UJI TOKSISITAS & NILAI LD50SJARIF ISMAILLaboratorium Farmakologi & Terapi Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman

Ada dua persyaratan penting yg harus dipenuhi agar OBA dapat diregistrasi di BPOM:Berkhasiat uji farmakologiAman uji toksisitas

Sebelum uji toksisitas dimulai siapkan data OBA yg akan diuji, yaitu: identifikasi, sifat OBA, dan rencana penggunaan penting utk meneliti berbagai efek yg berhubungan dg cara dan waktu pemberian suatu sediaan obat

Rencana lama dan cara pemberian OBA pada manusia bepengaruh pada lama dan cara pemberian OBA pada uji toksisitas

BPOM RI, 2005

Berdasarkan lama waktuUji toksisitas akut: dosis tunggal atau berulang selama 24 jamUji toksisitas Sub akut: 2 mg s/d 12 mgUji toksisitas jangka panjang : >12 mg

Uji Toksisitas KhususUji mutagenisitas.Uji karsinogenitasUji toksisitas sistem reproduksi & perkembangan janinUji toksisitas lokal

Tujuan Uji Toksisitas:Menentukan dosis lethal 50% (LD50).Mengetahui mekanisme dan target organ dari zat toksik yang diujiMenentukan rentang dosis (interval dosis) untuk uji berikutnya (uji farmakologi), toksisitas subakut dan kronik.Untuk mengklasifikasi zat uji, apakah tidak toksik, toksik atau super toksik

Klasifikasi Zat Berdasarka Nilai LD50

Lanjutan Tujuan Uji ToksisitasMengidentifikasi kemungkinan target organ atau sistem fisiologi yang dipengaruhiMengetahui hubungan antara dosis dengan timbulnya efek seperti perubahan prilaku, koma dan kematian.Mengetahui gejala-gejala toksisitas akut sehingga bermanfaat untuk membantu diagnosis adanya kasus keracunan.

Lanjutan Tujuan Uji ToksisitasUntuk memenuhi persyaratan regulasi, jika zat uji akan dikembangkan jadi obat.Mencari zat-zat yang potensial sebagai anti kanker, jika suatu zat memiliki LD50 < 1.000 mg/kgBB atau 1.000 ug/mL karena potensial sitotoksik.Untuk evaluasi keberbahayaan suatu zat melalaui data yang diperoleh seperti nilai slope dari grafik hubungan antara log dosis versus nilai-nilai LD.

Lanjutan Tujuan Uji ToksisitasMengetahui pengaruh umur, jenis kelamin, cara pemberian dan faktor-faktor lingkungan terhadap toksisitas suatu zat.Mengetahui variasi respons antar spesies dan antar strain serta memberikan informasi tentang reaktifitas suatu populasi hewan.Dengan diketahui LD50 dan ED50 dapat diperkirakan indeks terapi (untuk kurva respons efek dan lethal sejajar/paralel, jika tidak paralel LD1/ED50

Faktor-faktor yg mempengaruhi toksisitasSpesies & strain ADMEUmur ADMEStatus gizi enzim metabolismeLingkungan kolkisin & digitalis lebih toksik pada lingkungan panas, sdgkan antikolinesterase lebih toksik pada suhu yg lebih rendah.Jalur pemberian.Lain-lain: ac, kondisi kandang, aklimasi, penanganan, volume dosis, dll.

Uji Toksisitas AkutUntuk evaluasi keamanan dan prasyarat untuk uji farmakologi klinik atau uji klinik.Dosis yang diberikan bisa tunggal atau berulang dalam 24 jam dari suatu zat yg secara statistik diharapkan dapat membunuh 50% hewan uji.

Rancangan Uji Toksisitas AkutPemilihan hewan ujiOrientasi dosisPenentuan dosisCara pemberianFrekuensi pemberian & Jumlah zat yg diberikanPengamatan

Pemilihan Hewan UjiSpesies HewanSekurang-kurangnya dua spesies, yaitu rodent & non-rodent [BPOM, 2006].Paling tidak 2 jenis hewan uji rodentia (mencit & tikus putih) dan satu jenis non rodent (anjing & kera) [Natijan, 2006].Umumnya digunakan mencit & tikus ordo mamalia yang paling rendah, murah, mudah didapat & ditangani, terdapat banyak data toksisitas tentang hewan ini sehingga mudah untuk membandingkan toksisitas antar zat. Dari satu galur, sehat, dewasa, BB miripKelamin: jantan & betina: Jumlah Hewan: rodent minimal 5 ekor untuk tiap sex, non rodent minimal 2 ekor tiap sex

Orientasi DosisBertujuan mencari dosis yg kira-kira dapat mematikan 10% & 90% hewan uji.Untuk mencit & tikus, umumnya 2 ekor, diberi dosis 0.5, 5, 50, 500, 5000mg/kgbb.Untuk anjing & kera digunakan 1 ekor, berikan dosis tertentu berdasarkan penggunaan empiris, tingkatkan dosis 10 kalinya setiap hari hingga mati.Berikan dosis tsb utk anjing/kera lainnya untuk memastikan dosis tsb dapat mematikan.

Penentuan DosisMinimal 3 tingkatan dosis.Dapat dihitung jika diketahui dosis hasil orientasi mematikan sekitar 10 & 90% hewan uji, dosis ke-2 atau dosis ke-3 diantaranya dapat dihitung dg rumus: [log N/n =k.log a/n]N: Dosis mematikan sekitar 90% hewan ujiN: Dosis mematikan sekitar 10% hewan ujik: ragam 1 (k=jumlah kel. Tanpa kontrol)a: Dosis setelah n, dosis berikutnya stl a b=a2/n, dosis c=b2/n

Cara PemberianPemberian obat pada hewan disesuaikan dg penggunaan pada manusia.Hewan dipuaskan 8-12 jam sebelum pemberian zat uji, akses minum ad libitumBiasanya diberikan dg konsentrasi yang tetap dengan bermacam-macan dosis daripada berdasarkan volume tetap.

Frekuensi Pemberian & Jumlah Zat yang DiberikanDosis tunggal atau berulang dalam waktu 24 jam.Jumlah Zat yg diberikan tergantung jenis hewan yang digunakan.

PengamatanPengamatan hewan uji dilakukan pada jam ke-1, 2 dan 4 setelah pemberian dan setiap hari selama 7-14 hari.Catat jumlah hewan yg mati selama 7-14 hari.Mati < 3 hari faktor dosis langsung.Mati > 3 hari akibat kerusakan organ.Amati dan catat perubahan BB, pengurangan konsumsi makanan jika ada.Pemeriksaan kimia darah.Jika ada yang mati periksa PA jaringan.Buat grafik hubungan log dosis vs % respons LD50 dapat diketahui.

Cara Menentukan Nilai LD50Cara Farmakope Indonesia IIICara WeilCara Reed and MuenchCara Probit Bagian yang tidak lurus, respons kurang dari 84 dapat diluruskan dg memprobitkan sehingga memungkinkan untuk mendapatkan nilai LD1 dan LD99

Penghitungan NIlai LD50 Berdasarkan Metode ProbitDiperlukan Tabel ProbitTentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok uji.Tentukan log dosis tiap-tiap kelompok.Tentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dg log dosis, Y= mX + b. (m=slope; b=intercept).Masukan nilai 5 (probit 50% kematian hewan uji) pada persamaan garis lurus, pada nilai Y nilai LD50 dihitung dari nilai antilog X pada saat Y=5.

LATIHAN PENGHITUNGAN NILAI LD50Input data ini ke work sheet Excell

n DOSIS(mg)LogDOSIS(X)%MATINilaiPROBIT(Y)X2Y2XY41002020406080100Nilai SUM

Slope =(X)* (Y)-n (XY)[(X)]2 - (X2)

intersep=(X)* (XY)- (X2)* (XY)[(X)]2 - (X2)

n DOSIS(mg)LogDOSIS(X)%MATINilaiPROBIT(Y)X2Y2XY10410820163032406450Nilai SUM

Keterangan:SD: Standar deviasix: nilai tiap pengamatan: rata-rata: jumlahn: jumlah pengamatanSE: standar error