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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
CARRERA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES
Detección molecular de infección natural por Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia
bigemina (Smith & Kilborne, 1893), en garrapatas y tres grupos de mamíferos
domésticos asociados a fincas en dos parroquias rurales de la Amazonía
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del Título de
Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales
Autora: Herrera Mosquera Irma Vanessa
Tutora: Ph. D. Ana Yoleida Soto Vivas
Quito, Septiembre 2017
ii
© DERECHOS DE AUTOR
Yo Irma Vanessa Herrera Mosquera en calidad de autora y titular de los derechos morales
y patrimoniales del trabajo de titulación Detección molecular de infección natural por
Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893), en
garrapatas y tres grupos de mamíferos domésticos asociados a fincas en dos
parroquias rurales de la Amazonía modalidad Proyecto de Investigación, de
conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE
LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la
Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el
uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos
los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Declaro que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y
no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier
reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda
responsabilidad.
Firma:
Irma Vanessa Herrera Mosquera
c.c.n° 1722758743
Telf: 0995476760
E-mail: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL (LOS)
TUTOR(ES)
Yo, Ana Yoleida Soto Vivas, en calidad de tutora del trabajo de titulación: Detección
molecular de infección natural por Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia bigemina
(Smith & Kilborne, 1893), en garrapatas y tres grupos de mamíferos domésticos
asociados a fincas en dos parroquias rurales de la Amazonía, elaborado por Irma
Vanessa Herrera Mosquera, estudiante de la Carrera de Ciencias Biológicas y
Ambientales, Facultad de Biología de la Universidad Central del Ecuador, considero que
el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el
campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador
que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea
habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad
Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito a los 4 días del mes de julio del año 2017
--------------------------------------------------
Firma
Ph. D. Ana Yoleida Soto Vivas
c.c.n° 1757541719
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Paulina Guarderas, MSc. como Presidenta, Stefan Brück,
MSc. y Camila Acosta López, MSc. como Vocales.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del
título (o grado académico) de Licenciada en Ciencias Biológicas y Ambientales
presentado por la señorita Irma Vanessa Herrera Mosquera.
Con el título:
Detección molecular de infección natural por Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia
bigemina (Smith & Kilborne, 1893), en garrapatas y tres grupos de mamíferos
domésticos asociados a fincas en dos parroquias rurales de la Amazonía.
Emite el siguiente veredicto: APROBADO
Fecha: 14, Septiembre, 2017
Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Vocal 1 Paulina Guarderas, MSc. 19
Vocal 2 Camila Acosta López, MSc. 18
Vocal 3 Stefan Brück, MSc. 20
v
DEDICATORIA
A mi familia Margarita, Angélica, Pablo, Nubia y Andreita, por todo su apoyo y cariño.
A mis amigos, los de antes y los de hoy por formar parte de mi vida.
vi
RECONOCIMIENTOS
Al Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis, al proyecto “Artrópodos
vectores silvestres y reservorios domésticos como indicadores de vulnerabilidad a
enfermedades re-emergentes zoonóticas en la Amazonía ecuatoriana”, por el
financiamiento del presente estudio, a la Unidad de Entomología Aplicada del Instituto,
con especial gratitud a Sandra Enríquez y Jazzmín Arrivillaga por guiar la realización del
proyecto, al Ing. Lenin Ron por su apoyo en los análisis estadísticos.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pág.
LISTA DE TABLAS………………………………………………………………..xiii
LISTA DE GRÁFICOS………………………….………………………………….xiii
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………….xiii
ANEXOS…………………………………………………………………………….xiii
RESUMEN…………………………………………………………………………...xv
I CAPÍTULO
1. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………...1
1.1. Breve descripción de la especie Babesia bovis……………………………………3
1.2. Breve descripción de la especie Babesia bigemina……………………………….4
1.3. Profilaxis de la babesiosis en fincas ganaderas……………………………………4
1.4. Vectores de Babesia spp…………………………………………………………..4
1.5. Eco-epidemiología de la babesiosis……………………………………………….6
1.5.1. Estabilidad Enzoótica……………………………………………………………6
1.5.2. Otros hospedadores vertebrados…………………………………………………7
1.6. Detección de B. bovis y B. bigemina en el vector…………………………………7
1.7. Detección de B. bovis y B. bigemina en el hospedador……………………………7
1.8. Marcadores moleculares para la detección de B. bovis y B. bigemina…………….8
viii
II CAPÍTULO
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………………10
2.1. OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………...11
2.1.1. Objetivos específicos……………………………………………………………11
2.2. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………12
III CAPÍTULO
3. METODOLOGÍA…………………………………………………………………..13
3.1. Área de estudio……………………………………………………………………13
3.1.1. Parroquia rural García Moreno………………………………………………….13
3.1.2. Parroquia rural Aguas Negras…………………………………………………..14
3.2. Diseño experimental………………………………………………………………14
3.3. Población de estudio vertebrados………………………………………………….15
3.4. Población de estudio invertebrados……………………………………………….15
3.5. Tamaño de la muestra de mamíferos domésticos…………………………………15
3.5.1. Cálculo de muestra para población infinita……………………………………..15
3.5.2. Cálculo del tamaño de muestra para población finita………………...................16
3.6. Tamaño de la muestra de garrapatas………………………………………………16
3.7. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………17
3.7.1. Controles positivos para detectar B. bovis y B. bigemina……………………….17
3.7.2. Extracción de ADN de sangre de hospedadores vertebrados……………………17
ix
3.7.3. Extracción de ADN en glándulas salivales de garrapatas………………………17
3.8. PCR anidada para la detección de B. bovis y B. bigemina………………………..18
3.9. Amplificación del gen RAP-1 y SPEI AVAI para B. bovis y B. bigemina……….19
3.10. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar los amplicones del gen RAP-1 de
B. bovis y SPEI-AVAI de B. bigemina…………………………………………………19
3.11. Cálculo de tasa de la infección y porcentaje de positividad a B. bovis y B.
bigemina………………………………………………………………………………..20
3.12. Análisis de similaridad global de las secuencias obtenidas…………………..….20
3.13. Análisis estadístico de los datos………………………………………………….21
IV CAPÍTULO
4. RESULTADOS……………………………………………………………………...23
4.1. Porcentaje de positividad…………………………………………………………..23
4.1.1. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina por parroquia, zona y
localidad………………………………………………………………………………...23
4.1.2. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina en garrapatas……………….25
4.1.3. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina en hospedadores vertebrados
domésticos……………………………………………………………………………...26
4.2. Tasa mínima de infección natural…………………………………………………27
4.2.1. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en garrapatas, de acuerdo a la
Parroquia rural………………………………………………………………………….27
4.2.2. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en hospedadores domésticos
vertebrados por Parroquia rural…………………………………………………………29
4.3. Secuenciamiento de muestras positivas a B. bovis y B. bigemina………………...29
4.3.1. Distancia por método Neighbor-Joining para B. bovis…………………………..30
x
4.3.2. Distancia por método Neighbor-Joining para B. bigemina………………………31
4.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS…………………………………………….......32
V CAPÍTULO
5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………..37
6. RECOMENDACIONES…………………………………………………………….38
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….....39
ANEXOS……………………………………………………………………………….45
LISTA DE TABLAS
1. Edades de hospedadores vertebrados domésticos……………………………………22
2. Localidades positivas a Babesia spp…………………………………………………24
3. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por edad del hospedador vertebrado……..27
LISTA DE GRÁFICOS
1. Ciclo vital de Babesia sp. en vector y hospedador……………………………………3
LISTA DE FIGURAS
1. Porcentaje de positividad a B. bovis, B. bigemina y co-infección en garrapatas……..25
2. Porcentaje de positividad a B. bovis, B. bigemina y co-infección, en hospedadores
vertebrados……………………………………………………………………………...26
3. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en garrapatas, en las Parroquias
rurales Aguas Negras y García Moreno…………………………………………………28
4. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en hospedadores vertebrados
domésticos de las Parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno…………………29
5. Análisis de distancia Neighbor-joining del gen Rap-1 para B. bovis………………..30
6. Análisis de distancia Neighbor-joining del fragmento Spe I Ava I para B. bigemina...31
xi
LISTA DE ANEXOS
1. Fotografía de gel de agarosa con muestras positivas a B. bovis y B. bigemina
2. Secuencias obtenidas del Gen-bank para B. bovis
3. Secuencias obtenidas del Gen-bank para B. bigemina
4. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por Parroquia Rural.
5. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por tipo de zona.
6. Porcentaje de positividad a B. bovis por tipo de zona.
7. Porcentaje de positividad a B. bigemina por tipo de zona.
8. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por especie de garrapata.
9. Porcentaje de positividad a B. bovis por especie de vector.
10. Porcentaje de positividad a B. bigemina por especie de vector.
11. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por grupo de hospedador vertebrado.
12. Porcentaje de positividad a B. bovis por grupo de hospedador vertebrado.
13. Porcentaje de positividad a B. bigemina por grupo de hospedador vertebrado.
14. Resultados de secuenciación e identidad de las muestras positivas a B. bovis y B.
bigemina.
15. Disección de garrapatas para extracción de glándulas salivales.
16. Extracción de ADN desde sangre de hospedadores vertebrados.
17. Extracción de ADN desde glándulas salivales de garrapatas.
18. PCR para ADN de garrapatas y hospedadores vertebrados.
19. Preparación de gel de agarosa al 2 %.
20. Certificado e traducción del resumen.
xii
Tema: Detección molecular de infección natural por Babesia bovis (Babes, 1888) y
Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893), en garrapatas y tres grupos de
mamíferos domésticos asociados a fincas en dos parroquias rurales de la amazonía.
RESUMEN
La babesiosis es una enfermedad causada por hemoparásitos del género Babesia, se
transmite por la picadura de garrapatas de la familia Ixodidae. Los síntomas que produce
son hemoglobinuria, anemia, fiebre, ictericia e incluso la muerte; afecta a mamíferos
silvestres, domésticos y al ser humano. Frecuentemente B. bovis y B. bigemina infectan
al ganado bovino en Latinoamérica, produciendo importantes pérdidas económicas en el
sector, además se han reportado equinos y caninos infectados por dichas especies. El
objetivo del estudio fue determinar la tasa de infección natural por B. bovis y B. bigemina,
mediante PCR anidada en ADN de garrapatas, bovinos, equinos y caninos procedentes
de las parroquias rurales amazónicas Aguas Negras y García Moreno. Se concluye que el
vector es determinante en la transmisión de Babesia spp., ya que donde se controla el
vector los porcentajes y las tasas de infección disminuyen. B. bovis y B. bigemina amplían
su lista de hospedadores vertebrados e invertebrados, lo que les da éxito de circulación.
Palabras clave: Babesia, garrapatas, bovinos, equinos, caninos, infección natural.
xiii
Title: Molecular detection of a natural infection caused by Babesia bovis (Babes, 1888)
and Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893) in ticks and three groups of domestic
mammals associated with farms in two rural areas of the Amazon region.
ABSTRACT
Babesiosis is an illness caused by hemoparasites of the Babesia genus, transmitted by the
bite of ticks belonging to the Ixodidae family. The symptoms produced by this disease
are hemoglobinuria, anemia, fever, jaundice and even death; affecting wild mammals,
domestic mammals and human beings. Frecuently B. bovis and B. bigemina infect cattle
in Latin America, causing significant economic losses in the livestock sector; in addition,
equines and canines have been reported to be infected by these species. The objective of
this study was to determine the natural infection rate for B. bovis and B. bigemina by
means of nested PCR in the DNA of ticks, bovines, equines and canines from Amazon
rural areas in Aguas Negras and García Moreno localities. It is concluded that the vector
is determinant in the transmission of Babesia spp., when the vector is controlled the
percentages and infection rates decrease. B. bovis and B. bigemina increase their list of
vertebrate and invertebrate hosts, which gives them a higher circulation success.
Key words: Babesia, ticks, cattle, equines, canines, natural infection.
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original document in Spanish
_________________
M.Sc. Jimmy Torres
Certified Traslator: Fulbright Commission
ID: 1716957590 SENESCYT:1005-05-602038
1
CAPÍTULO I
1. MARCO TEÓRICO
La babesiosis es una enfermedad producida por protozoarios del género Babesia (Babes,
1888), son hemoparásitos obligados, se internan en los eritrocitos de células sanguíneas.
Afecta a mamíferos silvestres, domésticos e incluso al ser humano (Mohamen et al.,
2016) y se transmite por la picadura de garrapatas del Orden Ixodida (Michel et al., 2014).
La infección por Babesia sp. inmunosuprime y pueden manifestarse los síntomas que
definen la enfermedad, siendo más comunes la anemia, hemoglobinuria, ictericia y
estados febriles (Mtshali y Mtshali, 2013).
El género Babesia, pertenece al Reino: Protista, Phylum: Aplicomplexa, Clase:
Piroplasma, Orden: Piroplasmida, Familia: Babesidae (Hernández, 2012), el nombre del
Phylum deriva de un órgano ubicado en el polo apical del parásito, asociado a la invasión
y adhesión a la célula hospedera (Cox, 2002).
Existen más de 100 especies de Babesia descritas con amplia distribución mundial,
(Wójcik-Fatla et al., 2015), menos de 20 tienen importancia médica (Rodríguez, 2007).
Afectan a fauna doméstica, principalmente al ganado bovino (Mtshali et al., 2013)
produciendo pérdidas económicas importantes en éste sector (Da Silva et al., 2013).
En Latinoamérica los hemoparásitos Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia bigemina
(Smith y Kilborne, 1893), son los principales agentes de infección en bovinos. B. bovis
2
es más frecuente, sin embargo es común encontrar en el hospedador doméstico infección
por ambos patógenos (Oliveira et al., 2005; Zapata et al., 2011; Da Silva et al., 2013).
El vector principal es la garrapata Riphicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini,
1887), especie distribuida ampliamente en los trópicos y subtrópicos (Oliveira et al.,
2005; Mercado et al., 2011; Sharma et al., 2016). El ciclo de vida de Babesia spp. es
complejo y depende de las interacciones biológicas entre el vector y hospedadores. En la
garrapata Babesia spp. presenta formas sexuales, el ciclo inicia cuando ésta ingiere sangre
de un hospedador infectado, seguidamente ocurre rompimiento de eritrocitos para dejar
formas intracelulares en el intestino donde se desarrollan hasta producir vermículos que
perforan la pared intestinal. Unos vermículos se transportan a través de la hemolinfa hacia
los óvulos no quitinizados, produciendo la transmisión trans-ovárica o infección de
huevos que se mantendrá en ninfas y adultas. Otros irán a las glándulas salivales de la
garrapata para transmitir nuevamente el patógeno a un hospedador, a esta forma infectiva
se denomina esporozoito (Polanco y Ríos, 2016). El ciclo de vida de Babesia spp. en el
hospedador vertebrado se da asexualmente por gemación e inicia cuando la garrapata
inocula sustancias anticoagulantes, vasodilatadoras y los esporozoitos presentes en sus
glándulas salivales.
Los esporozoitos se internan en los eritrocitos donde ocurre la multiplicación de los
parásitos, los cuales por procesos de lisis celular invaden a otros hematíes, mismos que
serán ingeridos nuevamente por la garrapata (Bravo, 2012) (Gráfico 1).
3
Gráfico 1. Ciclo vital de Babesia sp. en vector y hospedador (Mosqueda et al., 2012)
1.1.Breve descripción de la especie Babesia bovis
La especie B. bovis, mide aproximadamente 2,4 x 1,5 um, presenta formas ameboideas,
piriformes o redondeadas, pueden presentar una vacuola que le da la apariencia de un
parásito con forma anillada (Hernández, 2012). Tiene un período de incubación de 10 a
12 días, la enfermedad se manifiesta en las siguientes 3 a 4 semanas. Es la más patogénica
con respecto a otras Babesias debido a que afecta al sistema nervioso central. Los
síntomas, además de fiebre y diarrea pueden incluir convulsiones, parálisis, atrofias
musculares y estados de coma (Gasque, 2008; Zapata et al., 2011). La tasa de morbilidad
4
es de 40 % y en brotes graves hasta el 90 % (SENASA, 2017), cuando los síntomas del
sistema nerviosos central se agudizan el pronóstico es reservado y generalmente concluye
con la muerte del bovino. Para prevenir la enfermedad por B. bovis se inoculan en los
animales cepas atenuadas del patógeno en altas concentraciones (Gasque, 2008).
1.2. Breve descripción de la especie Babesia bigemina
La especie B. bigemina, es grande y pleomórfica, mide 5 x 3 um de diámetro, puede
ocupar hasta ¾ partes del eritrocito, presenta un par de corpúsculos unidos que tienen
forma de pera (Hernández, 2012). El período de incubación es de 3 a 4 días, la enfermedad
se manifiesta entre 2 a 3 semanas después de la picadura del vector, el primer síntoma es
la fiebre, seguido de anemia, hemoglobinuria y hemoglobinemia como consecuencia de
la lisis de eritrocitos sanguíneos (Gasque, 2008; Zapata et al., 2011), la tasa de mortalidad
es inferior al 10 % (Hernández, 2012). Existen vacunas desarrolladas con cepas atenuadas
y virulentas de B. bigemina que son efectivas cuando se inoculan en animales jóvenes
(Gasque 2008; Rojas et al., 2011).
1.3.Profilaxis de la babesiosis en fincas ganaderas.
Debido a que el vector es determinante en la transmisión de los patógenos del género
Babesia en fincas ganaderas, la prevención se realiza mediante el control químico del
ectoparásito. Los productos más utilizados son organofosforados, amitraz y piretroides,
que se aplican por rocío o inmersión del hospedador, sin embargo debido al uso
permanente de éstos se ha demostrado que ciertas especies de garrapatas han desarrollado
resistencia a químicos como el amitraz (Rodríguez et al., 2014).
1.4. Vectores de Babesia spp.
En el Ecuador hay 30 especies de garrapatas de los géneros Amblyomma (Koch, 1844),
Dermacentor (Koch, 1844), Haemaphysalis (Koch, 1844), Ixodes (Latrielle, 1795) y
5
Rhipicephalus (Koch, 1844), que tienen un rol importante en la ecología y transmisión de
infecciones producidas por patógenos como la Babesia sp., (Pesquera et al., 2015).
Las garrapatas pertenecen al Phylum Artrópoda, Clase Arachnida Orden Acari, Suborden
Ixodida, Familia Ixodidae (Márquez et al, 2005). A dicha familia se les conoce como
garrapatas duras y tiene mayor importancia a nivel médico veterinario (Estrada, 2015).
Después de los mosquitos son el grupo más importante de artrópodos que transmiten
patógenos a humanos y otros vertebrados, son hematófagas obligadas, en todo su ciclo de
vida requieren de sangre para su desarrollo (Brites et al., 2015), transmiten protozoarios,
bacterias, virus y hongos que provocan enfermedades en el organismo parasitado como
la babesiosis (Pesquera et al., 2015).
El ciclo de vida de las garrapatas duras incluye una etapa inactiva o no hematófaga y
pertenece a la fase de huevo, a la eclosión le siguen tres etapas activas o de hematofagia
que son larva, ninfa y adulto, el paso de un estadío a otro implica la ingesta de un volumen
considerable de sangre del hospedador, seguido de la ecdisis del artrópodo (Márquez et
al., 2005). El tiempo de alimentación o hematofagia en garrapatas suele durar varios días,
dependiendo de la especie y la etapa en la que se encuentre (Faccioli, 2011).
Para fijarse al hospedador se manifiestan dos comportamientos, uno activo cuando la
garrapata busca a su hospedador y se denomina “de cazador” o de forma pasiva cuando
la garrapata espera el paso del hospedador para fijarse en él y se denomina “de acechador”
(Polanco y Ríos, 2016). La garrapata detecta mediante estructuras quimiorreceptoras del
órgano de Haller, presiones parciales de anhídrido carbónico, dióxido de carbono,
corrientes de aire, luz, humedad y olores del animal hospedador, entonces estira el primer
par de patas para llegar a él y fijarse en un sitio adecuado, de acuerdo al número de
hospedadores que parasitan, pueden ser: monofásicas o de un solo hospedador, difásicas
6
o de dos hospedadores y trifásicas o de tres hospedadores que no necesariamente son de
la misma especie (Márquez et al., 2005)
1.5. Eco-epidemiología de la babesiosis.
La babesiosis bovina tiene amplia distribución mundial, siendo más frecuente en las zonas
tropicales, es una de las enfermedades más importantes del ganado en África, Australia,
gran parte de Asia, Centro y Sur América donde se estima que entre 50% a 70% de ganado
está en riesgo de contraer la infección (PAHO, 2003).
La transmisión de B. bovis y B. bigemina está estrechamente ligada a la presencia de la
garrapata R. (B.) microplus (Sharma et al., 2016), a su vez la presencia del vector está
determinada por factores climáticos (Zapata et al., 2011), siendo los más importantes la
precipitación y humedad. Los picos poblacionales altos del vector se registran en épocas
secas (Álvarez et al., 2003). Polanco y Ríos (2016), afirman que la falta de humedad es
letal para los huevos y su exceso es dañina ya que proliferan en ellas hongos.
Factores que influyen en el desarrollo de signos clínicos son la raza, edad, sexo del
hospedador, Ribera et al. (1999) mencionan que las razas de bovinos de origen europeo
son más susceptibles a infección por B. bovis y menos a B. bigemina. De Sena et al.
(2011) afirman que animales en edades tempranas no presentan signos clínicos aunque
tienen la infección y desarrollan cierta inmunidad futura.
1.5.1. Estabilidad Enzoótica
Las zonas con estabilidad enzoótica se refiere a aquellos sitios donde al menos el 75 %
de animales contraen la infección por Babesia durante sus primeros nueves meses de vida
(Ríos et al., 2010). De acuerdo con Vanzini y Ramírez (1994), estas infecciones son sub-
clínicas y le confieren al animal inmunidad prolongada, misma que se renueva con nuevas
7
picaduras de garrapatas. Debido al bajo porcentaje de animales que contraen la infección
en edad adulta es poco probable que se presenten brotes epidemiológicos.
1.5.2. Otros hospedadores vertebrados
La babesiosis afecta también a equinos y caninos, mismos que son susceptibles de
contraer infección a B. bovis y B. bigemina, con respecto a esto Buling et al. (2007)
detectaron mediante análisis molecular en Argentina y España, equinos con infección por
B. bovis y B. bigemina, mientras Birkenheuer et al. (2004) encontraron infección por B.
bigemina en caninos domésticos de Carolina del Norte en Estados Unidos.
1.6. Detección de B. bovis y B. bigemina en el vector.
Para la detección de B. bovis y B. bigemina en el vector, se usan pruebas moleculares,
extrayendo el ADN de macerados de garrapatas o sus glándulas salivales, que es donde
se encuentra la forma infectiva del patógeno, se realiza PCR debido a que es altamente
sensible y específica (Oliveira et al., 2005; Harrus et al., 2010; Tavassoli et al., 2013).
1.7. Detección de B. bovis y B. bigemina en el hospedador.
El método directo de frotis sanguíneo es considerado la prueba de oro para detectar a
Babesia sp., este consiste en extender una fina capa de sangre sobre una placa de vidrio
para llevar a observar al patógeno en el microscopio, esta herramienta es eficaz en cuanto
a tiempo y costo (Da Silva et al., 2013).
Las desventajas del diagnóstico directo es que requieren de altas parasitemias para
detectar al patógeno y dependen de la experticia del observador para determinar la
especie, (Oliveira et al., 2005; Mtshali et al., 2013) por ello se complementan con otras
más sensibles y específicas como las inmunológicas y moleculares (Yang et al., 2016).
8
El diagnóstico de B. bovis indirecto por imunofluorescencia consiste en detectar antígenos
producidos por la infección, ya que dicha especie afecta el sistema nervioso central
también se realizan biopsias cerebrales (Gasque, 2008). La detección de B. bigemina en
casos agudos se realiza por frotis sanguíneo tinturado con giemsa y en casos crónicos se
diagnóstica con pruebas serológicas (Gasque, 2008).
Sharma et al. (2016) encontraron que las pruebas de PCR para la diagnosis de Babesia
sp, son más sensibles y específicas para la detección y búsqueda de este hemoparásito en
sangre de animales sospechosos clínicamente, obteniéndose valores contrastantes entre el
método de frotis de sangre 1,6% frente a 16,42 % por PCR.
La primera prueba por PCR para detectar a Babesia sp. se realizó en 1992, a partir de
entonces se han desarrollado adaptaciones a esta herramienta para obtener mejores
resultados, para detectar a B. bovis y B. bigemina se realiza PCR anidada, que consiste en
realizar una PCR adicional al producto de la primera, con el uso de primers específicos,
lo que resulta altamente sensible a la detección del patógeno, por ejemplo, para B. bovis,
en la primera PCR se puede obtener un parásito en 1⁷ eritrocitos y con PCR anidada se
obtiene un parásito en 1⁹ eritrocitos (Mosqueda et al., 2012).
1.8. Marcadores moleculares para la detección de B. bovis y B. bigemina.
Los marcadores moleculares más utilizados para detectar a B. bovis y B. bigemina,
corresponden a las secciones: gen citocromo-b, Gen msa-1 y msa-2c, subunidades
pequeñas de ARNr, el factor de elongación alfa (EF-1α), el gen de la ß-Tubulina, SBP 1-
2-3, los genes Rap y el gen Bv, su uso varía de acuerdo a la región geográfica así como
al grado de conservación genética (Ríos y Ríos, 2011).
El gen Rap-1 debido a su alto grado de similaridad genética en distintas regiones
geográficas, es frecuentemente usado como región blanco para la detección molecular en
9
las fases tempranas y tardías de la infección por B. bovis, teniendo una especificidad de
entre el 98-100%, ya que es una región altamente conservada (Ríos y Ríos, 2011).
En B. bigemina el gen Rap-1 presenta más polimorfismos genéticos, por esta razón
Figueroa et al., (1992) utilizaron un fragmento de ADN cortado con la enzima de
restricción Spe I-Ava I, con el cual se obtuvo excelentes resultados. A partir de ello se
diseñó dos pares de oligonucleótidos utilizados para la detección de B. bigemina
(Figueroa y Álvarez, 2003).
10
CAPÍTULO II
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La infección parasitaria por Babesia sp. afecta a mamíferos domésticos, principalmente
a las especies ganaderas, hecho frecuente en la región de los trópicos y sub-trópicos,
donde predominan B. bovis y B. bigemina (Hunfeld et al., 2008). Según Zapata et al.
(2011) se estima que más de 900 millones de cabezas de ganado están en riesgo de
contraer la infección por Babesia sp. con alta probabilidad de desarrollar la enfermedad,
esto se traduce en pérdidas económicas que ascienden a 800 millones de dólares al año.
La prevención de esta infección parasitaria a nivel mundial se centra en el control químico
del vector, lo que ha conducido a problemas como la resistencia a ixodicidas (Mosqueda
et al., 2012), son pocos los estudios enfocados en el monitoreo eco-epidemiológico
preventivo en zonas no endémicas o que no reportan la enfermedad, pero que debido a
sus características climáticas tienen alto potencial de circulación de los patógenos, dando
lugar a posibles brotes epidemiológicos (Oliveira et al., 2005).
En la Amazonía ecuatoriana ya se ha reportado infección por Babesia spp. en ganado
bovino sintomático de las provincias de Napo y Sucumbíos (Vasco, 2013), sin embargo
no existen estudios de B. bovis y B. bigemina en zonas sin evidencia de la enfermedad,
como es el caso de las parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno, ubicadas en las
provincias de Sucumbíos y Orellana respectivamente, que son zonas con ganadería a nivel
local (GAD-AN, 2015, GAD-GM, 2015).
Existen reportes de B. bovis en equinos y B. bigemina en caninos, pero se desconoce las
tasas de infección en estos hospedadores y su rol en la circulación de los patógenos a nivel
11
enzoótico (Birkenheuer et al., 2004; Buling et al., 2007), aspecto que tampoco ha sido
evaluado en el Ecuador.
Con estos antecedentes se formula la siguiente pregunta de investigación:
¿Cuál es el porcentaje de infección natural a B. bovis y B. bigemina en garrapatas,
equinos, bovinos y caninos, derivado de la circulación enzoótica en las parroquias rurales
amazónicas Aguas Negras, Provincia de Sucumbíos y García Moreno, Provincia de
Orellana?
2.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la infección natural por B. bovis y B. bigemina mediante la técnica de PCR
anidada en garrapatas (Orden Ixodida) y en sangre de bovinos, equinos y caninos
asociados a fincas en las parroquias rurales amazónicas Agua Negras y García Moreno.
2.1.1. Objetivos específicos
Determinar el porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina en las especies
de garrapatas y en el grupo de vertebrados domésticos (bovinos, equinos, caninos)
por localidad, zona y parroquia.
Determinar la tasa mínima de infección natural a B. bovis y B. bigemina en las
especies de garrapatas y en el grupo de vertebrados domésticos (bovinos, equinos,
caninos), por parroquia rural.
Comparar mediante análisis de similaridad global las secuencias del gen Rap-1
para B. bovis y el fragmento de restricción Spe I Ava I para B. bigemina obtenidas
de garrapatas, bovinos, equinos y caninos.
12
2.2. JUSTIFICACIÓN
En la parroquia rural García Moreno, Provincia de Orellana, el 17% del territorio está
dedicado a la producción agropecuaria, con un incremento anual estimado de 31% (GAD-
GM, 2015). Mientras que en la Parroquia rural Aguas Negras, Provincia de Sucumbíos,
el 19% del territorio se destina a la producción agropecuaria, siendo la segunda actividad
económica en la localidad. Esto implica fragmentación del hábitat por actividades
antrópicas, lo cual no solo amenaza a la calidad del ecosistema terrestre local, sino que
cambia los patrones de circulación de patógenos enzoóticos aumentando el riesgo de
infección por B. bovis y B. bigemina en nuevas especies de garrapatas y en hospedadores
domésticos. En estas localidades no se reporta casos clínicos, sin embargo es importante
determinar si existen hospedadores domésticos asintomáticos, ya que podrían jugar un rol
clave en la dinámica de transmisión de los patógenos (Arrivillaga y Caraballo, 2009).
13
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1. Área de estudio
El presente estudio se realizó con la información recopilada y muestras colectadas en la
Amazonía ecuatoriana, en las provincias Orellana, Parroquia rural García Moreno y
Sucumbíos, Parroquia rural Aguas Negras, como parte del proyecto “Artrópodos:
vectores silvestres y reservorios domésticos como indicadores de vulnerabilidad a
enfermedades re-emergentes zoonóticas en la Amazonía ecuatoriana”, (SE-377773),
desarrollado por el Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis, en los meses
de agosto y septiembre del año 2015.” A continuación se detallan las características
geográficas, climáticas, ecológicas de las parroquias rurales, así como las localidades y
zonas del área de estudio:
3.1.1. Parroquia rural García Moreno
Ubicada en las coordenadas 0°36’33,81’’S y 76°59’1,62’’O, se extiende por 131,719
Km², altitud promedio de 300 msnm, precipitación anual de 3000 mm, temperatura media
de 24 °C, humedad relativa de 80 % (GAD-GM, 2015). Según el Sistema de clasificación
de los ecosistemas del Ecuador corresponde a bosque siempre verde de tierras bajas
(MAE, 2013).
La Parroquia tiene nueve localidades, al norte están las localidades: García Moreno (S 0°
31'40,7" 77°1'9"), Marián 10 (S 0°29'2,4" 76°59'2,8") y Kilómetro 1 (S 0°32'56,9"
77°1'27,3"). Al sur oeste están las localidades: La Magdalena (S 0°33'28,2" 77°1'31,5"),
14
Centro (S 0°34'31,3" 77°1'40") y Flor de la Palma (S 0°36'26,4" 76°59'58,7"). Al este se
encuentran las localidades: Lobo 4 (S 0°32'36,9" 77°3'2,9"), Puerto Colón (S 0°33'38,1"
77°4'38") y Las Palmas (S 0°35'21,8" 77°1'55,4"). Por cada localidad se muestrearon
entre tres a siete fincas, las mismas que se clasificaron de acuerdo a su ubicación en zonas
urbanas, zonas periurbanas y zonas cercanas a bosque.
Parroquia rural Aguas Negras
Ubicado en las coordenadas 0°07’ S y 76°25’ O, con una superficie de 453 Km², un rango
altitudinal de 200 a 300 msnm, temperatura promedio anual de 24°C, precipitación anual
de 3150 mm y una humedad relativa de 88% (GAD-AN, 2015), de acuerdo al Sistema de
clasificación de los ecosistemas del Ecuador continental corresponde a bosque siempre
verde de tierras bajas y bosque inundable de la llanura aluvial (MAE, 2013).
Debido a que gran parte del territorio corresponde a la Reserva faunística Cuyabeno, las
nueve localidades de muestreo se ubicaron hacia la parte Este de la Parroquia. En el centro
se encuentran las localidades Flor de Oro (S 0°8'0" 76°18'2,7"), Aguas Negras (S
0°8'44,9" 76°16'11,6") y San Vicente (S 0°8'4,2" 76°18'5,5"). Al norte-este, se encuentran
las localidades: Marian 10 (S 0°4'25,3" 76°16'30,7"), Marian 4 (S 0°5'17,4" 76°16'24,1")
y Comunidad Iwia (S 0°5'12,8" 76°16'36,8"). Al sur-este se encuentran las localidades:
26 de Junio (S 0°10'42,5" 76°14'52,7"), Las Palmas (S 0°5'3,7" 76°13'41,9") y Rey de los
Andes (S 0°12'5,7" 76°14'17,1"). El número de fincas muestreadas por localidad oscila
entre tres a siete y también fueron clasificadas por su ubicación en zonas urbanas, zonas
periurbanas y zonas cercanas a bosque.
3.2. Diseño experimental
Este estudio fue una investigación de tipo descriptiva que consistió en describir y medir
las variables identificadas y sus posibles interrelaciones (Manterola y Otzen, 2014), para
15
ello se analizó molecularmente muestras biológicas de garrapatas y sangre de bovinos,
equinos y caninos, en busca de los hemoparásitos B. bovis y B. bigemina.
3.3. Población de estudio vertebrados
Sangre periférica tomada de la vena caudal de bovinos mayores de 6 meses de las especies
Bos taurus (Linnaeus, 1758) y Bos indicus (Linnaeus, 1758), tomada de la vena yugular
de equinos mayores de 6 meses del género Equus caballus (Linnaeus, 1758) y de la vena
safena de caninos mayores de un año de la especie Canis lupus familiaris (Linnaeus,
1758), las cuales fueron colocadas en tubos con anti-coagulante y almacenadas a - 20°C.
3.4. Población de estudio invertebrados
Garrapatas de las especies Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787), A. ovale (Koch,
1844), Dermacentor nitens (Neumann, 1897), Ripicephalus sanguineus (Latreille, 1806)
y R. (B.) microplus, colectadas sobre bovinos, equinos y caninos en fincas ganaderas de
las parroquias rurales y se conservaron en etanol absoluto en la Unidad de Entomología
Aplicada del CIZ.
3.5. Tamaño de la muestra de mamíferos domésticos
3.5.1. Cálculo de muestra para población infinita:
Para calcular el tamaño de muestra para bovinos, equinos y caninos se aplicó la ecuación
para poblaciones infinitas, utilizando la tasa de infección mínima de 20% que proponen
Quijada et al. (1998): n = (Zα)² *p*q / e²
Dónde:
n: corresponde al tamaño de muestra.
Z: nivel de confianza (1.96).
p: % de infección mínima para Latinoamérica (20%) (Quijada et al., 1998)
q: expectativa de no encontrar la infección (80%).
e: Error estimado (0,05)
16
Así:
3.5.2. Cálculo del tamaño de muestra para población finita:
Una vez conocido el número de la población infinita, se determinó la muestra de bovinos,
equinos y caninos aplicando la fórmula de Thrusfield (2007), para poblaciones conocidas,
utilizando el número total de animales muestreados por grupo: n= N * n ∞ / N +n ∞
Dónde:
a) Muestra bovinos, equinos y caninos de García Moreno:
b) Muestra bovinos, equinos y caninos de Aguas Negras:
3.6. Tamaño de la muestra de garrapatas
El número total de garrapatas colectadas fue de 435 para García Moreno y de 571 para
Aguas Negras, correspondientes a adultos, ninfas y larvas. Para este estudio se tomó
únicamente adultos debido a que su tamaño es ideal en la disección y obtención de
órganos internos usados en la extracción de ADN, bajo este criterio el tamaño de muestra
fue de 96 individuos (22 %) de García Moreno y 170 individuos (30%) de Aguas Negras.
n= (1,96)² *20 *80 = 6146,56 = 245/localidad
0,05² 0,05²
n: es el tamaño de la muestra.
N: es tamaño de la muestra (conocida)
n ∞: corresponde al tamaño de la población infinita.
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 127 * 245 / 127 + 245 = 31115 / 372 = 83 bovinos
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 31 * 245 / 31 + 245 = 7595 / 276 = 27 equinos
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 93 * 245 / 93 +245 = 22785 / 338 = 67 caninos
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 199 * 245 / 199 + 245 = 48755 / 444 = 117 bovinos
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 18 * 245 / 18 + 245 = 4410 / 263 = 17 equinos
n= N * n ∞ / N +n ∞ = 82 * 245 / 82 + 245 = 20090 / 327 = 61 caninos
17
3.7. MATERIALES Y MÉTODOS
3.7.1. Controles positivos para detectar B. bovis y B. bigemina.
Los controles positivos para este estudio se obtuvieron a partir de muestras de sangre de
bovinos, que fueron facilitados por el Instituto de Genética de la Universidad Nacional
de Colombia en Noviembre de 2015, en colaboración con el Dr. Richar Rodríguez, estas
se conservan en el banco de sueros del Centro Internacional de Zoonosis (CIZ) a -80°C.
3.7.2. Extracción de ADN de sangre de hospedadores vertebrados.
La extracción de ADN se realizó con el método para pequeños volúmenes de sangre,
tomado y modificado de Riera et al. (2010) que consistió en:
Trasferir 500 uL de sangre con anticoagulante a un tubo de 1.5 mL, adicionar 540 uL de
buffer GR, homogenizar (vórtex) por 1 minuto, centrifugar por 3 minutos a 13000 rpm y
descartar el sobrenadante. Repetir los pasos 2 y 3 por al menos 3 veces, añadir 180 uL de
buffer GB, adicionar 20 uL de proteinasa K en buffer PK (20 mg/mL), añadir 6 uL de
SDS al 20% agitar por un minuto. Incubar por 2 horas a 56 °C, a 1000 rpm y dejar enfriar
a temperatura ambiente. Se añade 9 uL de AcK 3M y se homogeniza suavemente, se
centrifuga a 13000 rpm por 5 minutos y se trasfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
Repetir pasos 9 y 10, añadir 600 uL de etanol absoluto a -20 °C e incubar toda la noche.
Centrifugar a 13000 rpm durante 5 minutos y descartar el sobrenadante, lavar el pellet
con 100 uL de etanol al 70%, centrifugar a 13000 rpm durante 5 minutos y descartar el
sobrenadante, dejar secar el pellet a 37 °C, añadir 50 uL de buffer TE e incubar a
temperatura ambiente por 20 minutos, almacenar a -20 °C hasta amplificar.
3.7.3. Extracción de ADN en glándulas salivales de garrapatas.
Se transfirió las garrapatas de etanol absoluto a agua destilada para hidratar sus órganos
internos durante 24 horas. Al día siguiente se diseccionaron para extraer sus glándulas
18
salivales, colocándolas dorsalmente sobre una caja petri pequeña con plastilina, donde se
sujetaron con una aguja de disección en la porción anterior del escudo. Con un bisturí se
hizo un corte lateral en el lado derecho anterior del escudo hacia abajo y luego en el lado
izquierdo, con pinzas entomológicas se extrajeron las glándulas salivales y se colocaron
en tubos con buffer de hidratación (Mastropaolo et al., 2014). Para obtener el ADN, se
aplicó el método chélex, tomado y modificado de Echeverría et al. (2015) que constó de:
a) Pre-tratamiento e hidratación: Colocar la muestra en 50 uL de buffer de hidratación
e incubar toda la noche a temperatura 37°C.
b) Extracción: Cortar la muestra con tijeras, y triturar con un micro-mortero con pistilo
(Kontes), centrifugar por 10 minutos a 13000 rpm, descartar el sobrenadante, añadir 100
uL de buffer TEX con CHELEX® 100 al 20 %, agitar vigorosamente, adicionar 40 uL de
proteinasa K en buffer PK (20 mg/mL) y agitar, incubar toda la noche a 56 °C a 1000
rpm, centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo,
etiquetar y almacenar a – 20 °C hasta amplificar.
3.8. PCR anidada para la detección de B. bovis y B. bigemina.
El ADN extraído de muestras de garrapatas y de sangre periférica, se usó de molde para
la amplificación del gen Rap-1 y Spe I Ava I. Los cebadores utilizados en la primera fase
de PCR fueron BigF y BigR, que amplificaron un fragmento de 278 pb del fragmento Spe
I Ava I para B. bigemina y los cebadores BovF y BovR del gen Rap-1, que amplificaron
un fragmento de 350 pb de B. bovis (Ríos y Ríos, 2011; Souza et al., 2014). A
continuación se indica la secuencia de los cebadores utilizados en la PCR:
BigF: 5’ CATCTAATTTCTCTCCATACCCCTCC 3’
BigR: 5’ CCTCGGCTTCAACTCTGATGCCAAAG 3’
BovF: 5’ CACGAGGAAGGAACTACCATGTTGA 3’
BovR: 5’ CCAAGGAGCTTCAACGTACGAGGTCA 3’
19
Las condiciones de reacción para la primera PCR fue: Buffer 1X, MgCl 1,5mM, dNTP`s
0,2mM, Primer 1 (Big F) 0,4uM, Primer 2 (Big R) 0,4uM, Primer 3 (Bov F) 0,4uM,
Primer 4 (Bov R) 0,4uM, H2O. El volumen final fue de 20ul y se utilizó un volumen de
muestra de 5 uL (Mtshali et al., 2013; Mera, 2015).
El producto resultante de la primera PCR, fue el modelo de ADN para la segunda PCR,
completándose el protocolo PCR-nested, se empleó las mismas condiciones de reacción
de la primera PCR, pero se usaron nuevos cebadores para la amplificación y 1 ul de
muestra, para un volumen final de 25 ul por reacción de PCR. Los primers utilizados
fueron BigNF y BigNR que amplificaron un fragmento de 170 pares de bases del
fragmento Spe I Ava I de B. bigemina y los cebadores BovnNF y BovnNR, que
amplificaron un fragmento de 290 pares de bases del gen Rap-1 de B. bovis (Souza et al.,
2014). A continuación se muestra la secuencia del segundo juego de cebadores:
3.9. Amplificación del gen Rap-1 y Spe I Ava I para B. bovis y B. bigemina.
Los productos de PCR se amplificaron con el siguiente programa para el termociclador:
Desnaturalización inicial a 95 °C por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturalización 95 °C por
30 segundos, hibridación a 56 °C por 45 segundos, extensión a 72 °C por 1 minuto y una
extensión final a 72 °C por 10 minutos (Mtshali et al., 2013).
3.10. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar los amplicones del gen Rap-1
de B. bovis y Spe I-Ava I de B. bigemina
De acuerdo a los pares de bases amplificados, de 170 para B. bovis y 290 para B.
bigemina, se elaboró un gel de Agarosa al 2%, con buffer TBE en concentración 5 x
BigNF: 5’ CGCAAGCCCAGCACGCCCCGGTGC 3’
BigNR: 5’ CCGACCTGGATAGGCTGTGTGATG 3’
BovNF: 5’ TCAACAAGGTACTCTATATGGCTACC 3’
BovNR: 5’ CTACCGAGCAGAACCTTCTTCACCAT 3’
20
(Mtshali et al., 2013). Se tomaron 2 uL de buffer de carga y 5 uL de muestra, se colocó
en los pocillos un control negativo que carece de muestra y dos positivos, uno de B. bovis
y otro de B. bigemina, se dejó correr en la cámara de electroforesis por 40 min. a 80
voltios. Para determinar si una muestra es positiva o negativa se visualizó las bandas en
el trans-iluminador de UV y se comparó con las bandas de control positivo y negativo,
adicionalmente los resultados se registraron fotográficamente (Anexo 1).
3.11. Cálculo de la tasa de infección y porcentaje de positividad a B. bovis y B.
bigemina
Para calcular el porcentaje de positividad y la tasa mínima de infección a B. bovis y B.
bigemina se aplicaron las siguientes fórmulas.
a) Porcentaje de positividad en garrapatas: Número de garrapatas positivas a Babesia
spp. / Número de garrapatas procesadas *100, por especie de garrapata y patógeno.
b) Porcentaje de positividad en hospedadores vertebrados: Número de hospedadores
vertebrados positivos a Babesia spp. / Número de hospedadores vertebrados procesados
*100. Para cada grupo (bovinos, equinos, caninos).
c) Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en garrapatas: Número de
garrapatas positivas Babesia spp. / Número total garrapatas colectadas*100.
d) Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en hospedadores vertebrados:
Número de hospedadores vertebrados positivos a Babesia spp. / Número total de
hospedadores vertebrados *100. Para cada grupo (bovinos, equinos, caninos).
3.12. Análisis de similaridad global de las secuencias obtenidas.
Las secuencias obtenidas del gen Rap-1 se compararon con secuencias del Gen-Bank de
Asia (Sri Lanka, China), América (Cuba, Brasil, Colombia) y Europa (Portugal), que
21
tuvieron identidades de 98 % y 99 % con las de este estudio, además se comparó con otras
de vacunas elaboradas en base al gen Rap-1 de B. bovis y B. bigemina (Anexo 2).
Las secuencias obtenidas del fragmento de restricción Spe I Ava I de B. bigemina, se
compararon con secuencias del Gen-Bank de Asia (India), Europa (Portugal), Oceanía
(Australia), que presentaron identidades de 94 % con las de este estudio (Anexo 3).
Posteriormente se compararon utilizando el programa Basic Local Alignment Search
Tool o BLAST (Altschul et al., 2011). Para determinar el grado de similaridad global de
las secuencias del gen Rap-1 y el fragmento Spe I Ava I amplificadas, se realizó el análisis
de Neighbor-joining con el modelo de Kimura 2 parámetros, que se encuentra disponible
en el programa MEGA 6.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), (Tamura et al.,
2013). Esto se hizo siguiendo los protocolos de Arrivillaga et al. (2002); Lessman et al.
(2011). Debido a que varias secuencias formaron parte de un mismo grupo, se tomó uno
o dos representantes de garrapatas, bovinos, equinos y caninos, para tener mejor
visualización en los árboles de los grupos obtenidos.
3.13. Análisis estadístico de los datos
Cabe recalcar que para este estudio se usó la información recopilada por el Proyecto
Artrópodos (código SE-377773), referente a los animales domésticos muestreados y las
garrapatas colectadas en la Amazonía. Se tomó datos de los animales domésticos, como
especie, edad y la presencia e identificación de garrapatas en cada finca, para construir
una base de datos donde se ingresó los resultados de los análisis asociados a la diagnosis
molecular y secuenciación de las dos especies de Babesia.
Con los resultados de los análisis moleculares para detección de B. bovis y B. bigemina
en hospedadores y garrapatas, se calculó los porcentajes de positividad y la tasa mínima
de infección natural por especie de Babesia a nivel de grupo (bovino, equino, canino) y
22
especie de garrapata. Adicionalmente se calculó ambos parámetros por parroquia, zona y
localidad. Para determinar si la variable positividad a Babesia spp. se relacionó con la
especie vertebrada, invertebrada, localidad, zona y parroquia se realizó análisis de
frecuencia Chi2, Pearson. Todos estos cálculos se realizaron en el programa R Studio,
versión 3.3.3 (Team R, 2013). Para analizar la positividad por edad de hospedador
doméstico se clasificó a los grupos en infantes, juveniles y adultos (Tabla 1).
Tabla 1. Edades de hospedadores vertebrados domésticos
CATEGORÍA CANINOS BOVINOS EQUINOS
Infante 0 - 9 meses 0 - 12 meses 0 - 2 años
Juvenil 10 meses - 1,5 años 1 - 2 años 2 - 4 años
Adulto 1,6 años en adelante 2 años en adelante 4 años en adelante
23
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS
4.1. Porcentaje de positividad
4.1.1. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina por parroquia, zona y
localidad
La Parroquia rural Aguas Negras, mostró el mayor porcentaje de positividad a Babesia
spp. con 38,63 % (17/44), mientras que García Moreno reveló menor porcentaje con 29,54
% (13/44). Estadísticamente la variable positividad a Babesia spp. no tiene relación con
la Parroquia rural (Pearson: p = 0.4999, Fisher: p = 0.5003) (Anexo 4).
Dentro de las parroquias Aguas Negras y García Moreno, las fincas ubicadas en zonas
cercanas a bosque mostraron el mayor porcentaje de positividad a Babesia spp. con el
57,69 % (15/26), seguido de las zonas periurbanas con 25,49 % (13/51), mientras que en
las zonas urbanas el porcentaje de positividad fue de 18,18 % (2/11). Estadísticamente las
variables tipo de zona y la positividad a Babesia spp. están relacionadas (Pearson: p =
0.009262, Fisher: p = 0.01185) (Anexo 5).
Las zonas cercanas a bosques reflejaron mayor porcentaje de infección a B. bovis con el
50 %, seguido de las zonas periurbanas con 17,64 % y en menor porcentaje para las zonas
urbanas con 9 %. Existe una relación estadística positiva entre el patógeno B. bovis y la
zona (Pearson: p = 0.01025, Fisher: p = 0.01366) (Anexo 6).
La especie B. bigemina se mostró en alto porcentaje para las zonas cercanas a bosques
con 42,30 %, seguida de las zonas periurbanas con 15,68 % y en bajo porcentaje en las
24
zonas urbanas con 2,22 %. La relación estadística entre las variables B. bigemina y la
zona, es significativa (Pearson: p = 0.03111, Fisher: p = 0.03751) (Anexo 7).
El porcentaje de positividad a Babesia spp. por localidades se determinó de acuerdo al
número de fincas positivas, los resultados revelaron localidades sin presencia de los
patógenos y localidades donde todas las fincas presentaron positividad a Babesia spp.
Estadísticamente las variables Babesia spp. y la localidad se encontraron relacionadas
(Pearson: p = 0.001497) (Tabla 2).
Tabla 2. Localidades positivas a Babesia spp.
PARROQUIA LOCALIDAD % DE FINCAS POSITIVAS
AGUAS NEGRAS
26 de Junio 25
Aguas Negras 22,22
Comunidad Iwia 33,33
2 de Diciembre 50
Flor de Oro 42,85
Las Palmas 50
Marián 4 33,33
Rey de los Andes 80
San Vicente 33,33
GARCÍA MORENO
Centro 33,33
Flor de la Palma 100
García Moreno 54,54
Kilómetro 1 27,27
La Magdalena 33,33
Las Palmas 0
Lobo 4 0
Marián 10 0
Puerto Colón 0
25
4.1.2. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina en garrapatas
La prueba molecular detectó infección a B. bovis y B. bigemina en R. (B.) microplus, R.
sanguineus y D. nitens y no se encontró a los patógenos en A. ovale y A. cajennense.
En la Parroquia rural García Moreno el 1,92 % (2/96) de garrapatas fueron positivas a B.
bovis y B. bigemina, mientras que la Parroquia rural Aguas Negras reveló el 39,1 %
(23/170) de garrapatas infectadas.
La especie B. bovis fue más frecuente en garrapatas, lo que se tradujo en un mayor
porcentaje de positividad por esta especie, mientras que B. bigemina se presentó en menor
porcentaje (Figura 1).
Figura 1. Porcentaje de positividad a B. bovis, B. bigemina y co-infección en garrapatas
La especie R. (B.) microplus presentó el mayor porcentaje de positividad a Babesia spp.
con el 10,57 % (22/208), seguido de R. sanguineus con 6,66 % (2/30), D. nitens manifestó
el menor porcentaje con 3,84 % (1/26). Las variables Babesia spp. y la especie de
garrapata no estuvieron relacionadas (Pearson: p = 0.781, Fisher: p = 0.706) (Anexo 8).
La especie R. (B.) microplus mostró mayor porcentaje de positividad a B. bovis con 10 %
(21/208) y baja positividad a B. bigemina con 1,9 % (4/208), por el contrario la garrapata
R. sanguineus reveló la mayor positividad a B. bigemina con 6,6 % (2/30) y menor a B.
68%8%
24%
Babesia bovis Babesia bigemina Co-infección
26
bovis con 3,33% (1/30), por otro lado, D. nitens mostró igual porcentaje de positividad a
B. bovis y B. bigemina con 3,84 % (1/26). Estadísticamente el patógeno B. bovis no se
relaciona a la especie de garrapata (Pearson: p = 0.3063, Fisher: p = 0.445) (Anexo 9),
tampoco existe correlación entre las variables B. bigemina y la especie de garrapata
(Pearson: p = 0.2945, Fisher: p = 0.1669) (Anexo 10).
4.1.3. Porcentaje de positividad a B. bovis y B. bigemina en hospedadores
vertebrados domésticos
Los hospedadores vertebrados C. lupus familiaris (caninos), B. taurus, B. taurus x B.
indicus (bovinos), E. caballus y E. caballus x E. asinus (equinos), obtuvieron una
positividad total de 13,22 % (48/363).
La frecuencia de B. bovis y B. bigemina, fue similar para los tres grupos de hospedadores
vertebrados, mostrando porcentajes de positividad y de co-infección similares (Figura 2).
Figura 2. Porcentaje de positividad a B. bovis, B. bigemina y co-infección, en
hospedadores vertebrados
Los hospedadores equinos manifestaron el mayor porcentaje de positividad a Babesia
spp. con 18,18 % (8/44), seguido del grupo de caninos con 17,96 % (23/128) y los bovinos
con 8,90 % (17/191). Estadísticamente existe correlación entre la positividad al patógeno
33%
31%
36%
Babesia bovis Babesia bigemina
Co-infección
27
Babesia spp. y la especie de vertebrado doméstico (Pearson: p = 0.03753, Fisher: p =
0.03183) (Anexo 11).
Los caninos y equinos mostraron similares porcentajes de positividad a B. bovis con 11,71
% (15/128) y 11,6 % (5/44) respectivamente, mientras que los bovinos mostraron menor
porcentaje con 6,28 % (12/191). Estadísticamente no existe relación entre las variables B.
bovis y la especie hospedadora (Pearson: p = 0.1997, Fisher: p = 0.1678) (Anexo 12).
Los hospedadores vertebrados presentaron similares porcentajes de infección a B.
bigemina, siendo en caninos 9,37 % (12/128), en equinos 9 % (4/44) y bovinos 8,37 %
(16/191). Estadísticamente no existe relación entre el patógeno B. bigemina y la especie
hospedadora (Pearson: p = 0.9514, Fisher: p = 0.9321) (Anexo 13).
Se determinó que el porcentaje de positividad a Babesia spp., no está relacionado con la
edad del hospedador (Pearson p = 0.3103, Fisher p = 0.2913) (Tabla 3).
Tabla 3. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por edad del hospedador vertebrado
EDAD AÑOS PORCENTAJE PROPORCIÓN
Infantes 14 % 8/57
Juveniles 21 % 8/30
Adultos 12 % 31/257
4.2. Tasa mínima de infección natural
4.2.1. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en garrapatas, de acuerdo a
la Parroquia rural
En la Parroquia rural Aguas Negras, la tasa mínima de infección mostró similares
porcentajes para R. sanguineus y R. (B.) microplus, y no se reportó infección para la
28
especie D. nitens. La tasa mínima de infección en garrapatas de la Parroquia rural García
Moreno, reveló bajos porcentajes para R. sanguineus y D. nitens, la especie R. (B.)
microplus no se reportó positiva a Babesia spp. en esta Parroquia (Figura 3).
Figura 3. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en garrapatas, en las
Parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno.
0%
3,94
4,35
0,65 0%
1,54
D. nitens R. (Boophilus)microplus
R. sanguineus D. nitens R. (Boophilus)microplus
R. sanguineus
AGUAS NEGRAS GARCÍA MORENO
TASA
MÍN
IMA
DE
INFE
CC
IÓN
PARROQUIA RURAL
0 %
5 %
1 %
2 %
3 %
4 %
29
4.2.2. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en hospedadores domésticos
vertebrados por Parroquia rural
La Parroquia rural Aguas Negras, obtuvo una mayor tasa de infección a Babesia spp. en,
hospedadores caninos, seguido de equinos y una menor tasa en bovinos. En la Parroquia
García Moreno, se determinó una tasa de infección alta en caninos, seguido de bovinos y
fue menor para equinos (Figura 4).
Figura 4. Tasa mínima de infección natural a Babesia spp. en hospedadores vertebrados
domésticos de las Parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno.
4.3. Secuenciamiento de muestras positivas a B. bovis y B. bigemina
En este estudio se obtuvieron secuencias de 21 muestras, derivadas de nueve garrapatas
(R. sanguineus, R. (B.) microplus, D. nitens) y 12 hospedadores (C. lupus familiaris, E.
caballus, Bos spp.). De acuerdo a las secuencias del Gen-Bank, 13 de las 21 pertenecen
a B. bovis y ocho a B. bigemina (Anexo 14).
1,79
39,13
2,02 8,00
31,11
6,82
Bos spp. C. familiaris E. caballus Bos spp. C. familiaris E. caballus
AGUAS NEGRAS GARCÍA MORENO
TASA
MÍN
IMA
DE
INFE
CC
IÓN
PARROQUIA RURAL
5 %
0 %
10 %
15 %
20 %
25 %
30 %
35 %
40 %
30
4.3.1. Distancia por método Neighbor-Joining para B. bovis.
El análisis neighbor-joining (Kimura-2 parámetros) determinó que no existen
divergencias entre las secuencias obtenidas de caninos, bovinos, equinos y garrapatas de
la Amazonía. Además, son altamente similares a las secuencias del grupo control externo
procedentes de Asia, Europa, América y con la vacuna para B. bovis, la vacuna para B.
bigemina se encuentra distante y forma otra rama del árbol (Figura 5).
Figura 5. Análisis de distancia Neighbor-joining del gen Rap-1 para B. bovis
CANINOS Bbovis612CGM
EQUINOS Bbovis610EGM
GARRAPATAS BbovisRBm236CAN
BOVINOS Bbovis601BGM
CANINOS Bbovis268CAN
VACUNAS BbovisVaccine
EXTERNOS BbovisKX365053.1Colombia
BbovisKT312814.1China
BbovisLC157854.1SriLanka
BbovisFJ901342.1Portugal
EXTERNOS
BbovisJF279443.1Cuba
BbovisFJ588009.1BrasilEXTERNOS
CANINOS Bbovis321CAN
VACUNAS BbigeminaRAP1Vaccine
82
20
45
59
12
10
6
13
14
31
4.3.2. Distancia por método Neighbor-Joining para B. bigemina
El análisis de neighbor-joining (Kimura 2 parámetros) determinó que no existen
diferencias poblacionales entre las secuencias de caninos, equinos y garrapatas, además
que éstas son más similares a las provenientes de Asia. Existe una ligera diferenciación
con la secuencia obtenida del bovino 627 de García Moreno, por otra parte los controles
externos de Europa y Oceanía, forman dos grupos separados. (Figura 6).
Figura 6. Análisis de distancia Neighbor-joining del fragmento Spe I Ava I para B.
bigemina
CANINOS Bbigemina607CGM
EQUINOS Bbigemina618EGM
GARRAPATAS BbigeminaRBm372BAN
EXTERNOS BbigeminaAB922127.1India
BOVINOS Bbigemina627BGM
EXTERNOS BbigeminaFJ939724Portugal
EXTERNOS BbigeminaLK055219.1Australia
53
25
88
55
32
4.4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El mayor porcentaje de positividad a Babesia spp. se reporta en la Parroquia rural Aguas
Negras, Provincia de Sucumbíos. Esto se explica por el número de fincas que presentan
infestación por garrapatas en sus animales, además que no se realiza control de las mismas
en caninos y equinos, mientras que en los bovinos el control es cada tres o seis meses o
una vez al año (Datos no publicados Proyecto Artrópodos CIZ, 2015).
En la Parroquia García Moreno, Provincia de Orellana, el porcentaje de positividad fue
menor, esto también coincide con la baja presencia de garrapatas en los tres grupos
hospedadores, ya que existe permanente control de estos ectoparásitos, siendo en caninos
cada tres, seis meses o una vez al año y para bovinos y equinos cada 15 días, o de 1 a 3
meses (Datos no publicados Proyecto Artrópodos CIZ, 2015).
Los resultados obtenidos concuerdan con el estudio de Pazmiño et al. (2016) realizado en
el Camal Metropolitano de Quito, donde se analizó mediante la prueba IFAT, sangre de
bovinos procedente de siete provincias del país y determinaron que el porcentaje de B.
bovis en la provincia de Sucumbíos fue de 7,32 % y en Orellana de 2,44 %. En dicho
estudio no se realizó el análisis para determinar la presencia de B. bigemina.
El mayor porcentaje de animales positivos a la infección por Babesia spp. provienen de
fincas ubicadas en las cercanías a bosque, seguido de las zonas periurbanas. Esto coincide
con el trabajo de Navas et al. (2008), realizado en el bosque tropical Guanacaste en Costa
Rica (80 a 250 msnm), donde se determinó que en sistemas silvopastoriles las poblaciones
de R. (B.) microplus incrementan ya que la presencia de árboles las protege de la
desecación que sufren en las zonas abiertas. Pulido et al. (2015) realizaron un estudio en
el altiplano Cundi-boyacense colombiano (2000-3000 msnm), donde determinaron que la
cobertura de suelo es un factor importante en la presencia de R. (B.) microplus, siendo
33
más favorable para su desarrollo las zonas con cobertura vegetal arbórea y zonas tipo
mosaico, como bosques intervenidos por pastos. Pese a la diferencia altitudinal de los
ecosistemas de Bosque de tierra firme y Bosque inundable en la Amazonía ecuatoriana
(218-459 msnm), la preferencia de hábitat del vector coincide con nuestros resultados.
La especie R. (B.) microplus obtuvo el mayor porcentaje de positividad a Babesia spp.,
esto coincide con el estudio de Oliveira et al. (2005), en Sao Paulo Brasil, quienes la
incriminan como vector exclusivo de B. bovis y B. bigemina, obteniendo porcentajes de
infección de 4,65 % (12/258) y 56,20 % (145/258) respectivamente. Vasco (2013),
analizó a R. (B.) microplus, procedentes de ocho provincias de Ecuador y encontró que
43 % tenían la infección, 15 % a B. bovis, 20 % a B. bigemina y 8 % co-infectadas.
La especie R. sanguineus, mostró un importante porcentaje de positividad a B. bovis y B.
bigemina, por tanto su presencia influye en la circulación de ambos patógenos. Esto
coincide con lo reportado por Tavassoli et al. (2013) en Kurdistán y Azerbaiyán (Irán),
quienes analizaron molecularmente a varias especies de garrapatas encontradas sobre
ganado en busca de patógenos e incriminaron a R. sanguineus en la transmisión de
Babesias bovinas, encontrando infección en 37,5 % (6/16) de los individuos y 62,5 %
(10/16) para cada localidad.
Este estudio reporta por primera vez a D. nitens infectada naturalmente con B. bovis y B.
bigemina, este hallazgo es importante ya que permite conocer más acerca de la interacción
de ambos patógenos con otros hospedadores invertebrados como potenciales reservorios.
Los tres grupos de hospedadores vertebrados, mostraron tasas de infección mínimas a B.
bovis y B. bigemina inferiores al 20 %, esto concuerda con los datos de infección mínima
reportada para Latinoamérica por Quijada et al. (1998). En este estudio los equinos
reportan un importante porcentaje de positividad a Babesia spp. Buling et al. (2007)
34
evaluaron el papel que tienen como reservorios los equinos en España y Argentina,
encontrando en 80 individuos 1,25 % de positividad a B. bovis y 2,5 % a B. bigemina.
Los caninos reportaron en este estudio positividad a B. bovis y B. bigemina, con respecto
a esto, Birkenheuer et al. (2004) encontraron B. bigemina en una hembra canina de
Carolina del Norte (EUA), Chauvin et al. (2009) mencionaron que existe cierta
especificidad entre la especie de Babesia y el hospedador vertebrado, pero excluyen a B.
bovis y B. bigemina que han sido reportadas incluso en mamíferos silvestres del norte de
México, como Odoicoleus virginianus (venado de cola blanca). Antes del presente
estudio no existen reportes en la literatura de B. bovis en caninos, con lo cual la lista de
hospedadores vertebrados se amplia para esta especie.
En los bovinos el porcentaje de positividad tanto a B. bovis como a B. bigemina fue bajo,
este hecho puede deberse al control de garrapatas que se realiza en ganado bovino de las
dos localidades de estudio. Guglielmon, (1995) menciona que la tasa de infección a
Babesia spp. se relaciona con la abundancia del vector, Figueroa et al. (2015) también
hacen referencia al grado de infestación por garrapatas en el hospedador vertebrado y su
directa relación con los porcentajes de positividad a Babesia.
Otro hecho que puede relacionarse a la baja positividad encontrada en bovinos, es que la
mayoría pertenece a cruzas de la especie B. indicus (Datos no publicados CIZ, 2015).
Guglielmon, (1995), afirma que B. indicus posee una resistencia natural a la infestación
por garrapatas, haciéndola menos susceptible de contraer Babesia spp. Rodríguez et al.
(2014) mencionan que B. indicus tiene porcentajes de infestación por garrapatas entre 10
a 20 % más bajos con respecto a B. taurus, además afirman que las cruzas (mestizos) de
la especie B. indicus adquieren dicha resistencia.
35
Según Ríos et al. (2010) se consideran sitios enzóoticos a aquellos en donde la positividad
es superior al 75 % como sucede en el Sudeste de Brasil, donde Oliveira et al. (2005)
reportan porcentajes de positividad superiores al 80 %. Debido a los bajos porcentajes de
infección obtenidos, las parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno no son zonas
con estabilidad enzóoticas para los patógenos B. bovis y B. bigemina.
El patógeno B. bovis fue más frecuente tanto en hospedadores vertebrados como en
invertebrados, esto concuerda con los trabajos de Oliveira et al. (2005); Zapata et al.
(2011) y Da Silva et al. (2013), que mencionan que dicha especie es más abundante en
estos grupos de animales de zonas tropicales.
El porcentaje de hospedadores invertebrados co-infectados fue bajo, esto concuerda con
el estudio de Vasco (2013) que reportó porcentajes inferiores al 10% en R. (B.) microplus
colectados sobre bovinos de Ecuador. Del total de hospedadores vertebrados positivos,
un tercio tuvo co-infección, esto concuerda con lo reportado por Mtshali et al. (2013),
quienes encontraron 27,2 % (117/430) de bovinos en Sudáfrica con los dos patógenos y
difiere con lo reportado por Oliveira et al. (2005) y Silva et al. (2009) quienes reportaron
más del 50 % de infección mixta en bovinos de Brasil y Portugal respectivamente.
Los análisis de similaridad global de secuencias obtenidas para B. bovis, determinaron
que el gen Rap-1 está altamente conservada a nivel mundial en esta especie, debido a que
no hubo diferenciaciones a nivel de grupos internos y externos. Mtshali y Mtsahli (2013),
analizaron secuencias obtenidas en ganado de Sudáfrica del gen Rap-1 y lo compararon
con otras de diferentes países de América. Aplicando el método de Neighbor-joining
determinaron que existe una alta similaridad de las secuencias de Sudáfrica con las de
América. Niu et al., (2015) también compararon secuencias obtenidas del gen Rap-1 de
B. bovis en ganado de China con otras procedentes de varias regiones del mundo,
36
determinando que no existen diferenciaciones significativas entre los aislados internos y
externos, esto lo hicieron mediante análisis de Neighbor-joining.
Con respecto a B. bigemina, se obtuvo sub-agrupaciones de las secuencias internas y
fueron más evidentes con respecto a las secuencias externas procedentes de Portugal y
Australia. Madruga et al. (2002) compararon secuencias de B. bigemina de cinco regiones
de Brasil, determinando por coeficiente de similaridad global que existían dos subgrupos.
En un estudio realizado en Suiza por Hilpertshauser et al. (2007), se analizaron secuencias
obtenidas del gen rARN 18S de B. bigemina y se comparó con otras procedentes de Italia,
España, Turquía, Kenia y México. Ellos determinaron mediante métodos de distancia,
alta variabilidad genética tanto a nivel de grupos internos como externos. Ambos autores
mencionan que B. bigemina se caracteriza por tener alto grado de polimorfismos. Por otro
lado, un estudio sobre la diversidad genética de B. bigemina realizado por Thompson
(2013), menciona que el fragmento Spe I Ava I, puede tener reacciones cruzadas con
algunas cepas de B. bovis. Un hallazgo interesante del presente estudio fue que las
secuencias obtenidas de B. bigemina fueron más similares a las que provienen de India
(Asia), esto podría deberse al lugar de procedencia del ganado, ya que el 91,47 %
(204/223) pertenecen a bovinos mestizos de la especie Bos indicus, que tiene origen en la
India (Datos no publicados Proyecto Artrópodos CIZ, 2015)
37
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES
Los porcentajes de infección más altos se reportan para R. (B.) microplus en la
parroquia rural Aguas Negras y en las fincas cercanas a bosque tanto en Aguas
Negras como en García Moreno. Los hospedadores caninos muestran el mayor
porcentaje de positividad en ambas parroquias.
El vector R. (B.) microplus es determinante en la circulación de los patógenos B.
bovis y B. bigemina, debido a que los mayores porcentajes de positividad están
vinculados a las localidades con bajo control del ectoparásito, así como a las zonas
de bosque, donde la especie tiene mejores condiciones para su desarrollo.
Las tasa de infección más alta se reporta en el grupo de caninos y en R. sanguineus
de Aguas Negras y García Moreno, mientras que R. (B.) microplus tuvo alta tasa
de infección solo en la parroquia Aguas Negras. Los grupos de equinos, bovinos
y D. nitens muestran baja tasa de infección en las dos localidades de estudio.
La lista de hospedadores invertebrados y vertebrados se amplia para B. bovis y B.
bigemina, ya que se reporta por primera vez a D. nitens infectada naturalmente,
aunque con bajo porcentaje de infección y a C. lupus familiaris que debido a las
38
altas tasas de infección que mostraron, estaría cumpliendo un rol importante en la
circulación de los patógenos en ambas parroquias.
Los análisis de similaridad global determinaron que el patógeno B. bovis que
circulan en las parroquias rurales Aguas Negras y García Moreno es el mismo en
todos los grupos hospedadores vertebrados e invertebrados. Mientras que la
especie B. bigemina, se mostró variable en los grupos internos y externos.
6. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar más estudios de monitoreo de los patógenos B. bovis y B.
bigemina, en localidades con riesgo de circulación aún en ausencia de enfermedad.
Ahondar más en el papel que desempeñan en la circulación y posible transmisión de B.
bovis y B. bigemina otros grupos de hospedadores vertebrados e invertebrados.
39
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÀFICAS
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45
ANEXOS
46
Anexo 1. Fotografía de gel de agarosa con muestras positivas a B. bovis y B. bigemina.
Tomada por: Vanessa Herrera, CIZ-2016
Marcador
molecular
Ctr
l. -
-
+ B
. b
ovi
s
+ B
. b
igem
ina
R.
(B.)
m 3
83B
R.
(B.)
m 2
72
B
R.
(B.)
m 2
75
B
47
Anexo 2. Secuencias obtenidas del Gen-bank para el gen Rap-1 de B. bovis
GenBank Autores Título Ident. País
LC157854 Yokoyama N. y Sivakumar
T.
Development of rap-1 gene-based
ELISAs for the serodiagnosis of Babesia
bovis and Babesia bigemina in Sri Lanka
98 % Sri Lanka
KT312814 Niu Q., Liu Z., Yu P., Yang
J., Abdallah M.O., Guan
G., Liu G., Luo J. y Yin H.
Genetic characterization and molecular
survey of Babesia bovis, Babesia
bigemina and Babesia ovata in cattle,
dairy cattle and yaks in China
98 % China
FJ588009 Ramos C.A., Araujo F.R.,
Alves L.C., de Souza I.I.,
Guedes D.S. Jr. y Soares
C.O.
Genetic conservation of potentially
immunogenic proteins among Brazilian
isolates of Babesia bovis
98 % Brasil
FJ901342 Silva M.G., Henriques G.,
Sanchez C., Marques P.X.,
Suarez C.E. y Oliva A.
First survey for Babesia bovis and
Babesia bigemina infection in cattle from
Central and Southern regions of Portugal
using serological and DNA detection
methods
98 % Portugal
KX365053 Jaimes J., Triana O. y Mejia
A.
Parasitological and molecular surveys
reveal high rates of infection with vector-
borne pathogens and clinical signs
associated with infection in cattle from
two important livestock areas in
Colombia
98 % Colombia
JF279443 Obregon D., Corona B.,
Martinez S., Oliveira
M.C., Tizioto P. y Fonseca
A.H.
Diagnóstico de Babesia bovis en búfalos
de la región occidental de Cuba a través
de un ensayo de Npcr
98 % Cuba
KM504166 Molad T., Fleiderovitz L.,
Leibovitz B., Wolkomirsky
R., Behar A. y Markovics
A.
Molecular characterization of the Israeli
B. bovis vaccine strain and field isolates
ND Israel
KP671754 Molad T. y Fleiderovitz L. Molecular characterization of the Israeli
B. bigemina vaccine strain and field
isolates
ND Israel
48
Anexo 3. Secuencias obtenidas del Gen-bank para B. bigemina
GenBank Autores Título Ident. País
AB922127 Kaur P., Juyal P.D., Sharma A.,
Singla L.D., Singh J. y
Mukhopadhyay C.S.
Babesia bigemina: A study on
molecular diagnosis and
haematobiochemical profile of dairy
animals in low lying areas of Punjab
94 % India
LK055219 Jackson A.P., Otto T.D., Darby A.,
Ramaprasad A., Xia D., Echaide
I.E., Farber M., Gahlot S., Gamble
J., Gupta D., Gupta Y., Jackson L.,
Malandrin L., Malas T.B., Moussa
E., Nair M., Reid A.J., Sanders M.,
Sharma J., Tracey A., Quail M.A.,
Weir W., Wastling J.M., Hall N.,
Willadsen P., Lingelbach K.,
Shiels B., Tait A., Berriman M.,
Allred D.R. y Pain A.
The evolutionary dynamics of variant
antigen genes in Babesia reveal a
history of genomic innovation
underlying host-parasite interaction
94 % Australia
FJ939724 Silva M.G., Henriques G.,
Sanchez C., Marques P.X., Suarez
C.E. y Oliva A.
First survey for Babesia bovis and
Babesia bigemina infection in cattle
from Central and Southern regions of
Portugal using serological and DNA
detection methods
94 % Portugal
49
Anexo 4. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por Parroquia Rural. Los valores del
eje Y están en una escala de 0-1.
Anexo 5. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por tipo de zona. Los valores del eje
Y están en una escala de 0-1.
50
Anexo 6. Porcentaje de positividad a B. bovis por tipo de zona. Los valores del eje Y
están en una escala de 0-1.
Anexo 7. Porcentaje de positividad a B. bigemina por tipo de zona. Los valores del eje Y
están en una escala de 0-1.
51
Anexo 8. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por especie de garrapata. Los valores
del eje Y están en una escala de 0-1.
Anexo 9. Porcentaje de positividad a B. bovis por especie de vector. Los valores del eje
Y están en una escala de 0-1.
52
Anexo 10. Porcentaje de positividad a B. bigemina por especie de vector. Los valores del
eje Y están en una escala de 0-1.
Anexo 11. Porcentaje de positividad a Babesia spp. por grupo de hospedador vertebrado.
Los valores del eje Y están en una escala de 0-1.
53
Anexo 12. Porcentaje de positividad a B. bovis por grupo de hospedador vertebrado. Los
valores del eje Y están en una escala de 0-1.
Anexo 13. Porcentaje de positividad a B. bigemina por grupo de hospedador vertebrado.
Los valores del eje Y están en una escala de 0-1.
54
Anexo 14. Resultados de secuenciación e identidad de las muestras positivas a B. bovis y
B. bigemina.
Parroquia Localidad Código Secuencia Sp. Gen-bank
Aguas Negras Aguas Negras R. sanguineus222C ACTTATTTGA-
GTAAACAGTATGAAC….
B. bovis
Aguas Negras Aguas Negras R. microplus236B TTATTTG----
AAACAGTATGAACG….
B. bovis
Aguas Negras 2 de diciembre R. microplus246B A-TTATTTGA-
GTAAACAGTATGAA….
B. bovis
Aguas Negras Iwia R. microplus283E ACTTATTT---
GTAAACAGTATGAAC….
B. bovis
Aguas Negras Iwia R. microplus284B ACTTATT-GA-
GTAAACAGTATGAA….
B. bovis
Aguas Negras Iwia R. microplus285B CTTATTTGAAGTAAA
CAGTAT GAACGC….
B. bovis
Aguas Negras Las Palmas R. microplus372B C-GTCAG-
AATCTTTAAGCTTC….
B. bigemina
Aguas Negras 2 de diciembre 250Canina CG-
CGTTGATCTCCTTGG….
B. bigemina
Aguas Negras Flor de oro 268Canina GAC---GAG---C-
TCGGCGTTGATGC….
B. bovis
Aguas Negras Iwia 288Equina GCGGGCG-
GACCCAGGTCTTCA….
B. bovis
Aguas Negras Rey Andes 321Canina GCGGGCG-
GACCCAGGTCTTCA….
B. bovis
García Moreno García Moreno D. nitens492E CACACAGTATGAACG
CCTGGTTCTTCAA….
B. bovis
García Moreno García Moreno R. sanguineus498C CAGT-
TCTTTAAGCTTCA….
B. bigemina
García Moreno Centro 601Bovina GCCTAAC-TTGACCCGG-
CTTCCC-GATTC….
B. bovis
García Moreno Centro 607Canina AGTCAGTACATCTTTA
AGCTTCATTCCAC….
B. bigemina
García Moreno Centro 610Equina CTTATTTGAAGTAA
ACAGTATGAAC….
B. bovis
García Moreno Centro 612Canina ACTTATTTGA-
GTAAACAGTATGAA….
B. bovis
García Moreno Centro 613Equina CAGTCAGTAATCTTTA
AGCTTCA….
B. bigemina
García Moreno Centro 618Equina CAGTCAGTAATCTTTAA
GCTTCATTCCA….
B. bigemina
García Moreno Centro 627Bovina G-T-G-
AATCTTTGACTTAT….
B. bigemina
García Moreno Centro 629Canina C--GCTATAACTGT-TA-
GTTATTATCAT….
B. bigemina
55
Anexo 15. Disección de garrapatas para extracción de glándulas salivales
Tomada por: Sandra Enríquez, CIZ-2016
Anexo 16. Extracción de ADN desde sangre de hospedadores vertebrados
Tomada por: Franklin Vaca, CIZ-2017
56
Anexo 17. Extracción de ADN desde glándulas salivales de garrapatas
Tomada por: Franklin Vaca, CIZ-2017
Anexo 18. PCR para ADN de garrapatas y hospedadores vertebrados
Tomada por: Franklin Vaca, CIZ-2017
57
Anexo 19. Preparación de gel de agarosa al 2 %
Tomada por: Franklin Vaca, CIZ-2017
Anexo 20. Certificado de traducción del resumen
