Über die Permeabilität der roten Blutkörperchen für Malonamid

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    28-Sep-2016

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  • Uber die Permeabilitat der roten Blutkorperchen fur Malonamid I.

    vou Fritz Schonheyder.

    (Aus dem biochemischen Institut, Kopenhagen.) ( M i t 5 Fignren im Text.)

    Es ist im allgemeinen ancrkannt, daB die roten Blutkorperchen von einer Nembran umgeben sind, die fur Gase, Wasser, die meisten Anionen nebst einer Reihe von Nichtelektrolyten durchlassig ist - dagegen undurchlassig fur Kationen mit Ausntthme des Ammoniums. Die Durchlassigkeitsverhaltnisse der Blutkorperchen sind seit dem Jahr- hundertwechsel mehrmals Gegenstand fur Untersuchungen gewesen, um dadurch ein tieferes Verstandnis der Biologie der Zelle zu erzielen.

    Es mu6 wohl bemerkt werden, da6 die Auskunfte, die man durch Permeabilititsuntersuchungen auf Blutkorperchen erhalt, sich nicht ohne weiteres auf andere Zellen iiberfuhren lassen, ebenso wie man sicher vorsichtig sein muB, von den Verhaltnissen in vitro zu denen in vivo zu schlieBen.

    Arbeiten von Schis d t haben gezeigt, daB die Permeiergeschwin- digkeit fur NH4Br konstant sei. Indessen zeigte es sich, da6 eine Reihe von Faktoren, mie z. B. das Alter der Flussigkeiten und Manipulationen mit dem Blute und dessen Alter, die Geschwindigkeit nicht unbedeutend vergroBern konnte.

    Dieses Verhalten hat sich auch in eigenen Untersuchungen iiber die Permeiergeschwindigkeit NH4Brs in die Blutkorperchen bei einer Reihe Personen mit verschiedenen Krankheiten, wo das Blut nicht so- fort nach der Blutabnahme untersucht werden konnte, geltend gemacht.

    Die Entdeckung @rskovs3, daB Kohlensiiure die Permeier- geschwindigkeit der Ammoniumsalze durch die Membran sehr be- ___-

    Der Redaktion am 2. Juli 1934 zugegongen. S c h i s d t , Om Blodlegmmes Permeabilitet. Ksbenhavn 1931. Brskov, Pftugers Archiv. 1933. Bd. 231. S. 680. Bochem. 2. 1934.

    Bd. 269. S. 349.

  • 40 FRITZ SCHOSHETDER:

    dentend erhiiht, scheint, jedoch nun dieses eigentumliche Verhaltnis aufgeklart zu haben.

    Es lag daher nahe, die Diffusionsverhiltnisse eines anderen Stoffes zu untersuchen, und z u diesem Zmeck ist hier Ualonamid THzCUCH,CUNH, gewahlt worden. Dieses ist ein weiBer liristallini- scher Stoff - in Wasser rerhaltnismaBig leicht loslich, welcher in den angewandteii Konzentrationen und in der Zeit, die der Versuch dauert, scheinbar keine hamolysierende Einwirkuiig auf die Blutk6rperchen ausub t.

    Die Theorie und Technik der Methode. Bei den Untersuchungen ist die volumetrische Methode angewandt

    vrorden, wo die Blutkiirperchen in einer Liisung der vermeintlich diffusiblen Substanz aufgeschleiiimt sind. Im Blutkorperchen herrscht ein bestimmter osmotischer Druck, und da die Zellgrenzschicht fur mehrere der Stoffe innerhalb des Blutkorperchens (Hamoglobin, KaliuIu, Kalzium) undurchlassig ist, wird das Volumen der Blutkihperchen vom oihotischen Druck der AuBenflussigkeit abhangen. Wenn dieser groBer ist als der der Innenflussigkeit, wird das Blutkorperchen einschrumpfen, wenn er kleiner ist, wird es schwellen.

    Die diffusible Substanz der AuBenflussigkeit wird in das Blub korperchen eindringen, hierdurch steigt der osmotische Druck und das Blutkorperchen wird grijBer, du eine momentam Wasserverschiebung stslttfindet. TVenn der Stoff langsam permeiert, kann man der Schwellung durch Hamatokritbestimmungen folgen, die, wie von Ege und Schisd t nachgewiesen, ein genaues Blutkorperchencolumen ergeben. Wenn die Blutkorperchen um etwa 50 Proz. angeschwollen sind, tritt die Hamolyse ein, die in ausgedehntem MaBe als indirektes Kriterium der Permeabilitat der Blutkorperchenhulle fur den betreffenden Stoff ver- wendet wird. Die Zeit bis zum Eintritt der Hamolyse wird fur quanti- tative Messungen der Permeiergeschwindigkeit verwendet.

    Die Hamolysenmethode ist mit einer Reihe von Fehlerquellen be- haftet, da die Hamolysengrenze, d. h. das Volumen, bei welchem die Hamolyse eintritt, fiir die verschiedenen Systeme verschieden ist. Sie ist abhangig von der Wasserstoffionenkonzentration, Tom Alter des Blutes und ist fur verschiedene Personen veruchieden, auBerdem tritt die Himolyse nicht in allen Blutkorperchen gleichzeitig ein, indem 10 bis 15 Proz. weniger resistent, 80 bis 90 Proz. mittelresistent und 5 bis 10 Proz. hochresistent sind, d. h. sie konnen das Anschwellen zu einem groBeren Volumen vertragen. Die Hamolysengrenze ist, wie von Ege angedeutet, auch von der Schwellungsgeschwindigkeit abhangig. AuBerdem konnen Spontanhamolyse und Destruktionshamoljse storend einw irken.

  • PERMEARILITXT DER ROTEX BLUTK~RPERCIIICS. 41

    Fur diese Arbeit wurde ungefahr die Technik geaiihlt, die von S c h i s d t fur die Untersuchungen uber die Einwanderung Ammonium- bromids in die roten Blutkorperchen ausgearbeitet ist, mo man die Schwellung in einem phusphatgepufften Sjstem mit passender Molaritat verfolgt, so daB das Endvolumen die Hamolj-sengrenze nicht erreicht. Eine ahnliche Methode ist 1-011 Mond verwendet worden. Als ein Aus- druck fur die Permeiergeschmindigkeit hat Sc h i sd t die Diffusions- konstante K bestimmt, d. h. die Stoffmenge, die in der Zeiteinheit eine Flacheneinheit passiert beini Konzentrationsfall 1. Diese GroBen sind infolge der Detiiiition unter den gegebenen Versuchsbedingungen konstant.

    h7 kann man vun einem Versuch zum anderen vergleichen, sie ist aber nur eine relative GroBe und pratendiert auch nicht mehr zu sein. Zi faBt in einer Zahl alle Zeit- und Tolumeneinheiten unter gegebenen Umstanden zusamnien. Die Diffusionskonstante wird nach der Gleichung von Sch i sd t ausgerechnet, die aus dem Gesetz von Fick fur Diffusion abgeleitet ist,.

    2: die Zeit nilch dem Anfang des Versuches. 1.6: Anfangsvolumen oder illininiumsvolumen. V8: Endvolumen. P: Volumen bis zur Zeit T. X: die disperse Phase des Blutkorperchens (= 50 Proz.) s. u.

    Diese Gleichung dient der Berechnung von der Permeiergeschwin- digkeit eines einzelnen Stoffes, wenn gleichzeitig so vie1 impermeier- bare Substanz in der AuBenflussigkeit vorhanden ist, daB das End- volumen die Hamoljsengrenze nicht erreicht.

    Es murde ausschlieBlich mit Menschenblutkorperchen gearbeitet, teils von gesunden, teils von kranken Individuen.

    Das Sj-stem besteht aus 15 ccm halbmolarem (5.1 Proz.) Malon- amid + 15 Gem einer Lijsung indiffusibler Substanz, die 5 ccm Phosphat- puffer (prim. Kaliumphosphat 2. I 8 g, sek. Satriumphosphat 16 e 3 g, kohlensaurefreies destill. Wasser bis 1 1, pIr: 7-53), und 10 ccm 1.8 Proz. NaCl enthat + 0 - 6 ccm etwa 20 Proz. Zitratblut. Der Ver- such geht immer bei 20 vor sich, indem sich die Kolbe mit dem ge- nannten Sjstem unter standigem Herumschiitteln in einem Thermostat mit dieser Temperatur befinde t. Die Volumenmessungen werden mittels den sorgfiltig kalibrierten Hamatokritrohren von Hamburge r unter- nommen, die von Zeit zu Zeit mit 2 ccm - mit einer Pipette aus dem Inhalt der Kolbe im Wasserbade entnommen - gefiillt werden. Nach bis 1 Stunde sind die Blutkorperchen bis zur Lackfarbe und hierdurch bis zum konstanten Volumen zentrifugiert worden. Notwendig

  • 42 FRITZ SCHONHETDI:R :

    ist es, die Hamatokritriihre mit Deckgllsern, die mit Hahnenfett ein- geschmiert sind, zu bedeckeii, da mail dadurch das Herausschleuderu des Inhalts beim Ingangsetzeii der Zeiitrifuge verhiiidert.

    V0 wird dadurch hestimmt, daB maii den Versuch bei Oo Tor sich gehen laBt, bei welcher Temperatur die Permeiergeschwindigkeit sehr gering ist, uiid wo deshalb Estrapolatioii zum Aiifaiigswert mit gro6er Geiiauigkeit Forgeiiommeii iwrden kaiiii.

    V, ist im erwahnten Sj stem gleich dein Werte, deli mail theoretisch zu findeii erirarteii muBte, d. h. deli Volumeiiivert, deli man beim Zu- satz roil geiiau soriel Wasser wie Maloiiamidlosuiig zum Sj-stem fiiidet. Diesen \\'ert hat man deli Wasserwert genaiint. IVeiiii das Eud- volumeu deli Wasserwert erreicht hat, ist die Koiizeiitratioii der im- permeierbaren Substaiiz in AuBeii- uiid Iiiiieiiflussigkeit dieselbe, uiid die permeierbareii Substanzeii im Gleichgewicht.

    Es hat sich ergebeii, daB der Wasserwert stundenlaiig koiistaiit ist. DaB das Endvolumen gleich dem Kasserwert ist, daB dieser kon- stant ist, und daB die Scliiwllungskurve der Gleichung folgt, bedeutet, da8 trotzdem im System Ionenwanderungen zwischen AuSen- und Innenflussigkeit wiihrend des Versuches vor sich gehen; so geschehen doch keine solchen Volunieninderungen, daR die Schwellungskurve fur Malonamid kompromittiert wird. Die Schmellungskurve gilt deshalb fur Malonamid allein.

    Die Ionen, von welchen hier die Rede sein kann, sind die Phosphat- und Chlorionen der AuBenfliissigkeit und die Phosphat-, Bicarbonat- und Chlorionen der Innenfliissigkeit.

    Nond und Hoffmannl haben die Diffusion einer Reihe Yon Nichtelektrolyten, u. a. Malonamid, untersucht, und finden fur diesen Stoff und fur Laktomid, daB der Wasserivert nicht erreicht wird. Sie meinen, dieser Unterschied riihre von einer Schadigung der Blut- korperchenhulle her, wodurch Elektrolyten ron der Innen- zur AuBen- fliissigkeit permeieren konnen. Diese Forscher haben indessen Rinder- blutkorperchen untersucht, von denen man nicht ohne weiteres zu Menschenblutkorperchen schlieBen darf. Die Angaben M o n d s und Ho ffmanns haben sich fiir Menschenblutkorperchen nicht bestatigen lassen.

    Es hat sich als ein groJ3er Vorteil erwiesen, NaCl und Phosphat- mischung in der AuBenfliissigkeit zu haben. Eine Reihe von Versuchen sind ausschlie6lich mit dem obenerwiihnten Phosphatpuffer als einziger indiffisibler Substanz vorgenommen ; das System scheint jedoch fur Untersuchungen iiber die Permeierverhlltnisse ungeeignet zu sein.

    Mond nnd Hoffmann, Pfliigers Archiv. 1928. Bd. 219. S. 467.

  • PERMEABILIT~T DER ROTEX BLUTKORPERCAES. 43

    v, und der Wasserwert sind inkonstant. Die Schwellungslturve zeigt ein plateau und danach eine ,,Sachschmellungii, es ist daher unmiiglich, einen befriedigenden A-Wert auszurechnen. Siehe iibrigens Schisd t I.

    Dieses Verhaltnis scheint indessen keine Rolle zu spielen, wenn B / ~ der Phosphatmischung mit 1-8 Proz. NtlCl ersetzt wird. Ebenso wie Schiedt habe ich gefunden, daB die Menschenblutkorperchen in 0.9 Proz. NaC1 ein konstantes Volumen einnehmen, im Gegensatz zu denen der Kaninchen (E g e ').

    0 7 -

    lr0 )-'--

    770

    700

    9u

    1 A i 7 & # 5 0 & 7 U d b b

    Fig. 1. Ordinatenachse: Volumen in Proz. des Volumens in war burg-Fliissigkeit. Abszissenachse: Die Zeit nach dem Anfang des Versuches in Minuten.

    Aufgezeichnete Kurve: Werte nach der S chisd t schen Gleichung berechnet. Versuch 1. @ Versuch 2. x Versuch 3.

    V, 3 86. V, = 113. h'= 5 .5 .

    Einige Versuche seien hier angefuhrt. System: 15 ccm Malonamid + 10 ccrn 1.8 Proz. NaCl + 5 ccm t : Minuten nach dem Anfang des Versuches. 7: Gefundene Volumen in Prozent vom Volumen in Warburg- V,: Volumen nach der S c h i e d t schen Gleichung berechnet.

    (Slmtliche Volumenwerte werden in Prozent des Volumens in Warburg - Chris tensen S-Fliissigkeit umgerechnet. K wird dadurch gefunden, daB man K T aus der Schiedtschen Gleichung durch Ein-

    Phosphatpuffer + 0.6 ccm Blut..

    Flussigkeit.

    V, = 86. V, = 113. K = 3.5.

    Schisdt , 1. c. p. 100. R. Ege . Studier over Glukosens Fordeling. Disp. Kebenhavn 1919. Christensen og Warburg, Hosp. Tid. 1928. Vol. 71. p. 1207.

  • 44 FRITZ SCHOSHEYDER:

    setzeii von Po und Vs samt r-erschiedener V-Werte 90-95-100 usw. ausrechnet. Durch Variation yon K kanu man eine Reihe von Iiuryen aufzeichnen, und die Kurre, die den meisten im Versuch gefundenen Yolumina entspricht, hat eben den K-Wert, den wir suchen.) 1. Datum: 4. I. 1934. M. C. C. Rlann. 48 Jahre. Iirankheit: Hernia

    2. Datum: 7. I. 1934. 1;. 3 h n . 25 Jahre. Kranliheit: Fract. columnae.

    3. Datum: 7. I. 1934. J. Xann. 19 Jahre. Gesund. Alter des Blutes:

    ing. dx. Alter des Blutes: 7 Stdn. Wasserwert: 1131/2.

    Alter des Blutes: 6 Stdn. \Vasserwert: 11 1 3/i , .

    1 1 Stdn. IVasserwert : 11 3.

    t v, _ _ _ _ ~ ~ _ _ - -- ~- 8iJi4

    ~ 901/, 9 9511, 15l/+ 991,4 25 103l, 37 109'/,

    73 113 180 115

    1260 113

    58 I 111'19

    p;, I t 87'!, 2 ~ 87'1, 913!, 31/4 1 90

    99'1, 12s/4 1 9?'/, 103'/, 22 ' 103 107 301,', 1 1041/2 I10 35 ~ 107'/,

    953/, 7 ~ 94

    1111/* 45 1 1081/, I 121/* 551/, ' 1 LO 113 83 112l/%

    115 1 112'/* 290 i 113 --__

    1093/4 1 112 1 112l/,

    113 auf Fig. 1 abgebildet I auf Fig. 1 abgebildet @

    Versuch 3

    273/; 105 3S3//, 1063/r

    60 111 78 112'1,

    47 1083,4

    auf Fig. 1 abgebildet x

    Xan sieht gute ubereinstimmung zwischen den gefundenen und berechneten Werten; K ist also 3.5.

    Die Bedentnng einer Beihe von Faktoren. Wie oben erwahnt, kann eine Reihe von Faktoren K fur die

    Ammoniumsalze andern. Es liegt daher nahe, die Permeabilitat der Membran Malonamid gegenuber zu untersuchen. Die Blutentnahme hat sich ohne Bedeutung erwiesen, ebenso wie es gleichgultig gewesen ist, ob das rerwendete Blut Zitrat- oder Oxalatblut war, oder mit 0.9 Proz. NaC1 griindlich ausgewaschen wurde.

    Die Zeit von der Blutentnahme bis zum Beginn des Versuches hat innerhalb der ersten 36 Stdn. K nicht beeinflu6t. Bei verschiedenen Versuchen sind die Blutkorperchen vor dem Zusatz zum System griind- lich geschiittelt worden, was keine Bnderung von K zur Folge gehabt hat. Man hat untersucht, welche Wirkung der Zusatz kleiner Mengen NaHCO, ausuben konnte. Zusatz ron 2-4-6-ctg. NaHCO, zum oben-

  • PER~ABILITAT DER ROTEX BLUTK~RPERCHES. 45

    e m a n t e d System (eine Nenge, die die Permeiergeschmindigkeit SH,Brs betrbhtlich beeinflufit) hat absolut lieine Einwirkung auf die Permeier- gescbwindigkeit des Malonamids. Merliuricyanid, das sogar in sehr &hen Mengen die Eindringung von Gluliose yerhindert, hat lieinen EinfiuB auf Malonamid.

    Verschiedene Tierarten. Es liegen eine Reihe von Bestimmungen uber die Permeier-

    geschwindigkeit verschiedener Sichtelelitrolj+n in die Blutkorperchen verschiedener Tierarten vor (G r i j n s 2, K o z a w a 3, 11 on d und G e r t z d)), zuletzt von Hober und Brsli0v5, der mittels der von Net te r und Brskov angegebenen Photozellenmethode auch die Permeiergeschwindig- keit Malonamids in die Blutkorperchen verschiedener Tiere und Men- schen untersucht hat. Die relativen Hamolysenzeiten in Sekunden waren folgende: Ratte 600, Maus 106, Mensch 4100 (2800 bis 5400), Schwein 1680 (1500 bis 1800), Rind 3300 (3000 bis 3800), Dorsch 890 (810 bis 960), Taube 3900 (3600 bis 4200), Ente 6300 (5400 bis 7200), Huhn 3600.

    Jacobs hat verschiedene Eindringungszeiten unter T-erwandten Tierarten gefunden.

    Gesnnde und kranke Menechen. Es lag nahe, das Blut gesunder und kranker Xenschen im er-

    wahnten System zu untersuchen. Das Blut von etwa 50 Personen ist untersucht morden, teils im

    schon beschriebenen System, teils in solchen, die spater besprochen werden. Das Versuchsmaterial besteht aus einer Reihe gesunder Individuen und aus Patienten mit verschiedenen Krankheiten, wie z. B. sek. Anamien, Cancer-Anamie, eine einzelne Anaemia perniciosa, ein einzelner hamolytischer Ikterus und Bleivergiftung, und einige F U e von Ikterus verschiedenen Ursprungs.

    Von vornherein war es nicht ausgeschlossen, daB man quantitative Versehiedenheiten finden konnte, urn so mehr,...

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