Lynettefællesskabet I/S Rapport

Marts 2012

Antibiotikaresistente bakterier i spildevand Undersøgelse af spredning fra Rigshospitalet til Renseanlæg Lynetten

This report has bred under the DHI Business Management System certified by DNV to comply with

ISO 9001: Quality Management System

Godkendt af:

13-03-2012

XApproved by

Signed by: Ulf Nielsen

i

Antibiotikaresistente bakterier i

spildevand

Undersøgelse af spredning fra Rigshospitalet til Renseanlæg Lynetten

Klient Lynettefællesskabet I/S

Klientens repræsentant Kim Rindel

Projekt nr. 11520009

Klassifikation Tilhører klienten

Forfattere Christine Anna Hastrup

Claus Jørgensen

Jette Wille Lentz Fredskilde

Ulf Nielsen

i

i DHI

INDHOLDSFORTEGNELSE

1 BAGGRUND ................................................................................................................. 1

2 FORMÅL ....................................................................................................................... 2

3 MÅLEPROGRAM .......................................................................................................... 3

3.1 Prøvetagningsprogram .................................................................................................. 3

3.1.1 Rigshospitalet ............................................................................................................... 3

3.1.2 Renseanlæg Lynetten ................................................................................................... 4

3.2 Analyseprogram ............................................................................................................ 5

3.2.1 Tabletmetoden .............................................................................................................. 7

3.2.2 E-Test (Epsilometer Test) ............................................................................................. 7

3.2.3 MALDI-TOF-MS ............................................................................................................ 7

3.2.4 Ribotypning ................................................................................................................... 7

4 RESULTATER OG DISKUSSION ................................................................................. 9

4.1 Forekomst af bakterier og resistens .............................................................................. 9

4.2 E. coli – ribotyper og resistensmønstre ....................................................................... 11

4.3 Klebsiella – ribotyper og resistensmønstre .................................................................. 14

5 KONKLUSION ............................................................................................................ 16

6 ANBEFALINGER ........................................................................................................ 17

7 REFERENCER ........................................................................................................... 18

BILAG A.................................................................................................................................... 23

BILAG B.................................................................................................................................... 25

BILAG C ................................................................................................................................... 27

BILAG D ................................................................................................................................... 29

BILAG E.................................................................................................................................... 31

BILAG F .................................................................................................................................... 33

ii DHI

1

1 BAGGRUND

Der har været et stigende forbrug af antibiotika i Danmark siden starten af 00’erne

(Statens Serum Institut, 2010). Et stigende antibiotikaforbrug medfører øget

antibiotikaresistens. Tidligere undersøgelser og måleprogrammer har vist, at

antibiotikaresistente bakterier forekommer i hospitalsspildevand, på renseanlæg, og i

vandmiljøet (Lynettefællesskabet, 2004; Lynettefællesskabet, 2007; Miljøstyrelsen,

2002). Hvis mennesker eksponeres for spildevand, er der en risiko for at blive inficeret.

Hvis der er tale om infektion med antibiotikaresistente patogene bakterier, kan

behandlingen besværliggøres eller i særligt uheldige tilfælde umuliggøres.

Baggrunden for dette projekt er et ønske om at undersøge spredningen af

hospitalsspecifik antibiotikaresistens til kloakker, renseanlæg og vandmiljø med henblik

på at forbedre datagrundlaget for at vurdere risikoen for at blive inficeret med

antibiotikaresistente bakterier. I Danmark bliver 10 % af humane antibiotika anvendt på

hospitaler (Statens Serum Institut, 2010). Der forekommer multiresistente bakterier på

hospitalerne. Hospitalernes antibiotikaforbrug giver samtidig et øget selektionspres,

hvor væksten af følsomme bakterier hæmmes, og væksten af modstandsdygtige

bakterier fremmes. Dette kan medføre, at antibiotikaresistente bakterier har en fordel

over for mere følsomme bakterier i spildevand med antibiotika.

For at undersøge, om antibiotikaresistens kan spores direkte tilbage til specifikke

hospitaler, er Rigshospitalet valgt som case. Infektionshygiejnisk Enhed (IHE) på

Rigshospitalet har opbygget en databank med ribotyper (rRNA-profiler) af alle

multiresistente E. coli og Klebsiella, som er identificeret på Rigshospitalet siden 2005.

E. coli eller Klebsiella betegnes som multiresistent, hvis den er resistent over for to af

følgende tre antibiotika: Gentamicin, cefuroxim og ciprofloxacin. Endvidere omfatter

databanken profilerne for de identificerede vancomycin-resistente enterokokker (VRE).

Ved sammenligning af ribotyper af antibiotikaresistente bakterier fundet i

Rigshospitalets spildevand, på Renseanlæg Lynetten og i Øresund med ribotyperne i

IHE’s databank vil det være muligt at vurdere, om den nedstrøms målte

antibiotikaresistens kan spores tilbage til Rigshospitalet. Nærværende projekt vil

dermed bidrage til mere viden omkring sammenhængen mellem hospitalerne og

antibiotikaresistens i vandmiljøet.

2

2 FORMÅL

Formålet med undersøgelsen er at screene for spredningen af hospitalsspecifik

antibiotikaresistens fra hospitaler til renseanlæg og vandmiljø. Der arbejdes konkret

med Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten, som Rigshospitalet afleder til. Samtidig

undersøges forekomsten af vancomycin-resistente enterokokker på renseanlæg og i

vandmiljø. Herunder er det formålet at:

udtage prøver fra henholdsvis Rigshospitalet, Renseanlæg Lynetten og Øresund

identificere og isolere antibiotikaresistente bakterier fra de tre lokaliteter

anvende ribotypning til kortlægning af rRNA-profiler af de fundne

antibiotikaresistente bakterier

sammenligne rRNA-profilerne af de fundne antibiotikaresistente bakterier med

rRNA-profiler i Rigshospitalets databank for at afklare, om de fundne

antibiotikaresistente bakterier kan spores tilbage til Rigshospitalet.

3

3 MÅLEPROGRAM

3.1 Prøvetagningsprogram

Der er taget prøver fra følgende tre lokaliteter:

Rigshospitalet

Renseanlæg Lynetten

Kongedybet i Øresund

3.1.1 Rigshospitalet Der blev udtaget spildevandsprøver fra Rigshospitalet tirsdag den 30. august 2011

mellem kl. 10.00 og kl. 10.30. Prøverne blev taget i brønden på

personaleparkeringspladsen langs Blegdamsvej (markeret med en stjerne på Figur 3-1).

Figur 3-1 Kort over Rigshospitalets område, hvor prøvetagningsbrønden er markeret med en stjerne. Bygninger, der afleder spildevand til prøvetagningsbrønden, er markeret med pile til prøvetagningsbrønden. Det originale billede er udlånt af Rigshospitalet.

Pumper, der afleder regn- og drænvand til prøvetagningsbrønden, blev standset under

prøvetagningen. Det forventes dermed, at prøverne udelukkende består af sanitært

spildevand.

Fordelingen af spildevand, der afledes til prøvetagningsbrønden, er ifølge teknisk

personale på Rigshospitalet estimeret til ca. 90% fra centralbygningen, sydbygningen og

mellembygningen og ca. 10 % fra epidemi- og infektionsafdelingen (stiplet linje).

Der blev udtaget ialt ca. 30 liter spildevand. Spildevandet blev efter prøvetagning

sammenblandet i forholdet 90:10, jf. ovenstående.

Figur 3-2 viser prøvetagningsbrønden.

4

Figur 3-2 Billede af prøvetagningsbrønden ved Rigshospitalet med prøvetagningsudstyr.

3.1.2 Renseanlæg Lynetten Der blev udtaget tre prøver fra Renseanlæg Lynetten: Én fra indløbet, én fra indløbet til

biologisk rensning og én fra udløbet. Vand fra indløbet til biologisk rensning er primært

renset, men ikke biologisk renset, og i tilfælde af højt flow med overløb vil vandet fra

indløbet til biologisk rensning være sammenligneligt med overløbsvandet, da overløb

sker efter primær rensning.

Prøverne blev taget som flowproportionelle døgnprøver fra kl. 9 den 29. august 2011 til

kl. 9 den 30. august 2011. Hver prøve blev taget i en PE-dunk med et volumen på 5

liter. Prøverne blev opbevaret på køl.

Der var flere kraftige regnbyger i Københavnsområdet i prøvetagningsperioden.

3.1.3 Kongedybet, Øresund Sedimentprøver blev indsamlet i Kongedybet i Øresund tæt på udløbet fra Renseanlæg

Lynetten. Indsamlingen fandt sted den 29. august 2011. Sedimentet blev indsamlet fra

en RHIB (Rigid-Hulled Inflatable Boat) ved brug af en grab i 6,8 meters dybe. Punktet,

hvor sedimentet blev indsamlet, har koordinaterne N55º41.761’ E012º38.890’. Dette

punkt er cirka 200 meter fra udløbet fra Lynetten.

Muslingerne blev indsamlet i en 10-liters plastspand ca. 50 meter fra punktet, hvor

sedimentet blev indsamlet. Efter indsamling blev muslingerne transporteret til DHIs

laboratorier i plastspanden, hvorefter muslingerne blev renset og skallerne fjernet.

5

Figur 3-3 Kort over København og Kongedybet i Øresund (Eniro/Krak, 2011). Prøvetagningsstedet for sediment og muslinger er markeret med rødt.

3.2 Analyseprogram

Analyser blev udført i DHIs laboratorier samt på IHEs laboratorier på Rigshospitalet.

Resistensbestemmelserne omfattede tre typer af testbakterier: Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae og enterokokker. Protokoller for bestemmelserne fremgår af

Bilag A-C. Der blev i alt analyseret for resistens over for fem antiobiotika. Tabel 3-1 er

en oversigt over antibiotika og testbakterier anvendt i analyserne.

Tabel 3-1 Antibiotika og tilhørende anvendelsesområder samt testbakterier og anvendte breakpoints for hvert antibiotikum

Antibiotikum Anvendelse Testbakterie(r) Breakpoint

[µg/ml]1

Ciprofloxacin Hospitaler og

primærsektor

E. coli og

Klebsiella 1

Cefuroxim Hospitaler E. coli og

Klebsiella 8

Gentamicin Hospitaler E. coli og

Klebsiella 4

Meropenem Hospitaler E. coli og

Klebsiella 8

Vancomycin Hospitaler Enterokokker 4

1. (EUCAST, 2011)

For spildevandsprøverne fra Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten blev der testet for

resistens for alle tre typer testbakterier.

Bestemmelse af ”suspekte E. coli” blev gennemført ved spredning af spildevandsprøven

i triplikat på Oxoid Brilliance agar, der er en selektiv agar for coliforme bakterier. Alle

violette kolonier blev talt som ”suspekte E. coli”, idet der ikke blev gennemført

yderligere verifikation af de enkelte kolonier. Brilliance agaren var enten uden

antibiotika eller med antibiotika, henholdsvis ciprofloxacin (1 mg/l), gentamicin (4

6

mg/l) og cefuroxim (8 mg/l). De angivne koncentrationer af ciprofloxacin, gentamicin

og cefuroxim er breakpoints, og bakteriekolonier dyrket ved eller over denne

antibiotikakoncentration må anses for at være resistente (EUCAST, 2011).

For bestemmelse af ”suspekte Klebsiella” blev der spredt spildevandsprøve i enkelt

udsæd på blodagar og i dobbelt udsæd på HiCromeTM

agar, en selektiv agar for

Klebsiella. For begge typer agar blev der lavet plader uden antibiotika samt plader med

Ciprofloxacin (1 mg/l), Gentamicin (4 mg/l) og Cefuroxim (8 mg/l) tilsat agaren. Alle

lilla-mangenta røde kolonier blev talt som ”suspekte Klebsiella”.

Figur 3-4 Billede af E. coli, coliforme og ikke coliforme bakterier dyrket på Oxoid Brilliance agar. Foto: DHI.

For at teste for multiresistens blev der udvalgt fem E. coli og Klebsiella fra hver plade

med henholdsvis ciprofloxacin, gentamicin og cefuroxim. De udvalgte kolonier blev

overført til nye agarplader, en plade pr. koloni. Kolonierne blev testet for Ciprofloxa-

cin-, Gentamicin-, Cefuroxim- og Meropenemresistens ved tabletmetoden. MALDI-

TOF-MS blev brugt til artsbestemmelse. Udvalgte isolater blev ribotypet og E-testet.

For bestemmelse af suspekte Enterokokker blev der spredt prøve i duplikat på Slanezt

agar uden antibiotika samt på agar med Vancomycin (4 mg/l). Der blev testet for

Vancomycinresistens ved tabletmetoden, og artsbestemmelse blev gennemført med

MALDI-TOF-MS. Udvalgte isolater blev ribotypet og E-testet.

For muslingeprøverne blev muslingekødet blendet i et våd vægt:volumen forhold på

1:10. Bakterier blev dyrket i MacConkey bouillon uden antibiotika samt med

henholdsvis Ciprofloxacin (1 mg/l), Gentamicin (4 mg/l) og Cefuroxim (8 mg/l).

Samme procedure blev fulgt for sedimentprøverne.

Violet: E. coli

Pink: coliform

Blå: Ej coliform eller E. coli

7

3.2.1 Tabletmetoden Tabletmetoden bruges til bestemmelse af resistens over for forskellige antibiotika.

Tabletmetoden er baseret på diffusion af antibiotika i agar.

Resultaterne af tabletmetoden er for hvert antibiotikum enten følsom, intermediær eller

resistent. Hvis resultatet er følsom, betyder det, at bakterien ikke har nogen påviste

resistensmekanismer mod det pågældende antibiotikum. I medicinsk forstand betyder

følsom, at antibiotikummet forventes at have virkning ved standarddosis. Hvis resultatet

er intermediær, betyder det, at bakterien har nedsat følsomhed over for det pågældende

antibiotikum. Medicinsk kan dette betyde, at stoffet evt. kræver en højere dosering, eller

at stoffet opkoncentreres på infektionsstedet. Hvis resultatet er resistent, betyder det, at

bakterien har en til flere resistensmekanismer, som gør, at bakterien ikke påvirkes af det

pågældende antibiotikum. Dette bevirker, at en infektion med denne bakterie ikke vil

kunne behandles med det pågældende antibiotikum (Dansk Selskab for Klinisk

Mikrobiologi, 2004).

3.2.2 E-Test (Epsilometer Test) E-test bruges til at fastlægge MIC-

koncentrationen for bakterier. Testen består af

en plastikstrip påført antibiotika i stigende

koncentration ned langs længden af strippen.

Strippen placeres på en agarplade og inkuberes.

Der opstår en hæmningszone omkring strippen,

som vist på Figur 3-5. MIC (Minimum

Inhibition Concentration) værdien aflæses

direkte på strippen og angiver den laveste

antibiotika koncentration, der skal til for at

hæmme bakteriernes vækst (Dansk Selskab for

Klinisk Mikrobiologi, 2004).

3.2.3 MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS er i dette studie brugt til artsbestemmelse af bakterier baseret på

proteiner. Det er en koblet analysemetode bestående af tre dele: MALDI (Matrix

Assisted Laser Desorption Ionization), TOF (Time of Flight) og MS (Mass

Spectrometry). Proteiner fra de bakterier, der ønskes artsbestemt, ekstraheres og

indlejres i en matrix. Matrixen beskydes med en laserstråle, hvis energi bevirker, at

proteinmolekyler ioniseres. Efterfølgende accelereres proteinmolekylerne i et elektrisk

felt. De ioniserede molekylers forskellige masser gør, at forskellige molekyler får

forskellige hastigheder, som registreres og danner et spektrum. Spektret er specifikt for

den pågældende mikroorganisme, som identificeres ved sammenligning med kendte

referencespektre i en database (OUH, 2009).

3.2.4 Ribotypning Ribotypning er en metode, der anvendes til at identificere bakteriestammer. Metoden

virker ved, at en bakteriestamme isoleres, og der ekstraheres genomisk DNA. DNA’et

kappes med et restriktionsenzym og separeres ved gelelektroforese. 16S og 23S rRNA

bruges som probe. Gelen fotograferes og analyseres digitalt på en computer, hvor

billedet sammenlignes med tidligere undersøgte bakterier i en database. Ribotypen er

således en slags fingeraftryk, der fortæller om DNA’et som koder for rRNA.

Figur 3-5 Eksempel på agarplade med E-test (kilde: Wikipedia)

8

Ribotypning anvendes som fast procedure på Rigshospitalet, udført af

Infektionshygiejnisk Enhed, ved udredning af infektionsudbrud samt ved overvågning

af særlige bakterietyper i forbindelse med eventuel spredning af infektioner og analyse

til sammenligning af resistente bakterier (Infektionshygiejnisk Enhed, 2007).

9

4 RESULTATER OG DISKUSSION

4.1 Forekomst af bakterier og resistens

Der blev fundet multiresistente bakterier (resistente for mindst to antibiotika) i

spildevandsprøverne, mens de hverken blev fundet i sedimentprøverne eller i

muslingerne. De følgende resultater er derfor kun for spildevandsprøverne. Tabel 4-1

viser de fundne koncentrationer af suspekte E. coli, suspekte Klebsiella, suspekte

enterokokker og coliforme bakterier i spildevandsprøverne.

Tabel 4-1 Total koncentration af suspekte E. coli, suspekte Klebsiella, suspekte enterokokker og coliforme bakterier i spildevandet fra hvert prøvetagningssted samt koncentrationen af hver type bakterie resistent over for udvalgte antibiotika fra hvert prøvetagningssted.

Bakterie Prøve-

tagningssted

Total

Ciprofloxacin

resistente

bakterier

Cefuroxim

resistente

bakterier

Gentamicin

resistente

bakterier

Vancomycin

resistente

bakterier

[kim/ml] [kim/ml] % [kim/ml] % [kim/ml] % [kim/ml]

E. coli

Rigshospitalet 22.700 7.140 31 1.050 5 1.090 5 -

RL tilløb 31.800 1.270 4 1.000 3 1.320 4 -

RL tilløb bio 40.100 1.730 4 1.180 3 909 2 -

RL udløb 1.550 59 4 55 4 55 4 -

Klebsiella

Rigshospitalet 39.500 10.200 26 16.000 41 10.000 25 -

RL tilløb 69.400 2.270 3 2.180 3 1.070 2 -

RL tilløb bio 49.500 1.770 4 1.910 4 1.800 4 -

RL udløb 2.880 82 3 64 2 82 3 -

Coliforme

Rigshospitalet 50.900 14.500 28 9.460 19 6.270 12 -

RL tilløb 89.600 2.720 3 2.820 3 1.729 2 -

RL tilløb bio 93.700 2.820 3 2.950 3 1.409 2 -

RL udløb 5.500 104 2 105 2 100 2 -

Enterokok-

ker

Rigshospitalet 39.100 - - - (5)

RL tilløb 26.600 - - - (27)

RL tilløb bio 1.080 - - - (< 5)

RL udløb 2.910 - - - (36)

( ) Kolonier kunne ikke verificeres som enterokokker på IHE

Der ses en tendens til, at koncentrationen af total kimtal er lavere i spildevandet fra

Rigshospitalet end i tilløbet til Renseanlæg Lynetten, mens den laveste koncentration

blev observeret i det rensede spildevand. Renseeffektiviteten over renseanlægget for de

målte bakterier ligger omkring 95%. En rensningsgrad på 95% ses ofte, men

rensningsgrader på > 99% er ikke udsædvanlige (Erichsen et al., 2006).

Der er generelt fundet flere suspekte Klebsiella end suspekte E. coli. Klebsiella og E.

coli tilhører begge gruppen af coliforme bakterier. Summen af E. coli og Klebsiella

burde derfor være mindre end eller lig med koncentrationen af totale coliforme

bakterier. Generelt var der god overensstemmelse, idet niveauerne var ens, som det

10

fremgår af Tabel 4-1. Dog ses det, at for mange af prøverne er summen af suspekte

Klebsiella og suspekte E. coli lidt højere end koncentrationen af totale coliforme (13%

til 92% højere). Det skyldes, at selektiviteten af de anvendte agar er forskellig, og at

man derfor ikke umiddelbart kan sammenligne tallene. Endvidere kan det skyldes, at

nogle af de suspekte Klebsiella og de suspekte E. coli ikke var Klebsiella eller E. coli.

Det ses også, at der generelt var flere resistente bakterier i spildevandsprøverne fra

Rigshospitalet end i prøverne fra Renseanlæg Lynetten. Koncentrationen af resistente

bakterier i Renseanlæg Lynettens tilløb og tilløb til biologisk rensning var nogenlunde

ens, mens den laveste koncentration blev målt i udløbet. Andelen af resistente bakterier

i tilløb og udløb fra Lynetten var 2% til 4%, mens andelen af resistente bakterier var

væsentligt højere i spildevandet fra Rigshospitalet (12% til 31%) med undtagelse af

cefuroxim og gentamicin resistente suspekte E. coli, hvor kun 5% var resistente.

De resistente bakterier, der findes i spildevandet, kommer enten fra inficerede patienter,

er dannet i kloakken ved celledeling (vertikal overførsel) eller ved udveksling af

genetisk materiale mellem bakterier (horisontal overførsel). Ved en intensiv anvendelse

af antibiotika forventes der at ske en selektion af resistente bakterier, så en større andel

af patienterne udskiller resistente bakterier til spildevandet. Ved en høj koncentration af

antibiotika i spildevandet forventes det, at resistente bakterier vil have en

konkurrencemæssig fordel og dermed have en forøget koncentration og procentvis

andel. En stor andel af de antibiotika, der anvendes i oplandet til Renseanlæg Lynetten,

bliver brugt på Rigshospitalet (se Tabel 4-2). Dette stemmer overens med, at de højeste

andele af resistente bakterier blev fundet ved Rigshospitalet. Desuden ses det, at andelen

af resistente bakterier generelt var højest for cefuroxim og ciprofloxacin, hvilket

stemmer med, at forholdet mellem den beregnede koncentration af antibiotikum i

spildevandet set i forhold til breakpoint koncentration var højest for disse.

Tabel 4-2 Forbrug og beregnet spildevandskoncentration af de antibiotika, der er anvendt i studiet (DHI 2011). Tabellen viser endvidere antibiotikakoncentrationen i de agar, som er anvendt til tællingerne (breakpoint), samt forholdet mellem beregnet antibiotikakoncentration i spildevandet og forholdet mellem beregnet antibiotikakoncentration (Rigshopitalet og Renseanlæg Lynetten) og koncentration i agar.

Antibiotikum

Forbrug

RH

Forbrug

RL

opland

Forbrug

RH

Konc.

spildevand

RH

Konc.

tilløb RL

Konc

agar

*Spildevand

(RH)/Agar

*Spildevand

(RL)/Agar

(kg/år) (kg/år) % (µg/l) (µg/l) (µg/l) % %

Cefuroxim 156 276 56 646 4,7 8000 8 0,1

Gentamicin 0,9 2,3 38 3,6 0,04 4000 0,1 0,001

Ciprofloxacin 51 184 28 211 3,1 1000 21 0,3

Meropenem 74,7 89 84 310 1,5

*Den beregnede koncentration i spildevandet/koncentrationen i agar benyttet til tælling

På baggrund af prøvetagninger er det ikke muligt at vurdere indholdet af multiresistente

bakterier opstrøms Rigshospitalet. Det er muligt, at nogle patienter inficeret med

multiresistente bakterier på Rigshospitalet forlader hospitalet, mens de stadig bærer

multiresistente bakterier. Dette vil medføre, at den multiresistente bakteriestamme både

vil være til stede i Rigshospitalets spildevand og i husspildevandet fra patientens hjem.

Der blev ikke fundet vancomycin resistente enterokokker i spildevandet.

11

4.2 E. coli – ribotyper og resistensmønstre

Tabel 4-3 viser resultaterne af resistensbestemmelser gennemført af IHE af E. coli i

spildevandprøverne. Der blev analyseret 15 stammer fra hver af de fire

spildevandsprøver. Hver spildevandsprøve blev spredt på tre agarplader tilsat

antibiotika, henholdsvis ciprofloxacin, cefuroxim og gentamicin, for at selektere for

resistente stammer. Fra hver agarplade blev der udtaget fem E. coli stammer. Hver

stamme blev rendyrket på en ny agarplade, og resistens over for ciprofloxacin,

cefuroxim, gentamicin og meropenem blev testet ved tabletmetoden. Resultatet F er

markeret med grøn skrift og indikerer en følsom stamme, I er markeret med gul skrift

og indikerer en intermediær stamme, og R er markeret med rød skrift og indikerer en

resistent stamme.

Det ses, at de stammer, der er isoleret fra agarplader tilsat ciprofloxacin, alle er bestemt

til at være ciprofloxacinresistente. Det samme gælder for cefuroxim. For gentamicin er

prøven fra RL tilløb en undtagelse, idet alle stammer er følsomme over for gentamicin.

Det formodes, at der er tale om en laboratoriefejl, idet stammer fremdyrket på en

agarplade med gentamicin burde være resistente overfor gentamicin.

Tabel 4-3 Resistensmønstre for de 15 dyrkede E. coli stammer fra spildevandsprøverne fra henholdsvis Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. F betyder, at stammen er følsom, I betyder intermediær og R betyder resistent.

Rigshospitalet RL tilløb RL tilløb bio. RL udløb

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

Dyrket på plade

med

ciprofloxacin

R F F F R R F F R F F F R R F F

R F F F R F R F R R F F R R F F

R F F F R F F F R R F F R F R R

R F F F R F F F R R F F R F F R

R F F F R I F F R R F F R F F R

Dyrket på plade

med cefuroxim

F R R F F R F F R R F F R R F F

F R R F R R F F F R F F F I F F

F R R F R R F F R R R F F R F F

R R R F F R F F R R F F R R F F

R R R F R R F F F R F F F R F F

Dyrket på plade

med gentamicin

F F R F F I I F F R R F F F R F

F I R F F F F F R F R F F I R F

F F R F F F F F R F R F F I R F

R R R F F F F F F R R F R F R F

R R R F F F F F F I R F

12

Der blev fundet 7 multiresistente E. coli stammer med 4 forskellige resistensmønstre på

Rigshospitalet, 3 multiresistente E. coli stammer med 3 forskellige resistensmønstre i

tilløbet til Lynetten, 11 multiresistente E. coli stammer med 5 forskellige

resistensmønstre i tilløbet til biologisk rensning og 7 multiresistente E. coli stammer

med 4 forskellige resistensmønstre i udløbet fra Lynetten. 16 multiresistente E. coli

stammer blev udvalgt til ribotypning. De ribotypede stammer er markeret med en grå

kasse i Tabel 4-3.

Resultaterne af ribotypningen af de udvalgte E. coli stammer er vist i Tabel 4-4. Af de

16 ribotypede E. coli stammer var der 10 forskellige ribotyper. 9 af de 10 ribotyper var i

forvejen kendt og en del af Rigshospitalets databank, hvilket betyder, at de tidligere er

forekommet på Rigshospitalet. Den ene ukendte ribotype blev fundet i tilløbet til

biologisk rensning på RL og blev tildelt ribotypenummeret 876-S6.

Ribotype 70-S4 blev identificeret i spildevandet fra tilløbet til RL og i tilløbet til

biologisk rensning på RL. Selvom ribotypen er den samme, viser Tabel 4-4, at de

analyserede E. coli stammer har forskellige resistensmønstre.

Ribotype 129-S1 blev identificeret i spildevandsprøverne fra alle fire

prøvetagningssteder, henholdsvis Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk

rensning på RL og udløb fra RL. Alle fire 129-S1 stammer har forskellige

resistensmønstre.

Tabel 4-4 Ribotyper for de analyserede multiresistente E. coli fundet i spildevandet fra Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. Resistens over for Ciprofloxacin, Cefuroxim, Gentamicin og meropenem er også vist. F betyder følsom, I betyder intermediær, og R betyder resistent. De ribotyper, der er identificeret fra mere end et prøvetagningssted, er markeret med fed skrift.

Prøvetagningssted

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

Ribotype

Rigshospitalet

F R R F 70-S3

F R R F 129-S1

R R R F 163-S2

R R R F 163-S2

RL tilløb

R F R F 70-S4

R R F F 70-S4

R R F F 129-S1

RL tilløb bio

R R F F 70-S4

F R R F 125-S2

R F R F 129-S1

R R R F 104-S1

R F R F 876-S6

13

RL udløb

R R F F 71-S2

R R R F 129-S1

R R F F 424-S2

R F R F 166-S7

På den ene side indikerer fundet af en multiresistent E. coli ribotype 129-S1 i alle

prøverne, at multiresistente E. coli fra Rigshospitalet kan nå Renseanlæg Lynetten og

blive udledt, enten gennem renseanlægget eller i forbindelse med en overløbshændelse.

På den anden side indikerer forskellene i deres resistensmønstre, at de fundne E. coli

type 129-S1 stammer fra forskellige kilder.

Ribotypning er baseret på forskelle i den DNA, der koder for de ribosomale subunits

5S, 16S og 23S. Det betyder, at der godt kan være forskelle i den øvrige del af det

kromosomale DNA, selvom ribotypen er den samme. Desuden kan samme ribotype

bære plasmider med forskellige resistensegenskaber. Derfor kan to stammer af samme

ribotype have forskellige resistensmønstre. Det er f.eks. vist for quinolone kromosomalt

båret (GyrA) resistens i Clostridium dificile (Carman et al., 2009).

Kromosomalt bårne resistensegenskaber ændrer sig ikke over kort tid, da det kræver en

mutation. Der kan dog være hurtige fænotypiske ændringer, da den resistente egenskab

ikke udtrykkes under alle forhold (se Schreiber, 2011), men det forventes, at

dyrkningsforholdene ved resistensbestemmelserne er ensartet, så de fænotypiske

ændringer ikke vil blive detekteret med de metoder, der er anvendt i nærværende studie.

Kromosomalt bårne resistensegenskaber forventes derfor ikke at ændre sig på den korte

tid, der er mellem Rigshospitalet og Renseanlæg Lynetten. Derimod kan plasmidbårne

resistensegenskaber ændre sig over relativt kort tid ved horizontal overførsel mellem

bakterier. F.eks. beregnede Marcinek et al. (1998), at der skete mellem 104 og 10

8

plasmidoverførsler pr. 4 timer i et renseanlæg. Der er derfor sandsynligt, at der sker en

ændring af de plasmidbårne resistensegenskaber mellem Rigshospitalet og

Renseanlægget.

Resistens over for ciprofloxacin, cefuroxim, gentamicin og meroponem kan både være

båret kromosomalt og ved plasmider (Schumacher et al., 1996; Suh Yah. 2010; Center

for Disease Control, 2010; Cheung et al., 2005; Fujisawa-Kon et al., 1981, Kaufhold &

Potgieter, 1993). Det betyder, at resistensmønstrene i princippet godt kan ændre sig på

vej ned igennem kloaksystemet ved horisontal overførsel af plasmider.

Det er også muligt at samme ribotype har eksisteret på Rigshospitalet med forskellige

ribotyper. Ved opslag i Rigshospitalets database kan det ses, at der fra januar 2008 til

december 2011 har været identificeret 90 isolater af E. coli ribotype 129-S1. De 90

isolater har et varierende resistensmønster, hvilket tyder på, at det er en klon, der har

været længe på Rigshospitalet, eller som muterer hurtigt (Andersen, 2012).

Det konkluderes, at der er fundet multiresistente E. coli ribotype 129-S1 ved alle

prøvetagningssteder. Da de har forskellige resistensmønstrer, er det sandsynligt, at de E.

coli ribotype 129-S1, der er fundet ved Renseanlæg Lynetten, ikke er de samme som de,

der er fundet ved Rigshospitalet. Men det kan ikke udelukkes, at det er de samme, da

resistensmønstret kan ændre sig på vejen gennem kloaksystemet.

14

4.3 Klebsiella – ribotyper og resistensmønstre

Tabel 4-5 viser resistensmønstre for Klebsiella stammer dyrket fra spildevandsprøverne

fra Rigshospitalet og indløbet til RL. Der blev ikke isoleret nogle resistente Klebsiella

stammer i spildevandet fra indløbet til biologisk rensning på RL eller i udløbet fra RL.

Der blev generelt ikke fundet lige så mange multiresistente Klebsiella stammer som

resistente E. coli stammer. Der var 10 multiresistente Klebsiella stammer fra

spildevandsprøven fra Rigshospitalet med 3 forskellige resistensmønstre. Der var 2

multiresistente Klebsiella stammer fra spildevandet fra tilløbet til RL, og begge

stammer havde samme resistensmønster. De multiresistente Klebsiella stammer, der

blev udvalgt til ribotypning, er markeret med en grå kasse i Tabel 4-5.

Tabel 4-5 Resistensmønstre for de 10 dyrkede Klebsiella stammer fra spildevandsprøven fra Rigshospitalet og de to stammer fra tilløb til RL.

Rigshospitalet RL tilløb

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

Fra agarplade

med

ciprofloxacin

R R R F R R F F

R R R F R R F F

R I R F

R R R F

R R R F

Fra agarplade

med cefuroxim I R R F

Fra agarplade

med gentamicin

R R R F

R R R F

R R R F

R R R F

Resultaterne af ribotypningen af de udvalgte Klebsiella stammer er vist i Tabel 4-6. Der

blev fundet tre ribotyper ialt. To af de tre udvalgte stammer fra Rigshospitalet havde

samme ribotype, 876-S1.

15

Tabel 4-6 Ribotyper for de analyserede multiresistente Klebsiella fundet i spildevandet fra Rigshospitalet, tilløb til RL, tilløb til biologisk rensning på RL og udløb fra RL. Resistens over for ciprofloxacin, cefuroxim, gentamicin og meropenem er også vist. F betyder følsom, I betyder intermediær, og R betyder resistent.

Prøvetagningssted

cip

rofl

ox

acin

cefu

rox

im

gen

tam

icin

mer

op

enem

Ribotype

Rigshospitalet

R R R F 876-S1

I R R F 876-S1

R R R F 233-S7

RL tilløb R R F F 111-S6

16

5 KONKLUSION

Hovedkonklusion af nærværende projekt er, at det ikke kan udelukkes, at de

multiresistente bakterier fundet ved Renseanlæg Lynetten stammer fra Rigshospitalet.

Konklusionerne kan opdeles baseret på testbakterierne E. coli, Klebsiella og

enterokokker.

For E. coli blev 16 stammer udvalgt til ribotypning. Samme ribotype, 129-S1, blev

fundet ved alle fire prøvetagningssteder, både på Rigshospitalet og Renseanlæg

Lynetten. Der er således mulighed for, at resistente bakterier af denne ribotype ved

Renseanlæg Lynetten er kommet fra Rigshospitalet. Bakterierne med ribotype 129-

S1 fra de fire prøvetagningssteder har dog alle forskellige resistensmønstre, hvilket

vil sige, at de er resistente for forskellige antibiotika. Stammerne er således ikke

ens, selvom de har samme ribotype.

Forskellen i resistensmønstre kan skyldes flere ting. Det er muligt, at bakterierne

har fået/tabt resistensegenskaber over for visse antibiotika via overførsel med andre

bakterier i kloaksystemet. Det er også muligt, at samme ribotype er forekommet på

Rigshospitalet med forskellige resistensmønstre.

Der blev udvalgt 4 Klebsiella stammer til ribotypning, tre fra Rigshospitalets

spildevand og én fra tilløbet til Renseanlæg Lynetten. Ribotypen fra tilløbet til RL

var forskellig fra ribotyperne identificeret i Rigshospitalets spildevand.

Der blev ikke fundet vancomycinresistente enterokokker.

Dertil kan tilføjes, at det kun er et begrænset antal stammer, der er udvalgt til ribotypning. Det er

muligt, at der har været andre ribotyper, som er forekommet ved mere end et af

prøvetagningsstederne, men som bare ikke er blevet identificeret.

17

6 ANBEFALINGER

For at få mere viden omkring kilder til multiresistente bakterier i oplandet til

Renseanlæg Lynetten kræves videre undersøgelser af spildevandet i oplandet til

renseanlægget. Metoden med ribotypning af multiresistente stammer kan ikke

fastlægge, hvorfra en bestemt bakterie stammer. Metoden kan derimod påvise, at en

stamme fundet ved renseanlægget er den samme som en stamme identificeret ved en

specifik kilde (i dette tilfælde Rigshospitalet). Resultaterne af nærværende studie har på

denne måde vist, at der er en vis sandsynlighed for, at nogle af de multiresistente

bakterier fundet ved Renseanlæg Lynetten stammer fra Rigshospitalet. Resultaterne kan

dog ikke udelukke, at de multiresistente stammer fundet ved renseanlægget kommer fra

andre kilder i oplandet, da indholdet af multiresistente bakterier og deres ribotyper ikke

kendes for f.eks. husspildevand.

Det videre arbejde med sporing af resistens i oplandet til Renseanlæg Lynetten

anbefales at indeholde prøvetagning af spildevand flere steder i oplandet samt

efterfølgende ribotypning af fundne multiresistente stammer. Prøver af spildevand taget

opstrøms fra Rigshospitalet vil belyse indholdet af multiresistente bakterier og deres

ribotyper i spildevand uden påvirkning af et hospital. Sammen med prøver fra

Rigshospitalet vil det være muligt at lave en sammenligning, der giver et billede af, om

der er visse ribotyper, der primært er hospitalsspecifikke, og om der generelt er stor

forskel på indholdet af multiresistente bakterier i hospitalsspildevand og husspildevand.

Flere prøver vil gøre det muligt mere nøjagtigt at bedømme, om Rigshospitalet er en

betydelig kilde til multiresistente bakterier på Renseanlæg Lynetten.

En fremtidig undersøgelse kunne også indeholde prøvetagning og ribotypning af

multiresistente bakterier i spildevand fra andre hospitaler i oplandet for at belyse, om de

ribotyper, der er kendt fra Rigshospitalet, er specifikke for Rigshospitalet, eller om de er

fælles for hospitaler generelt.

18

7 REFERENCER

Andersen, L. P., 2012

Personlig kommunikation om tidligere forekomst af ribotyper på Rigshospitalet

Carman R. J., Genheimer, C. W., Rafii, F., Park, M., Hiltonsmith, M. F. & Lyerly, D.

M., 2009

Diversity of moxifloxacin resistance during a nosocomial outbreak of a predominantly

ribotype ARU027 Clostridium difficile diarrhea

Anaerobe, 15, s. 244-248

Center for Disease Control, 2010

Laboratory Detection of Imipenem or Meropenem Resistance in Gram-negative Organ-

isms

http://www.cdc.gov/HAI/settings/lab/lab_imipenem.html#a5

Cheung, T. K. M., Wai Chu, Y., Yu Chu, M., Ha Ma, C., Hung Yung, R. W. & Man

Kam, K., 2005

Plasmid-mediated resistance to ciprofloxacin and cefotaxime in clinical isolates of Sal-

monellsa enterica serotype Enteritidis in Hong Kong

Journal of Antimocrobial Chemotherapy, 56, s. 586-589

Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004

Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologis referencegruppe vedrørende antibiotika

resistensbestemmelse- Klaringsrapport

http://www.dskm.dk/pdf/rapporter/DSKM-rapporter/klaringsrapport-RETTET.pdf

DHI, 2011

Pharmaceuticals Database

Eniro/Krak, 2011

Kort over København og Øresund

http://map.krak.dk/

Erichsen, A.E., Kaas, H., Dannisøe, J., Mark, O. og Jørgensen, C., 2006

Etablering af badevandsprofiler og varslingssystemer i henhold til EU's nye

badevandsdirektiv

Miljøprojekt Nr. 1101

EUCAST, 2011

Data from the EUCAST MIC distribution website

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

http://eucast.org

Fujisawa-Kon, N., Ike, Y., Shimizu, S. Motohashi, K., Hashimoto, H. & Mitsuhashi, S.,

1981

Identification of R plasmids mediating gentamicin resistance from Escherichia coli

strains in Japan

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 19(6), s. 1070

Infektionshygiejnisk Enhed, 2007

19

Årsberetning 2007

http://www.rigshospitalet.dk/NR/rdonlyres/D9F7172B-190D-4DA0-81B3-

E347DE24F197/0/IHE%C3%A5rsberetning2007.pdf

Kaufhold, A. & Potgieter, E., 1993

Chromosomally mediated high-level gentamicin resistance in Streptococcus mitis

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(12), s. 2740-2742

Lynettefællesskabet I/S, 2004

Måleprogram- Antibiotikaresistens I spildevand fra et sygehus og et boligområde

Samarbejdsprojekt mellem Lynettefællesskabets Miljøgruppe og Statens Serum Institut.

Rapport udarbejdet af DHI.

Lynettefællesskabet I/S, 2007

Kortlægning og vurdering af spildevand med antibiotika og resistente bakterier fra

hospitaler

Rapport udarbejdet af DHI.

Marcinek, H., Wirth, R., Muscholl-Silberhorn, A. & Gauer, M.,1998

Enterococcus faecalis gene transfer under natural conditions in municipal sewage wa-

ter treatment plants

Applied Environmental Microbiology, 64(2), s. 626-632

Miljøstyrelsen, 2002

Occurrence and fate of antibiotic resistant bacteria in sewage

Miljøprojekt Nr. 722

OUH, 2009

Årsrapport 2009

Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Odense Universitetshospital

Statens Serum Institut, 2010

Fakta om antibiotikaforbrug: Antibiotikaforbrug i Danmark

http://www.ssi.dk/Smitteberedskab/Om%20overvaagning/Antibiotikaforbrug/Fakta%20

om%20antibiotikaforbrug.aspx

Schreiber, C., 2011

Einträge, Vorkommen, Verbreitung und gesundheitliche Bedeutung

antibiotikaresistenter Bakterien in Abwasser und Gewässern

Ph.D., Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

Schumacher, H., Skibsted, U., Skov, R. & Scheibel, J., 1996

Cefuroxime Resistance in Escherichia coli. Resistance Mechanisms and Prevalence.

APMIS- Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 104, s. 531-

538

Suh Yah, C., 2010

Plasmid-Encoded Multidrug Resistance: A case study of Salmonella and Shigella from

neteric diarrhea sources among humans

Biological Research, 43, s. 141-148

20

21

B I L A G

22

23

BILAG A

Protokol for bestemmelse af resistens mod ciprofloxacin, gentamicin og ce-

furoxim hos Escherichia coli og coliforme

Definition

Suspekte E. coli defineres som violette kolonier på Oxoid Brilliance E. coli/coliform selective

agar (CM1046). Coliforme defineres som lyserøde kolonioer på Oxoid Brilliance E.

coli/coliform selective agar (CM1046) efter inkubation i 24 timer ved 44 °C.

Prøvetagning og transport

Prøverne er udtaget, og transport er arrangeret af DHI - UAI.

Reagenser

Trypton-saltvand:

Trypton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g

Oxoid Brilliance E. coli/coliform selective agar (CM1046) (28.1 g/l) med og uden antibiotika.

Natrium-cefuroxim, Sigma-Aldrich C4417-1G. Der opløses 80 mg i 10 ml MQ vand og tilsat

1,00 ml/l agar.

Gentamicin opløsning, Sigma-Aldrich G1397-10ML (50 mg/l). Der tilsættes 80 µl/l agar.

Ciprofloxacin. Sigma-Aldrich 17850-5G-F. Der afvejes 100 mg/100 ml sterilt MQ-vand med 1

ml 1M HCl og tilsættes 1 ml/l agar.

Udførelse

Der laves 10-fold fortyndingsrække.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Brilliance uden antibiotika.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Brilliance tilsat ciprofloxacin

(1 mg/l), gentamicin (4 mg/l) eller cefuroxim (8 mg/l).

Plader inkuberes ved 44 °C i 22-26 timer.

Aflæsning

Alle violette kolonier tælles som suspekte E. coli.

Alle pink kolonier tælles som coliforme.

Alle tydeligt blå eller farveløse kolonier anses for at være andre end E. coli eller coliforme.

Kolonier, der er pink, men med svag blå nuance, tælles som coliforme.

Det ene sæt plader sendes til IHE efter tælling.

Kontroller

E. coli ATCC 25922 er følsom over for ciprofloxacin (MIC < 0,015 mg/l), gentamicin (MIC =

0,1 – 1 µg/ml) og cefuroxim (MIC = 2 – 8 µg/ml) og anvendes som positiv kontrol. Spredes også

på agar uden antibiotika for substratkontrol.

24

25

BILAG B

Protokol for bestemmelse af resistens mod vancomycin hos suspekte

enterokokker

Definition

Suspekte enterokokker defineres som bakterier der ved 44 °C ± 0,5 °C kan vokse på Slanetz &

Bartley Agar (Oxoid) under reduktion af TTC.

Prøvetagning og transport

Prøverne er udtaget, og transport er arrangeret af DHI - UAI.

Reagenser

Pepton-saltvand (ISO8199:1988)

Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g

Vancomycin, Sigma-Aldrich 861987-250mg. Der er opløst 40 mg/10 ml MQ-vand og tilsat 1

ml/l agar.

Slanetz & Bartley (Oxoid) agar.

Udførelse

Der laves 10-fold fortyndingsrække.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Slanezt agar uden antibiotika.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i duplikat på Slanezt agar med vancomycin

(4 µg/ml).

Plader inkuberes ved 44°C ± 0,5°C i 44 ± 4 timer.

Alle kolonier, der vokser frem som røde kolonier, tælles. Der laves ikke verifikation.

Andelen af suspekte enterokokker, der vokser på agar med antibiotika, beregnes.

Kontroller

Enterococcus faecalis ATCC 29212 anvendes som positiv kontrol (MIC 2 – 6 mg/l). Spredes

også på agar uden antibiotika for substratkontrol.

26

27

BILAG C

Protokol for bestemmelse af resistens mod ciprofloxacin, gentamicin og

cefuroxim hos suspekte Klebsiella

Definition

Suspekte Klebsiella sp. defineres her som kolonier, der giver ”purple-magenta” farvede kolonier

på HiCrome™ Klebsiella Selective Agar efter inkubation i 24 timer ved 37 °C.

Prøvetagning og transport

Prøverudtagning og transport arrangeres af DHI - UAI.

Reagenser:

Pepton-saltvand (ISO8199:1988)

Pepton 1,0 g, natriumklorid 8,5 g

Natrium-cefuroxim, Sigma-Aldrich C4417-1G. Der er opløst 80 mg i 10 ml MQ vand og tilsat

1,00 ml/l agar.

Gentamicin opløsning, Sigma-Aldrich G1397-10ML (50 mg/l). Der tilsættes 80 µl/l agar.

Ciprofloxacin. Sigma-Aldrich 17850-5G-F. Der afvejes 100 mg/100 ml sterilt MQ-vand med 1

ml 1M HCl og tilsættes 1 ml/l agar.

Udførelse

Der lave 10-fold fortyndingsrække.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i dublikat på HiCrome™ Klebsiella

Selective Agar uden antibiotika.

Der spredes 0,1 ml af prøve og fortyndinger af prøve i dublikat på HiCrome™ Klebsiella

Selective Agar tilsat ciprofloxacin (1 mg/l), gentamicin (4 mg/l) eller cefuroxim (8 mg/l).

Plader inkuberes ved 37 °C i 22-26 timer.

Alle ”purple-magneta” kolonier tælles som suspekte Klebsiella sp.

Hvis der er stor usikkerhed om vurdering af positive kolonier, føres et passende udvalg (cirka 5

fra hver prøve uden antibiotikum og 5 fra hver prøve med gentamicin) videre på HiCrome™

Klebsiella Selective Agar for yderligere verifikation. Klebsiella sp er store fede kolonier.

Kontroller

Der anvendes ikke kontroller, idet det antages, at antibiotika aktiviteten kontrolleres i forbindelse

med undersøgelse af E. coli. Årsagen er, at vi ikke har en kontrolstamme med kendt følsomhed.

28

Analyser, muslingeprøver

DHI: Muslingekød blendes 10 % (gwt/vol) og spredes som angivet for spildevandsprøver.

Desuden dyrkes op i MacConkey bouillon med og uden antibiotika (ciprofloxacin 1 mg/l,

gentamicin 4 mg/l, eller cefuroxim 8 mg/l). Rør sendes til IHE.

29

BILAG D

IHEs resultater for enterokokker dyrket på Slanetz agar.

30

31

BILAG E

32

33

BILAG F

IHEs resultater for E.coli, Klebsiella og enterokokker i sedimentprøverne fra Kongedybet.