UMBILIKALNA KRV KAO UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MATIČNIH ĆELIJA IZVOR MATIČNIH ĆELIJA

HEMATOPOEZEHEMATOPOEZE

Doc. dr Dejan ŠkorićDoc. dr Dejan Škorić

MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZEMATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE

MMatične ćelije hematopoeze (MĆHatične ćelije hematopoeze (MĆH)) formiraju zrele formiraju zrele ćelije krvi i imune ćelije. ćelije krvi i imune ćelije.

Pluripotentne Pluripotentne MĆH MĆH (PMĆH) (PMĆH) su nediferentovane su nediferentovane ćelije koje imaju sposobnost ćelije koje imaju sposobnost samoobnavljanja, samoobnavljanja, proliferacije, diferencijacijeproliferacije, diferencijacije u pravcu raznih u pravcu raznih specijalizovanih ćelija krvi, specijalizovanih ćelija krvi, usađivanjausađivanja u u odgovarajuću mikrosredinu i odgovarajuću mikrosredinu i mobilizacijemobilizacije iz iz kostne srži (KS) u perifernu krv (PK). kostne srži (KS) u perifernu krv (PK).

PMĆHPMĆH su veoma retke jer je samo su veoma retke jer je samo 11 od 10.000 od 10.000 ili ili 15.000 ćelija sa jedrom u KS pluripotentna MĆH. 15.000 ćelija sa jedrom u KS pluripotentna MĆH. UU UK UK 11 od od 1000 ćelija 1000 ćelija sa jedrom je MĆH. sa jedrom je MĆH.

MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE Pluripotentne MĆH se diferentuju u Pluripotentne MĆH se diferentuju u pluripotentne pluripotentne

progenitoreprogenitore (PP), koji su i dalje pluripotentni, ali sa (PP), koji su i dalje pluripotentni, ali sa redukovanim potencijalom samoobnavljanja. Daljom redukovanim potencijalom samoobnavljanja. Daljom diferencijacijom iz njih nastaju diferencijacijom iz njih nastaju pluripotentni mijeloidni pluripotentni mijeloidni progenitori (PMP) progenitori (PMP) i i pluripotentni limfoidni progenitori (PLP).pluripotentni limfoidni progenitori (PLP). Od PMP i PLP nastaju progenitori opredeljeni za dve ili samo Od PMP i PLP nastaju progenitori opredeljeni za dve ili samo jednu lozu. Ovi poslednji se nazivaju jednu lozu. Ovi poslednji se nazivaju opredeljeni progenitori.opredeljeni progenitori.

Pluripotentne MĆH i progenitorske ćelije nisu morfološki Pluripotentne MĆH i progenitorske ćelije nisu morfološki prepoznate i jedini morfološki parametar kojim su ove ćelije prepoznate i jedini morfološki parametar kojim su ove ćelije definisane je, da pripadaju mononuklearnoj ćelijskoj definisane je, da pripadaju mononuklearnoj ćelijskoj subpopulaciji i da su veličine malog limfocitasubpopulaciji i da su veličine malog limfocita..

Daljom diferencijacijom opredeljenih progenitora nastaju Daljom diferencijacijom opredeljenih progenitora nastaju morfološki prepoznatljive ćelije, koje se nazivaju morfološki prepoznatljive ćelije, koje se nazivaju prekursorskeprekursorske ćelije i iz kojih sazrevanjem nastaju ćelije i iz kojih sazrevanjem nastaju zrelezrele krvne ćelije (Slika 1).krvne ćelije (Slika 1).

Fenotip Testovi

Morfološki pregledImunofenotipFunkcionalni testovizrelih celija

MCH

PP, PMP, PLP

Opredeljeni progenitori

Dendriticne celije

T-limfociti

Eritrociti

B-limfociti

Monociti /makrofagi

Granulociti

Trombociti(megakariociti)

NK celije

Lin- CD34+

CD38-

HLA-DRlow

Thy-1+ c-kit+

CD133+

Lin+/- CD34+

CD38+

HLA-DRhigh

Thy-1low

Lin+ CD34-

CRU/SRC

LTC-IC/CAFC

HPP-CFC

CFU-GEMM

CFU-GMCFU-GCFU-MBFU-ECFU-ECFU-Mk

Fenotip Testovi

Morfološki pregledImunofenotipFunkcionalni testovizrelih celija

MCH

PP, PMP, PLP

Opredeljeni progenitori

Dendriticne celije

T-limfociti

Eritrociti

B-limfociti

Monociti /makrofagi

Granulociti

Trombociti(megakariociti)

NK celije

Lin- CD34+

CD38-

HLA-DRlow

Thy-1+ c-kit+

CD133+

Lin+/- CD34+

CD38+

HLA-DRhigh

Thy-1low

Lin+ CD34-

CRU/SRC

LTC-IC/CAFC

HPP-CFC

CFU-GEMM

CFU-GMCFU-GCFU-MBFU-ECFU-ECFU-Mk

Slika 1. Šematski prikaz hematopoeze. Sa leve strane se nalaze uobičajene kombinacije antigena koje odgovaraju određenom stepenu diferencijacije, a sa desne strane su prikazani in vivo i in vitro testovi za identifikaciju MĆH, progenitorskih ćelija i zrelih ćelija krvi (preuzeto iz Lord i sar., Stem Cells, 1997).

Fenotipska identifikacija matičnih Fenotipska identifikacija matičnih ćelija hematopoezećelija hematopoeze

Humane pluripotentne i opredeljene MĆH imaju na Humane pluripotentne i opredeljene MĆH imaju na svojoj površini CD34 antigen. Ovaj antigen je svojoj površini CD34 antigen. Ovaj antigen je prisutan na 1-4% mononuklearnih ćelija (MNĆ) prisutan na 1-4% mononuklearnih ćelija (MNĆ) kostne srži i 1-2% MNĆ umbilikalne krvi (UK);kostne srži i 1-2% MNĆ umbilikalne krvi (UK);

CD34CD34++ ćelije predstavljaju heterogenu populaciju i ćelije predstavljaju heterogenu populaciju i među njima se nalaze: pluripotentne MĆH (oko među njima se nalaze: pluripotentne MĆH (oko 1-1-5%5%KS; KS; 10%10%-UK), progenitorske ćelije (oko 20%) i -UK), progenitorske ćelije (oko 20%) i nematične ćelije;nematične ćelije;

IZVORI MATIČNIH ĆELIJA IZVORI MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZEHEMATOPOEZE

Kostna srž (Thomas i sar., 1957)Kostna srž (Thomas i sar., 1957)

Periferna krv (Goldman i sar., 1979)Periferna krv (Goldman i sar., 1979) 90% Autolog90% Autolognnih TMĆH i 60% Alogenih su iz PKih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK

Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)

IZVORI MATIČNIH ĆELIJA IZVORI MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZEHEMATOPOEZE

Kostna srž (Thomas i sar., 1957)Kostna srž (Thomas i sar., 1957)

Periferna krv (Goldman i sar., 1979)Periferna krv (Goldman i sar., 1979) 90% Autologih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK90% Autologih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK

Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)

PODELA ALOGENIH TMĆH PREMA VRSTI PODELA ALOGENIH TMĆH PREMA VRSTI DAVAOCADAVAOCA

ssingeneingene –– davalac je identičan davalac je identičan blizanacblizanac

alogene od srodnog-podudarnog alogene od srodnog-podudarnog davaocadavaoca (30%)(30%)

alogene od nesrodnog-podudarnog alogene od nesrodnog-podudarnog davaoca davaoca (50-80% (50-80% – – KSKS i ili PK)li PK)

alogene od nesrodnog-nepodudarnog alogene od nesrodnog-nepodudarnog davaocadavaoca

(15-30% (15-30% → → UK)UK)

UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)

Gluckman i saradnici su 1988. godine izveli prvu Gluckman i saradnici su 1988. godine izveli prvu transplantaciju MĆH iz UKtransplantaciju MĆH iz UK u dečaka sa u dečaka sa Fanconijevom anemijom. Davalac je bila njegova Fanconijevom anemijom. Davalac je bila njegova HLA-podudarna sestraHLA-podudarna sestra (Gluckman i sar., 1989).(Gluckman i sar., 1989).

Početkom 90-ih, urađene su prve TMĆH iz UK od Početkom 90-ih, urađene su prve TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a 1992. i 1993. formirane su nesrodnih davalaca, a 1992. i 1993. formirane su prve prve banke za UKbanke za UK (Njujork, Milano i Diseldorf) (Njujork, Milano i Diseldorf) (Rubinstein i sar., 1993).(Rubinstein i sar., 1993).

Krajem 90-ih godina Krajem 90-ih godina uraurađeno je đeno je nekoliko stotinanekoliko stotina TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a započeto je TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a započeto je i intenzivno korišćenje UK za transplantaciju u i intenzivno korišćenje UK za transplantaciju u odraslih odraslih bolesnika (Laughlin i sar., 2001).bolesnika (Laughlin i sar., 2001).

UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat)

U toku 2004. godine, ustanovljeni su U toku 2004. godine, ustanovljeni su kriterijumi kriterijumi za indikacije i izbor uzoraka UK za TMĆHza indikacije i izbor uzoraka UK za TMĆH (Gluckman i sar., 2004).(Gluckman i sar., 2004).

U današnje vreme ima preko U današnje vreme ima preko 3350.00050.000 kriokonzervisanih uzoraka UK, dostupnih za kriokonzervisanih uzoraka UK, dostupnih za alogenu TMĆH. Pretraživanje uzoraka UK se vrši alogenu TMĆH. Pretraživanje uzoraka UK se vrši preko preko NetcordNetcord organizacije ( organizacije (WangWang i sar., 200 i sar., 20099).).

Do sada je ukupno urađeno preko Do sada je ukupno urađeno preko 1010000000 TMĆH iz TMĆH iz UK i oko UK i oko 20%20% alogenih TMĆH poslednjih godina alogenih TMĆH poslednjih godina urađeno iz UK (Gluckman i sar., 2010).urađeno iz UK (Gluckman i sar., 2010).

Prednosti UK kao izvora MĆH (1)Prednosti UK kao izvora MĆH (1)

Umbilikalna krv je neograničeno dostupan izvor Umbilikalna krv je neograničeno dostupan izvor MĆH.MĆH. Formiranjem banaka za UK, potencijalno Formiranjem banaka za UK, potencijalno neograničen broj uzorakaneograničen broj uzoraka UK može da se dugotrajno UK može da se dugotrajno skladišti u njima;skladišti u njima;

Nema rizika za davaoce umbilikalne krvi. Nema rizika za davaoce umbilikalne krvi. Ako se Ako se primenjuju uobičajene ginekološke procedure, prikupljanje primenjuju uobičajene ginekološke procedure, prikupljanje UK je potpuno UK je potpuno bezbednobezbedno po porodilju i novorođenče; po porodilju i novorođenče;

Umbilikalna krv je lako i brzo dostupan izvor MĆH. Umbilikalna krv je lako i brzo dostupan izvor MĆH. Zamrznuti uzorci u bankama za UK su godinama Zamrznuti uzorci u bankama za UK su godinama apsolutno apsolutno dostupnidostupni za TMĆH, za TMĆH, dok se gdok se godišnje se gubi iz registra odišnje se gubi iz registra (BMDW) oko (BMDW) oko milion dobrovoljnih davalaca KSmilion dobrovoljnih davalaca KS ili PK i to ili PK i to zbog bolesti, gubitka volje za donaciju ili smrti.zbog bolesti, gubitka volje za donaciju ili smrti.

Prednosti UK kao izvora MĆH (2)Prednosti UK kao izvora MĆH (2)

Redukovana incidenca i težina GVHD posle TMĆH iz Redukovana incidenca i težina GVHD posle TMĆH iz UK i pored HLA-nepodudarnostiUK i pored HLA-nepodudarnosti je posledica je posledica smanjenog smanjenog broja i imunske nezrelosti T limfocita i APĆ.broja i imunske nezrelosti T limfocita i APĆ. T limfociti su T limfociti su “devičanski” i (10-1000 puta) manje aloreaktivni od ćelija iz “devičanski” i (10-1000 puta) manje aloreaktivni od ćelija iz PK. Smanjena je produkcija Th1 citokina (IL-2 i INF-γ)PK. Smanjena je produkcija Th1 citokina (IL-2 i INF-γ), , što što doprinosi smanjenom kapacitetu T limfocita iz UK za Th1 doprinosi smanjenom kapacitetu T limfocita iz UK za Th1 citotoksični imunski odgovorcitotoksični imunski odgovor..

Smanjen rizik od transmisivnih virusnih infekcija. Smanjen rizik od transmisivnih virusnih infekcija. Novorođenčad se inficiraju Novorođenčad se inficiraju CMV i EBVCMV i EBV u toku intrauterinog u toku intrauterinog perioda (transplacentarno) ili perinatalno i infekcije su u perioda (transplacentarno) ili perinatalno i infekcije su u tom uzrastu retke (tom uzrastu retke (1%1%). Inficiranost CMV i EBV je velika (do ). Inficiranost CMV i EBV je velika (do 70%) kod starije dece i odraslih osoba. 70%) kod starije dece i odraslih osoba.

Nedostaci UK kao izvora MĆH (1)Nedostaci UK kao izvora MĆH (1)

Uzorci UK imaju manji broj MĆH u odnosu na kalem iz Uzorci UK imaju manji broj MĆH u odnosu na kalem iz KS ili PK.KS ili PK. Kalem iz KS ima Kalem iz KS ima 10 10 puta više CD34puta više CD34++ ćelija od ćelija od prosečnog uzorka UK, a kalem iz PK i do prosečnog uzorka UK, a kalem iz PK i do 100 100 puta više. puta više. Posledice su: povećano je odbacivanje kalema (od 7% do Posledice su: povećano je odbacivanje kalema (od 7% do 22%); produženo je vreme potrebno za obnavljanje 22%); produženo je vreme potrebno za obnavljanje granulocitopoeze (Ngranulocitopoeze (N>>500/mm500/mm33) (od 23 do 33 dana), i ) (od 23 do 33 dana), i trombocitopoeze (Trtrombocitopoeze (Tr>>20.000/mm20.000/mm33) (od 54 do 90 dana) i) (od 54 do 90 dana) i povećana je smrtnosti od posledica transplantacije povećana je smrtnosti od posledica transplantacije (transplant related mortality - TRM)(transplant related mortality - TRM) (od 20% do 44%) u (od 20% do 44%) u odnosu na TMĆH iz KS od nesrodnih, podudarnih davalaca. odnosu na TMĆH iz KS od nesrodnih, podudarnih davalaca.

Ćelijska doza je najznačajniji faktor za Ćelijska doza je najznačajniji faktor za prognozuprognozu TMĆH iz UK.TMĆH iz UK.

Minimalna ćelijska doza za TMĆH iz UKMinimalna ćelijska doza za TMĆH iz UK

• Deca: Deca: >> 3,7 x 10 3,7 x 107 7 NĆ/kg NĆ/kg• Odrasli: Odrasli: >> 2,0 x 102,0 x 107 7 NĆ/kg NĆ/kg

>> 1,7 x 10 1,7 x 1055 CD34 CD34++/kg/kg >> 4 x 10 4 x 1044 CFU-GM/kg CFU-GM/kg (Gluckman i sar., 2005)(Gluckman i sar., 2005)

Nedostaci UK kao izvora MĆH (2)Nedostaci UK kao izvora MĆH (2) Uzorci umbilikalne krvi imaju manji broj i redukovanu Uzorci umbilikalne krvi imaju manji broj i redukovanu

funkcionalnu aktivnost limfocita i antigen prezentujućih funkcionalnu aktivnost limfocita i antigen prezentujućih ćelija u odnosu na kostnu srž ili perifernu krvćelija u odnosu na kostnu srž ili perifernu krv.. Funkcionalna Funkcionalna nezrelost T limfocita nezrelost T limfocita povećeva rizik za nastanak povećeva rizik za nastanak teških teških infekcijainfekcija u ranom posttransplantacionom periodu. u ranom posttransplantacionom periodu. Incidenca Incidenca potencijalno fatalnih infekcija je značajno višapotencijalno fatalnih infekcija je značajno viša (sespa=55%) (sespa=55%) posle TMĆH od nesrodnih davalaca UKposle TMĆH od nesrodnih davalaca UK..

Umbilikalna krv se može samo jednom prikupljati – Umbilikalna krv se može samo jednom prikupljati – nema mogućnosti da se matične ćelije hematopoeze nema mogućnosti da se matične ćelije hematopoeze iliili limfociti ponovo prikupljaju od istog davaoca. limfociti ponovo prikupljaju od istog davaoca. U U slučaju recidiva maligne bolesti posle TMĆH iz KS ili PK, slučaju recidiva maligne bolesti posle TMĆH iz KS ili PK, moguće je ponovo prikupiti MĆH ili limfocite od istog moguće je ponovo prikupiti MĆH ili limfocite od istog davaoca i primeniti sekundarnu TMĆH (retransplantacija), ili davaoca i primeniti sekundarnu TMĆH (retransplantacija), ili indukovati antitumorski efekat putem infuzije limfocita indukovati antitumorski efekat putem infuzije limfocita davaoca. davaoca. UK se prikuplja samo jednom – neposredno posle UK se prikuplja samo jednom – neposredno posle rođenja deteta.rođenja deteta.

Primena UK u alogenoj TMĆH od nesrodnih Primena UK u alogenoj TMĆH od nesrodnih davalacadavalaca

Ključno pitanje: Ključno pitanje: kakvi su rezultati postignuti u lečenju dece kakvi su rezultati postignuti u lečenju dece i odraslih primenom UK u odnosu na KS i PKi odraslih primenom UK u odnosu na KS i PK

Hwang i sar., 2007. godine su objavili izuzetnu Hwang i sar., 2007. godine su objavili izuzetnu retrospektivnu studiju u kojoj su zaključili:retrospektivnu studiju u kojoj su zaključili:

1.1. Od Od 11241124 objavljenih radova samo objavljenih radova samo 66 mogu da se koriste u mogu da se koriste u komparativnoj analizi WCE i PltE, TRM, aGVHD i cGVHD, komparativnoj analizi WCE i PltE, TRM, aGVHD i cGVHD, RR, DFS i OS, posle primene UK (0-2 HLA-nepodudarnost) RR, DFS i OS, posle primene UK (0-2 HLA-nepodudarnost) vs. KS (6vs. KS (6/6 HLA/6 HLA-podudarnost);-podudarnost);

2.2. Produženo je vreme prihvatanja kalema (WCE i PltE) i Produženo je vreme prihvatanja kalema (WCE i PltE) i povećana je smrtnost od posledica transplantacije, ali je povećana je smrtnost od posledica transplantacije, ali je smanjen procenat relapsa i redukovana je incidenca i smanjen procenat relapsa i redukovana je incidenca i težina aGVHD i cGVHD, posle primene UK u odnosu na KS, težina aGVHD i cGVHD, posle primene UK u odnosu na KS, tako da nema statistički značajne razlike u DFS i OS (i za tako da nema statistički značajne razlike u DFS i OS (i za decu i za odrasle).decu i za odrasle).

Strategije za uvećanje ćelijske doze iz UKStrategije za uvećanje ćelijske doze iz UK

Poboljšanje metodologije prikupljanja i Poboljšanje metodologije prikupljanja i kriokonzervacije uzoraka UK;kriokonzervacije uzoraka UK;

Simultana transplantacija 2 uzorka UK – Simultana transplantacija 2 uzorka UK – dvostruka TMĆH iz UK;dvostruka TMĆH iz UK;

Ex vivoEx vivo ekspanzija MĆH iz UK; ekspanzija MĆH iz UK;

Primena kondicionog protokola sa Primena kondicionog protokola sa redukovanim dozama radio i/ili redukovanim dozama radio i/ili hemioterapije.hemioterapije.

Prikupljanje uzoraka UK Prikupljanje uzoraka UK –– određivanje određivanje hematološkog potencijalahematološkog potencijala

Adekvatno prikupljanje UK je neophodno za obezbeđivanje Adekvatno prikupljanje UK je neophodno za obezbeđivanje kvalitetnih uzoraka UK,kvalitetnih uzoraka UK, što podrazumeva uzorke sa što što podrazumeva uzorke sa što većim hematološkim potencijalom.većim hematološkim potencijalom.

Hematološki potencijal predstavlja sposobnost određenog Hematološki potencijal predstavlja sposobnost određenog kalema da kalema da obnovi hematopoezuobnovi hematopoezu i posredno se i posredno se odreodređuje na đuje na osnovu broja osnovu broja NĆ, CD34NĆ, CD34++ ćelija i opredeljenih progenitorskih ćelija i opredeljenih progenitorskih ćelija (CFU-GEMM, CFU-GM i BFU-E).ćelija (CFU-GEMM, CFU-GM i BFU-E).

Harris i saradnici (1994) su u fundamentalnoj studiji Harris i saradnici (1994) su u fundamentalnoj studiji prikazali da, prikazali da, bez obzira na metod prikupljanja UK, broj NĆ u bez obzira na metod prikupljanja UK, broj NĆ u jednom ml UK je uvek isti. To praktično znači da se jednom ml UK je uvek isti. To praktično znači da se prikupljanjem uzorka sa većom zapreminom, obezbeđuje prikupljanjem uzorka sa većom zapreminom, obezbeđuje veći apsolutni broj NĆ.veći apsolutni broj NĆ.

Prikupljanje uzoraka UKPrikupljanje uzoraka UK Optimalan i opšteprihvatljiv metod prikupljanja UK još uvek Optimalan i opšteprihvatljiv metod prikupljanja UK još uvek

nije ustanovljen.nije ustanovljen.

Dileme i pitanja u vezi procedure: Dileme i pitanja u vezi procedure: ko ko (ginekološko osoblje ili (ginekološko osoblje ili specijalizovani timovi), specijalizovani timovi), kadakada (pre porođaja placente ili posle (pre porođaja placente ili posle porođaja placente; rano klemovanje pupčanika ili odloženo), porođaja placente; rano klemovanje pupčanika ili odloženo), kako kako (putem gravitacije ili nekim drugim metodom) treba (putem gravitacije ili nekim drugim metodom) treba da prikuplja UK da bi dobio kvalitetne uzorke sa da prikuplja UK da bi dobio kvalitetne uzorke sa najvećom najvećom mogućom zapreminom i bez kontaminacije sa patogenim mogućom zapreminom i bez kontaminacije sa patogenim agensima i limfocitima porodilje.agensima i limfocitima porodilje.

Do sada je postignuta jedino saglasnost u vezi sa Do sada je postignuta jedino saglasnost u vezi sa korišćenjem korišćenjem zatvorenih sistema (setova)zatvorenih sistema (setova) za prikupljanje i za prikupljanje i delimična saglasnost o delimična saglasnost o ranom klemovanjuranom klemovanju pupčanika posle pupčanika posle porođaja deteta. porođaja deteta.

Prikupljanje uzoraka UK Prikupljanje uzoraka UK – metodi– metodi

• In uteroIn utero metod metod• Ex uteroEx utero metod metod• KombinovaniKombinovani metodmetod

In uteroIn utero metod metod Prikupljanje UK Prikupljanje UK in uteroin utero metodom se obavlja u toku trećeg metodom se obavlja u toku trećeg

stadijuma porođaja, tj. stadijuma porođaja, tj. neposredno po rođenju detetaneposredno po rođenju deteta, , a a pre pre porođaja posteljiceporođaja posteljice. Kese su postavljene ispod nivoa . Kese su postavljene ispod nivoa posteljice, što omogućava oticanje krvi iz posteljice i posteljice, što omogućava oticanje krvi iz posteljice i pupčanika u kese pod pupčanika u kese pod dejstvom gravitacijedejstvom gravitacije. Proceduru vrše . Proceduru vrše ginekolozi ili babice. ginekolozi ili babice.

Prednosti Prednosti in uteroin utero metoda: metoda: izbegavanje procesa koagulacije UK i stvaranja ugrušakaizbegavanje procesa koagulacije UK i stvaranja ugrušaka;; Izbegavanje moguće rupture posteljice i pupčanika u toku Izbegavanje moguće rupture posteljice i pupčanika u toku

porođaja.porođaja. Nedostaci Nedostaci in utreoin utreo metoda: metoda: veća mogućnost bakterijske kontaminacije uzoraka UK;veća mogućnost bakterijske kontaminacije uzoraka UK; proceduru obavlja ginekološko osoblje, čija je pažnja više proceduru obavlja ginekološko osoblje, čija je pažnja više

usmerena na porođaj. usmerena na porođaj. Većina autora je prikazala da je in utero metod efikasniji od Većina autora je prikazala da je in utero metod efikasniji od

ex utero metoda.ex utero metoda.

Prikupljanje uPrikupljanje uzzorakaoraka UK UK-uticaj -uticaj ginekologinekoloških faktoraških faktora

Na zapreminu uzorka UK pored Na zapreminu uzorka UK pored metoda prikupljanjametoda prikupljanja utiču i utiču i ginekološki faktori ginekološki faktori (Jones i sar., 2003; Askari i sar., 2005; (Jones i sar., 2003; Askari i sar., 2005; Solves i sar., 2005; Mancinelli i sar., 2006; George i sar., Solves i sar., 2005; Mancinelli i sar., 2006; George i sar., 2006).2006).

U svim studijama je potvrđeno da telesna U svim studijama je potvrđeno da telesna težina težina novorođenčeta (TT) i težina placente (TP)novorođenčeta (TT) i težina placente (TP) utiču na utiču na zapreminu i broj ćelija, tj. veća TT i TP obezbeđuju uzorke sa zapreminu i broj ćelija, tj. veća TT i TP obezbeđuju uzorke sa većom zapreminom i brojem ćelija.većom zapreminom i brojem ćelija.

Otkriveno je da na zapreminu uzoraka utiče i Otkriveno je da na zapreminu uzoraka utiče i dužina dužina pupčanika (duži pupčanik/pupčanika (duži pupčanik/↑↑v), broj prethodnih trudnoća v), broj prethodnih trudnoća (prvorođeno dete/(prvorođeno dete/↑↑v), gestacijski uzrast (duže trajanje v), gestacijski uzrast (duže trajanje trudnoće/trudnoće/↑↑v), način porođaja (Carski rez/v), način porođaja (Carski rez/↑↑v) i pol deteta.v) i pol deteta.

Kriokonzervacija uzoraka UK(1)Kriokonzervacija uzoraka UK(1) TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, zahteva efikasne TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, zahteva efikasne

procedure prikupljanja, obrade i procedure prikupljanja, obrade i kriokonzervacijekriokonzervacije (Wall i (Wall i sar., 2005).sar., 2005).

Namena različitih metoda (protokola) kriokonzervacije je Namena različitih metoda (protokola) kriokonzervacije je sprečavanje mogućih oštećenja ćelija tokom procesa sprečavanje mogućih oštećenja ćelija tokom procesa zamrzavanja i odmrzavanja (tzv. zamrzavanja i odmrzavanja (tzv. kriooštećenjakriooštećenja).).

Da bi se sprečio nastanak kriooštećenja, neophodno je Da bi se sprečio nastanak kriooštećenja, neophodno je odrediti odrediti optimalnu brzinu hlađenja i koncentraciju optimalnu brzinu hlađenja i koncentraciju krioprotektora,krioprotektora, jer su to dva glavna faktora koji utiču na jer su to dva glavna faktora koji utiču na preživljavanje zamrznutih ćelija (Balint i sar., 1999). preživljavanje zamrznutih ćelija (Balint i sar., 1999).

Brzina hlađenja može biti Brzina hlađenja može biti kompjuterski kontrolisanakompjuterski kontrolisana (programirano zamrzavanje) ili nekontrolisana (programirano zamrzavanje) ili nekontrolisana (neprogramirano zamrzavanje), a od krioprotektora se u (neprogramirano zamrzavanje), a od krioprotektora se u današnje vreme koriste jedino današnje vreme koriste jedino dimetilsulfoksid dimetilsulfoksid (DMSO) i (DMSO) i HES (Hunt i sar., 2006). HES (Hunt i sar., 2006).

Kriokonzervacija uzoraka UK(2)Kriokonzervacija uzoraka UK(2)

Protokoli kriokonzervacije UK su nastali od protokola Protokoli kriokonzervacije UK su nastali od protokola korišćenih za zamrzavanje matičnih ćelija KS i PK;korišćenih za zamrzavanje matičnih ćelija KS i PK;

Prilikom kriokonzervacije kalema iz KS ili PK nije neophodno Prilikom kriokonzervacije kalema iz KS ili PK nije neophodno da oporavak ćelija bude optimalan, jer obično u kalemu pre da oporavak ćelija bude optimalan, jer obično u kalemu pre kriokonzervacije ima „višak“ MĆH. kriokonzervacije ima „višak“ MĆH.

Suprotno od KS i PK, u UK se nalazi inicijalno mali broj MĆH, Suprotno od KS i PK, u UK se nalazi inicijalno mali broj MĆH, tako da je neophodno da kriokonzervacija bude tako da je neophodno da kriokonzervacija bude optimalna,optimalna, tj. da što je moguće veći broj ćelija preživi zamrzavanje.tj. da što je moguće veći broj ćelija preživi zamrzavanje.

Kriokonzervacija uzoraka UK(3)Kriokonzervacija uzoraka UK(3) Donaldson i saradnici (1996) su prvi objavili Donaldson i saradnici (1996) su prvi objavili komparativnukomparativnu

studiju u kojoj su vršili kriokonzervaciju uzoraka UK sa studiju u kojoj su vršili kriokonzervaciju uzoraka UK sa različitim koncentracijama DMSO-različitim koncentracijama DMSO-aa, u kombinaciji sa , u kombinaciji sa različitim brzinama hlađenja. različitim brzinama hlađenja.

Zaključili su da je Zaključili su da je kompjuterski kontrolisana brzina hlađenja kompjuterski kontrolisana brzina hlađenja od 1 od 1 do 2 do 2 ºC/min, kao i koncentracija DMSO-a od 5% do ºC/min, kao i koncentracija DMSO-a od 5% do 10%,10%, odgovarajuća za adekvatan oporavak CD34 odgovarajuća za adekvatan oporavak CD34++ ćelija. ćelija.

Kasnije, u drugim studijama su prikazani Kasnije, u drugim studijama su prikazani oprečni oprečni rezultati rezultati oporavka MĆH posle primene programiranog ili oporavka MĆH posle primene programiranog ili neprogramiranog zamrzavanja (Ballatore i sar.,1996; neprogramiranog zamrzavanja (Ballatore i sar.,1996; Shlebak i sar., 1999;Shlebak i sar., 1999; Hunt i sar., 2003;Hunt i sar., 2003; Meyer i sar., 2006). Meyer i sar., 2006).

Naša iskustvaNaša iskustva

Prvi uzorak UK u Srbiji je prikupljen u junu Prvi uzorak UK u Srbiji je prikupljen u junu 2000. godine (Škorić, Sinđić, Popović)2000. godine (Škorić, Sinđić, Popović)

Kasnije je prikupljeno preko 100 uzoraka Kasnije je prikupljeno preko 100 uzoraka upotrebom aktivnog i standardnog upotrebom aktivnog i standardnog in in uteroutero metoda metoda

Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M., Stojimirović E., Rodić Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M., Stojimirović E., Rodić P., Jovanović N.: Savremene mogućnosti korišćenja umbilikalne P., Jovanović N.: Savremene mogućnosti korišćenja umbilikalne krvi kao izvora za transplantaciju matične ćelije hematopoeze. krvi kao izvora za transplantaciju matične ćelije hematopoeze. Bilt transf 2004, 50(1-2):123-126.Bilt transf 2004, 50(1-2):123-126.

Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Cryopreservation of umbilical cord blood. Bilt transfuziol Cryopreservation of umbilical cord blood. Bilt transfuziol 2006, 2006, 52 (1): 12-16.52 (1): 12-16.

Škorić D. Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija hematopoeze. Škorić D. Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija hematopoeze. Bilt.hetmatol. 2007, 35:27-34.Bilt.hetmatol. 2007, 35:27-34.

Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Collection Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Collection

strategies and cryopreservation of umbilical cord bloodstrategies and cryopreservation of umbilical cord blood. Transfus . Transfus Med. 2007 Apr;17(2): 107-13Med. 2007 Apr;17(2): 107-13

Škorić D., Sindjić M., Balint B., Petakov M., RodiŠkorić D., Sindjić M., Balint B., Petakov M., Rodić P. Comparisson ć P. Comparisson between two different umbilical cord blood collection strategies between two different umbilical cord blood collection strategies while the placenta is still in uterus. while the placenta is still in uterus. Pediatric Blood Pediatric Blood & Cancer& Cancer 2006; 47(4):4622006; 47(4):462

Škorić DŠkorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M. and Ivanovski P. ., Sinđić M., Balint B., Petakov M. and Ivanovski P.

Influence of Obstetric Factors on Quality of Umbilical Cord Blood Influence of Obstetric Factors on Quality of Umbilical Cord Blood UnitsUnits. Pediatric Blood . Pediatric Blood & Cancer& Cancer 2008; 51(4):541 2008; 51(4):541

..

DOPRINOS METODOLOGIJI DOPRINOS METODOLOGIJI PRIKUPLJANJA, IZDVAJANJA I PRIKUPLJANJA, IZDVAJANJA I

KRIOKONZERVACIJE MATIČNIH ĆELIJA KRIOKONZERVACIJE MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE IZ UMBILIKALNE KRVIHEMATOPOEZE IZ UMBILIKALNE KRVI

dr Dejan Škorićdr Dejan ŠkorićDoktorska disertacija, jun 2007.Doktorska disertacija, jun 2007.

TabelaTabela 1 1. Rezultati prikupljanja UK upotrebom aktivnog . Rezultati prikupljanja UK upotrebom aktivnog i standardnog i standardnog in uteroin utero metoda metoda

*Srednja vrednost ± standardna devijacija **Odbačeni uzorci su manji od 50 ml i/ili imaju manji apsolutni broj NĆ od 8 x 108

NSZ = nema statističke značajnosti

Metod Metod prikupljanjaprikupljanja GrupGrupaa A A GrupGrupaa B B Statistička Statistička

značajnostznačajnost

Broj uzorakaBroj uzoraka 4949 5050

Zapremina (ml)Zapremina (ml)** 103 103 ±± 3535 86 86 ±± 2929 p<0,05p<0,05

Medijana (ml)Medijana (ml) 9797 8181 pp<<0,050,05

Min. vrednost (ml)Min. vrednost (ml) 5050 5151

Max. vrednost (ml)Max. vrednost (ml) 172172 135135Odbačeni uzorci Odbačeni uzorci

(%)**(%)** 1414 3636 pp<<0,010,01

BBakterijska kont.(%)akterijska kont.(%) 2.042.04 2.02.0 NSNSZZ

PROTOKOLPROTOKOL KRIOPROTEKTORKRIOPROTEKTOR ZAMRZAVANJEZAMRZAVANJE

Protokol 1Protokol 1 10% DMSO10% DMSO ProgramiranoProgramirano

Protokol 2Protokol 2 10% DMSO10% DMSO NeprogramiranoNeprogramirano

Protokol 3Protokol 3 5% DMSO5% DMSO ProgramiranoProgramirano

Protokol 4Protokol 4 5% DMSO5% DMSO NeprogramiranoNeprogramirano

Tabela 2. Protokoli kriokonzervacije mononuklearnih ćelija umblikalne krvi

20

10

0

-10

-20

-60

-30

-70

-40

-50

0 10 20

30 40

50

III

III

IV

V

Vreme (min)

Tem

pera

tura

(ºC

)

20

10

0

-10

-20

-60

-30

-70

-40

-50

0 10 20

30 40

50

20

10

0

-10

-20

-60

-30

-70

-40

-50

0 10 20

30 40

50

III

III

IV

V

Vreme (min)

Tem

pera

tura

(ºC

)

Grafikon 1. Procedura programiranog zamrzavanja se sastoji od 5 faza: I = 5°C/min, 4 minuta ; II = 0°C/min, 5 minuta (ekvilibracija); III = 2°C/min, 5 minuta; IV = 1°C/min, 35 minuta; V = 5°C/min, 5 minuta.

Tabela 2. Uticaj ginekoških faktora na kvalitet Tabela 2. Uticaj ginekoških faktora na kvalitet uzoraka umbilikalne krvi (TT i TP)uzoraka umbilikalne krvi (TT i TP)

TT > 3300 g; TT > 3300 g; TP > 700gTP > 700g

(broj uzorka = (broj uzorka = 62)62)

TT (2500g − TT (2500g − 3300g); TP 3300g); TP

(600g − 700g)(600g − 700g)(broj uzoraka (broj uzoraka

= 37)= 37)

Zapremina (ml) Zapremina (ml) ** 96 ± 3596 ± 35 74 ± 2274 ± 22 p<0,05p<0,05

NĆ* (x10/8)NĆ* (x10/8) 12,5 ± 5,3 12,5 ± 5,3 9,2 ± 5,7 9,2 ± 5,7 p<0,05p<0,05

CD34+* (x CD34+* (x 10/6)10/6) 3,9 ± 3,9 ± 1,41,4 2,9 ± 2,9 ± 1,21,2 p<0,05p<0,05

CFU-GM* CFU-GM* (x10/4)(x10/4) 104,1 104,1 ± 24,7 ± 24,7 64,3 64,3 ± 18,5 ± 18,5 p<0,01p<0,01

*srednja vrednost ± standardna devijacija (SD)

Rezultati postignuti u našem istraživanju stvorili Rezultati postignuti u našem istraživanju stvorili su tehničko-manipulativne preduslove za su tehničko-manipulativne preduslove za prikupljanje, izdvajanje i kriokonzervacijuprikupljanje, izdvajanje i kriokonzervaciju umbilikalne krvi. Ovi preduslovi su neophodni zaumbilikalne krvi. Ovi preduslovi su neophodni za formiranje formiranje javne/nacionalne javne/nacionalne banke banke zza UKa UK u u Srbiji, koja bi omogućila savremeno lečenje Srbiji, koja bi omogućila savremeno lečenje bolesnika u kojih je neophodna transplantacija bolesnika u kojih je neophodna transplantacija matičnih ćelija hematopoeze od nesrodnih matičnih ćelija hematopoeze od nesrodnih davalaca.davalaca.