nel reperimento di un donatore

Aumentato rischio di recidiva

Aumentato rischio di rigetto

Intensa immunosoppressione

Necessità di T-depletare per ridurre il rischio di GvHD

[KIR2DL1

KIR3DL1

KIR2DL2/3

<

C

HLA-CLys80(Cw2,4,5,6,..“gruppo 2”HLA-C)

HLA-CAsn80(Cw1,3,7,8,..“gruppo 1”HLA-C)

HLA-Bw4 alleli

Natural Killer Cellula autologa

[KIR2DL1

KIR3DL1

KIR2DL2/3

<

C

HLA-C group 2 Cw2

HLA-C group 2 Cw4

HLA-Bw4B51

HLA-C group2Cw2

HLA-C group1Cw1

HLA-Bw4B27 >

C

missing HLA-C group1

]

DonatoreHLA NK cell

RiceventeTarget

NK nel TCSE aploidentico

L’infusione di cellule NK alloreattive si associa a tre importanti

fenomeni:

distruggendo le cellule T dell’ospite, primariamente deputate

al rigetto del trapianto, si riduce l’incidenza di questa

complicanza;

attaccando prevalentemente le cellule ematopoietiche, non si

assiste al fenomeno della GvHD;

distruggendo le APC dell’ospite, deputate alla presentazione

dell’antigene ai linfociti T del donatore e quindi all’innesco

della reazione GvH, si realizza un effetto protettivo nei

confronti di questa complicanza.

Evidenze che l’alloreattività NK non ha come bersaglio altri

tessuti al di fuori delle cellule linfoematopoietiche suggeriscono

che l’infusione pre-TCSE di NK alloreattive possa essere

utilizzata con sicurezza nel regime di condizionamento del

paziente.

NK nel TCSE aploidentico

Esperimenti in modelli murini indicano che l’alloreattività NK in

direzione GvH può promuovere un’immunosoppressione e

mieloablazione tali da consentire l’innesto di midollo osseo MHC

incompatibile senza sviluppo di GvHD, usando un regime di

condizionamento non letale.

Donor Lymphocyte Infusion

Bulk Dose Regimen vs Escalating Dose Regimen1,5 x 108/kg 1075 x 107 108/kg

Obiettivo:

indurre un effetto di Graft versus Tumor

Effetti collaterali:

induzione di GvHD

aplasia ed immunosoppressione

CTL anti-leucemia

Identificazione di antigeni presenti sulle cellule

tumorali in grado di stimolare linfociti T citotossici

(CTL) specifici per le cellule maligne e scarsamente

reattivi verso i tessuti sani dell’ospite.

Espansione di CTL dotati di:

• efficiente funzione effettrice in vivo

• memoria immunologica a lungo termine

CTL anti-Epstein Barr virus

CTL EBV-specifici del donatore CTL EBV-specifici autologhi:

ottenuti prima del TCSE e criopreservati

ottenuti al momento della diagnosi di EBV-LPD

Il trattamento preventivo è da preferire per i minori effetti collaterali e le maggiori probabilità di successo

CD4+ anti-CMV ed Aspergillus

I linfociti T del donatore vengono messi in coltura

con Aspergillus fumigatus or CMV, e viene

aggiunta IL-2 nelle prime due settimane.

Si ottengono solo cloni CD4+ producenti IFN-

gamma.

I cloni vengono valutati per la cross-reattività nei

confronti del paziente.

TCSE e cellule mesenchimali Matched-pair analysis Osiris-EBMT 2002

L’infusione di MSC espanse in associazione con

le CSE:

riduce l’incidenza di GvHD acuta e cronica

migliora DFS and OS

non sembra influire sull’incidenza di recidive

TCSE: nuove frontiere

Espansione ex-vivo di CSE da CB per

trapianto nell’adulto

Malattie autoimmuni non-organo specifiche

Malattie autoimmuni organo specifiche

(DM)

Infarto miocardico acuto (IMA)

Distrofia muscolare di Duchenne

Patologie degenerative SNC

TCSE e malattie autoimmuni

RazionaleDistruggere le cellule immuni autoreattive e ricostituire un sistema immunitario correttamente funzionante.

ModalitàMobilizzazione delle CSE autologhe mediante somministrazione di G-CSF; raccolta aferetica delle CSE; separazione delle CSE dal prodotto aferetico e congelamento.

TCSE e malattie autoimmuni

Problemi aperti

Rischio di riacutizzazione della malattia di base in

corso di trattamento con G-CSF

Immunosoppressione post-SCT

Difficoltà di selezionare un numero adeguato di CS

Rischio di inoculare cellule mature autoreattive

Malattie autoimmuni organo-specifiche (DM, AR)

CSE e diabete mellito

Obiettivi:• arrestare il processo autoimmune• favorire la riparazione degli organi danneggiati

La natura monocellulare della patologia lo rende un

terreno ideale per la terapia cellulare:

colture di CS che differenzino in cellule insulari

terapia genica

Terapia genica

Modificazione genetica di cellule allo scopo di ottenere un effetto terapeutico

Nell’ambito delle malattie autoimmuni organo-specifiche, l’obiettivo primario è quello di modificare la risposta immune infiammatoria aberrante: geni per l’espressione di recettori alterati per le citochine infiammatorie; geni per la secrezione di citochine anti-infiammatorie.

CSE e plasticità

Le CSE sono in grado di differenziare in numerosi

tipi cellulari non emopoietici, e possono quindi

promuovere una ripresa funzionale e strutturale a

livello di vari organi ed apparati, tra cui: fegato, reni,

pancreas, polmone, cute, tratto gastroenterico, cuore,

apparato muscolo-scheletrico, tessuto nervoso.

TCSE nell’IMA

Iniezione intracoronarica di cellule CD133+ autologhe dopo IMA.

Razionale

Possibilità che CS purificate dal BM o dal PB abbiano effetto terapeutico in pz che abbiano di recente subito un importante danno transparietale per IMA con associati marker prognostici negativi di ricostruzione per danno microvascolare.

TCSE nella degenerazione maculare

Trapianto di cellule CD34+ autologhe.

Razionale

Vi sono alcune evidenze sul potenziale differenziativo delle CS di derivazione midollare in cellule retiniche in modelli murini.

L’azione angiogenetica delle cellule infuse attualmente rappresenta un limite importante

all’applicazione nell’uomo

TCSE nelle patologie SNC

Sclerosi multipla

Il TCSE sembra in grado di sopprimere la componente infiammatoria della SM;

le CSE possono migrare nel SNC e differenziare in cellule che esprimano marker neurali e gliali;

Le CSE possiedono inoltre un potenziale rigenerativo neurale e mielinico.

Parkinson

Stroke

TCSE nella distrofia muscolare di Duchenne

Trapianto di cellule CD133+ autologhe nella distrofia di Duchenne.

Razionale

Le CS muscolari trapiantate nel topo distrofico possono dare origine a miociti scheletrici differenziati. Le cellule CD133+ derivate dal muscolo di pz con Duchenne possono differenziare in vivo in miociti.

Espansione di CSE ex-vivoObiettivi:

ottenere un numero di CSE adeguato per la procedura trapiantologica manipolazione nell’ambito della terapia genica

L’espansione delle cellule in coltura può essere >100 volte in 1-2 settimane; il potenziale di espansione delle cellule più immature è tuttavia molto più limitato (2-20 volte).

Ruolo chiave delle citochine nel prevenire la differenziazione terminale delle CS.