Über die Hydrolyse von d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren

(Aus der Medizinisehen Universit~tsklinik K61n. Direktor: Prof. Dr. Knipping.)

[~ber die IIydrolyse y o n d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren*, **.

Von Hans Iterken.

Mit 2 Textabbildungen.

(Eingegangen am 18. Februar 1942.)

I . Einleitung. Vorkommen und biologische Bedeutung yon d-Aminosduren in Tumorproteinen.

Bei Untersuchungen fiber die Konfiguration der aus den Proteinen normaler Organe iso]ierten Aminos~uren war bisher allgemein festgestellt worden, dai~ diese alle der gleichen sterischen l~eihe, und zwar der l-Reihe angehSrten. 2'. K6gl und H. Erxleben 1 haben nun vor eini- ger Zeit den interessanten Befund erhoben, dab in den Eiweil~kSrpern gutartiger und b5sartiger Tumoren neben den natiirlichen Eiweil~- bausteinen aueh so!che der d-Reihe in grSl~erer Menge vorkommen. Von den isolierten Aminosi~uren wies besonders die Glutaminsi~ure aus bSsartigen Tumoren einen hohen Prozentsatz der unnatfirlichen Form auf. Die t~einheit der isolierten Substanzen wurde in jedem Falle dutch die Elementaranalyse gepriift. D a der Einwand gemacht werden konnte, dal~ die Depression der spezifischen Drehung bei den an Geschwfilsten gewonnenen Pr~paraten dureh analytisch nicht nach- weisbare Verunreinigungen hervorgerufen werden kSnnte, wurde partiell raeemische Glutamins~ure aus Brown Pearce-Tumoren nach dem Ver- fahren yon F. Ehrlich ~" mit g~render Here behandelt, um die d-Form rein darzustellen. Es gelang auf diese Weise tatss reine d-Glut- aminoss zu isolieren 3. Die Anwesenheit yon unnatfirliehen Amino- ss konnte fiberdies noch in anderer Form bests werden: Pr~parate yon Glutaminss aus menschliehen Lebermetasta- sen bzw. aus Brown Pearce-Tumoren, die nach der spezifisehen Drehung einen Gehalt yon 43,0% bzw. 30,5% d-Form enthielten, wurden neu- tralisiert und so verdfinnt, dal~ in beiden LSsungen die gleiche )/Ienge d-Glutaminss vorhanden war. Nach Znsatz yon d-Aminos~ture-

* Herrn Prof. W. Heubner zum 65. Geburtstag gewidmet. ** Die Arbeit wurde mit Unterstfitzung durch die Deutsche Forsehungs-

gemeinsehaft und die I.G.-Farbenindustrie Werk Wuppertal-Elberfeld aus- geftihrt.

4L56 tI. tIerken:

oxydase aus Aeetontroekenpulver von Hammelnieren, die bekannt- lieh nut die unnatfirliehen Aminos/~uren desaminiert 4, t r a t bei beiden Pr/tparaten wtthrend einer Versuehsdauer yon 90 Minuten der gleiehe Sauerstoffverbraueh u nd die gleiehe Ammoniakbildung auf 5. Da die I~eaktionsgesehwindigkeit des Fermentes yon der Konzentrat ion des Substrates abhgngig ist und die beiden versehieden stark raeemisierten Glutamins~urepr/~parate auf Grund der Drehungsbestimmung so ver- dtinnt waren, daft sie iibereinstimmende Konzentrationen an d-Form aufwiesen, so best/~tigt also die gleiehe Reaktionsgesehwindigkeit das Ergebnis der Drehungsbestimmung.

I m Verlauf weiterer Untersuehungen konnte bald der Einwand entkr~ftet werden, dab die Raeemisierung der Glutamins~ure Ms Folge der Nekrosevorg~nge in Tumoren anzusehen sei. Naeh Trennung der nekrosearmen und nekrosereiehen Gewebepartien yon Impf- und Reizgesehwtilsten ergab die ehemisehe Analyse in beiden praktiseh den gMehen Geha.lt an d-Glutamins~ure 6. Es konnte siehergestellt werden, daft dieses Ergebnis nieht dureh versehieden hohe Ausbeute vor- get~useht wurde. Bemerkenswert war bei diesen Versuehen, dat3 die Proteine der nieht met~stasierenden ImpI- und Reiztumoren der t~atte sehr viel weniger d-Bausteine enthielten, als das b6sartige sehnell me- tastasierende Brown Pearce-Careinom des t(aninehens.

Von besonderer Wiehtigkeit waren nun Ufitersuehungen fiber die Spezifit~t des Vorkommens yon partiell raeemisehen Aminos~uren. I-Iierbei konnte festgestellt werden, daft sowohl in normalen und embryo- nalem Gewebe als aueh in den Proteinen versehiedener pathologiseh ver~nderter Organe (u. a. Tuberkulose, Lymphogranulomatose) nut sehr geringe Mengen d-Aminos~uren gefunden wurden, die den als Fehlergrenze angenommenen Weft von 2% nieht fibersehreiten ~.

Die wiehtige biologisehe Bedeutung dieser Befunde bei Gesehwiilsten erg!bt sieh aus der Vorstellung, dab die Funktion der normalen Regu- latoren insbesondere aueh der normalen proteolytisehen Enzyme stark beeinfluBt wird, wenn die Proteine als Erfolgsstelle dutch den Einbau yon unnatiirliehen Aminosguren yon der Norm abweiehen. I)ber den EinfluB des sterisehen BaYS auf die Spaltbarkeit yon Peptiden liegen bereits zahlreiehe Versuehe vor. Itierbei wurde allgemein beobaehtet, daft die Einfiihrung einer d-Aminos/~ure in ein Peptid die Hydrolyse dutch normale Peptidasen behindert oder g~nzlieh aufhebt s, 9, 10. Nun besitzt zwar die Tumorzelle selbst bei einem hohen Gehalt an unnatfirlichen Aminos/iuren noeh eine iiberwiegende Menge normaler EiweiB- k6rper. Es mugte sieh abet naehweisen lassen, daft ein groger Teil der Tumorproteine dem Angriff der normalen Fermente entzogen wird, wenn die in dem EiweiB der Gesehwiils~e enthaltenen d-Aminos~uren in der Tat jenen EinfluB besitzen, der auf Grund der Modellversuehe

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. z157

an Peptiden zu erwarten war. Tats~chlieh konnten nun F. KSgl und H. Erxleben 11 in Versuehen am Hund den Beweis erbringen, dal~ naeh Fiitterung yon gekoehtem Brown Pearce-Carcinom betrs Mengen eiweii~artiger Verbindungen ungespalten ausgeschieden werden, aus denen sieh d-Glutaminss in hohem Prozentsatz gewinnen lie3. So konnte ans den mit dem Faeces ausgesehiedenen Produkten dieser Art naeh salzsaurer t tydrolyse zum ersten Male Glutamins~ure mit negativer Drehung ( ~ D ~ - - - 5 , 3 ~ erhalten werden, d .h . die nieht natfirliche Form wurde im lJbersehul~ isoliert.

II. Enzymchemische Folge~ungen.

Diese Befunde wurden etwas ausffihrlicher besprochen, da sie die Basis f fir eine l~eihe neuer enzymchemischer Fragen abgegeben haben. Aus d e m Auftreten yon partiell racemischen Aminosauren kann ge- folgert werden, daI~ die proteolytischen wie die Eiweil~ synthetisierenden Fermente des Tumors yon denen der normMen Zellen abweichen , da sowohl ffir den Einbau der unnatfirlichen Aminosi~uren in die Tumor- proteine wie ffir den Abbau dieses Eiweil~es besondere Fermente vorhanden sein mfissen.

Da fermentat ive Eiweil~synthesen in vi tro bisher auf erhebliche Sehwierigkeiten stiei~en, und nur in beseheidenem Umfange mSglich waren, wird aber diese Seite des Problems einer experimentellen Klarung sehr schwer zuganglieh sein. Besser sind wir dagegen fiber die Funktion tier eiweii~spaltenden Enzyme orientiert. Es war daher zun~ehst zu prfifen, ob bereits dureh Untersuchung der Proteolyse eine Kl~rung der Frage zu erreiehen war, welche Untersehiede im Fermentsystem der normalen und der Tumorzelle bestehen. Inzwischen ist eine Reihe yon Arbeiten fiber die in Careinomen und im Serum yon Krebskranken vorkommenden Peptidasen verSffentlieht worden, ohne dal~ bisher iibereinstimmende Ergebnisse yon den verschiedenen Autoren erzielt wurden.

Wir selbst haben unsere frfiheren Untersuchungen auf diesem Ge- bier inzwischen in verschiedener Richtung erweitert und gleiehzeitig versucht, die Grfinde ffir die zum Teil sehr widersprechenden Befunde in der Literatur aufzuklaren. Es sollen zunaehst die Untersuehungen fiber die in Careinomen und Organextrakten enthaltenen Peptidasen angeffihrt werden und daran anseh]iel~end die Versuche fiber das Vor- kommen yon d-Peptide spaltenden Fermenten im Serum yon Krebs- kranken besprochen und damit gleiehzeitig der heutige Stand des Problems dargestellt werden. Vorher scheint es mir notwendig, noeh auf die yon uns zum Nachweis der d-Peptidspaltung benutzte Methode einzugehen , die zur Kl~rung der Verh~ltnisse wesentlich beigetragen hat.

Zeitschrift fiir Krebsforschung. 52. Bd. 31

458 H. Herk~n :

11I. Der Nachweis der d-Peptidhydrolyse mit Hil]e yon d-Aminos~ureoxydase.

Bei der Bespreehnng unserer Versuehe tiber die im Serum enthaltenen d-Peptide spMtenden Enzyme haben wir bereits frtiher darauf hingewiesen, dag ein Teil der widerspreehenden Befunde auf methodisehe Schwierigkeiten zuriiekgeffihrt werden kann. Es wurde darauf aufmerksam gemaeht, dab die Genauigkeit der gebr~uehliehsten Me- thoden (Titration der COOH-Gruppen, Aminostiekstoffbestimmung naeh van Slylce) nieht ausreieht, ]~m geringe tIydrolysewerte einwand- frei zu messen. Dies gilt besonders ffir die Titrationsmethode, bei der nach Ansieht v. Eulers und seiner Mitarbeiter 12 erst Werte fiber 10% Spaltung als positiv zu betraehten sind. AIle bisher verwandten Me- thoden haben darfiber hinans den Naehteil, dab optiseh reine d-Peptide verwendet werden miissen, die wesentlieh sehwerer zug/~nglieh sind als die raeemisehen Verbindungen. Wir haben daher f/dr die 3/iessung der Hydrolyse yon d-Peptiden eine lViethode ausgearbeitet, die die Titrationsmethode an Genanigkeit erheblieh fibertrifft und aul3erdem die Anwendung raeemiseher Peptide gesta, t tet 13. ])as Prinzip dieses Verfahrens beruht darauf, die aus den d-Peptiden abzuspaltende d-Ami- nos/iure mit Hilfe yon d-Aminos~tureoxydase naehzuweisen. Die ge- nauen Kenntnisse fiber den ehemisehen Bau und die Wirkungsweise dieses Fermentes verdanken wir den grundlegenden Arbeiten v0n O. Warburg und W. Christian 14 sowie yon E. Negelein und H. BrSme115. ])as Ferment ist ein konjugiertes Protein, das aus einem unwirksamen Proteinteil und einer reversibel abtrennbaren unwirksamen prostheti- sehen Gruppe besteht, die sieh dissoziierend zu dem wirksamen Ferment vereinigen. Die prosthetisehe Gruploe wurde als Alloxazin-Adenin- ])inueleotid erkannt. Ffir unsere Untersuehungen ist die Erkenntnis wiehtig, dab die geaktionsgMchung bei der Alaninoxydation fiir das reine Ferment eine andere ist als f fir die ungereinigten Pr~parate. E. Negelein und H. BrSmel ~5 fanden bei den Untersuehungen mit reiner d-Aminos/iureoxydase als Bilanz der Alaninoxydation.

Alanin + 0 2 = Essigs/iure + CO 2 -r NH3.

Mit Nierenextrakten erhielt H. A. Krebs folgende Gleiehung:

Alanin + 1/~ O~ = Brenztraubens~ure + NH~.

])ieser Untersehied ist darauf zuriiekzufiihren, dag die ungereinigten Pr//parate Katalase enthalten, die das intermedi/~r gebildete Wasser- stoffsuperoxyd zersetzt, das dann nieht mehr mit Brenztmubensaure reagieren kann. Je naeh An- oder Abwesenheit yon Katalase ver- braueht also 1 Mol d-Alanin 1/2 Mol oder 1 Mof Sauerstoff. ])urch

Hydro]yse yon d-Peptiden durch Fermente ~us Gewebeextr~kten und Seren. 459

Messung des 02-Verbrauches u n d des gebildeten Ammoniaks haben wir

festgestellt , dab fiir unsere Fermentpr~Lpbrage die Gleichung yon H. A. Krebs gfiltig ist 16. Diese gilt n ieh t nu r ~fir d-Alanin, sondern ~uch Iiir andere Aminosi~uren wie d-Leuein, d-Vblin usw. Wir bes t immen bei unseren Unte r suchungen den bei der Desaminierung ve rb rauch ten O~: im Warburg-Respirometer und berechnen die Gr6i3e der Peptidsloaltung aus der ]%eaktionsgleiehung

1% �9 CHNH 2 �9 COOH -~ 1/2 0 2 - - 1%. CO �9 COOH - / N H a .

Zur q u a n t i t a t i v e n Erfassung der Hydrolyse yon d-Glu taminss

hal t igen Pept iden wird sich die Methode weniger gut eignen, da d- Glutamins~ure yon tier d-Aminoss nur langsam u n d in manchen Fi~llen unvo]lsti~ndig desaminier t wird 5.

Ieh habe n u n untersueht , ob diese Methode, die zun~chst nu r ftir die Serulnversuche beno tz t wurde, auch ffir den Nachweis der d-Pept id- spal tung dutch die in den Glycer inex t rak ten aus Tumoren und nor.

malen Organen en tha l t enen proteolyt ischen Fe rmen te geeignet ist. Db wir bereits festgestellt hbt ten , dal~ die oben angeffihrte Gleiehung f i i r unsere d-Aminoss giiltig ist, mul~te nur noch nach- gewiesen werden, ob die Glycer inext rakte frei~ yon diesem F e r m e n t

sind bzw. keine Subs tanzen entha l ten , die die abgespal tenen Amino- ss dem Nachweis entziehen. Wie bus Tab. 1 hervorgeht, e rg ib t sich die Brauehbarke i t des Verfahrens aueh fiir diese Versuche bUS der Tatsache, dal~ zu den E x t r a k t e n zugesetzte d-Aminos~ure q u a n t i t a t i v wieder gefunden wird.

Tabellel. Nachweis e iner d -Aminos~ure (d-Leucin) in G]ycer in- e x t r a k t e n mi t Hilfe yon d -Aminos~ureoxydase .

Yersuchs- Zugesetzte Wieder ge- % des Organextrakt zeit Menge fundene Menge zugesetzten

in S td . d - L e u c i n d - L e u c i n d-Leucins in mg d N in mg d

1. Magen-Ca . . . . . . . 2. Magen-Ca . . . . . . . 3. Magen-Ca . . . . . . . 4. Benzpyren~umor . . 5. Magenschleimhaut . . 6. Duodenalschleimhaut . 7. Leber . . . . . . . . 8. Hirn . . . . . . . . 9. ~Tier e . . . . . . . .

10. L u n g e . . . . . . . 11. tterz . . . . . . . . 12. Nebenniere . . . . . 13. Muskel . . . . . . . 14. Struma . . . . . . .

72 72 72 48 72 72 72 48 48 48 72 48 48 72

0,0350 0,0560 0,0280 0,0175 0,0560 0,0350 0,0350 0,0350 0,0280 0,0560 0,0350 0,0700 0,0350 0,0280

0,0346 0,O535 0,0290 0,0190 0,0505 0,0346 0,0374 0,0355 0,0165 0,0525 0,0318 0,0720 0,0362 0,0265

99,0 95,5

103,6 108,5 90,3 99,0

107,0 101,2. 59,0 94,0 90,9

103,0 103,5 94,7

31"

460 ~I. Herken:

Eine Ausnahme hiervon maehen nur die Glyeerinextrakte aus Nierengewebe. Hier waren die Ausbeuten schwankend und in manchen F~llen wurde nur etwa 60 % des zugesetzten d-Leucins wiedergefunden. Da dieses Organ sehr reich an d-Aminoss ist, seheinen bei der Extraktion der Peptidasen geringe Mengen dieses Fermentes in die Extraktionsfliissigkeit iiberzugehen. Die in den Versuehen mit diesem Organ gemessenen d-PeptidspMtungen stellen daher Mindest- werte dar.

In friiheren Untersuehungen konnte bereits gezeigt werden, dab n~eh Zusatz yon d-Aminos~ureoxydase zu d-Tripeptiden auch naeh ls Versuchszeiten keinerlei Sauerstoffverbraueh eintritt. In gleiehen Ver- suehen mit d, 1-Leueylglycin wurde dagegen eine geringe kontinuier- liche S~uerstoffaufnahme in Warburg-I~espirometer registriert. Dies beruht darauf, dal3 eine im Acetontrockenpulver der Niere vorhandene Dipeptidase kleine ~engen des d-Leueylglycins zur Aufspaltung bringt. Die im gleiehen Troekenpulver vorhandene d-Aminos~ureoxydase desaminiert dann das freie d:Leuein16% Da diese d-DipeptidspMtung aber aueh bei t~nger dauernden Desaminierungsversuehen aul3erordentlieh klein ist (2--4% in 21/2 Stunden) kann sie bei der Auswertung der Ver- suehe mit Organextrakten vernachl~ssigt werden. Dies gilt nut ffir Versuche, in denen keine Metalle Ms Aktivatoren der" hydrolysierenden Fermente verwendet werden.

IV . Die Spaltung von d-Peptiden dutch die proteolytischen Enzyme aus Gewebsextrakten.

Bevor ich auf die eigenen Versuehe mit Organextrakten eingehe, sollen bier noch die Untersuchungen anderer Autoren besproehen werden, die im AnsehluB an die Mitteilungen yon F. KSgl und H. Erx- leben I ausgefiihrt wurden. In einer kurzen Mitteilung berichteten Irwing, I . S. Fruton und M. Bergmann 17, dab Chlor~cetyl-d-glutaminyl-l-tyrosin durch Glycerinextrakte aus Tumoren gespMten werden konnte. Von

untersuehten Carcinomen hydrolysierten 2 das Peptid zu einem gewissen Prozentsatz. Vergleiehende Untersuehungen an normMen Ge- weben sind nicht angegeben. Die Autoren beschrs sich auf den Hinweis, dab die SpMtung eines d-Glutaminss Peptids im ttinblick aui die Untersuchungen von F. KSgl und Mitarbeitern bemerkenswert sei. Im Jensen-Sarkom der Rat te konnten dagegen n~ch Angaben yon B. Skar~yi~slci is keine d-Peptide spaltenden Fermente naehgewiesen werden. Als Substrat diente bier d,l-Alanylglyein. Da das Peptid nicht fiber 50 % gespalten wurde, sehlieBt Skar~y~slci daraus, da.B nur der 1-Anteil des Peptids hydrolysiert wurde. Eigene Versuehe, die weiter unten angeftihrt sind, zeigen abet, dab diese Annahme nicht in allen Fgllen zu gech t besteht. H. Bayerle und 2". H. PodIoucky 19

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente ~us Gewebeextrakten und Seren. 461

konnten in einem Falle durch hgufiges Nachgeben yon Brown Pearce-

Tumorextrakt zum Ansatz eine Spaltung yon d,l-Leucylglycin feststellen, die die Grcnze yon 50% cinwandfrei iibertraf. E. Abderhalden und G. Caesar 2~ fanden, dab Glycyl-d-norleucin und Glycyl-d-isoleucin dutch Extraktc aus normalen Organen und Tumoren hydrolysiert wird. Nach Angaben yon E. Maschmann 21 wird Glycyl-d,l-leucin und Glycyl- d,l-alanin nur in Gcgenwart yon Mangan als Akt iwtor fast zu 100% ge- s~oalten. Dagegcn beobachteten E. Bamann und O. Schimke ~2, dab d, l-Leueylglycin trotz Zusatz yon Mangan als Aktivator nicht fiber 50% gespalten wird. d-Leucylglycin wurdc dagegcn dutch Ovarial- extrakte in 10 Stunden bereits zu 60% hydrolysiert. Aus diesen Versuchen ziehen die letztgenannten Autoren den Schlul~, dal~ das Spaltungsprodukt der im d, ]-Peptidversuch zuerst eintretenden Hydro- lyse der l-Komponente ngmlich d-Leucin die Spaltung der d-Kompo- nente ,,v611ig unmSglich" macht. Nach Angaben der Autoren sell die Spaltung des d-Peptids nach Zugabe yon 1-Leucin ausbleiben. Racemisehe Peptide sollen deswegen zum Nachweis yon d-Peptidespaltenden Fer- menten nicht br~uchbar sein, da diese, obwohl sie vorhanden sind, dem Nachweis entzogen werden. Wir werden im folgenden zeigen, daft diese Ansicht in dieser strengen Form nicht zu t r i f f t . Betrachtet man die Ergebnisse zusammenfassend, so kann festgestellt werden, dab die meisten Autoren iibereinstimmend finden, daft Dipeptide, in denen nnr eine d-Aminosgure enthalten ist, durch die in den Extrakten enthalte- hen Fermente hydrolysiert werden. Unklarheiten scheinen jedoch noch dariiber zu bestehen, ob racemische Peptide fiir den Nachweis der d- Peptidspaltung verwendet werden kSnnen. Wenn die Annahme yon E. Bamann und O. Schiml~e richtig ist, wiirden racemische Peptide tat.- sgchlich hierfiir unbr~uchbar sein. Wir haben bereits in einer kurzen Mitteilung 2a zu diesen Untersuchungen Stellung genommen. In unserem Laboratorinm hat A. Schmitz eine Reihe yon Versnchen mit Glycerin- extrakten an normalen Organen und Tumoren vorgenommen nnd lest- gestellt, dab mit der Titrationsmethode nur Hydrolysewerte yon d, l-Leucylglycin gemessen wurden, die die Grenze yon 50 % nicht oder nut sehr geringfiigig iibersehritten~4.

D~ bisher allgemein angenommen wurde, dal~ bci den Versuehen mit raeemisehen Peptiden zuerst oder s0gar ausseh]ieftlich die 1-Kompo- nente def. Peptide hydro]ysiert wird, so bestanden zungehst keine Be- denken, den Aoiditgtszuwachs anf die tIydrolyse des 1-Anteiles zurtiek- zufiihren. Nun hatten wir aber bereits bei den Untersuehungen iiber das Vorkommen yon d-Peptide spaltenden Fermenten im Serum die Erfahrung gemaoht, daft z. 13. bei einer Gesamtspaltung des d, 1-Leucyl- glycylglyeins yon 49,6 % der d-Anteil zu 3 % hydrolysier~ werden kann ~a. Wir haben deshalb die gleiehen Ansgtze der Tab. 2 mit der yon uns

462 H. Herken:

Tabelle2. S p a l t u n g yon d,l-Leucylglycin dureh T u m o r e x t r a k t e . P e p t i d - K o n z e n t r a t i o n m/a o.

Gewebe I % Spaltung

1. Magen-Ca. [

2. Magen-Ca. I

Zei t ccm-Verbrauch in Std. ~x/Jo0 KOH

24 0,52 48 0,69

24 0,58 48 0,56

41,4 55,2

46,4 44,8

angegebenen manomet r i sehen Methode gepri i f t , der d - K o m p o n e n t e des Pep t id s e f fag t wird. Wie die folgenden K u r v e n zeigen, t r i t t naeh Zugabe yon d-Aminos~iureoxydase ein erhebl ieher

J / J

20g C~T~

759

~100 i

mit d e r n u r die Spa l tung

3o ~7 Fepmentzu~'abe

_4bb. 1. 02-Verbraueh naeh Zugabe yon d-Amino- s~.ureoxydase zu den Versttchsans~.tzen.

2o f20 75g/4/~

Sauers to f fve rbrauch auf, der im Warburg-Respirometer gemessen wurde.

Da die Aminos~ureoxydase nur freie d -Aminos~ure desami- n ieren k a n n (nieht die im P e p t i d gebundenen) , so erg ib t sieh hieraus, dab eine be t rgeh t l i ehe Spal- tung der im raeemisehen P e p t i d en tha l t enen d - K o m p o n e n t e ein-

ge t re t en sein mug. Wir haben auch an die MSglich-

keit gedaeht, dab ein Teil des ab- gespaltenen 1-Leueins durch eine Racemase in die d-Form umgewandelt

werden kSnnte. Wenn dies der ]?all w~re, miiBte zum Versuchsansatz zugesetztes ]-Leucin ebenfalls racemisiert werden. Wir konnten aber in derartigen Versuchen naeh Zusatz yon d-Aminos~ureoxydase niemals einen S~uerstoffverbraueh feststellen. Gegen diese Aimahme sprechen auch die sparer angefiihrten Versuche mit d, 1-Leucylglycylglycin.

Die GrSge der P e p t i d h y d r o l y s e l~gt sich nach der angegebenen Fo rme] errechnen.

Tabelle3. S p a l t u n g der d - K o m p o n e n t e yon d , l - L e u c y l g l y e i n d u r e h G e w e b s e x t r a k t e . P e p t i d k o n z e n t r a t i o n m/t 0.

' mg d. N. Gewebe Zei~ O2-Verbrauch berechnet aus % Spaltung

in Std. in cmm 02-u !

1. 3~agen-Ca . . . . . . . [ 48 2. Magen-Ca . . . . . . . I 48

153,5 127,2

0,192 0,159

55,0 45,5

Die Higl/te der mit der Titrationsmethode 9emessenen Hydrolyse ent- f~il~t also in diesen Versuchen au[ die St~altung des d-Anteils des Peptids. Hieraus e rg ib t sich, dab die , ,unspezif ischen" Methoden zur Messung

Hydrolyse von d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 463

der Peptidhydrolyse niehts dariiber aussagen, welcher Teil des Peptids zerlegt wird, wenn nicht optisch absotut reine Substanzen verwendet werden. Da l:Leucylglycin in der gleichen Versuchszeit quanti tat iv aufgespalten wird, so wird bei Versuclien mi~ racemischen Peptiden also nieht nur die I-Iydrolyse der d-Komponente gehemmt, wie F. Bamann und 0. Nchimlce 2~ annehmen, sondern auch die des 1-Anteiles. Weiche Vorg/tnge hierfiir verantwortlich sind, konn~e noch nicht gekl~rt werden. Wahrscheinlich werden sich aber die Spaltungsprodukte yon 2 Fer- menten gegenseitig beim Reakti~nsablauf der Peptidspaltung beein- flussen. Hier werden verg!eichende Untersuchungen mit der Titrations- methode und der manometrischen Bestimmung Aufklirnng geben. Die Gegenwart yon freiem l-Leuein, das nach E. Bamann und O. Schim/~e die Hydrolyse der d-Komponente unm5glich machen roll, schliegt jeden- falls nieht aus, dag die d-Komponente des Dipeptids hydrolysiert wird.

In weiteren Ver~uchen /connte gezeigt werden, daft die d-Dipeptid- �9 spaltung nicht spezi/isch /i~r Carcinome ist. Fast alle normalen Organe ]c6nnen d-Leucylglycin hydrolysieren. In folgender Tabelle sind hierfiir einige Beispiele angegeben.

Tabelle4. Spaltung der d-Xomponente yon d, l -Leucylglycin durch Ex t rak te aus normalen Geweben. Versuchszeit 48Stunden.

I Peptidmenge mg d. N. Gewebe ]mgd .N. in2ccm O~-Verbranch berechnet auf % Spalfllng

] Versuchsansatz in cmm O~-Verbrauch !

1. Magenschleimhaut.. . I 0,350 2. Duodenalschleimhaut " I 0,350 3. Milz . . . . . . . . . 0,560 4. Lunge . . . . . . . . I 0,560 5. Niere . . . . . . . . . I 0,350 6. Musket . . . . . . . . 0,350 7. Prostata . . . . . . . 0,350

96,2 111,0 160,0 88,5 80,5 4,4

60,3

0,120 0,139 0,200 0,111 0,101 0,0055 0,0753

34,3 39,8 35,7 19,8 28,9

1,6 21,5

Nach Angaben yon E. Maschmann 25 k6nnen Extrakte aus Aceton- ~rockenpulver yon Organen d-Dipeptide nut mit Zusatz yon Metallen als Aktivatoren der hydrolysierenden Fermente spalten. Glycerin- extrakte aus frischen Geweben verhalten rich also grunds~tzlich anders, denn in unseren Versuehen kamen keine zus~tzlichen Aktivatoren zur Anwendung. Es is~ natiirlieh wahrscheinlich, dab diese Gewebeex~rakte geringe Mengen der aktivierenden Metalle enthalten.

Far unser Problem ist nun die Kl i rung der Frage yon gro~er Wichtig- keit, ob fiir die Spaltung yon Peptiden, die nut sine Aminos~ure der d-Reihe enthalten, besondere d-Peptidasen n6tig rind. F a r die t tydro- lyre yon d-Leucylglycin braffcht dies unserer Ansieht nach nieht der Fall zu rein. ' Bei Versuchen mit Glycerinextrakten aus Organen mug beriieksichtigt werden, dab hier Fermentgemische vorliegen, die fast

464 H. Herken:

alle proteolytisehen Enzyme enthalten. Im Rahmen dieser Arbeit interessieren hier besondars die versehiedenen Peptidasen. In den Ex- trakten warden also aul~ar Aminopolypeptidase und Dipeptidase aueh Fermente vom Typ der Carboxypeptidasa enthalten sein. Da in der Literatur bereits Hinweise daffir vorliegen, dab auch solehe Peptide dureh Carboxypeptidasa hydrolysiert werden k6nnen, die am Carboxyl- ende eine natfirlieha, aber in dirakter Nachbarsehaft dazu dan Anti- poden einer natfirliehen Aminos/ture entha.Iten 2s, mul~ man noah mit der M6gliehkait rechnen, dab auch d-Geueylglyein yore freien Carboxyl- ende her aufgespalten werdan kann. Naeh Angaben yon M. Bergmann and I. S. Fruton ~7 seheint allerdings die yon Anson krystallisierte Carboxypeptidase nicht in der Lage zu sein, d, 1-Leueylglyein in titri- metriseh mel~baren Mengan zu spalten. Man wird daher eine Entschei- dung der Frage naeh dem Vorkommen yon d-Peptidasen am basten noah zurfickstellen und ffir die Kls Substrate haranziehen, die sowohl am Aminoende wie am Carboxylende d-Aminos~turen enthalten. Ein geeigneges Substrat wfirde z. B. d-Leueyl-d-leuein sein. d-Dipeptide aus kurzkettigen d-Aminostturen (z. B. aus d-Alanin) warden aus den welter unten angeftihrten Grfinden nieht so brauchbar sein 2s.

Im AnschluB hieran sollen noah Versuahe mit Tripeptiden angeffihrt werden, die vielleieht sehon eine gawisse Aufkt~rung in dieser Frage geben. Mil3t man die Spaltung z .B. yon d-Laueylglyeylglyein manometrisch mit Hilfe von d-Aminos~ureoxydase, so t r i t t nur dann ein Sauerstoffverbraueh auf, wenn das Peptid dutch Aminopeptidase in d-Leuain und Glycylglycin zerlagt wird. Wenn man mit der MSglieh- keit reehnet, dal~ auch dieses Tripeptid yore freien Carboxylende her aufgespalten werden kSnnte und so in Leueylglyein und Glyain zerlegt wiirde, so wird diese Reaktion, die bei den Versuchen mit d-Dipeptiden eine Spaltung dnreh d-Peptidasen vortguschen k6nnte, bei dieser Versuehsanordnung niaht stSrend in Erscheinung treten, da die d- Aminosgureoxydase mit dem im Peptid gebundenen d-Leucin nicht reagiert. Wie wir Sparer sehen werden, erM]t man hier nun ganz andere Ergebnisse als bei den Untersuehungen mit dam d-Dipeptid.

Es ist nun durehaus nicht gMchgiiltig, welahe Tripeptide ffir dar- argige Experimente verwendet warden. Diesa Frage ist bei den Unter- suahungen fiber d-Peptide spaltende Fermente bisher kaum beriieksichtigt worden. Hier haben vor allem die Ungersuchungen yon M. Berg- mann und Mitarbeitern ~~ fiber die sterisehe Spezifit~t der Peptidasen Klarheit geschaffen. Aus diesen Arbeiten, die sich mig dem geaktions- mechanismus zwischan Peptidase und Peptid besch~ftigen, geht hervor, dab die frfiher aufgestellte Regel, die Einffihrung von d-Aminos~u- ten in ein Peptid hebe die Spaltbarkeit dureh normale Enzyme auf, in dieser allgemeinen Form nicht gfiltig ist. Am besten sind d iesef fir

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 465

die geaktion zwisehen Enzym und Substrat wiehtigen Punkte yon den oben genannten Autoren bei der Einwirkung gereinigter Dipeptidase- pr/tparate untersueht worden, die daher als Beispiel angefiihrt werde~ sollen. Auger den sehon friiher fiir die Enzym-Substratbindung notwendig gefundenen Carboxyl und Aminogruppen miissen naeh Ansieht yon M. Bergmann nnd Mitarbeitern noeh folgende wei~ere Bedingnngen erfiillt sein :

1. Es mug Peptidwasserstoff vorhanden sein. 2. c~ und c~'H-Atom mtissen in bestimmter r~tumlieher Anordnung

vorliegen. Die Notwendigkeit der Anwesenheit des Peptidwasserstoffes wird

so erklgrt, dal3 das Peptid unter dem Einflug des Enzyms aus der Amid in die Imidform umgewandelt wird.

- - C - - N H --C~N

II o OH

I H~, / N H 2 H 0 0 C \ / H ~' R~- - C

\ C / \ C / \ / / / \ \ c - f i \ a : l ie"

n~ \ N H 2 l cis-F0rm. OH

Die hnidform maeht nun zwei rgumliehe Anordnungen mSglich

H O O C - - H a' oH \ i /

- - N IIC ~I~

trans-Form.

Wegen der r/tumliehen N/the yon NHs und COOH-Gruppe wird angenommen, dal] das Peptid w~hrend der Fermenteinwirknng in der eis-Form vorliegt. So entsteht ein Seehseek, in dem die Eeken yon der Carboxylgrnppe, dem c~-Kohlenstoff, Peptidkohlenstoff, c~'-Kohlen- stoff und der Aminogruppe gebildet werden. Die 6 Eeken sollen in einer Ebene liegen (,,binding plane"). Um die sterisehe Spezifit/it der Dipeptidase zu erklgren, muB angenommen werden, dab sieh das Enzym an mehr als 2 Punkten der bindenden Ebene anlagert. So bindet es z .B. bei der Spa:ltung yon 1-Leucylglyein die Aminogruppe, Peptid- wasserstoff und Carboxytgruppe. Die Anntiherung erfolgt yon der Seite her auf der die beiden c~-H-Atome liegen. Die groge C4Hg-Gruppe verhindert die Bindung des Fermentes yon der anderen Seite. Der ~-Wasserstoff kann dutch eine 1Kethylgruppe ersetzt werden, ohne dab dadureh die Spaltbarkeit des Peptids aufgehoben wird. Hieraus ergibt sieh, daft gewisse Peptide, in denen d-Alanin eingebaut ist, gespalten werden, allerdings langsamer als wenn das Peptid die 1-Form der

466 H. Iterken:

gleichen Aminos/~ure enths Werden aber d-Aminoss mit volu- min6seren Atomgruppen in das Pept id eingeffihrt, so t r i t t v611ige H e m m u n g der Hydrolyse ein. So erwies sich d-Leucylglycin als nicht spMtbar. Bei diesem Pept id kann das E n z y m die bindende Ebene yon oben her nicht mehr erreichen. Erreicht es d~s Substrat ~ber yon der Unterseite her, so k~nn das Ferment nicht in Aktion treten, weft die ffir seine Funktion notwendigen SubstratgruppGn night in der richtigen Anordnung vorliegen. Diese Vorstellungen fiber die l~eaktion zwischen Enzym und Substrat lassen sich natiirlich in entsprechender Abwand- lung auch auf den Wirkungsmechanismus der Aminopolypeptidase

H \ /,NH2 C H 3 . ~ ~NH2 \C

c~/\co" I H/ \C0/I C4H60~N C4H60aN 1-Alanylglycylglycin d-Alanylglycylglycin

H~ /NH~ CH3 CH~

j c ~\ /~H \/ell V . ~ v C~I_I603 X i I CH 2 NH~ c~ \ c / xH

/'\ H/\\co/I CH~ CH 3 C4I.I603 N

1-Leuoylglycylglycin d-Leucylglycylglycin

Tabelle 5. SpMtung der d - K o m p o n e n t e yon d , l - A l a n y l g l y c y l g l y c i n durch G l y c e r i n e x t r a k t e aus Org~nen.

I I Peptidmenge ] mg d. N. be- % Spaltung Organ Zeit mg d.N. 02-Verbrauchl rechnet aus in Std. in 2 ccm Ansatz in cmm O~-Verbrauch

I 1. M~gen-Ca . . . . . 48 2. )r yon

~gen :Ca . . . . ii 48 3. Driisenmetastase yon Adeno-Ca. . 72

4. Benzpyrentumor 72 5. Myom . . . . . 72 6. Struma . . . . 72 7. Gehirn . . . . . 48 8. Leber . . . . . 48 9. Duodenalschleim- 1

haut . . . . . . . 48 10. Niere . . . . . i] 48 lI. Prostatahyper-

grophie . . . . 72

I 0,350 I , i 0,175

0,350 0,350 0,175 0,350 0,350 0,175

0,350 0,350

0,350

169,0

74,8

106,0 59,0 57,5 30,0 78,9 41,7

21,7 182,8

0,211

0,0935

0,133 0,0737 0,0719 0,0375 0,0985 0,0521

0,0271 0,229

17,6 0,022

60,2

53,5

38,0 21,0 41,0 10,7 28,2 29,8

7,8 65,5

6,3

Hydrotyse yon d-Pep$iden durch Fermente aus Gewebeextrakgen und Seren. 467

f ibertragen ~9. Die Spal tung yon Tr ipept iden wird hier in folgender

Weise erkl/tr t : die ak t iven Gruppen in dem Subs t ra t der Aminopoly-

peptidase werden yon den freien Aminogruppen u n d verschiedenen Atomgruppen der i ibrigen Pep t idve rb indung gebildet. Die b indende Ebene soll hier, wie die Formeln (S. 466) zeigen, durch die NH- und CO-Gruppe, du tch das co-C-Atom sowie die NIt2-Gruppe bes t immt sein.

Wie die Tab. 5 (S. 466) zeigt, wird in Obere ins t immung mi t diesen A n n a h m e n d-Alanylglycylglycin durch die in Glycer inext rak ten entha l t enen Pept idasen tats/~chlich sehr gu t zerlegt.

Man k a n n deshalb Pept ide wie d-Alanylglycin und d-Alany]glycyl- g lyc in n ich t als Subs t ra t zur Prt i fung des Vorkommens yon d-Pepti- dasen heranziehen, wie es in letzter Zeit noch verschiedentl ich geschehen ist m, 80 Aus diesem Grunde habe ich ffir derart ige Versuche d-Leucyl-

g lycylglycin als Subs t ra t benutz t , mi t dem un te r Anwendung der oben beschriebenen Versuchsanordnung folgende Resul ta te erhal ten wurden:

Tabelle6. S p a l t u n g der d - K o m p o n e n t e yon d , l - L e u c y l g l y c y l g l y c i n .

Pel) t idmenge ~ g d. N. be- Organ Zeit m g d . N . O~-Verbr. rechne t aus % Spal tung

in Std. in 2 ccm Ansa tz in c ram O~-Verbrauch

1. Nagen-C~ . . . . . 2. Magen-Ca . . . . . 3. Metastasen yon

Magen-Ca . . . . . 4. Drfisenmetastasen

yon Adeno-Ca. . . 5. Benzpyrentuinor 6. B r o w n - P e a r c e - C a . .

7. Magen-Ca . . . . . 8. Driisenmetastase 9. Mamma-Ca.

(Scirrhus) . . . . . ]0. Prostatahyper-

trophie . . . . . . 11. Struma . . . . . . . 12. Ulcus cMlos . . . . 13. Myom . . . . . . 14. Muskel . . . . . . 15. IIirn . . . . . . . 16. DuodenMschleim-

huut . . . . . . . 17. Magenschleimhaut . 18. Milz (Rind) . . . . 19. Milz (Schwein) . . 20. Leber (Schwein). 21. Leber . . . . . 22. Niere . . . . . . 23. Nebenniere . . . .

48 48

48

72 48 48 48 48

72

48 72 48 72 48 48

48 48 48 48 48 48 48 48

0,350 0,350

0,175

0,350 0,350 0,560 0,350 0,175

0,175

0,350 0,350 0,350 0,175 0,350 0,350

0,350 0,350 0,350 0,560 0,175 0,350 0,350 0,350

5,1 9,0

8,4

10,9 12,4 4,4

16,8 5,7

2,0 0 0

5,1 0 0

0 0

8,4 0

8,3 8,5

?

0,0064 0,0113

0,0105

0,0137 0,0155 0,0055 0,0210 0,00705

0,00250

0,0064

m

0,0105

0,0104 0,0106 0,00675

1,8 3,2

5,9

3,9 4,4 1,0 6,0 4,0

0,7 0 0

3,6 0 0

0 0

3,0 0

5,9 3,0 1,9 0

468 H. Herken:

I n einigen F/~llen wurde auch die Spa l tung yon d-Leucy lg lyey l - g lyein dureh Organex t r ak t e un te rsueh t . Wie aus der Tab. 7 hervorgeht , wurden bier die gleiehen W e r t e gefunden, wie wenn d, 1-Leueyl- g lyey lg lye in als Subs t r a t ve rwende t wurde.

T~belle7. S p a l t u n g yon d - L e u e y l g l y e y l g l y e i n du reh O r g a n e x t r ~ k t e .

PeDdi tmenge m g d. N'. be- Organ Zeit m g d. N. in Q-Verb r . rechnet aus % Spal tung

in Std. 2 ecru Ansatz in clnm O~-Verbrauch

1. Metastasen yon Magen-C~ . . . . . .

2. Magen-Ca . . . . . . 3. Magen-Ca . . . . . . 4. Uleus callos . . . . 5. Prostatahypergrophie 6. Struma . . . . . .

48 48 48 48 48 72

0,350 0,700 0,700 0,350 0,700 0,350

10,9 19,1 26,6

0 3,5 0

0,0136 3,9 0,0239 3,4 0,0333 4,8

- - 0

0,00437 0,6 0

Auffallend ist, daft ganz betriichtliche quantitative Unterschiede zwischen den Hydrolysewerten yon d-Leucylglycin uncl d-Leucylglycylflycin

& i

/ d-Zeacflgiycin j

I / e-ze e/e/z /e/w.

O ! Permen/z~ya~ e " .

Abb. 2. EE?-drolyse der d-Komljonente yon d, 1-Leuoy]g]yein rind d, 1-;LeueyIglye~]gIyein. JOarstellung des O.a-Verbrauohes nach Zugabe yon d-.4minos~m'eoxydase.

bestehen, die besonders deut l ioh aus einer vergle iehenden Dars te l lung des v e r b r a u e h t e n Sauerstoffs naeh Zugabe yon d-Aminosf iureoxydase hervorgehen, wie die folgenden Kurven zeigen.

V. Bemerkungen iibe~" die d-Peptid spaltenden ff ermente und die d-Peptid Synthese.

Aus der Gr61~e der d -Leucy lg lycy lg lyc in -Hydro lyse kann m a n schlie- f3en, dab nur sehr geringe Mengen yon d -Pep t ide spa l tenden E n z y m e n vorl iegen, wenn m a n n ich t ann immt , dab die Tgt igke i t d iese r F e r m e n t e durch hemmende Stoffe bee in t rgeh t ig t wird. I-Iierfiir l iegen aber bisher keiner le i Anha l t spunk t e v o r . Wie eine Be t raeh tung der Tab. 6

]-Iydrolyse yon d-Peptiden din'oh Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 4L69

zeigt, k6nnen von den normalen Org~nen Leber, Niere und Milz d- Leucylglyeylglycin etwa in gleiehem Umfange spalten wie die Extrakte ~us Careinomen ~I. Ans den Proteinen dieser Organe konnten ~ber keine nnnatiirliehen Aminos/~uren isoliert werden 7. Es war nun auf- fgllig, dab yon den normalen Organen gerade Niere und Leber das Peptid spalten lkonnten, yon denen uns aus friiheren Versuehen 5 bekannt war, dag sie besonders reich an d-Aminos~ureoxydase sind. Wit haben hier zungchst an die MSgliehkeit gedaeht, dab der Einbgu yon d-Amino- sgnren in die Proteine dieser Organe-dadureh nnm6glieh gemaeht wird, dab die nnnattirliehen Bausteine dureh dieses Ferment sehr sehnell in die optisehe inakt ive Ketosgure iibergefiihrt werden. Wenn diese Vorstellungen zutreffen, mfigten aber aueh die Milzextrakte fiber dieses Ferment verfiigen. Wit haben dieses Organ daraufhin noehmals besonders untersueht. Es ergab sieh jedoeh, daft die Milz nieht in der Lage ist, d-Aminos~uren oxydativ zu desaminieren. Experimentell sind wit hierbei so vorgegangen, dab FermentlSsungen aus Aeeton- troekenpulver yon friseher Nilz mit einer d-Aminoss bekannter Konzentration versetzt wurden. Die zngesetzten Nengen d-Amino- sgnre wurden aueh naeh ls Versuehszeiten - - bis zu 24 Stunden - - mit Hilfe yon d-Aminosgureoxydase aus frisehen Sehweinenieren quanti tat iv ,,wiedergefunden".

Auf Grund der Theorie kann erwartet werden, dab das d-Leueyl- glyeylglyein si0Mtende Ferment unter bestimraten Bedingungen aueh den Einbau yon d-Bansteinen vornehmen kann, wenn sieh bei der d-Peptid-Hydrolyse ein Gleiehgewieht einstellt. Bei den Eiweil3kSrpern sind die Verh~ltnisse ffir die Synthese allerdings besonders nngfinstig, weil das Gleiehgewieht zwisehen Aminosguren und Pept iden wie aueh zwisehen Peptiden nnd Proteinen unter den bisber untersuehten Be-

�9 dingungen weir auf der Seite der Spaltung liegt. Dies ist aueh der Grund, warum die enzymatisehe Peptid-Synthese in vitro bisher auf groBe Sehwierigkeiten stiel3. DaB aber die hydrolytisehe Spaltnng yon Pep- giden dureh Enzyme tats/~ehlieh ein umkehrbarer Vorgang ist, konnte dutch M. Bergmann und Mitarbeiter 32 siehergestellt werden. Die Syn- these yon Peptiden gelingt, wenn sieh hierbei Verbindungen ergeben, die wenig 15slieh sind. Hierdureh werden Bedingungen gesehaffen, bei denen alas Syntheseprodukt immer nut in niedriger Konzentration vorliegt. Damit versehiebt sieh d~s Gleiehgewieht zugunsten der Synthese. So verbinden sieh z .B. Benzoyl-l-leuein nnd 1-1eueinanilid unter der Einwirkung yon Papain zu Benzoyl-l-leueyl-l-leueinanilid. Wie bei der t lydrolyse maeht sieh aueh bei der Synthese yon Peptiden der Ein- fluB des sterisehen Banes der Aminoss geltend. So k6nnen z. B. die Aeylderivate voa d-Alanin, d-Leuein und d-Phenylalanin dutch Papain nicht mit Alanin geknppelt werden.

470 H. Herken:

Wie wir bereits gesehen haben, k6nnen die Ext rak te aus Milz, Leber und Niere ebenso wie die aus Carcinomen d-Leucylglyeylglyein zu einem gewissen Prozentsatz spalten. Weiter haben die bisherigen Feststellungen ergeben, dab die in den Organauszfigen enthaltenen ~ermente d-Leueyl- glyein gut hydrolysieren k6nnen. Der gr6gte Teil der Gewebe wfirde demnaeh fiber Enzyme verffigen, die aus den oben erSrterten theoretisehen Grfinden d-Aminoss in ein Peptid einbauen k6nnten. Trotzdem enthalten die Proteine sowohl yon. Milz, Leber und Niere als aueh an- deter normaler Organe im Gegengatz zu den Gesehwfilsten keine un- nattirlichc Glutamins~ure. Nan mug abet beriicksiehtigen, dab der Auf- bau eines grSgeren Proteinmolekfils noeh ein sehr uniibersiehtlieher Vor- gang ist, an dem eine groBe l~eihe yon Katalys~toren beteiligt sein wird. Bei dem Einbau yon d-Aminoss in die Organproteine werden abet auSerdem noeh andere Faktoren eine wesentliehe Rolle spielen. Ausschlag- gebend wird hierbei vielleieht besonders das Angebot an unnattirliehen EiweiBbausteinen sein. Man wird es yon vornherein ats wenig wahr- seheinlich ablehnen mfissen, dab die Aminosguren der d-Reihe dem Carei- nom yon augen etwa mi t der Nahrung zugefiihrt werden, zumal d- Aminos/~uren bisher nut in pIlanzliehen Proteinen in ganz geringen Mengen aufgefunden worden sind. Meiner Ansieht nach liegt es sehr vial n~her, anzunehmen, dag das CareinomeiweiS yon der Zufuhr der unnatfirlichen Aminosguren yon auSen unabh~ngig ist und diese selbst her- stellt. Hierin wird wohl die wichtigste enzymehemisehe Abweiehung des Tumors vom normalen Gewebe zu sehen sein. I m Zusammenhang hiermit ist nun ein Befund yon I v a n o v i c s a3 besonders interessant, dab der Bacillus mesenterieus vulgatus, dessen Kapsel aus einem d-Gluta- mins~turepeptid besteht, zum Aufbau dieser Kapsel d-Glutamins/~ure nieht verwerten kann, sondern in seinem Stoffweehsel aussehlieglieh auf Aminos~uren der 1-Reihe angewiesen ist. Eine Aufkl~rung der Frage, ob ein gleiehes Verhalten aueh ffir das Careinom zutrifft, ist natfirlieh sehr wichtig. Dies 1/~gt sieh vielleieht am besten an Gewebskulturen yon Careinomzellen prfifen, die fiber l~ngere Zeit auf einem d-Amino- ss N~hrboden gezfiehtet wurden. Eine andere M6gliehkeit w&re die, das Sehicksal yon d- und 1-Aminos/turen, die dutch den Gehalt an Deuterium und isotopem N eharakterisiert sind, im careinomkranken Tierk6rper bzw. ihren Ubergang in die Careinomproteine zu ver.folgen. Von solehen Untersuehungen-kann ein wesentlieher Fortsehrit t erwartet werden.

Bei der Besprechung tier Versuehe fiber die Hydrolyse yon d-Leueyl- glyein dutch Organextrakte wurde bereits darauf hingewiesen, dab dieser Befund nicht unbedingt Ifir die Anwesenheit yon d-Peptidasen spricht. Ob die beobaehtete Tripeptidspaltung auf besondere d-Fer- mente zurfiekzuffihren ist, ist ebenfalls noeh nieht v611ig Mar. Ieh

Itydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. d~71

halte es aber nieht ffir ausgesehlossen, dug die dureh den Einbau yon d-Leuein hervorgerufene sterisehe Hinderung dureh hShere Konzen- trationen yon 1-Peptidusen iiberwunden werden kunn. tIierfiir seheint zu spreehen, dug gerade diejenigen Orgune zur Spultung yon d-Leueyl- glyeylglyein bef~higt sind, yon denen bekunnt ist, dug sie reich an proteolytisehen Fermenten sind. Dies gilt aueh ffir die Extrakte aus Careinomen. Die Bereehtigung zu dieser Annuhme leitet sieh aus den Ergebnissen der Versuehe der Tab. 5 ab, in denen gezeigt werden konnte, dal3 die Glyeerinuusziige aus b6sartigen Geweben d-Alunylglyein in sehr hohem MaBe spulten. Wit werden uuf die Hydrolyse yon d-Tri- peptiden dureh Orgunextrukte in einer sp/~teren Arbeit noeh einmal znrfiekkommen.

Bei der Beurteilung yon Untersuehungen fiber das Vorkommen spezifiseher Fermente, die fiir den Einbau der d-Aminos/iuren in die Proteine notwendig sind, wird man yon vornherein mit der M6glieh- keit reehnen mfissen, dab die Menge dieser Enzyme in den Tumoren voraussiehtlieh sehr gering sein wird. Denn selbst bei dem h6ehsten Gehult an d-Aminosguren ist doeh nur eine Bruehteil der in don Pro- teinen enthMtenen Eiweigbausteine raeemiseh. Zum Naehweis der Enzymabweiehungen wird man sieh daher empfindlieher Methoden bedienen mfissen. Die meisten der bisher benutzten Metheden afirften kuum hierfiir uusreiehende Genuuigkeit besitzen. Ebenso wird es wieh- rig sein, weitere Einzelheiten fiber die Wirkungsbedingungen der Pepti- dusen zu erfahren. In diesem Zusammenhung ist z. B. yon Interesse, dab S. Edlbacher und H. Baue@ ~ vor kurzem feststellen konnten, dug die Spultung yon 1-Leueylglyein durch bestimmte Konzentrationen d-Leueylglyein vSllig gehemmt wird und E. Bamann und O. Schimlce 84~ machten die wichtige Feststellung, dab die Hydrolyse yon d-Leueyl- glyein dureh m/20 1-Leuein aufgehoben wird. Auf die gegenseitige Hem- mung der Itydrolyse der d- und 1-Komponente des gMehen Peptids hubert wir bereits autmerksam gemueht (vgl. S. 4 unten).

VI. Die Wirkungsweise der Carboxypeptidase.

Bei der weiteren Bearbeitung dieses Problems wird man noch andere proteolytisehe Fermente zur Kl/~rung heranziehen mfissen, lfir die ebenfalls wohldetinierte Substrate zur Verfiigung stehen. Besonders notwendig scheint es, hierbei aueh die Fermente vom Typ der Carboxy- peptidase aus normalen und bSsartigen Geweben zu prtifen, Ifir die unter entsprechender Abwandlung s sterisehe Spezifitgtsver- h/~ltnisse gelten, wie sie bei den Aminopeptidasen besehrieben wurden. So kann z. B. die Carboxypeptidase nur dann in Aktion treten, wenn d~s Carboxylende des Peptids einer natfirliehen Aminos/~ure angeh6rt, Es bestehen aber doch noeh einige charakteristisehe Untersehiede gegen-

472 I-I. tterken:

fiber der Wirkungsweise der Aminopeptidase, die dieses Ferment zu einem interessanten Untersuehungsobjekt maehen. Aus der Tatsaehe, daft Pyruvyl-l-Alanin hydrolysiert wird, konnte gesehlossen werden, daft die Anwesenheit des ~-H-Atoms f~r die Reaktion mit dem Ferment nieht notwendig ist. Weiter konnten M. Bergman~ und Mitarbeiter wahrseheinlieh maehen, dab das Substrat wghrend der Fermenteinwir- kung in der trans-Form vorliegt. Dies ergab sieh aus dem Befund, dab das Vorliegen einer freien Aminogruppe, die ffir die Aktion der Amino- peptidase unbedingt notwendig ist, den Wirkungsmechanismus der Carboxypeptidase st6rt. Dagegen wird die Fghigkeit des Fermentes giinstig beeinfluftt, wenn die freie Aminogruppe im Peptid mit einem RadikM gebunden ist, wghrend nattirlich die Carboxylgruppe am Carboxylende nieht besetzt sein darf. Zur Prfifung des sterisehen Verhaltens der Carboxyl0eptidase aus Carcinomen haben wir inzwisehen Versuehe mit geeigneten Subsganzen in Angriff genommenl

VII. Die biologische Bedeutung der d-Aminosiiureoxydase. Im Laufe unserer Untersuohungen hat sieh verschiedentlieh die

Notwendigkeit ergeben, die Wirkungsbedingungen sowie die physio- logisehe Bedeutung eines anderen Fermentes zu erforschen, dem im R~hmen des neuen Tumorproblems eine besondere Rolle zugesproehen wurde. Es handelt sieh um die d-Aminos~ureoxydase. Da hier bereits eine gewisse Kl~irung eingetreten zu sein scheint, sell diese Frage kurz besproehen werden. Man ging yon der Annahme aus, daft die Be- deutung dieses Ferments ffir den normalen Proteinstoffweehsel darin liege, den Einbau yon etwa im Stoffweehsel anfallenden d-Amino- sguren dureh 1Jberfiihrung in die optiseh inaktive Ketos~iure zu ver- hindern. Im Zusammenhang mit dem neuen Tumorproblem w t i r d e daher diesem Ferment eine wiehtige Belle zukommen. Eine Annahme derartiger Beziehungen schien zutreffend Ms sieh herausstellte, daft die unnatiirliehe Form der Glutaminsgure, die in den Proteinen der b6sartigen Tumoren in besonders hohem Prozentsatz a.ngetroffen wurde, yon allen d-Aminos~iuren am langsamsten und nut unvollstgndig desaminiert wird. Die Untersuehnngen an anderen Aminosguren haben jedoeh gezeigt, daft keine einfaehe Beziehung zwisehen der Gesehwindig- keit der Desaminierung der d-Aminosguren nnd ihrem Auftreten in Tumorproteinen besteht. 8o konnte z .B. d-Leuein aus den Eiweift- k6rpern der Tumoren isoliert werden, trotzdem es dutch das Ferment sehnell und vollstgndig in die Ketosgure tibergeffihrt wird. Da die Desaminierung nut in Leber und Niere gut meBbar ist - - der Tumor ist n~eh den bisherigen Fests~ellungen frei yon diesem Ferment - - mug angenommen werden, dab es sieh bier um einen zentralen Regulations- meehanismus handelt, der sieh aueh im tumorkranken Organismus

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente ~us Gewebeextrakten und Seren. 473

nieht ~nddrt; denn Untersuehungen an Nierengewebesehnitten yon krebskranken Tieren haben gezeigt, dal3 sie ebenso wie die Gewebe- schnitte des gleichen Organs yon Gesunden in der Lage sind, die d- l%rmen der Eiweil3bausteine zu desaminieren as*. Weiter ist noch yon Interesse, dab das d-Ferment in ein Peptid eingebaute d-Aminosguren naeh den bisherigen Erfahrungen nicht angreifen kann und somit aueh die im Carcinomprotein enthaltenen unnatiirlichen Aminos~uren nicht entfernen kanm Aueh dieser Befund sehr/~nkt natiirlieh die Bedeutung dieses Ferments fiir den Proteinstoffwechsel der Tumoren sehr ein.

VII I . Die Hydrolyse yon d.Peptiden dutch Serumenzyme.

Im AnschluB hieran so]len nun Versuche fiber die Hydrolyse yon d-Peptiden durch Serumenzyme besprochen werden. Wir haben uns bereits in einer frfiheren Arbeit 16 mit der bisher hieriiber erschienenen Literatur besch/~ftigt und festgestellt, dal3 die Ergebnisse ebenso wie die bei den Versuchen mit Organextrakten wenig einheitlich sind. Die meisten Autoren benutzten die Titrationsmethode nach Willstiitter und Waldschmidt-Leitz a6 bzw. Grassmann und Heyde 37 zum Nachweis der Peptidsloaltung. Nach den Untersuchungen yon v. Euler und Mit- arbeitern 8s, die die d-Peptide als Substrat brauchten, ist das Vorkommen yon d-Dipeptidase im Serum nicht spezifisch. Allerdings sell eine d- Peptidspaltung im Serum Krebskranker h~ufiger eintreten als in den iibrigen Seren. Im Gegensatz hierzu stehen Befunde yon /~. und R. Abderhalden 39 sowie yon H. Bayerle und G. Borger 4~ die keine Spaltung yon Glycyl-d-Leucin bzw. d-Leucylglycin dutch carcinomatSse oder normale Seren erhalten konnten. Dagegen fanden H. Bayerle und G. Borger, dab die Hydrolyse you d-Leueyig]yeylglycin durch Seren vSllig unspezifiseh ist. Bei diesen Autoren sowie bei von Euler und Mit- ~rbeitern fehlen abet Angaben fiber die optische Reinheit der verwandten l%ptide. Dies schr/~nkt' die Brauchbarkeit der Ergebnisse natiirlich ein. Auf d ie Wichtigkeit der l%tstellung der optischen l%einheit der Peptide haben besonders E. und R. Abderhalden a9 aufmerksam gemacht. Nach den Untersuchungen dieser Autoren wird optisch reines d-Leucy]glyeylglycin nur yon Carcinomseren gespalten. Da sieh bei der Herstellung der d-Peptide eft geringe Beimischungen der l-Kompo- nente nicht vermeiden lassen, haben E. Waldschmidt-Leitz und Mitarbei- teral versucht, die Beimengung an ]-Peptid durch Einwirkung yon Aminopeptidase aus Darmschleimhaut festzulegen. Diese Werte wurden dann jeweils yon den Versuchsergebnissen abgezogen. Sie fanden mit

* Anmer/cung bei der Kor~'e~tur: U. Westphal [Naturwiss. 30, 120 (1942)] hat allerdings vor kurzem unter anderen Versuchsbedingungen eine erniedrigende d-Aminoss in der Leber tumorkranker Ratten festgestellt. Es ist aber noch nieht sicher, ob dieser Befund spezifisch fiir Krebs ist.

Zeitschrift ffir Krebsforschung. 52. Bd. 32

~74 H. Herken:

der colorimetrischen Methode yon E. Z immermann 4">, ,,die l~eakt.ion von einigen noch zu kl~irenden Ausnahmen abgesehen spezifisch". Die Gr6Be der Hydrolyse dieses Tripeptids durch die Serumenzyme war erheblich geringer als die yon E. Waldschmidt-Leitz und K. Mayer~ 8 in friiheren Versuehen an Dipeptiden gemessene Spattung. Sie entspraeh in der I-IShe ungefghr derjenigen, die yon uns in einer friiheren Arbeit bei einigen Carcinomseren ermittelt wurden. Dagegen ist sieh heute die Mehrzahl der Autoren darfiber einig, dab d-Dipeptide durch die Enzyme yon Krebsseren nicht gespalten werden k6nnen. Diese Peptide verhalten sieh hier also v611ig anders als bei den Versuohen mit Organ~ extl~akten. Dies scheint in gewisser Hinsicht yon Interesse, da das Se- rum frei yon Carboxypeptidase sein soll ~4, yon der wir, wie eingangs erws vermuten, dab sie vielleieht fiir die Spaltung der d-Kompo- nente der Dipeptide verantwortlieh ist. Bei einer vergleichenden Be~ trachtung der mit Tripeptiden als Substrat erhaltenen Ergebnisse ergeben sich aber noeh verschiedene Differenzen, die zun/~chst nicht so leicht zu erkl~iren sind. So erhielten z. tL E. und R. Abderhalden s9 Hydrolyse- werte yon d-Leucylglycylglycin durch die Enzyme yon Careinomseren, die unsere mit gleicher Methodik gemessenen Spaltungen erheblich iibertreffen. Wit haben einen kleinen Teil unserer mit der manometrischen Methode erhaltenen Ergebnisse mit dem titrimetrischen Verfahren kontrolliert und zuns gut iibereinstimmende Werte gefunden. Die durch Titration mit alkoholiseher KOH gefundenen Prozentzahlen lagen meist etwas hSher als die manometrisch ermittelten. Im Verlauf der weiteren Arbeit stellte sich abet heraus, dab die Titrationsmethode oft sehr unzuverl~tssige Werte ]iefert. Um die Leistungsf~ihigkeit des titrimetrischen Verfahrens zum Naehweis yon d-Peptide spaltenden Fermenten im Serum zu priifen, hat daher Fr~Lulein H. Senhenn auf meine Bitte eine gr6Bere Anzahl yon Seren bei don verschiedensten Erkranknngen untersueht 4~, die aueh zur K1/trung der oben erw~hnten Differenzen beitragen sollten. Als Substrat diente in diesen Versuchen d, 1-Leucylg]yein sowie d- und d, 1-Leueylglyey!glycin. Wghrend d, 1, Leucylglyein in keinem Falle in einwandfreier Weise fiber 50 % hydrolysiert wurde, konnten bei Verwendung yon d, 1-Leueylglyeylglycin als Substrat in einigen Fallen Spaltungswerte bis zu 76% beobachtet werden. Eine Hydrolyse des raeemischen Tripeptids yon fiber 50 % wurde aber nicht nut bei Seren yon Krebskranken, sondern auch bei anderen Krankheits- bildern z. B. bei der Tuberkulose gefunden. Die bei den frtiher aufgeffihr- ten Versuehen gemachten Erfahrungen haben mich j edoch veranlaBt, diese Befunde in einigen F/~llen mit der manometrisehen Methode zu kon~ trollieren. Diese Uberprfifung der Versuche mit racemisehen Tripeptiden ergab, daB die den Wert von 50 % tibersteigende t lydrolyse nieht auf die Zerlegung des d-Anteiles zurfickgeffihrt werden kann (vgl. Tab. 8).

Hydrolyse yon d-Peptiden dutch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 475

Tabelle 8. Spa ] tung yon d , l - L e u e y l g l y e y l g l y c i n d u r c h Serumenzyme. P e p t i d k o n z e n t r a t i o n in al len Fal len m/25.

Serum I Tigrimetrisch I Manomebriseh

Acid. Zuwaehs % Spaltung 02-Verbrauch % Spalbung

1. Magen-Ca . . . . . . 1 1 , 4 0 4 7 0 ' 2 1 0 I 0 2. Rectum-Ca . . . . . 1,413 70,6 19,5 4,4 3. Tuberkulose . . . . I 1,53 76,5 [ 0 0 4. Tuberkulose . . . . . ] 1,32 60,0 ] 0 0

Die angegebenen Zahlen beziehen sich auf l~ngere Versuchszeiten (96--120 Stunden). Ers t dann t r a t eine Spaltung des raeemischen Tri- peptids yon fiber 50% auf. Die Differenzen zwisehen den mi t beiden Methoden erzielten Ergebnisse k6nnen mit groBer Wahrseheinliehkeit dadureh erkl/~rt werden, dab die neben Aminopolypept idase im Serum erhaltene Dipepgidase den nach der Spaltung des Tripeptids verbleiben- den Glyeylglieinrest welter zerlegg ~5. In weiteren Ti trat ionsversuchen wurde die I tydro lyse yon d-Leueylglycylglycin dureh Seren untersueht . Das verwendete d-Pept id war optiseh nieht ganz rein. Sowohl bei Ein- wirkung yon Aminopept iden aus der Darmschle imhant wie der Peptidase aus normalen Seren konnte in den Versuehen ein bestimm~er Aeidit/~ts- zuwaehs festgestellt werden, der eine Spal tung ":on 6 - - 8 % des einge- se tz ten Peptids entsprach. Obwohl sieh dieser Wer t an einer gewissen Anzahl yon Bes t immungen mit genfigender Sieherheit festlegen lieG, wurden naeh dem Vorsehlag v. E u l e r s s7 nu t solehe Versuehe als posit iv angesehen, die die Spal tung der beigemischten 1-Komponente mehr als 10% iiberstiegen. H . S e n h e n n erhielt unger Bertieksiehtigung dieser Einschr/~nknngen bei 5 yon 20 Careinomseren ein positiyes Ergebnis, Dies s t immt gut mi t den yon E. und R . A b d e r h a l d e n a9 erhaltenen Re- sultaten iiberein, die ebenfMls bei 25% der untersueh~en Krebsseren eine betr/~chtliehe t Iydro lyse yon d-Leucylglycylglyein fanden. Aueh hier wurde nun die S10altung des Tripeptids dureh Sernmenzyme in einigen F/~llen mit beiden Methoden gel0riift..

Tabelle 9. t I y d r o l y s e yon d -Leucy lg lyey lg lyc in . P e p t i d k o n z e n t r a t i o n m/20.

Titrimetrische 2~Ianome$rische Serum :Bestimmung. t~estimmung.

, % Spaltung* % Spaltung

1. Rectum-Ca . . . . . . . . 2. Magen-Ca. : . . . . . . . 3. Gallenblasen-Ca . . . . . . 4. Magen-Ca . . . . . . . . . 5. Tuberkulose . . . . . . . 6. Tuberkulose . . . . . . .

10 11 4 3 5 3,1

* Nach Abzug der im Peptid enthaltenen 8% 1-Form.

4,1 3,1 1,3 0 0

32*

47 6 H. Herken:

Aus der Tabel]e ist ersiehtlieh, dag es tatss bereehtigt ist, erst SpMtungsreste yon 10% und mehr bei Anwendung der Titrations- methode als positiv anzusehen. Wenn hierbei in manchen Fgllen eine d-Leueylglyeylglyeinhydrolyse dureh ein Careinomserum fibersehen wird, wie bei dem Serum des Gallenblaseneareinoms, so dfirfte dies gegen- tiber dem Fehler kaum ins Gewieht fallen, wenn niedrigere Werte Ms positiv angesehen werden. Dag die mit der Titrationsmethode gemessenen Spaltungen h6her liegen als die manometriseh mit Hilfe yon d-Amino- saureoxydase ermittelten, mag in diesen Fs neben den sehon bei der Spaltung des raeemisehen Tripeptids angeffihrten Grfinden aueh daran liegen, dab die methodisehe Fehlerbreite bei der Titration der freiwerdenden Carboxylgruppen doeh ziemlieh betraehtlieh ist. Das gleiehe seheint aueh f fir den Naehweis der Peptjdspaltung mit der eolorimetrisehen Nethode naeh/~. Z i m m e r m a n n 42 zu gelten, wie E. und R. Abderhalden 46 vor kurzem mitteilten. DaB aueh diese unspezifisehe" Nethode keine quantitativen Werte liefern kann, ergibt sieh aus dem oben Gesagten. Das Vorkommen yon d-Peptide spaltenden Fermenten in Seren yon Krebskranken hat abet nun deswegen so besondere Be- aehtung gefunden, well hierdureh die Erreiehung einer fibersiehtliehen Krebsdiagnose m6glieh sehien. Naeh den bisherigen Erfahrungen ist aber die praktisehe Brauehbarkeit des Verfahrens nut auGerordentlieh gering, wenn der Naehweis der Peptidspaltung mit der titrimetrisehen Methode geffihrt wird, da nut eine kleine Anzahl yon Fallen positiv reagiert. Es war daher noeh die Frage zu kls ob mit der empfindlieheren manometrisehen Methode bessere gesultate erzielt werden kSnnen. Bei unseren Untersuehungen fiber die Hydrolyse yon d-Leueylglyeylglyein dutch Serumenzyme hat sieh nun tatss herausgestellt, daG mit dieser Methode bei einer wesentlieh grSBeren Anzahl yon Careinomseren positive Ergebnisse erhalten wurden. In der folgenden Tabelle ist eine grSBere Anzahl yon Versuehen zusammengestellt; sie mag einen I)ber- bliek fiber einen Teil der bisher yon uns ermittelten Werte geben.

Bezeiehnet man nun auf Grund dieser Ergebnisse diejenigen Falle Ms positiv, die das Tripeptid in der H6he yon 1% und dariiber zu hydrolysieren vermoehten, so ergibt sieh, dab 56% der Careinomseren positiv reagierten. Bei den normalen und den fibrigen pathologischen SererL wurde dieser Weft in 3 F/~llen fibersehritten, also etwa in 9%. Zwisehen Normalseren und Careinomseren bestehen abet quantitative Untersehiede. Itydrolyse des Tripeptids yen fiber 1,5 % haben wir bisher nur bei Krebsseren gefunden. Auf diesen Befunden ls sieh abet meiner Ansieht naeh keine Krebsdiagnose aufbauen, da d-Leueylglyeylglyein spaltende Fermente im Serum sieherer Careinomfalle trotz mehrfaeher Untersuehung nicht naehgewiesen werden konnten, t t ierdureh wird die diagnostisehe Brauehbarkeit des Verfahrens natiirlieh sehr eingesehrs

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 477

Tabelle 10. S p a l t u n g d e r d - K o m p o n e n t e y o n d , l - L e u c y l g l y c y l g l y c i n d u r c h S e r u m e n z y m e * .

Peptidmenge Zeit Serma inin2 ccmmg Ansatzd" 2r in Std. % Spaltung

1. Rectum-Ca. mit Lebermetastasen

2. Rectum-Ca. mit Lebermetastasen

3. Rectnm-Ca . . . . . 4. Rectum-Ca . . . . . 5. Rectum-Ca . . . . . 6. Rectum-Ca . . . . . 7. Rectum-Ca . . . . . 8. Rectum-Ca . . . . . 9. Rectum-Ca . . . . .

10. Bronchia]-Ca . . . .

11. Bronchial-Ca., der- selbe Fall nach drei Wochen . . . . .

12. Bronchial-Ca . . . . 13. Bronchial-Ca . . . . 14. Magen-Ca . . . . . 15. Magen-Ca . . . . . 16. Magen-Ca . . . . . . 17. Magen-Ca . . . . . 18. Magen-Ca . . . . . 19. Magen-Ca. mit

Lebermetastasen 20. Magen-Ca . . . . . 21. Magen-Ca . . . . . 22. Magen-Ca . . . . . 23. Magen-Ca.mitMeta-

stasen . . . . . . 24. Gallenblasen-Ca. 25. Gallenblasen-Ca. 26. Gallengang-Ca. . . 27. Lungenmetastasen 28. Hodentumor mit

Metastasen . . . . 29. Mamma-Ca . . . . 30. Portio-Ca . . . . . 31. Portio-Ca. bestr. 32. Portio-Ca. bestr. 33. Sarkom am Ober-

&rill . . . . . . .

34. Unterschenkel- sarkom . . . . . .

0,350

0,350 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,350 0,560

0,350 0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,350

0,560

48

72 96 96 72 72 96 96 72 72

120

72 72 72 72 72 48 72 72

72 72 48 48

72 96 48 48 48

96 72 96 96 96

48

72

mg d. N. be- O~-Verbr. reclmet aus i~ cram O~-Verbrauch

13,4 0,0167

10,2 0,0128 0

18,2 0,0228 0 0

4,5 0,0056 5,8 0,0073 1,9 0,0024 5,8 0,0073

11,7 0,0146

10,3 0,0129 7,1 0,0089 0

15,6 0,0195 0 0

3,7 0,0046 0

7,0 0,0088 16,3 0,0204 0 0

18,3 0,0229 5,6 0,0070 5,0 0,00625 3,1 0,0039 5,0 0,00625

7,1 0,0089 0

5,9 0,00735 0 0

3,6 0,0045

0

* Ein Tefl der Ergebnisse wurde in der Z. physiol. Chem. 270, 201 6ffentlicht.

4,8

3,7 0

4,1 0 0

1,0 1,3 0,4 1,3 2,6

2,3 1,6 0

3,5 0 0

0,8 0

1,6 3,6 0 0

6,6 1,3 1,1 0,7 1,1

1,6 0

1,3 0 0

1,3

0

1941) ver-

478 H. Herken:

Tabelle 10 (Fortsetzung).

]?eDtidmenge m g d. N. be- Se rum in m g d. :K. Zeit O~-Verbr. rechnet aus % Spal tung

in 2 ecm Ansatz in Std. in cram O.~-Verbrauch

35. Norm. Serum 36. Norm. Serum 37. Norm. Serum 38. Norm. Serum 39. Norm. Serum

40. Grippepneumonie 41. Grippepneumonie 42. Grippepneumonie . 43. Lobiire Pneumonie .

44. Chron. Pneumonie 45. Chron. Bronchitis 46. Lungen-Tbe. . . 47. Lungen-Tbc. . . 48. Lungen-Tbe. . . 49 Lungen-Tbc . . 50. Herzinsuffizienz . 51. tIerzinsuffizienz,

Prostat~hyper-

t rophie .....

52. gerzinsuffizienz . 53. Magennleus . . . . 54. Magenuleus . . . . 55. Magenuleus . . . . 56. Magenuleus . . . . 57. Oesophagospasmus. 58. Chron.Kieferh6hlen-

entzt indung . . 59. Lymphat. Leuk~mie 60. An/imie .....

61. Nephritis .....

62. Nephritis .....

63. Nephritis .....

64. TerpentinabseeB. 65. Hi~molyt. Ikterus . 66. Ikterus (Stein) . 67. Ik terus . . . . . .

68. Res tempyem der Pleura . . . . . .

0,350 0,350 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,560 0,560 0,350 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 0,560

0,280

48 48 96 72 72

i20 96 48 96 72

120 48 44 72 72

120 48

120

72 48 72 48 72 96 48

120 44 48 96 4 8 48

120 96 96 72

120

96

0 0 0 0 0 ..

1,0 0 0 0

2,0 4,7 0

2,I 0 0 0 0

3,7

5,8 0

0 0 0

2,2 2,2

? 0 0 0

2,2 0

2,2 2,2

I

0,00125

0,0025 0,0059

0,00265

0,0046

0,0073

0,00175

0,00275 0,00275 0,0041

0,00275

0,00275 0,00275

0 0 0 0 0

0,2 0 0 0

0,4 1,1 0

0,5 0 0 0 0

0,8

1,3 0

O,3 0 0 0 0

0,5 0,5 1,2 0 0 0 0

0,5 0

0,5 0,5

D ie b e o b a e h t e t e P e p t i d h y d r o l y s e w a r i n a l l e n F/~llen n i e d r i g u n d er-

r e i c h t e ~ u e h n a e h l a n g e n V e r s u e h s z e i t e n (120 S t u n d e n ) n i e m a l s e i n e n

W e f t y o n 1 0 % , d e r be i d e n U n t e r s u e h u n g e n m i t d e r T i t m t i o n s m e - rhode,6 , 87, als u n t e r s t e G r e n z e f e s t g e s e t z t wa r . D ies k a n n a b e t n i e h t

Hydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextr~kten und Seren. 47 9

darauf zuriickgefiihrt werden, dab das abgespaltene d-Leuein zerstSrt und dadurch dem Nachweis entzogen wird, denn wir haben uns davon iiberzeugt, dal3 zum Serum zugesetztes d-Leuein aueh naeh langen Versuehszeiten quanti tat iv ,,wiedergefunden" wird4L Auch bei diesen Versuchen erhebt sieh wieder die Frage, ob.fiir diese Peptidspaltung besondere Peptidasen notwendig sind. Bekanntlich sind die im Serum vorkommenden d-Peptide spaltenden Fermente yon E. Waldschmidt- Leitz und Mitarbeitern 4s als Abwehrfermente angesehen worden, da es ihnen ge]ang, dureh Injektion racemiseher Peptide Abwehrfermente hervorzurufen. Dieser ]~efund konnte bisher nicht best~tigt werden ~% 5o 2~ueh wir haben uns davon fiberzeugt, dai3 dureh intravenSse Injektion versehiedener raeemischer Peptide weder spezifisehe Abwehrfermente erzeugt wurden, noch durch derartige Injektion das Angehen yon Benz- pyrentumoren beeinflul3t werden konnte*. Es ist demnaeh sehr zweifel- haft geworden, ob die Ansicht yon E. Waldschmidt-Leitz zu l~echt besteht. Im Verl~uf unserer Untersuchungen haben sich nun eine Reihe von Beobaehtungen ergeben, die eine andere Deutung mSglieh machen. Hierzu haben Versuehe mit einem anderen d-Peptid, und zwar mit d-Alanylglycylglyein den Anla~ gegeben.

Auf Grund der eingangs angeffihrten Versuche zur Kls der sterischen Spezifit~t der Peptidasen war zu erwarten, dal3 sich dieses Peptid vSllig anders verhalten wfirde als d-Leucylglyeylglycin. In ge- meinsamer Untersuehung mit R. Merten 51 konnte gezeigt werden, dal3 die d-Komponente yon d, l:A]anylglyeylglyein durch die in den Carei- nomseren enthaltenen Fermente sehr viel besser hydrolysiert wird als d-Leuey]glyeylglyein. Dieses Tripeptid ~ r d e aber auch yon nieht carcinomatSsen Seren in sts Mal3e gespalten. Weitere Versuche lieferten nun _~ha]tspunkte dafiir, dal3 eine gesteigerte t tydrolyse von d-AlanylglyCylglycin im Verlauf yon Ze]lzerfallsprozesse~i im K5rper auftr i t t und vielleicht a]s Ausdruck einer path01ogisehen Ver/~nderung im Fermenthaushalt des Serums angesehen werden kann. Unter- suchungen an norma]en Seren sowie solehen Fs in denen kein er- heb]icher pathologischer Befund erhoben werden konnte, ergaben, dab hier die Hydrolysewerte dieses Peptids sehr niedrig waren. Aueh bei Krankheitsprozessen, die bereits ls Zeit abgelaufen waren, wurden nut geringe Werte gefunden. Zur Bests dieser Ansicht wurden inzwischen noch weitere normale Seren und solehe yon Kranken mit Lungentuberkulose untersueht, d i e frische Einsehmelzungsherde ~uf- wiesen.

Es lii[3t sich auch im Tierversuch zeigen, daft die Fdhiglceit des Serums d-Alanylglycylglycin zu spalten zunimmt, wenn Zellen im KSrper zum Absterben gebracht werden. Unterbindet man bei einem Kaninchen

* Unver6ffentlichte Versuche.

480 It. Herken:

Ar te r ie und Vene einer Niere und b e s t i m m t die I-Iydrolyse des Pe p t i d s du tch die Se rumenzyme vor und nach der Operat ion, so erh/~lt m a n naeh dem Eingr i f f ans te igende Wer te . Dazu sei noeh bemerk t , dag das Kan inehense rum sehon normMerweise zu einer gr6Beren SpMtung yon d -Alany lg lyey lg lye in befs i s t als menschliehes Serum (vgl. Tab. 11).

"r~Selle 11. Sp&l tung de r d - K o m p o n e n t e yon d , l - A l a n y l g l y e y l g l y e i n d u t c h S e r u m e n z y m e .

Peptidmenge mg d. N. be- Serum in mg d . N . Zeit 02:Yerbr. rechnet aus % Spaltung

in 2 ccmAnsatz in Std. 0~-Verbrauch

1. NormM. Serum . . 2. NormM. Serum . . 3. NormM. Serum . . 4. Normal. Serum . . 5. Tuberknlose . . . . 6. Tuberkulose . . . . 7. Tuberkulose . . . . 8. Tuberkulose . . . . 9..Tuberkulose . . . .

0,560 0,560 0,560 0,560 0,560 ~28o 0,56o 0,560 0,560

48 48 72 72 72 96 72 72 72

0 2,1 2,3 4,9

22,6 29,1 26,2 37,2 24,3

0,0026 0,0029 0,006i 0,0283 0,0364 0,0328 0,0465 0,0304

0 0,5 0,5 1,1 5,0

13,0 5,9 8,3 5,4

Ebenso fanden sieh bei den verseh iedens ten E rk rankungen , die mi t einer Gewebeseh/~digung einhergehen, h6here H y d r o l y s e w e r t e dieses Pep t ides Ms bei no rma len (vgl. Tab. 12). N a n wi rd wohl n ieh t fehl- gehen, wenn m a n die hohen d -Alany lg lyey lg lye in -SpMtungen dureh Care inomseren ebenfMls Ms Folge yon Gewebenekrosen ansieht , d ie ja bei den b6sar t igen Gesehwii ls ten bekannt~ieh sehon frfih auf t re ten .

Tabetle12. Spa lbung de r d - K o m p o n e n t e yon d , l - A l ~ n y t g l y e y l g l y e i n d u t c h die S e r u m e n z y m e eines K a n i n e h e n s vor und naeh der O p e r a t i o n .

Versuehszeit 72 Stunden. Peptidmenge 0,560 mg d. N. in 2 ecru Ans~tz.

mg d. N. be- Serum O~-Verbrauch rechnet aus % Spaltung

in cram O~-u

I Kaninchen vor Operation . . . . . I 29,1

,, 4 Tage nach Operation : I 47,2 ,, 10 Tage nach Operation . 68,5

0,0364 0,0591 0,0855

6,5 10,5 15,3

~Tir e r innern in d iesem Zusammenhang , d a b H. P/ei/jer und Mit- a rbe i te r 52, sowie Grassmann und Heyde 4~ sehon fr t iher fes ts te l l ten, dab die F / ih igkei t des Serum, 1-Peptide zu spal ten, bei manchen E r k r a n - kungen zun immt .

I m Ansehlul3 h ie ran war nun noeh zu tiberlegen, ob die bei den Krebsse ren und einigen anderen pa thologischen Seren beobach te t e d- Leucy lg lycy lg lye in -Spa l tung ebenfal ls m i t dieser im Verlauf yon Zell- zerfal lsprozessen gefundenen ve r~nder ten F e r m e n t t ~ t i g k e i t in Zusam- menhang gebrach t werden kann. Wie wir bere i ts bei der Besprechung

Hydrolyse von d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 48 i

Tabelle 13. Hydro ly se yon d - A l a n y l g l y c y l g l y c i n durch Seren yon K r e b s k r a n k e n und a n d e r e n pa tho l0g i s chen F/~llen.

Peptidmenge 0,560 nag d. N. in 2 cem Ansatz.

mg d. N. be- Sel~Im Zeit O2-Verbr. rechneb aus % Spal tung

in Std. in cram 02-Verbrauch

1. Rectum-Ca . . . . . . . . . . . 2. Rectum:Ca . . . . . . . . . . . 3. )r . . . . . . . . . . . 4. Gallenblasen-Ca . . . . . . . . 5. Lungenmetastasen . . . . . . 6. Bronchial-Ca . . . . . . . . . . 7. Bronchial-Ca . . . . . . . . . . 8. Bronchial-Ca . . . . . . . . . . 9. Hodentumor mit Metastasen . .

10. 'Gallenblasen-Ca . . . . . . . . 11. Ikterus (Parenchymsch~digung

der Leber) . . . . . . . . . . 12. Akute lob~re Pneumonie . . . .

13. Chron. Pneumonic . . . . . . 14, Chron. Pneumonie . . . . . . 15. Grippepneumonie . . . . . . . 16. Gr!ppepneumonie . . . . . . . 17. TerpentinabsceB . . . . . . . . 18. Schrumpfniere . . . . . . . . 19. Cholecystitis (chron.) . . . . .

96 96 72 72 96 72 72 20 96 48 72 20 72 20 48 48 48 96 20 72 72

51,3 27,6 12,0 17,0 53,9 27,6 34,5 42,5 42,5 13,4 12,2 20,8 23,0 30,0

0 2,1 5,6

11,3 30,5 37,3 2,0

0,0643 0,0346 0,0150 0,0212 0,0675 0,0345 0,0432 0,0532 0,0532 0,0167 0,0153 0,0260 0,0288 0,0375

0 0,00263 0,0070 0,0141 0,0381 0,0467 0,0025

11,4 6,2 2,7 3,8

12,0 6,2 7,7 9,5 9,5 3,0 2,7 4,6 5,2 6,7 0

0,5 1,3 2,5 6,8 8,3 0,4

der Unte r suchungen mi t Org~nextrakten ausfiihrten, scheint es n icht

~usgeschlossen, dal~ d-Leucylglycylglycin m gewissem Umfange yon h6he- t en Konzen t r a t i onen der normMen Fermente angegriffen wird. I n ver- gMchendenUnte r suchungen lieB sich n u n zeigen, dab diejenigen Seren, die d-Leucylglycylglycin hydrolysieren konnten , d-Alanylglycylglycin

in hohem Mal~e spal te ten (Tab. 14). Diese Ergebnisse scheinen ffir die oben geiiugerte Vermutung zu

sprechen. Auf diese Weise lieB sich auch zwanglos erkls warum bei manchen Carcinomseren die d-Leucylglycylglycin-SpMtung fehlt. Es k6nnte sich hier u m Friihfi~lle oder kleine Carcinome handeln, bei denen die Zerfal lserscheinungen nicht bzw. noch nicht so ausgeprs sind. Wie die Untc r suchungen an anderen Seren zeigen, t r i ff t abet eine der- artig e Auslegung nicht ffir alle Fiille zu. So haben wir B. bei einigen Seren yon Tuberkulosekranken d-Alany]glycy]glycin-SpMtungen gemessen, die diejenige mancher Krebsseren noch fibertraf, wi~hrend die d-Leucylg]ycylglycin- t iydrolyse un te r 1% blieb oder in manchen F~l- len gar n icht nachweisbar war. E ine eindeutige Erk ls ffir dieses verschiedene Verhal ten der Seren k a n n noch nicht gegeben werden.

482

Tabelle 14.

H. Herken:

S p a l t u n g de r d - K o m p o n e n t e y o n d , l - A l a n y l g l y c y l g l y c i n u n d d , l - L e u c y l g l y c y l g l y c i n d u r c h S e r u m e n z y m e .

Peptidmenge 0,560 rag d. N. in 2 ccm Ansatz.

Serum

1. BronchiM-Ca . . . . . . . 2. Bronchial-Ca . . . . . . . 3. Bronchial-Ca . . . . . . . 4. Bronchial-Ca . . . . . . . 5. Gallenblasen-Ca . . . . . 6. Lungenmetastasen . . . 7. Hoden~umor . . . . . . 8. Akute Pneumonie . . . . 9. Herzinsuffizienz (Prostata-

hypertrophic) . . . . . . 10. Ikterus . . . . . . . . .

Zeit in Std.

d-Alanylglycylglycin

02-Ver- [ % Spal~ung branch I

r

120 72 72 72 48 48 96

1.20

1.20 72

24,4 29,0 24,5

1 5 , 5 13,4 16,9 42,5 30,0

12,2 12,2

5,4 6,5 5,5 3,5 3,0 3,8 9,5 6,7

2,7 2,7

d-Leucylglycylglyein

02-Ver- b rauch

11,7 10,3 7,1 7,1 5,0 5,0 7,I 4,7

3,7 2,2

% Spaltan~

2,6 2,3 1,6 1,6 1,i 1,1 1,6 1,1

0,8 0,5

M a n k a n n na t i i r l i eh an die M6gl ichke i t denken , d a b in den Se ren v o n

K r e b s k r a n k e n besonde re A k t i v a t o r e n der P e p t i d a s e n v o r k o m m e n , die

in den m e i s t e n a n d e r e n Se ren fehlen.

I n d i e s e m Z u s a m m e n h a n g sei auf die U n t e r s u e h u n g e n y o n E . M a s c h -

m a n n 5a hingewiesen , dab f i i r v e r s e h i e d e n e S u b s t r a t e ve r s eh i edene Me-

t a l l e als A k t i v a t o r e n d i e n e n kSnnen . So soll z. B. i m M e e r s e h w e i n e h e n -

s e r u m die S p a l t u n g y o n L e u e y l g l y e i n u n d L e u e y l g l y e y l g l y e i n d u r e h

Mangan , d ie y o n A l a n y l g l y e i n d u r e h M a g n e s i u m u n d die G l y e y l g l y c i n -

h y d r o l y s e d u r e h K o b a l t besonders g e f 6 r d e r t we rden .

Tabelle 15. S p a l t u n g yon d - A l a n y l g l y c y l g l y c i n d u t c h S e r e n yon M a g e n - k r a n k e n .

Peptidmenge 0,560 mg d. N. in 2 ccm Ansatz.

Q-Ye t - rag d. N. be- Sermn ~ Zeit b rauch rechnet aus % Spaltung

in Std. in cram 02-Verbrauch

1. Gastritis . . . . . . . . . . . 2. Gastritis . . . . . . . . . . . 3. Gastritis . . . . . . . . . . . 4. Magenulcus . . . . . . . . . . 5. ~agenulcus . . . . . . . . . . 6. Magenulcus . . . . . . . . . . 7. 5~agenulcus . . . . . . . . . . 8. ~r (ca~ll6s, penetrierend) 9. Magen-Ca . . . . . . . . . . .

10. ~agen-Ca . . . . . . . . . . . 11. ~agen-Ca . . . . . . . . . . . 12. 3s . . . . . . . . . . . 13. Magen-Ca . . . . . . . . . . .

72

72 72 72 72 96 96 48 72 72 72 72 48

1,5 0

1,4 5,9 5,9 7,2 6,5 7,9

10,5 11,5 14,4 18,7

0

0,0019

0,00175 0,0074 0,0074 0,009 0,0081 0,0099 0,0131 0,0144 0,018

i 0,0234 !

0,3 0

0,3 1,3 1,3 1,6 1,4 1,8 2,3 2,6 3,2 4,2 0

tIydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und 8eren; 483

Es wurde bereits gesagt, dal? die d-Leucylglycy]glycin-Spaltung dutch Serumenzyme ffir diagnostische Zwecke nicht herangezogen wer- don kann, weil zu h/~ufig siehere Carcinomf/~lle negative Resultate liefern. Die Messung der Itydro]yse yon d-Alanylglycylglycin kommt hierffir ebenfalls nicht in Betracht, well sie ,,unsloezifisch" ist. Es war aber noch zu Iortifen, ob die Spaltung dieses Pelotides neben den gebr/s lichen klinischen Untersuchungsmethoden in geeigneten F/~llen als diagnostisches ttilfsmittel hcrangezogen werden kann. Zur Kls dieser Frage wurde eine Reihe yon Magenkranken, die keine andere Organerkrankung aufwiesen, untersucht, wobei ich vorstehende Werte erhielt (Tab. 15) .

Nach diesen Befunden scheint hier keine scharfe Grenze zwisehen dem Magenulcera und den Carcinomen zu bestehen. Die Carcinom- seren liefern aber bis anf einen Fall die hfchsten Werte. Dlese wenigen Versuche lassen nattirlich kein absehliel~endes Urteil zu. Es dfirfte sich aber doch lohnen, der Untersuehung dieser Frage weiter nachzu- gehen. ES wird sieh hierbei vor allem als zweckms erweisen, die einzelnen F/ille in kfirzeren Zeitabsti~nden mehrmals zu untersuchen.

IX. Schlu/3bemerlcung. Bei der absehlieBenden Beurteilung der Versuche lgftt sich feststel-

len, dab bisher keine sicheren Beweise ffir das Vorhandensein sloezifischer d-Aminopeptidasen im Carcinom oder im krebskranken Organismus bei- gebrach~ werden konnten. Die ersten Untersuchungen an Krebsseren batten ergeben, dab d-Leucylglycylglycin in einem gewissen Prozent- satz hydrolysiert wurde. Es schien daher zun~chst eine gewisse Be- rechtigung Zu bestehen, die Existenz solcher Fermente anzunehmen, da seit ]~ngem bekannt war, dab dieses Tripeptid durch die nattirlichen Pep- tidasen nicht gcspalten wird. Im Laufe unserer Arbeit haben wir jedoch Anhaltslounkte daffir gewinnen kfnnen, dal~ gegen diese Auffassung in der allgemeinen Art gewisse Bedenken bestehen. Bevor aber hierfiber ein absehliel~endes Urteil abgegebcn werden kann, miissen noch andere Substrate, vor allem aueh grSl3ere Polypeptide untersucht werden. Die erhebliehen quantitativen Unterschiede, die sich bei den Versuchen fiber die IIydrolyse yon d-Leucylglycin und d-Leucylg]ycylglycin dureh Organextrakte gezeigt haben, machen klare Vorstellungen sowohl fiber den Abbau wie fiber den Aufbau eines grSgeren Eiweigmolekfils, in dem unnatfirliche Aminos/~uren vorkommen, sehr schwierig.

Wie man sich don abwcichenden B a u d e r EiweiBkSrper im Carci- nora zu denken hat, ist natfirlich noch nicht zu fibersehen. Die An- nahme, dab in einem Tum0rlorotein die 1-Ketten der entslorechenden normalcn EiweiBkfrpcr an versehiedenen Stellen durch d-Amino- s/~uren unterbrochen sind, kommt vielleicht der Wirkliehkeit am n/ich-

4 8 ~ H. Herken:

sten a4. Unsere Kenntnisse fiber die Bedingungen, unt, er denen die Pro- teinsynthese zustande kommt, werden noeh wesentlieh erweitert werden mfissen, um bier einen besseren Einbliek zu erhalten. Auf die Be- deutung yon Metallen und Cystein Ms Aktivatoren bei diesen katalyti- sohen Prozessen ist bereits hingewiesen worden. Es sei abet noeh angeftihrt, dab es neben diesen Akt iwto ren noeh solehe yon ganz anderer Art gibt , deren Anwendung in einigen Fglten tiberrasehende Ergebnisse lieferte. In diesem Zusammenhang sei an die merkwfirdige Beobaeh- tung yon O. K. Behrens und M. Bergmann ss erinnert. Bei Spaltungs- versuehen mit synthetisehen Substraten wie Glyeinanilid, Glutamin- sguremonanilid, G lyeylleuein, die dureh Papain nieht gespalten werden, fanden diese Autoren, dag diese Verbindungen von dem t~erment zerlegt werden, wenn Serum zugesetzt wurde, das abet allein ebenfalls nieht in der Lage ist, die oben genannten Substrate anzugreifen. Anf der Suehe naeh ghnliehen Aktivatoren wurden eine l~eihe yon Verbindungen bekannter Zusammensetzung gepriift. Dabei zeigte sieh, dab Aeetyl- phenylalanylglyein ebenfalls die Spaltung dieser Substrate dureh Papain aktiviert . Auf weitere Einzelheiten kann hier nieht ngher eingegangen werden. Der kurze Hinweis lgBt aber bereits erkennen, dab der Wir- kungsmeehanismus der proteolytisehen Fermente noeh augerordentlieh uniibersiehtlieh ist and rnit vielen MSgliehkeiten gereehnet werden mul3. Trotz der Sehwierigkeiten wird aber eine weitere Aufklgrung des Problems am ehesten yon Untersuehungen an Peptidasen zu er- warren sein, obwohI sie nut eine kleine Teilfunktion bei der Protein- synthese und Proteolyse erfiillen, da Versuehe mit Protein spaltenden Fermenten wegen der Sehwierigkeit der Besehaffung einheitlieher Substrate noeh weniger ~ibersiehtlich sind.

Zusammen/assung der Ergebnisse.

1. Die yon uns angegebene m~nometrische Methode zur Messung der d-Peptidspaltung, die zun~chst imr fiir die Serumversuehe benutzt wurde, eignet sich ~ueh ffir den quantit~tiven Nachweis der Hydrolyse yon d-Peptiden durch die in G]yeerinextrakten aus Geweben enthaltenen proteolytischen Fermenten. Eine Ausnahme hiervon maehen die Nierenextmkte. Die bei den Versuehen mit diesem Organ gemessenen d-Peptidsp~ltungen stellen Mindestwerte d~r.

2. Die d-Komponente yon rucemisehem Leucylglycin wird sowoht durch die aus C~rcinomen extrahierten Enzyme als auch dureh normale Organextr~kte hydrolysiert. Ein Zusatz yon l~etallen oder Cystein ~ls Aktivatoren der Peptidasen ist nicht erforderlieh. Vergle ichende Untersuehungen mit der Titrationsmethode und dem manometrisehen Verfahren ergaben, dab eine Sp~ltung eines r~eemischen Dipeptids yon 50% nieht nur der Zerlegung der ]..Komponente zugeschrieben

ttydrolyse yon d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeexbrakten und Seren. 485

werden kann, wie bisher auf Grund der 3/[essungen mit den ,,unspezi- fischen" Methoden (Titration der COOH-Gruppen, Aminostickstoff- bestimmungen nach van Slyke) allgemein angenommen wurde. EJnige Versuche sprechen daffir, dab beide Koml0onenten des racemisehen Leucylglycins gleichm/~l~ig angegriffen werden. Welches Ferment ffir die Hydrolyse des d-Dipeptids verantwortlich ist, konnte noch nicht gekls werden.

3. Die Vorstellungen yon M. Bergmann fiber die sterische Spezi- fits der Peptidasen werden erSrtert und in Versuchen mit Tripeptiden gezeigt, dal3 die Annahme, die Einffihrung einer d-Aminos~ure in ein Peptid hebe die Spaltung dureh die normalen Peptidasen vSllig auf, in dieser al]gemeinen Fassung nicht gfiltig ist. Ffir den Grad der sterisehen Hinderung ist die Ls der C-Kette der in das Peptid eingeffihr- ten d-Aminos/~ure aussehlaggebend. Hierdureh erkl~irt sich, dal3 d- Alanylglycylglycin durch die in den Organextrakten enthaltenen Fermente gut hydrolysiert wird. Dadurch werden Versuche yon M. Berg- mann best~tigt.

4. Die d-Komponente yon racemischen Leucylg]ycylglycin wird nach den bisherigen Feststellungen nur yon Extrakten aus Carcinomen und einigen normalen Organen (Milz, Leber und Niere) in einem gewissen Ausmal~ .angegriffen. Die niedrige Hydrotyse ist nicht auf eine Hem- mung durch Spaltprodukte aus dem 1-Anteil des Pep~ids zurfickzu- ffihren, denn d-Leucylglycylglycin wird rficht sti~rker hydrolysiert. Das d-Tripeptid verh~lt sich also vSltig anders als d-Leucylglyein.

5. Auf Grund der Versuchsergebnisse mit d-Leucylglycin und d- Leucylglyey]glycin verffigen daher die meisten Organe fiber Fermente, die aus theoretischen Grfinden auch d-Aminos~uren in ein Peptid einbauen k6nnen. Wenn die normalen Organprot.eine trotzdem l~eine unnatfirliehen Aminoss enthalten, so mul~ beriicksichtigt werden, dab hierbei noch andere Faktoren (z. B. Angebot von d-Aminosguren) eine wesentliche Rolle spielen.

6. Die Frage wird besprochen, ob der d-Aminosi~ureoxydase im gahmen des neuen Tumorproblems eine besondere I~olle zukommt. Nach den bisher gewonnenen Resultaten scheint dies nicht der Fall zu sein, da eine Desaminierung yon unnatiirlichen Aminosguren nur in der Leber und der Niere gut mel3bar ist. Es kann sich bier also hSeh- stens um einen zentralen ~egulationsmeehanismus handeln.

7. Vergleichende Unt, ersuehungen mit der Titrationsmethode und der manometrischen Messung fiber die Spaltbarkeit yon d-Tripeptiden dutch Serumenzyrne ergaben, dab die far die Beurteilung der Versuche wichtige Aufteilung des Peptids in d-Aminosi~ure und den Glyeyl- glycinrest titrimetrisch nieht quanti~ativ erfal3t wird. Da im Serum neben Aminopolypeptidase aueh Dipeptidase vorhanden ist, wird nach

486 H. tterken:

Abspaltung der d-Aminosgure auch der zurfickbleibende Dipeptidrest, hydro]ysiert. Die durch Titration ermittelten Werte sind daher zu hoch. Dieser Fehler maeht sich bei Anwendung raeemischer Tripeptide besonders st6rend bemerkbar.

8. Untersuchungen an einer grSl~eren Za.hl yon Seren zeigten, dab d-Leueylglyeylg]yein am besten durch die Enzyme yon Carcinom- seren hydrolysiert wird. Die beobaehtete Spaltung war jedoch in allen Fgllen nicht sehr groin. Fiir diagnostisehe Zwecke ist das Verf~hren nicht brauehbar, da zu hgufig siehere Krebsfglle negativ re~gieren.

9. Die d-Komponente yon d, 1-Al~ny]glyeylglycin wird dutch die Serumenzyme sehr viel besser gespalten als d-Leucylglyeylglyein. Die Hydrolyse ist jedoeh vSllig unspezifiseh. Zwisehen normalen und p~tho!ogischen Seren bestehen abet betr/~ehtliehe quantitative Unter- sohiede. Es konnten ]~eweise beigebraeht werden, da~ eine Steigerung der d-A]anylglyeylglycin-Hydrolyse im Serum als Folge yon Zellzer- fallsprozessen im K6rper auftritt.

10. Es wird besprochen, ob die im Serum beobachtete d-Leucyl- glyeylglyeinrHydrolyse ebenfalls als Ausdrnek grSBerer Gewebenekro- sen im ~)rganismus angesehen werden kann. Obwohl m~nehes be- felts fiir eine derartige Auslegung der Versuche spriebt, konnte jedoch noch kein absehliel~endes Urteil a.bgegeben werden.

11. Zur Prfifung der Frage, ob die d-Alanylglycylglyein-Spaltung im Serum neben den gebrguchlichen k]inisehen Untersuehungsmethoden als diagnostisehes Hilfsmittel mit her~ngezogen werden kann, wurde eine Reihe yon Magenkranken untersueht, die sonst keine Organerkr~n- kung aufwiesen. Die bis jetzt vorliegenden Ergebnisse liel~en keine seharfe Grenze zwisehen den M~genulcera und den Carcinomen erkennen. Die Seren yon Krebskranken lieferten allerdings bis ~uf einen Fall die hSehsten Werte.

Zur Aus/i~hrung der Versuche. Operationspr~parate oder Org~ne yon frisch getSteten Tieren wurden im

~I6rser mit Quarzsand zerrleben, ansch]iel~end mit 1 Tell Glycerin (87%) und 2 Teilen m/15-Phosphatpuffer (p~ = 7,4) versetzt und 24 Stunden unter h~ufigem Schfitteln bei 0 ~ extr~hiert. Lgngere Extr~ktion erwies sigh als unzweckmgl~ig und lieferte keine gr61]eren Fermentausbeuten. Der Gewebebrei wurde abzentri- fugiert und die fiberstehende Fliissigkeit, die die Fermente enthMt, fiir die Ver- suchsans/~tze verwendet. GrSl~ter Wert mul3 auf die Einhaltung steriler Versuehs- bedingungen gelegt werden. S~mtliche Glassachen und M6rser wurden im Trocken- schrank bei 160 ~ sterilisiert und naeh Abk~ihlung sofort ffir die Versuehe verwendet. Die l~essung des bei der Desaminierung eintretenden Oe-Verbr~uehes geschah in der yon O. Warburg 56 angegebenen Aploaratur. Die Gef~l~e waren kegeli6rmig mit seitlichem Anh~ng und Ventilstopfen. Im Inneren hatten sic einen Einsatz zur Aufnahme yon KOtt. Die Ansatze fiir die Fermentversuehe, die in kleinen Glasr6hrchen mit Sehliffstololen bei einer Temper~tur yon 37,5 ~ aufbewahrt wurden, hatten folgende Zusammensetzung:

Hydrolyse von d-Peptiden dutch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren. 487

a) 1,0 ecru Glyeerinextrakt, 1,0 eem PeptidlSsung und 2,0 cem Phosphat- puffer (0,15m p~ = 7,4). Die Konzentration und die Art des verwendeten Peptides ist aus den Tabellen ersiehtlich.

b) 1,0 eem Glyeerinextrakt und 3 ecru Phosphatpuffer (Leerversuch ohne Peptid).

e) Gleieher Ansatz wie a), nur wurde an Stelle des Peptids 1,0 ccm einer d-Aminos~urel6sung bekannter Konzentration zugegeben. Der Ansatz diente zur Testung der d-Aminos&ureoxydasewirkung. Damit sollte verhindert werden, dab durch Unwirksamkeit des desaminierenden Fermentes negative Werte vorge- t~uscht wurden.

In einigen F&llen wurden die Ans~tze 2real untersucht und in folgender Weise angesetzt:

a) 1,0 eem Glycerinextrakt, 2,0 cem PeptidlSsung und 2,0 ecru Phosphat- puffer (TH = 7,4).

b) 1,0 eem Glycerinextrakt und 4,0 ecru Phosphatpuffer Ms Leerversuch. c) G1eicher Ansatz wie a), an Stelle des Peptides 2,0 ccm einer d-Aminsiiure-

16sung bekannter Konzentration. Nach den in den Tabellen angegebenen Versuchszeiten wurden jeweils 2 ccm

der Ans~tze in die Wa~~ eingeffillt, in deren Einsatz 0,2 ccm 10% KOH einpipettiert war. Im seitliehen Anhang der Gef~Be befand sich 0,5 ccm der d-FermentlTsung, deren Herstellung weiter unten beschrieben wird. Die Mano meter und Gef~Be wurden mit reinem O 2 durchstrTmt. Der un te r b) angegebene Ansatz diente als Thermobarometer. Nach Temperatur und Druckausgleich kippten wir die d-Aminos~ureoxydaselTsung in den Hauptraum des Versudhs= gef~Bes ein und bestimmten den bei der Desaminierung eintretenden O2-Ver- braueh. Die Temperatur betrug bei diesen Versuehen 37,5 ~

In gleicher Weise wurden die Serumversuche durehgeffihrt. Die Ans/~tze waren in folgender Weise zusammengesetzt:

a) 0,5 ecru Serum, 1,0ccm PeptidlSsung, deren Konzentration aus den Tabellen hervorgeht. 1,0 cem Phosphatpuffer (m/i s 10H = 7,4).

b) 0,5 ecru Serum, 2,0 ecru Phosphatpuffer. Dieser Ansatz diente als Thermo- barometer.

Von diesen Ans/~tzen wurden 2 ecru in die WarbuT'g-Gef~,13e eingeffillt. e) 0,5 ecm Serum, 0,5 cem m/200 d-Leucin bzw. d-Alanin, 1,5 cem Phosphat-

puffer (Ansatz zur Aktiviti~tsprfifung des Fermentes). 2 ecru enthMtend 0,0280 mg d. N. wurden naeh den in den Tabellen angegebenen Versuchszeiten in die kegel- fSrmigen Versuehsgefi~Be einpipettiert. Die d-FermentlSsung wurde naeh Tem- peratur und Druckausgleich in den Hauptraum des Gef/~ges eingekippt.

Die Bereitung des Aeetontroekenpulvers geschah naeh den Angaben yon H. A. KrebsL Die Nieren wurden frisch (1/2 Stunde nach dem Tode des Tieres) in eiuer Latapiemfihle zerkleinert, mit der 6faehen Menge Aeeton versetzt und dann 15 Minuten gesehiittelt. Nach Absaugen des Aeetons auf einem Biichner- Filter wird der Brei noehmals mit der 6fachen Menge Aeeton versetzt und 4 Stunden bei 0 ~ im Eisschrank gehMten. Naeh Entfernung des Aeetons wird der Brei mit ]~ther naehgewaschen u n d ansehliegend im Vakuumexsiceator fiber Phosphot- pentoxyd getrocknet und bei 0 ~ aufbewahrt.

Herstellung der FermentlTsung ffir die Versuche: 1,5 g Acetontrockenpulver werden mit Quarzsand im MTrser zerrieben und mit 20 ccm Aqua dest. und 20 ccm Phosphatpuffer (mA5 io~ 7,4) versetzt. Die Suspension wurde 15 Minuten ge-. sehtittelt und dann zentrifugiert. Die fiberstehende Fliissigkeit wird dutch ein Faltenfflter gegossen. Ftir die Versuche wurden 0,5 ccm dieser FermentlSsung benutzt. Fiir die Gewinnung der d-Aminos/~ure0xydase k6nnen sowohl IIammel

4 8 8 H. Herken : Hydrolyse yon d-Peptiden.

wie Schweinenieren Verwendung linden. Da sieh bei den Fe rmen tp r~pa ra t en bereits nach 3 Wochen ein gewisser Akt ivi t~tsver lust bemerkba r machte, wurden naeh dieser Zeit s te ts neue Trockenpu]ver hergestel]t.

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Über die Hydrolyse von d-Peptiden durch Fermente aus Gewebeextrakten und Seren