Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42 de la maladie dAlzheimer A.Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki Cambridge

Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42

de la maladie d’Alzheimer

A. Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki

Cambridge

Céline Pellentz

Marianne Simon

06/08, longévité et vieillissement

Molecular and cellular neuroscience, 2004

Présentation du sujet et Problématique

Les expériences et résultats

Synthèse

Conclusion

La maladie d’Alzheimer: une brève présentation



Synthèse

Conclusion

La maladie d’Alzheimer: une brève présentation

Stade modérétroubles de la mémoire (noms des proches, évènements récents), difficulté

d’expression et de compréhension des mots, désorientation spatiale et temporelle (chez lui, mois, saison…), hallucinations et/ou des délires

Stade tardiffaiblesses physiques, vulnérabilité à diverses infections (souvent cause de décès),

disparition de la mémoire à long terme, expression orale limitée à quelques mots (voire mutisme total), difficultés à se mouvoir, incontinence

Durée

Environ 10 ans

Stade symptomatique

Phase non symptomatiqueDurée

Environ 20-30 ans

Stade précocePerte de la mémorisation, troubles du langage ( périphrases ) et

de l’orientation spatiale et temporelle, angoisses (voire de dépression)

Maladie d’Alzheimer maladie neurodégénérative du système nerveux central 60 à 80% des démences chez les plus de 65ans, forme familiale dans 1% des cas

1906 Aloïs Alzheimer décrit des altérations anatomiques observées post-mortem sur une femme atteinte de démence, d’hallucinations et de trouble de l’orientation



Synthèse

Conclusion

La maladie d’Alzheimer: mécanisme moléculaire et traitements

Plaque amyloide

Dégénérescence neurofibrillaire

Thérapie génique avec le NGFsiRNA contre

-sécrétaseInhibiteurs de

ou -sécrétase -sheetbreakers

En recherche…

Limiter les facteursde risque

Inhibiteurs de canaux NMDA

Inhibiteurs de cholinestérase

Traitements

Vaccin anti-A

Chélateur du cuivre

Diagnostic précoce (IRM,TEP)

En essai clinique



Synthèse

Conclusion

Les modèles de la maladie d’Alzheimer

Problème non résolu par ces modèles : rôles respectifs de Ab40 etAb42 dans la pathologie ?

•les singes âgés :

troubles cognitifs et de la mémoire, anomalies cellulaires (dépôt d'amylose, anomalie du cytosquelette des neurones) dans le cortex et l'hippocampe

•Souris transgéniques pour APP, PS1 ou TAU muté

plaque amyloïde, dégénérescence fibrillaire, activation des astrocytes.

principal modèle MAIS conséquences comportementales difficiles à caractériser, temps et coût

•C. Elegans : expression de A42 avec une séquence signal extracellulaire dans le muscle

paralysie, plaque amyloïde Intérêt : phénotype rapide, crible génétique possible

•Drosophile : possède APPL (mais pas la partie A), -sécrétase mais pas -sécrétase

APP humain : problème de développement

APP+-sécrétase : production de peptide A et neurotoxicité

Intérêts: peut regarder rapidement les phénotypes (longévité,dégénérescence de l’œil, locomotion, mémoire) + peut observer l’effet de produits létaux dans l’oeil



Synthèse

Conclusion

La création de souches exprimant le peptide Aβ

Embryons [yeux blancs] déchorionné

stade blastoderme syncitial

PA

X [yeux blancs] non transfectée

Mouche transgénique

Pour chaque individu aux yeux pigmentés (souche indépendante)

Détermination du chromosome où a eu lieu l’insertion (grâce aux chromosomes balanceurs)

Établissement de souche homozygote ou hétérozygote

Croisements de souche

Promoteur Site

d’expression

Transgène Marqueur Nom des

souches

GMR Œil

A40

Gène white

[yeux pigmentés]

Dose dépendant

L1

A42 K1,K3,K52,K53

Ø 1

UAS

(+elavGal4)neurones

A42 H29.3

C99 I8

GFPInjection du plasmide d’intérêt avec la transposase

[yeux blancs]

Transposition dans le noyau d’une

cellule germinale



Synthèse

Conclusion

Possibilité d’avoir un phénotype observable aisément?

Expression dans l’œil

pGMR-42K3

homozygote

Rouge ponceauWB Anti-A

Témoin positif

Témoin négatif

Témoin négatif(Plasmide vide pGMR)

Augmentation de la dégénération parallèlement à l’accumulation de A

Mouches exprimant A42

pGMR-A42K1

homozygotepGMR-A42

K52 homozygote

K52

/K52



Synthèse

Conclusion

Expression d’ Aβ42 dans le cerveau

50%

% de survie

jours

UAS-C99I8 hétérozygote + elavGal4C155

elavGal4C155

UAS-A42H29.3 hétérozygote

UAS-A42H29.3 hétérozygote + elavGal4C155

Longévité en présence d’A42 dans le cerveau

Longévité des témoins

L’expression de A42 dans le cerveau diminue la longévité des Drosophiles



Synthèse

Conclusion

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine

Aβ42 s’agrège à l’extérieur des cellules

extraits protéiques de tête de mouches GMR-Aβ42

K3 – Western Blot

ponceau

La majorité des peptides Aβ42 présents dans la

tête des Drosophiles est sous forme insoluble

Test Elisa de la présence d’Aβ dans le surnageant de cellules de Drosophiles

transfectées par UAS-Aβ40.

Le peptide Aβ40 - et donc sans doute Aβ42

(même séquence signal) - est sécrété par les cellules l’exprimant



Synthèse

Conclusion

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine

La sévérité du phénotype est fonction de la dose d’Aβ42 agrégé

immunomarquage du peptide Aβ42 sur des cryosections horizontales d’œil de Drosophile adultes (4-5 jours).

corrélation quantité de peptide / degré de désorganisation?

wt

Aβ42K10

témoin

Aβ42K3

homozyg

Aβ42K10

homozyg

L’intensité du phénotype croit avec la quantité de peptide accumulé

Bleu de toluidine



Synthèse

Conclusion

Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaineLa sévérité du phénotype augmente avec l’âge

Mouches GMR-Aβ42K3 hétérozygotes.

Comptage du nombre de mouches dans chaque catégorie phénotypique au cours de l’âge.

Shift wt/mild -> mild/moderate

Plus d’évolution après le 32ème jour

La sévérité du phénotype croit avec l’âge, jusqu’au

32ème jour.

Ponceau

Western Blot d’extraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ42

K3 à 0-2 ou 35 jours.

L’augmentation de la sévérité du phénotype avec l’âge doit être due à

une accumulation croissante d’Aβ



Synthèse

Conclusion

Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle

Sélection d’un mutant surexprimant la néprisiline

2000 souches EP d’une banque publique (expression des

insertions EP dans les cellules où Aβ est exprimé grâce à eyGal4)

Souches GMR-Aβ42

23 souches ayant un effet modificateur et n’entrainant aucun

phénotype au niveau de l’œil en absence d’Aβ

Dont un suppresseur du phénotype le plus sévère

Nature de cette souche et étude plus précise de son effet sur le

phénotype d’Aβ42

Insert EP inséré en amont du Drosophila neprilysin 2 gene => upregulation de sa

transcription

L’insertion EP entraine une multiplication par 5-6 de l’activité

de nep2

Démarche du crible Nature de la souche sélectionnée



Synthèse

Conclusion

Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle

Effet de la surexpression de nep2 sur l’accumulation du peptide Aβ42

Nep2 code une protéase

Western Blot d’extraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ42K3 hétérozygotes ou GMR-Aβ42K3

hétérozygotes ; EP(3)3549nep2

Ponceau

La surexpression de nep2 entraine une diminution de

l’accumulation de peptide Aβ42

Effet de la surrexpression de nep2 sur le phénotype durée de vie

Coexpression dans le SNC induite par Gal4 de

Aβ42H29.3 et de nep2

La surexpression de nep2 atténue le

phénotype « raccourcissement de la durée de vie »

50%

témoin



Synthèse

Conclusion

Bilan: La Drosophile, un bon modèle…

Un modèle plutôt fidèle à la pathologie

humaine, au moins au niveau moléculaire.

Permettant une caractérisation

phénotypique aisée

Sur lequel on peut mettre en œuvre des

outils efficaces

D’où de possibles réponses aux questions

que l’on peut poser à un tel modèle

•Aβ sous forme d’oligomères insolubles et de plaques extracellulaires

Aβ42 semble être sécrété et être retrouvé sous forme insoluble

•Oligomères responsables de la neurotoxicité

Phénotype croissant avec la quantité d’Aβ accumulé

• Symptômes à évolution progressive

La sévérité du phénotype s’accroit avec l’âge.

Toxicité d’Aβ pour les photorecepteurs => phénotype très marqué dans l’œil

Toxicité pour les neurones du SNC mesurable par la diminution de la durée de vie

Crible de gènes modulateurs, ici par banque gain de fonction

Identification d’un gène connu en modèle Souris

•Relation entre agrégation d’Aβ et toxicité?

•Cible cellulaire de la toxicité d’Aβ?

•Réponse cellulaire à Aβ?

•Pourquoi la pathologie AD est elle âge-dépendante?

•Quel est le mécanisme de la toxicité médiée par tau? Link, 2005



Synthèse

Conclusion

… Mais avec ses limites

Un modèle qui ne pourra pas tout expliquer

•Maladie d’Alzheimer = maladie complexe, origines variées

Ne modélise que la cascade amyloïde (implication de tau)

Des différences au niveau moléculaire même qui

peuvent mettre en doute les conclusions

•Homologue Appl d’APP n’a pas de domaine Aβ-like.

•Pas d’activité β-sécrétase.

Présence des intervenants du mécanisme moléculaire chez l’homme?

•Aβ40 présent dans les plaques amyloïdes

Instable dans le modèle, même en présence de peptide Aβ42.

Bon modèle pour les premières études des mécanismes moléculaires (cribles impossibles chez un mammifère)

Mais tous les résultats sont à vérifier en modèle Mammifère = garder en mémoire que ce n’est qu’un modèle



Synthèse

Conclusion

Analyse critique

Des méthodes expliquées un peu succinctement (Ponceau), comme la caractérisation des souches.

Des changements de souche étudiée rendant parfois l’interprétation un peu « hasardeuse »

Ex: étude de la sévérité des phénotypes en fonction de la quantité de peptide accumulé,

-Immunomarquage d’Aβ sur des coupes d’yeux homozygotes pour Aβ42K3 ou

Aβ42K10

-observation de l’organisation des ommatidies dans des souches Aβ42K3

hétérozygotes et homozygotes ou Aβ42K52 hétérozygotes.

Étude de la sécrétion du peptide Aβ40 au lieu du peptide Aβ42.

-> Même séquence signal mais comportement très différent

-> Aβ42 a une séquence signal clivée dans la mouche mais chez le C. elegans Aβ s’accumule DANS les cellules bien que sa séquence signal soit clivée (Link 1995)



Synthèse

Conclusion

Utilisations ultérieures du modèle

Perspectives

•Ce modèle a été utilisé pour des tests :

•De mémoire (olfaction)

•De locomotion

•De survie

L’accumulation de A40 ou A42 peut altérer la mémorisation

MAIS seule A42 est capable de faire des plaques amyloïdes, de provoquer la dégénérescence des neurones, de causer des problèmes locomoteurs et enfin une mort prématuré. (Liima and al. 2004)

Ce modèle de Drosophile peut servir de crible pour trouver des pistes thérapeutiques ciblant les plaques amyloïdes et leurs conséquences.

BONUS

Le modèle UAS-Gal4

hypothèse de la cascade amyloïde

Documents

Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42 de la maladie dAlzheimer A.Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki Cambridge