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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
Departamento de Sanidad Animal
INFLUENCIA DE LA CATALASA Y DE LA β-TOXINA EN LA PATOGÉNESIS DE “STAPHYLOCOCCUS AUREUS”
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Susana Martínez Pulgarín
Bajo la dirección del doctor
Ricardo de la Fuente López
Madrid, 2005 ISBN: 84-669-2854-5
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE SANIDAD ANIMAL
INFLUENCIA DE LA CATALASA Y DE LA
β-TOXINA EN LA PATOGÉNESIS DE
Staphylococcus aureus
SUSANA MARTÍNEZ PULGARÍN
Memoria presentada para optar al Título de Doctora
por la Universidad Complutense de Madrid
Director de la Tesis Doctoral:
Dr. D. Ricardo de la Fuente López
Madrid, 2005
A todos los que me han acompañado y apoyado durante este viaje: a Rubén, a mi familia, a mis amigos y, especialmente, a mis compañeros.
ÍNDICE
I
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
ÍNDICE
LISTADO DE FIGURAS..........................................................................................................................IV
LISTADO DE TABLAS ..............................................................................................................................V
LISTADO DE ABREVIATURAS ..........................................................................................................VI
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................... 1
1.1. PATOGENIA DE LAS INFECCIONES POR S. aureus ..........................................................4
1.2. FACTORES ASOCIADOS CON LA VIRULENCIA DE S. aureus .......................................6
1.2.1. Componentes superficiales.....................................................................................................7
1.2.1.1. Polisacárido capsular.....................................................................................................7
1.2.1.2. Polisacárido extracelular ...............................................................................................7
1.2.1.3. Proteínas superficiales ..................................................................................................8
1.2.2. Toxinas y enzimas extracelulares...........................................................................................9
1.2.2.1. Toxinas con actividad sobre membranas ..................................................................9
1.2.2.2. Toxinas con actividad de superantígenos................................................................10
1.2.2.3. Enzimas extracelulares ...............................................................................................11
1.2.3. Regulación genética de los factores de virulencia .............................................................12
1.2.3.1. El sistema regulador Agr y otros sistemas reguladores de dos componentes ...13
1.2.3.2. SarA y otras proteínas homólogas ............................................................................14
1.2.3.3. Regulación genética frente al estrés oxidativo ........................................................15
1.3. DEFENSA INNATA DEL HOSPEDADOR: CÉLULAS FAGOCÍTICAS .....................17
1.3.1. Sistema citotóxico oxígeno-dependiente............................................................................18
1.3.2. Sistema citotóxico oxígeno-independiente ........................................................................18
1.3.3. Actividad antimicrobiana de las células no fagocíticas ....................................................19
1.4. CATALASAS BACTERIANAS....................................................................................................20
1.4.1. Catalasa de S. aureus ...............................................................................................................21
1.5. ESFINGOMIELINASAS BACTERIANAS ..............................................................................22
1.5.1. β-toxina de S. aureus...............................................................................................................24
2. OBJETIVOS ..............................................................................................................................................27
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .........................................................................................................31
3.1. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES POR DELECCIÓN DEL GEN katA,
DEL GEN hlb Y DE AMBOS EN S. aureus ...............................................................................33
II
3.1.1. Construcción del mutante ∆katA........................................................................................34
3.1.2. Construcción del mutante ∆hlb............................................................................................35
3.1.3. Construcción del doble mutante ∆katA ∆hlb ....................................................................37
3.2. COMPLEMENTACIÓN DE LOS MUTANTES OBTENIDOS........................................38
3.3. CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LOS MUTANTES OBTENIDOS...............39
3.4. ESTUDIOS DE SUPERVIVENCIA INTRACELULAR.......................................................40
3.4.1. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386 y sus respectivos mutantes ∆katA,
∆hlb y ∆katA ∆hlb en la línea celular J774A.1 ....................................................................41
3.4.2. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386 y sus respectivos mutantes ∆katA,
∆hlb y ∆katA ∆hlb en la línea celular MAC-T ....................................................................49
3.5. ENSAYOS DE VIRULENCIA EN UN MODELO MURINO ...........................................57
4. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................................................65
4.1. CEPAS BACTERIANAS, MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO .........................67
4.2. PLÁSMIDOS....................................................................................................................................68
4.2.1. Construcción de los plásmidos pERkat y pERhlb ...........................................................68
4.2.2. Construcción de los plásmidos pHkat, pHhlb y pHkathlb .............................................72
4.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA .............................................................72
4.3.1. Oligonucleótidos ....................................................................................................................72
4.3.2. Reacción de PCR ...................................................................................................................74
4.4. EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSÓMICO.........................................................................75
4.5. CLONAJE Y TRANSFORMACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN...............................75
4.6. EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS..............................................................................................76
4.7. TRANSFORMACIÓN DE PROTOPLASTOS........................................................................76
4.8. MUTAGÉNESIS POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA ..............................................78
4.9. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALASA.....................................................78
4.10. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA .............................................79
4.11. CURVAS DE CRECIMIENTO .................................................................................................80
4.12. ESTUDIOS IN VITRO DE SUPERVIVENCIA INTRACELULAR ...............................80
4.12.1. Mantenimiento de las líneas celulares...............................................................................80
4.12.2. Preparación de las suspensiones bacterianas...................................................................81
4.12.3. Ensayos de supervivencia intracelular ..............................................................................81
4.13. DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL 50 EN UN MODELO MURINO.................83
4.13.1. Animales de experimentación............................................................................................83
4.13.2. Preparación de las suspensiones bacterianas...................................................................83
4.13.3. Inoculación y determinación de la dosis letal 50 ............................................................83
4.14. MÉTODOS ESTADÍSTICOS....................................................................................................84
III
5. CONCLUSIONES ..................................................................................................................................85
RESUMEN ....................................................................................................................................................89
SUMMARY.....................................................................................................................................................95
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................ 101
IV
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1. Esquema del sistema regulador Agr de S. aureus ...................................................................14
Figura 3.1A. Comprobación por PCR de la transformación de S. aureus 2386 con pERkat .............34
Figura 3.1B. Comprobación por PCR de la delección del gen katA en S. aureus 2386 ......................34
Figura 3.2A. Comprobación por PCR de la transformación de S. aureus 2386 con pERhlb.............35
Figura 3.2B. Comprobación por PCR de la delección del gen hlb en S. aureus 2386..........................35
Figura 3.3. Actividad hemolítica y reacción de CAMP en agar Columbia con un 5% de
sangre de cordero......................................................................................................................36
Figura 3.4. Comprobación por PCR de la delección de los genes katA y hlb en S. aureus 2386 .......37
Figura 3.5. Comprobación por PCR de la complementación de los mutantes ∆katA, ∆hlb
y ∆katA ∆hlb de S. aureus 2386 con los plásmidos pHkat, pHhlb y pHkathlb,
respectivamente.........................................................................................................................38
Figura 3.6. Curvas de crecimiento bacteriano de S. aureus 2386 y sus mutantes ∆katA, ∆hlb y
∆katA ∆hlb .................................................................................................................................39
Figura 3.7. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante
complementado en la línea celular J774A.1 ..........................................................................43
Figura 3.8. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante
complementado en la línea celular J774A.1 ..........................................................................45
Figura 3.9. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho
mutante complementado en la línea celular J774A.1 ..........................................................47
Figura 3.10. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante
complementado en la línea celular MAC-T.........................................................................51
Figura 3.11. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante
complementado en la línea celular MAC-T.........................................................................53
Figura 3.12. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho
mutante complementado en la línea celular MAC-T .........................................................55
Figura 3.13. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado
en un modelo murino..............................................................................................................58
Figura 3.14. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en
un modelo murino ...................................................................................................................60
Figura 3.15. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado
en un modelo murino..............................................................................................................62
Figura 4.1. Construcción de los plásmidos termosensibles pERkat y pERhlb....................................71
Figura 4.2. Construcción de los plásmidos de complementación pHkat, pHhlb y pHkathlb ..........73
Figura 4.3. Delección de un gen mediante mutagénesis por recombinación homóloga....................79
V
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1.1. Factores asociados con la virulencia de S. aureus ......................................................................6
Tabla 4.1. Cepas bacterianas empleadas en este estudio..........................................................................69
Tabla 4.2. Plásmidos utilizados en este estudio ........................................................................................70
Tabla 4.3. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de ADN...............................................74
VI
LISTADO DE ABREVIATURAS
ADN
AIP
ARN
ATCC
BHI
BSA
CAMP
DL50
DO
DS
EDTA
H2O2
IC
IIM
J774A.1
kb
MAC-T
MDBK
MPO
NADPH
PAB
pb
PBS
PCR
PEG
PMN
SCVs
SM
SMasa
SmcL
SMM
SMMP
TSST-1
UFC
Ácido desoxirribonucleico
Péptido señal autoinducible
Ácido ribonucleico
American Type Culture Collection
Infusión de cerebro y corazón
Albúmina sérica bovina
Test de Christie, Atkins y Muench-Petersen
Dosis Letal 50
Densidad óptica
Desviación estándar
Ácido etilen-diamino-tetraacético
Peróxido de hidrógeno
Intervalo de confianza
Infecciones intramamarias
Línea celular de macrófagos de origen murino
Kilobases
Línea celular epitelial mamaria bovina
Línea celular epitelial renal bovina
Mieloperoxidasa
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
Bacto Penassay Broth
Pares de bases
Phosphate buffered saline
Reacción en cadena de la polimerasa
Polietilen glicol
Polimorfonucleares neutrófilos
Small colony variants
Esfingomielina
Esfingomielinasa
Esfingomielinasa C de Listeria ivanovii
Solución tampón de sacarosa
Medio hipertónico (SMM 2x: PAB 4x)
Toxina del síndrome del choque tóxico 1
Unidades formadoras de colonia
1. INTRODUCCIÓN
3
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
Capítulo 1
INTRODUCCIÓN
S. aureus es un microorganismo ubicuo, que de forma natural se halla en
la piel y las membranas mucosas de los mamíferos y las aves. En ocasiones
actúa como agente etiológico de procesos patológicos tanto en el hombre
como en los animales domésticos. Esto se debe a que posee un gran número
de potenciales factores de patogenicidad que le permiten colonizar y sobrevivir
en una amplia variedad de tejidos (Dinges et al., 2000; Kerro Dego et al., 2002).
En el hombre S. aureus, además de producir infecciones localizadas en
la piel y las mucosas, puede invadir tejidos y órganos diversos originando
procesos graves, como neumonía, osteomielitis, endocarditis, artritis, pleuritis y
meningitis. Esta bacteria es una de las causas más frecuentes y graves de
infecciones nosocomiales, siendo especialmente importantes las estirpes que
presentan multirresistencias a los antibióticos, sobre todo a la meticilina y a la
vancomicina, ya que constituyen un grave problema de Salud Pública. A esta
variedad de patologías hay que añadir las debidas específicamente a la
producción de determinadas toxinas, como son las intoxicaciones alimentarias,
el síndrome del choque tóxico y el síndrome estafilocócico de la piel escaldada
(Alexander y Hudson, 2001).
En medicina veterinaria S. aureus destaca por su implicación en las
infecciones intramamarias (IIM) de hembras en lactación, que ocasionan
importantes pérdidas económicas (Sutra y Poutrel, 1994). En el ganado ovino y
caprino es responsable de la mamitis gangrenosa aguda, caracterizada por una
rápida multiplicación de la bacteria que ocasiona la necrosis generalizada del
cuarterón. En el ganado bovino, sin embargo, la infección mamaria suele
progresar hacia formas crónicas o subclínicas. En el ganado ovino y caprino es
responsable, además, de alteraciones cutáneas como la dermatitis y la foliculitis
estafilocócicas.
Capítulo 1 Introducción
4
1.1. PATOGENIA DE LAS INFECCIONES POR S. aureus.
El primer paso para el establecimiento de la infección estafilocócica
consiste en la adhesión de la bacteria a las células y tejidos del hospedador para
llevar a cabo la colonización. El foco primario de infección suele desarrollarse
en heridas presentes en la piel o las mucosas del hospedador, desde donde
S. aureus puede diseminarse al torrente sanguíneo y, en consecuencia, a otros
tejidos y órganos. En el caso de las infecciones intramamarias de rumiantes, la
entrada de S. aureus a la glándula mamaria se produce a través del canal del
pezón, principalmente durante el ordeño, siendo los cuarterones infectados y
las lesiones en la piel de las ubres y los pezones los principales reservorios de
S. aureus en estos procesos (Sutra y Poutrel, 1994).
Tras haberse producido la colonización inicial, S. aureus posee diversas
herramientas que le permiten evadir la respuesta del sistema inmune del
hospedador y favorecen el avance de la infección por el organismo (Foster y
Bohach, 2000). Finalmente S. aureus produce un grave daño tisular,
favoreciendo su adherencia a nuevos tejidos y, en consecuencia, su
diseminación (Kerro Dego et al., 2002). Las infecciones por S. aureus se
caracterizan, además, por la formación de abscesos con una infiltración masiva
de PMN que liberan una gran cantidad de enzimas lisosómicas al medio
extracelular, contribuyendo con ello al daño tisular (Boulanger et al., 2002).
Aunque S. aureus ha sido tradicionalmente considerado como un
patógeno extracelular, diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado que es
capaz de adherirse y ser internalizado por una gran variedad de tipos celulares,
pudiendo sobrevivir y, en ocasiones, multiplicarse en el interior de células
epiteliales (Almeida et al., 1996; Bayles et al., 1998; Kahl et al., 2000; Brouillette
et al., 2003; Hess et al., 2003), endoteliales (Hamill et al., 1986; Yao et al., 1995;
Menzies y Kourteva, 1998), fibroblastos (Fowler et al., 2000), osteoblastos
(Hudson et al., 1995; Ahmed et al., 2001) e, incluso, células fagocíticas
(Gresham et al., 2000; Hébert et al., 2000; Brouillette et al., 2003).
Capítulo 1 Introducción
5
El mecanismo que utiliza S. aureus para adherirse a las células consiste
en la formación de un puente de fibronectina entre las proteínas de unión a la
fibronectina de la bacteria y las integrinas α5β1 de la célula eucariota
(Dziewanowska et al., 1999; Peacock et al., 1999; Sinha et al., 1999;
Dziewanowska et al., 2000; Fowler et al., 2000; Massey et al., 2001). Tras la
adhesión se desencadenan una serie de señales intracelulares que dan lugar a la
polimerización de los microfilamentos de actina de la célula en el punto de
contacto con la bacteria, de manera que S. aureus es rodeado por pseudópodos
e internalizado en un compartimento aislado denominado endosoma (Almeida
et al., 1996; Bayles et al., 1998; Jevon et al., 1999). Recientemente se ha
observado que las proteínas tirosín-quinasas Src participan en las vías de
transducción de señales intracelulares responsables de la internalización de
S. aureus (Agerer et al., 2003; Fowler et al., 2003).
Diversos autores han descrito que después de la internalización,
S. aureus escapa del endosoma y se multiplica en el citoplasma de la célula
(Bayles et al., 1998; Wesson et al., 1998; Qazi et al., 2001). Se ha observado que
la expresión de Agr, un regulador global que activa la producción de
hemolisinas entre otras toxinas, es necesaria para que se produzca la ruptura
del endosoma y S. aureus pueda escapar al citoplasma celular (Qazi et al., 2001;
Shompole et al., 2003).
Asimismo, se ha visto que S. aureus es capaz de inducir la apoptosis de
las células invadidas (Bayles et al., 1998; Menzies y Kourteva, 1998; Wesson et
al., 1998; Kahl et al., 2000; Wesson et al., 2000). Hasta el momento no se
conocen con exactitud los mecanismos por los cuales S. aureus produce la
apoptosis de la célula pero se ha demostrado que están controlados por los
reguladores globales Agr y SarA (Wesson et al., 1998). La α-toxina parece jugar
un papel importante, puesto que mutantes que no producen esta toxina son
menos eficaces a la hora de producir apoptosis (Menzies y Kourteva, 2000).
Asimismo se ha descrito que la internalización de S. aureus provoca la
activación de las caspasas 3 y 8 de la célula, dos componentes clave de la
principal cascada proteolítica que da lugar a apoptosis (Wesson et al., 2000).
Capítulo 1 Introducción
6
1.2. FACTORES ASOCIADOS CON LA VIRULENCIA DE S. aureus.
La patogenicidad de S. aureus se considera un proceso complejo y
multifactorial, resultado de la acción combinada de más de 50 factores de
virulencia que son expresados coordinadamente durante las diferentes fases de
la infección (colonización, evasión de las defensas del hospedador,
multiplicación, diseminación bacteriana).
Estos factores se han dividido clásicamente en dos grandes grupos:
componentes superficiales y toxinas y enzimas extracelulares (véase tabla 1.1).
Tabla 1.1. Factores asociados con la virulencia de S. aureus
Componentes superficiales
• Polisacárido capsular • Polisacárido extracelular • Proteínas superficiales
- Proteínas de unión a colágeno (Cna) - Proteínas de unión a fibronectina (FnBPA y FnBPB) - Proteínas de unión a fibrinógeno (ClfA y ClfB) - Proteína A (Spa)
Toxinas y enzimas extracelulares
• Toxinas con actividad sobre membranas - Toxinas o hemolisinas α, β, γ, δ - Leucocidina
• Toxinas con actividad de superantígenos - Enterotoxinas (A-E y G-J) - Toxina del síndrome del choque tóxico 1 (TSST-1) - Toxinas epidermolíticas o exfoliativas (A y B)
• Enzimas extracelulares - Estafiloquinasa - Coagulasa - Hialuronidasa - Lipasas - Proteasas - ADNasa termoestable o termonucleasa - Catalasa
Otros autores, sin embargo, basándose en su actividad biológica, han
propuesto la división de los factores de virulencia de S. aureus en tres categorías
funcionales (Kerro Dego et al., 2002):
Capítulo 1 Introducción
7
• Factores que median la adhesión de la bacteria a la célula hospedadora.
• Factores que promueven el daño y la diseminación tisular.
• Factores que protegen a la bacteria del sistema inmune del hospedador.
Para detallar el papel que desempeñan estos factores en la patogénesis
de S. aureus utilizaremos la clasificación clásica, puesto que algunos factores
pueden ser englobados en varias categorías funcionales.
1.2.1. Componentes superficiales.
Dentro de este grupo se incluyen el polisacárido capsular, el
polisacárido extracelular y las proteínas superficiales.
1.2.1.1. Polisacárido capsular.
En S. aureus se han descrito 11 serotipos de polisacárido capsular (PC)
(tipos 1 al 11), siendo el PC5 y el PC8 los más frecuentes (70%) dentro de las
cepas humanas y de rumiantes (Baselga et al., 1994). El polisacárido capsular
forma generalmente una microcápsula, que también se conoce como slime. Su
papel en la patogénesis no está del todo claro, parece ser que podría participar
en la evasión del sistema inmune aumentando la resistencia de las bacterias a la
fagocitosis (Thakker et al., 1998; Luong y Lee, 2002), así como en la adherencia
de S. aureus a los tejidos del hospedador (Aguilar et al., 2001).
1.2.1.2. Polisacárido extracelular.
S. aureus expresa también un polisacárido extracelular poli-N-succinil-ß-
1-6-glucosamina denominado PIA/PNSG (McKenney et al., 1999),
responsable de la formación de películas bacterianas o biofilms (colonias
adherentes rodeadas por una gran matriz de polisacárido) junto con la proteína
Bap (proteína asociada a biofilm) (Cucarella et al., 2001). La proteína Bap
promueve tanto la unión a superficies inertes como la adhesión intercelular,
mientras que PIA/PNSG parece estar implicado únicamente en la adhesión
intercelular (Cucarella et al., 2002). Muchas infecciones crónicas están asociadas
Capítulo 1 Introducción
8
con estirpes productoras de biofilms, debido a que son muy difíciles de eliminar
por fagocitosis y no responden bien al tratamiento antibiótico (Costerton et al.,
1999; Cucarella et al., 2004).
1.2.1.3. Proteínas superficiales.
El primer paso en el establecimiento de la infección consiste en la
adherencia a los tejidos del hospedador. S. aureus utiliza diferentes proteínas
superficiales que están ancladas en la pared celular bacteriana para adherirse a
varios componentes de la matriz extracelular. En este grupo se engloban las
proteínas de unión al colágeno (Cna), a la fibronectina (FnBPA y FnBPB) y al
fibrinógeno (ClfA y ClfB), así como la proteína A. Estas proteínas en conjunto
se denominan MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matriz
molecules) (Foster y Höök, 1998).
La proteína A (Spa) es un componente de superficie de la mayoría de
las cepas virulentas de S. aureus y está presente en el 50-60% de las cepas
aisladas de IIM bovinas (Sutra y Poutrel, 1994). Aunque no se conoce con
certeza su papel en la patogénesis, se ha sugerido que altera la respuesta
inmune del hospedador mediante la disminución de la opsonización y la
fagocitosis porque es capaz de unirse a la fracción Fc de las IgG impidiendo la
unión de la bacteria a los receptores específicos de las células del sistema
inmune (Gemmell et al., 1990). Además, recientemente se ha demostrado que la
proteína A puede actuar como un factor de colonización ya que se adhiere al
factor von Willebrand, una proteína importante en el proceso de hemostasis
(Hartleib et al., 2000).
En las infecciones por S. aureus son las proteínas de unión a la
fibronectina y al colágeno, principalmente, las que permiten la adherencia de la
bacteria a microlesiones del epitelio, donde quedan expuestos la lámina basal y
el tejido conjuntivo ricos en fibronectina y colágeno (Sutra y Poutrel, 1994).
Las proteínas de unión a fibronectina están implicadas, además, en la
adherencia de S. aureus a las células del hospedador y su posterior
Capítulo 1 Introducción
9
internalización (Dziewanowska et al., 2000; Fowler et al., 2000; Massey et al.,
2001).
1.2.2. Toxinas y enzimas extracelulares.
S. aureus puede producir una amplia gama de toxinas y enzimas
extracelulares (Dinges et al., 2000; Foster y Bohach, 2000), que contribuyen a su
capacidad para colonizar y producir enfermedad en el hombre y los animales.
Las exotoxinas producidas por S. aureus pueden dividirse en dos grupos:
toxinas con actividad sobre membranas y toxinas con actividad de
superantígenos.
1.2.2.1. Toxinas con actividad sobre membranas.
Dentro de este grupo se incluyen las toxinas o hemolisinas α, β, γ y δ y
la leucocidina. La β-toxina se trata detalladamente más adelante, en el apartado
1.5.1.
La α-toxina es citotóxica para una amplia gama de células, entre las que
se incluyen eritrocitos, células mononucleares del sistema inmune, células
epiteliales, células endoteliales y plaquetas (Bhakdi y Tranum-Jensen, 1991;
Bhakdi et al., 1996). Esta toxina ejerce su acción citolítica formando poros en
las membranas, alterando de esta forma la osmorregulación, el flujo de cationes
y otras moléculas, llegando, incluso, a producir apoptosis (Jonas et al., 1994;
Menzies y Kourteva, 2000; Bantel et al., 2001). Se ha observado que la α-toxina
es el principal factor responsable del daño tisular en varios modelos biológicos:
mamitis en ratón (Bramley et al., 1989), queratitis en conejo (O'Callaghan et al.,
1997; Dajcs et al., 2002) y artritis séptica en ratón (Nilsson et al., 1999). Por su
actividad membranolítica, la α-toxina podría estar implicada, además, en la
ruptura del endosoma que engloba a la bacteria tras su internalización en la
célula, permitiendo su liberación al citoplasma celular. La mayoría de las cepas
de S. aureus de origen humano y un 20-50% de las cepas procedentes de IIM en
ganado bovino producen esta toxina (Sutra y Poutrel, 1994).
Capítulo 1 Introducción
10
La δ-toxina es un polipéptido pequeño (26 aminoácidos) capaz de
causar daños en la membrana de una amplia variedad de células (Dinges et al.,
2000). Se ha sugerido que la lisis causada por esta toxina es debida a la
formación de canales en la membrana (Mellor et al., 1988). La δ-toxina es
producida por el 97% de las cepas de S. aureus, pero su papel en la patogénesis
no se conoce aún con exactitud. Esta toxina está codificada en el extremo 5’ de
RNAIII, la molécula efectora del sistema regulador Agr (Johansson y Cossart,
2003) y se ha insinuado que podría actuar como un péptido señal (Dinges et al.,
2000).
Los últimos miembros de este grupo son la γ-toxina y la leucocidina.
Son citolisinas que por su estructura se incluyen en una misma familia de
proteínas (leucotoxinas) ya que están compuestas por dos cadenas
polipeptídicas denominadas S y F que actúan sinérgicamente para dañar las
membranas de las células mediante la formación de poros (Foster y Bohach,
2000). La γ-toxina está presente en casi la totalidad de las cepas de S. aureus,
ejerce su acción principalmente sobre los eritrocitos y, en menor medida, sobre
neutrófilos y macrófagos (Foster y Bohach, 2000). Se ha visto que actúa como
factor de virulencia en un modelo murino de artritis séptica, aunque sólo en
combinación con la α-toxina (Nilsson et al., 1999), y en un modelo de queratitis
en conejo (Dajcs et al., 2002). La leucocidina, por el contrario, es sintetizada
por un pequeño porcentaje de cepas y su acción se centra sobre las membranas
de neutrófilos y macrófagos (Foster y Bohach, 2000). La expresión de esta
toxina se ha relacionado con el desarrollo de infecciones cutáneas graves en el
hombre (Cribier et al., 1992). Existen otros miembros menos conocidos en la
familia de las leucotoxinas, como es el caso de LukE-LukD, que se asocia con
diarreas debidas a tratamientos antibióticos (Gravet et al., 1998), y
LukM-LukF’-PV, que es producida por cepas aisladas de mamitis bovinas
(Kaneko et al., 1997; Rainard et al., 2003).
1.2.2.2. Toxinas con actividad de superantígenos.
Este grupo está formado por la familia de toxinas pirogénicas
(PTSAgs), compuesta por las enterotoxinas (tipos A-E y G-J) y la toxina del
Capítulo 1 Introducción
11
síndrome del choque tóxico 1 (TSST-1), y las toxinas exfoliativas (tipos A y B).
Los superantígenos no son procesados por las células presentadoras de
antígenos, sino que se unen a moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad de clase II (MHC-II) produciendo una estimulación
masiva (proliferación policlonal) de linfocitos T y la liberación de citoquinas
(Foster y Bohach, 2000). Esta modulación de la respuesta inmune puede
contribuir a la evasión de las defensas del hospedador y a la persistencia
bacteriana (Ferens y Bohach, 2000).
Las toxinas pirogénicas se caracterizan por producir fiebre,
hipertensión, inmunosupresión y aumento de la sensibilidad al shock
endotóxico. Las enterotoxinas estafilocócicas son una causa frecuente de
intoxicación alimentaria en el hombre y también pueden producir el síndrome
del choque tóxico, aunque este síndrome se debe principalmente a la acción de
la TSST-1 (Foster y Bohach, 2000). En medicina veterinaria no se ha descrito
ninguna enfermedad causada específicamente por estas toxinas, pero si se ha
comprobado que pueden favorecer la inmunosupresión (Ferens y Bohach,
2000). Un 20% de las cepas aisladas de mamitis bovinas expresan
conjuntamente la enterotoxina tipo C (SEC) y la TSST-1, cuyos genes se
encuentran situados en la isla de patogenicidad SaPIBov (Fitzgerald et al.,
2001).
Las toxinas epidermolíticas o exfoliativas están implicadas en el
síndrome estafilocócico de la piel escaldada (Bailey et al., 1995). Aunque estas
toxinas pertenecen al grupo de los superantígenos, su capacidad para estimular
la proliferación de linfocitos T es aproximadamente 100 veces menor que la de
las toxinas pirogénicas (Monday et al., 1999). La producción de estas toxinas
por cepas de S. aureus aisladas de IIM bovinas es poco frecuente (Akineden et
al., 2001; Larsen et al., 2002).
1.2.2.3. Enzimas extracelulares.
Entre las enzimas extracelulares destaca la estafiloquinasa. Esta enzima
es un activador del plasminógeno y produce la descomposición de las mallas de
Capítulo 1 Introducción
12
fibrina (Kuusela y Saksela, 1990; Christner y Boyle, 1996), con lo que aumenta
el potencial invasivo de la bacteria (Lottenberg et al., 1994). Recientemente se
ha descrito que la estafiloquinasa es capaz de inducir la secreción de defensinas
por los neutrófilos, unirse a ellas y neutralizar su efecto bactericida,
contribuyendo a la protección de S. aureus frente a las defensas del hospedador
(Jin et al., 2004).
El papel concreto jugado en la patogénesis por otras enzimas
extracelulares como la coagulasa, la hialuronidasa, las lipasas, las proteasas o la
ADNasa no se conoce con exactitud, pero se considera que contribuyen a la
capacidad invasiva de S. aureus y que podrían estar implicadas en la captación
de nutrientes. Asimismo, se ha sugerido que las proteasas podrían participar en
la regulación de la virulencia de S. aureus degradando las toxinas producidas por
la bacteria cuando estas ya no son necesarias (Lindsay y Foster, 1999), así como
en el procesamiento de las enzimas secretadas por S. aureus (Shaw et al., 2004).
La catalasa también pertenece a este grupo y será descrita posteriormente en el
apartado 1.4.1.
1.2.3. Regulación genética de los factores de virulencia.
La expresión coordinada de los factores de virulencia de S. aureus en
respuesta a diversas señales medioambientales durante la infección (por
ejemplo, expresión de adhesinas al principio, durante la colonización, y
producción de toxinas más tarde para facilitar la diseminación tisular) se debe a
la existencia de varios reguladores globales que pueden actuar de forma
independiente o interaccionar entre sí formando una compleja red de
regulación.
Hasta el momento se han descrito dos grandes familias de reguladores
globales en S. aureus: los sistemas reguladores de dos componentes (TCRS), de
los cuales el más conocido es el sistema Agr, y la familia de proteínas
homólogas a SarA (Arvidson y Tegmark, 2001; Novick, 2003; Cheung et al.,
2004).
Capítulo 1 Introducción
13
1.2.3.1. El sistema regulador Agr y otros sistemas reguladores de dos
componentes.
Los sistemas reguladores de dos componentes permiten a la bacteria
detectar y responder a condiciones medioambientales incluso cuando los
estímulos no penetran en el citoplasma. Estos sistemas constan de un sensor
de membrana (histidín quinasa) y de un regulador de respuesta citoplásmico.
En respuesta a una señal apropiada, se produce la autofosforilación de un
residuo de histidina en el dominio citoplásmico del sensor y, a continuación, el
grupo fosfato es transferido a un residuo de aspartato en el regulador de
respuesta, que, al activarse, estimula o reprime la transcripción de sus genes
diana, que elaboran una respuesta adecuada a la señal recibida (Yarwood et al.,
2001).
El sistema regulador Agr consta de un locus con dos unidades
transcripcionales divergentes, RNAII y RNAIII, que están bajo el control de
los promotores P2 y P3, respectivamente (véase figura 1.1) (Novick, 2003;
Yarwood y Schlievert, 2003; Cheung et al., 2004). RNAII codifica cuatro
proteínas, AgrB, D, C y A, de las cuales, AgrA y AgrC forman el sistema
regulador de dos componentes, siendo AgrC el sensor y AgrA el regulador de
respuesta. AgrB es una proteína transmembrana implicada en el procesamiento
y la secreción de AgrD, dando lugar al péptido señal autoinducible (AIP)
(Yarwood y Schlievert, 2003). El sistema Agr es un regulador que responde a la
densidad bacteriana (“quorum sensing”), de manera que, durante la fase
postexponencial de crecimiento, cuando hay un gran número de bacterias, se
alcanza una elevada concentración de AIP, éste se une al sensor AgrC, que se
autofosforila y activa al regulador de respuesta AgrA, lo que da lugar a un
incremento de la transcripción de RNAII y RNAIII (Yarwood y Schlievert,
2003; Cheung et al., 2004). La molécula efectora de este sistema regulador es
RNAIII, que actúa a nivel transcripcional inhibiendo la expresión de proteínas
superficiales (proteína A, proteínas de unión a fibronectina, etc.) y activando la
expresión de toxinas y enzimas extracelulares (α-toxina, β-toxina, lipasas,
proteasas, etc.), factores de virulencia relacionados con la adquisición de
nutrientes, la supervivencia y la diseminación bacteriana. El mecanismo por el
Capítulo 1 Introducción
14
cual RNAIII regula la transcripción de estos genes es desconocido (Johansson
y Cossart, 2003; Novick, 2003).
Otros sistemas reguladores de dos componentes descritos en S. aureus
son SaeRS, ArlRS y SrrAB/SrhSR (Novick, 2003). Estos reguladores parecen
actuar como mediadores entre las señales medioambientales (concentraciones
de sal, glucosa, antibióticos, pH, niveles de oxígeno) y los reguladores globales
Agr y SarA (Novick, 2003)
1.2.3.2. SarA y otras proteínas homólogas.
Estas proteínas son reguladores transcripcionales que actúan uniéndose
a una secuencia consenso situada próxima al promotor de sus genes diana. El
locus sarA se transcribe desde tres promotores, sarP1, sarP2 y sarP3, que se
activan en momentos distintos; los dos primeros se activan al comienzo
Figura 1.1. Esquema del sistema regulador Agr de S. aureus.
Figura 1.1. Esquema del sistema regulador Agr de S. aureus. El operón P2, a través de RNAII, codifica las proteínas AgrB, D, C y A. AgrA y AgrC constituyen el sistema regulador de dos componentes, siendo AgrC el sensor y AgrA el regulador de respuesta. AgrB es una proteína transmembrana implicada en el procesamiento y secreción de AgrD para dar lugar al péptido señal autoinducible (AIP). El operón P3 da lugar a RNAIII que actúa como la molécula efectora del locus agr. En la figura aparecen reflejados otros reguladores de S. aureus, así como los posibles caminos a través de los cuales intervienen en la regulación (líneas rojas discontinuas). Esta figura ha sido modificada de Yarwood y Schlievert (2003).
Capítulo 1 Introducción
15
de la fase exponencial de crecimiento y el último durante la fase
postexponencial por acción del factor σB en respuesta a estímulos
medioambientales (Arvidson y Tegmark, 2001; Novick, 2003). La proteína
SarA es requerida para activar la transcripción del locus agr, uniéndose para ello
a una secuencia consenso situada entre los promotores P2 y P3 (Novick, 2003).
Se ha descrito que SarA promueve la síntesis de las proteínas de unión a
fibrinógeno y fibronectina, α-, β- y δ-toxinas y biofilm, mientras que reprime la
de las proteínas de unión a colágeno, proteína A y proteasas uniéndose
directamente a los promotores de los genes diana, o indirectamente, por su
efecto sobre otros reguladores (Novick, 2003; Cheung et al., 2004).
Hasta la fecha se han descrito varias proteínas homólogas a SarA, entre
las que destacan SarR, SarS, SarT, SarU, Rot y MgrA (Cheung et al., 2004).
Además de sus efectos directos sobre la transcripción de los factores de
virulencia, estas proteínas interaccionan entre sí y con Agr y SarA, formando
parte de la compleja red de regulación de S. aureus (Cheung et al., 2004).
1.2.3.3. Regulación genética frente al estrés oxidativo.
Los organismos aeróbicos utilizan el O2 para obtener energía durante
su metabolismo, generando continuamente sustancias oxígeno reactivas, como
el ión superóxido, el peróxido de hidrógeno o los radicales hidroxilo, que
poseen un amplio espectro de biotoxicidad dirigido a ADN, ARN, proteínas y
lípidos (Cabiscol et al., 2000). Cuando la generación de estas sustancias excede
la capacidad de defensa del organismo se habla de estrés oxidativo y puede
deberse a la acción de diversos agentes medioambientales, como las radiaciones
ionizantes o las radiaciones ultravioletas. Asimismo, las células fagocíticas, a
través de la enzima NADPH oxidasa, utilizan el estrés oxidativo como una
herramienta frente a la invasión de bacterias patógenas (Cabiscol et al., 2000).
Los iones metálicos, como el hierro o el manganeso, juegan un papel
clave en la defensa de las bacterias frente al estrés oxidativo, ya que actúan
como cofactores para las enzimas antioxidantes que poseen (catalasa,
peroxidasa, superóxido dismutasa) (Agranoff y Krishna, 1998). El manganeso,
Capítulo 1 Introducción
16
además, presenta propiedades antioxidantes por sí solo (Agranoff y Krishna,
1998). Por otro lado, elevadas concentraciones de hierro pueden ser
perjudiciales para las bacterias ya que reaccionan con el peróxido de hidrógeno
dando lugar a radicales hidroxilo, que son más tóxicos (Cabiscol et al., 2000).
La respuesta genética frente al estrés oxidativo se produce en todos los
organismos aeróbicos, incluidas las bacterias. En S. aureus se han descrito, hasta
el momento, cuatro reguladores transcripcionales, PerR, Fur, MntR y Zur, que
responden a niveles de iones metálicos y controlan la expresión de genes
necesarios para la resistencia al estrés oxidativo. PerR es un represor de la
expresión de varias enzimas antioxidantes, entre las que se encuentran la
catalasa y la alquil hidroperóxido reductasa, de proteínas responsables del
almacenamiento de hierro y de Fur en respuesta a concentraciones elevadas de
manganeso en el medio (Horsburgh et al., 2001a). Su expresión es inhibida por
altas concentraciones de hierro y peróxido de hidrógeno (Horsburgh et al.,
2001a). Fur reprime la transcripción de proteínas necesarias para la captación
de hierro y activa la transcripción de catalasa en respuesta a niveles elevados de
hierro (Horsburgh et al., 2001b). MntR actúa como represor de la expresión de
proteínas encargadas de la captación de manganeso cuando los niveles de este
ion en el medio son altos (Horsburgh et al., 2002). Se ha observado que
mutantes en estos reguladores presentan una menor virulencia a la hora de
desarrollar abscesos cutáneos en un modelo murino, lo que sugiere que la
regulación de la resistencia al estrés oxidativo y de la homeostasis del hierro y el
manganeso es importante para la patogenicidad de S. aureus (Horsburgh et al.,
2001a; Horsburgh et al., 2001b; Horsburgh et al., 2002). Por último, Zur
controla la homeostasis del zinc mediante la represión de proteínas
transportadoras de este metal pero no parece ser esencial para la virulencia
(Lindsay y Foster, 2001).
Capítulo 1 Introducción
17
1.3. DEFENSA INNATA DEL HOSPEDADOR: CÉLULAS
FAGOCÍTICAS.
Las células fagocíticas tienen como objetivo principal defender al
organismo frente a agresiones externas. Están englobadas en dos grandes
sistemas: el sistema polimorfonuclear y el sistema mononuclear fagocitario.
Dentro del sistema polimorfonuclear el tipo celular predominante es el
neutrófilo (PMN), siendo su actividad fagocítica el principal mecanismo de
defensa del hospedador en los momentos iniciales de la infección (Sordillo et
al., 1997). El sistema mononuclear fagocitario está integrado por los
monocitos, que se encuentran en la sangre y la médula ósea, y por los
macrófagos, que derivan de los anteriores y se localizan en los tejidos y órganos
linfoides.
Ante una infección bacteriana, las células fagocíticas son atraídas por
factores quimiotácticos al foco de la infección, donde se llevan a cabo los
procesos de reconocimiento, ingestión y destrucción intracelular de las
bacterias. La fase de reconocimiento es más eficaz si se produce previamente la
opsonización de las bacterias por inmunoglobulinas (Sutra y Poutrel, 1994). La
unión del inmunocomplejo al receptor de la célula fagocítica origina una serie
de cambios fisiológicos y metabólicos encaminados hacia la destrucción
bacteriana (Curnutte et al., 1994). La membrana de la célula se invagina
rodeando a la bacteria, que queda englobada en un compartimento intracelular
aislado, denominado fagosoma, donde posteriormente se fusionan los gránulos
citoplásmicos primarios o azurófilos vertiendo factores bactericidas y
bacteriostáticos. Simultáneamente al englobamiento de la bacteria en el
fagosoma se produce la activación del sistema NADPH oxidasa, cuya función
consiste en la generación de compuestos oxidantes.
Los mecanismos que poseen las células fagocíticas para llevar a cabo su
actividad antimicrobiana se han dividido tradicionalmente en dos tipos: el
sistema citotóxico oxígeno-dependiente y el sistema citotóxico oxígeno-
independiente (Haas y Goebel, 1992).
Capítulo 1 Introducción
18
1.3.1. Sistema citotóxico oxígeno-dependiente.
Este sistema se conoce también con el nombre de estrés oxidativo y
consiste en la producción de sustancias reactivas de oxígeno, como el ión
superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2), los radicales hidroxilo
(·OH) o el ácido hipocloroso (HOCl) (Cabiscol et al., 2000). Dentro de este
sistema la NADPH oxidasa ocupa un lugar clave. Esta enzima se activa al
inicio de la fagocitosis y cataliza la reducción del oxígeno a ión superóxido,
utilizando NADPH como donador de electrones, provocando la liberación de
grandes cantidades de O2- al interior del fagosoma, que constituye el punto de
origen para la producción del resto de compuestos oxidantes (Klebanoff,
1999).
Hasta ahora se había considerado que la actividad antimicrobiana de las
células fagocíticas era llevada a cabo principalmente mediante la acción directa
de estos compuestos oxidantes sobre el ADN, ARN, proteínas y lípidos de los
microorganismos, sin embargo, estudios publicados recientemente muestran
que la destrucción de los microorganismos se realizaría mayoritariamente a
través de la actividad de las proteasas vertidas al fagosoma tras la fusión de los
gránulos azurófilos y que los productos de la NADPH oxidasa actuarían de
forma indirecta proporcionando las condiciones óptimas para la activación de
estas proteasas en el interior de la vacuola fagocítica (Reeves et al., 2002; Reeves
et al., 2003; Ahluwalia et al., 2004). Así, estos autores han descrito que la
actividad de las sustancias oxígeno reactivas en el interior de la vacuola
fagocítica daría lugar a la despolarización de la membrana y a un aumento de la
concentración de Ca2+, lo que provocaría la apertura de canales en la
membrana de la vacuola a través de los cuales entraría K+. Esta entrada de K+
originaría un aumento de pH en el interior de la vacuola necesario para que se
desarrolle la actividad de las proteasas granulares.
1.3.2. Sistema citotóxico oxígeno-independiente.
Tras la formación del fagosoma se produce la fusión de los gránulos
citoplásmicos secundarios o específicos a la membrana plasmática de la célula
Capítulo 1 Introducción
19
secretando al exterior su contenido, integrado por lactoferrina y un conjunto
de péptidos entre los que destacan las defensinas y catelicidinas (Gudmundsson
y Agerberth, 1999). Estas últimas presentan una amplia actividad microbicida
dirigida a bacterias, virus y hongos (Ramanathan et al., 2002). Además, tanto las
defensinas como las catelicidinas ejercen una actividad quimiotáctica atrayendo
a neutrófilos, linfocitos, monocitos, células dendríticas y mastocitos (Chertov et
al., 2000; Yang et al., 2001), lo que sugiere que el contenido de estos gránulos
no es sólo mediador de la respuesta inmune innata sino que también actuaría
como puente hacia la inmunidad adquirida (Chertov et al., 2000; Yamashiro et
al., 2001).
Después de la fusión de los gránulos citoplásmicos secundarios se
produce la fusión de los gránulos citoplásmicos primarios o azurófilos con el
fagosoma donde se vierten una gran cantidad de hidrolasas (hidrolasas ácidas,
lisozima, proteasas neutras, desoxirribonucleasas, etc.), la mieloperoxidasa
(MPO), en el caso de PMN y macrófagos, y la peroxidasa (EPO), en el caso de
los eosinófilos (Hurst y Barrette, 1989).
1.3.3. Actividad antimicrobiana de las células no fagocíticas.
A pesar de que existen muchos estudios acerca de la destrucción de los
microorganismos por las células fagocíticas mediante los mecanismos
dependientes e independientes de radicales libres, poco se conoce sobre las
herramientas utilizadas por otros tipos celulares.
Recientemente, se ha descrito, que una gran variedad de células pueden
producir compuestos oxidantes mediante un sistema NADPH oxidasa similar
al de las células fagocíticas (Meier, 2001). Aunque estas células generan
superóxido a niveles más bajos que los fagocitos, es posible que estos niveles
sean suficientes para afectar a la supervivencia intracelular de las bacterias. En
este sentido, se ha observado que la expresión de superóxido dismutasa por
Campylobacter jejuni (Day et al., 2000) y Escherichia coli (Battistoni et al., 2004)
incrementa su supervivencia en el interior de células epiteliales, lo que sugiere
que las sustancias reactivas de oxígeno pueden estar implicadas en los
Capítulo 1 Introducción
20
mecanismos bactericidas de este tipo celular. Esta hipótesis se ve apoyada,
además, por el hecho de que estímulos fagocíticos inducen la liberación de
superóxido por células epiteliales (Falzano et al., 2001). En relación a las células
endoteliales, se ha visto que los radicales libres, especialmente el peróxido de
hidrógeno, juegan un papel importante en la actividad antimicrobiana de estas
células frente a microorganismos como Pseudomonas aeruginosa (De Assis et al.,
2000) o Rickettsia conorii (Feng y Walker, 2000), pero no frente a S. aureus, donde
debe estar mediada por mecanismos oxígeno independientes (Zhang, B. et al.,
1997).
A pesar de las investigaciones realizadas hasta la fecha, los mecanismos
responsables de la actividad antimicrobiana que presentan las células no
fagocíticas no están del todo claros, observándose diferencias tanto en función
del tipo celular como del microorganismo estudiado.
1.4. CATALASAS BACTERIANAS.
Las catalasas son un grupo de enzimas que se halla presente en todas
las células eucariotas y procariotas que poseen un sistema de citocromos
(Lemberg y Legge, 1949). Su función consiste en descomponer el peróxido de
hidrógeno generado durante el metabolismo aeróbico en agua y oxígeno
molecular.
En el interior del fagosoma de las células fagocíticas la concentración
de H2O2 puede llegar a ser 100 mM (Hurst y Barrette, 1989). Este hecho hace
pensar que las catalasas bacterianas pueden tener un papel relevante en la
protección de los microorganismos frente al metabolismo oxidativo de las
células eucariotas.
En diversos estudios se ha comprobado que la capacidad que tienen
algunos microorganismos de sobrevivir en el interior de células fagocíticas está
influenciada por la catalasa. Es el caso de Nocardia asteroides (Beaman et al.,
1985), Mycobacterium tuberculosis (Manca et al., 1999), Candida albicans (Wysong et
Capítulo 1 Introducción
21
al., 1998; Nakagawa et al., 2003), Campylobacter jejuni (Day et al., 2000),
Edwardsiella tarda (Mathew et al., 2001) y Helicobacter pylori (Basu et al., 2004). En
C. jejuni se ha visto que, aunque la catalasa es importante en la supervivencia
de esta bacteria en el interior de macrófagos, no parece tener función
protectora alguna para la supervivencia en células epiteliales, dónde dicha
función parece recaer sobre la superóxido dismutasa (Day et al., 2000).
1.4.1. Catalasa de S. aureus.
Las primeras evidencias experimentales que relacionaron la catalasa con
la virulencia de S. aureus fueron aportadas por Mandell (1975). Este autor
observó que existía una correlación entre la actividad catalasa de varias cepas
de S. aureus y su letalidad para el ratón. Asimismo, al comparar la destrucción
intracelular in vitro, en PMN de humanos, de una cepa virulenta de S. aureus y
de una cepa que presentaba una actividad catalasa muy baja obtenida por
selección con rifampicina, encontró que la cepa virulenta era más resistente,
sugiriendo que la catalasa podría actuar en la patogénesis de S. aureus
protegiendo a las bacterias de la toxicidad del peróxido de hidrógeno generado
por los PMN.
Posteriormente, Kanafani y Martin (1985) compararon cepas de
S. aureus virulentas (aisladas de procesos patológicos) y no virulentas (aisladas
de boca y fosas nasales de individuos sanos) en un modelo murino y
observaron que las virulentas presentaban unos niveles de actividad catalasa
significativamente superiores a las no virulentas, lo que apoyaría la hipótesis de
que la catalasa podría ser un factor de virulencia relevante en la patogénesis de
S. aureus.
Nishihara et al. (1985) estudiaron la sensibilidad al H2O2 in vitro, la
supervivencia intracelular en leucocitos y la virulencia en un modelo murino de
un mutante de S. aureus, obtenido de forma espontánea en el laboratorio, que
presentaba una actividad catalasa muy débil frente a su cepa parental y no
encontraron una correlación entre el nivel de actividad catalasa y la resistencia a
la acción bactericida de los leucocitos, a pesar de que el mutante presentaba
Capítulo 1 Introducción
22
una menor virulencia, por lo que concluyeron que la catalasa no parecía ejercer
un papel importante en la protección de S. aureus frente a los leucocitos.
Martin y Chaven (1987) analizaron la sensibilidad al H2O2 in vitro de dos
mutantes catalasa negativos de S. aureus obtenidos tras un tratamiento con
dietil-sulfonato y comprobaron que la sensibilidad de los mutantes era mayor
que la de su cepa parental, por lo que sugirieron que la catalasa era un factor
esencial en la defensa de S. aureus frente al peróxido de hidrógeno.
Asimismo, Horsburgh et al. (2001a) observaron que un mutante catalasa
negativo, obtenido por inactivación del gen mediante la inserción de un
transposón, presentaba una mayor sensibilidad al peróxido de hidrógeno in vitro
que su cepa parental pero, sin embargo, era igual de virulento a la hora de
producir abscesos cutáneos en un modelo murino.
Finalmente, Messina et al. (2002) estudiaron la virulencia de cepas de
S. aureus catalasa positivas y negativas obtenidas en aislamientos clínicos. Estos
autores midieron la capacidad de supervivencia bacteriana en el hígado de
ratones inoculados por vía intravenosa y no observaron diferencias entre las
cepas estudiadas, por lo que concluyeron que la ausencia de actividad catalasa
no disminuye por sí sola la virulencia de S. aureus en un modelo experimental.
En el hombre se han descrito alrededor de 40 casos de aislamientos
clínicos de S. aureus catalasa negativos. La gran mayoría de estos aislados fueron
responsables de infecciones en sujetos inmunocomprometidos y sólo unos
pocos se aislaron de pacientes inmunocompetentes, lo que ha llevado a
plantear que los aislados catalasa negativos podrían ser menos virulentos
(Bertrand et al., 2002; Watine et al., 2003).
1.5. ESFINGOMIELINASAS BACTERIANAS.
Las esfingomielinasas (SMasas) bacterianas son fosfolipasas C con alta
especificidad por la esfingomielina (SM) (Titball, 1993; Titball, 1998). Son
Capítulo 1 Introducción
23
SMasas neutras, es decir, su actividad catalítica se desarrolla a pH neutro y en
presencia de Mg2+. Se caracterizan por ser toxinas extracelulares que dañan las
membranas de los eritrocitos y otras células de mamíferos mediante la
hidrólisis de la SM, siendo su actividad sobre los eritrocitos la responsable de
su carácter hemolítico. La lisis celular que producen se correlaciona con el
contenido de SM de la membrana, por ello, los eritrocitos de rumiantes, que
tienen el porcentaje de SM más alto de todos los mamíferos (51% oveja, 46%
vaca y cabra, 27% hombre, 13,5% caballo, 11% perro y 11-13% pequeños
roedores), son los más sensibles. Producen una hemólisis típica, denominada
“calor-frío”, que consiste en un halo de hemólisis incompleta tras la incubación
a 37ºC que se hace completa cuando los eritrocitos se enfrían por debajo de
10ºC. (Coleman et al., 1986). Además de por su actividad sobre las membranas
celulares, las SMasas bacterianas podrían estar involucradas en la patogénesis al
interferir en las vías de transducción de señales de la célula eucariota infectada,
puesto que la hidrólisis de la SM da lugar a la liberación de ceramida, un
importante mensajero secundario implicado en procesos tan relevantes como
el crecimiento y la diferenciación celular, la respuesta inflamatoria a través de la
síntesis de citoquinas y la muerte celular por apoptosis (Hannun y Obeid, 1995;
Levade y Jaffrezou, 1999; Sawai y Hannun, 1999; Ohanian y Ohanian, 2001).
Se han descrito SMasas C en Staphylococcus aureus (β-toxina) (Coleman et
al., 1986; Projan et al., 1989), Staphylococcus intermedius (Dziewanowska et al.,
1996), Staphylococcus schleiferi (Linehan et al., 2003), Bacillus cereus (Johansen et al.,
1988; Yamada et al., 1988), Leptospira interrogans (Segers et al., 1990), Listeria
ivanovii (SmcL) (González-Zorn et al., 1999; González-Zorn et al., 2000),
Helicobacter pylori (Chan et al., 2000) y en la cepa de Pseudomonas sp. TK4
(Sueyoshi et al., 2002) pero poco se conoce sobre el papel que desempeñan en
la patogénesis de estas bacterias. La SMasa de B. cereus ha sido ampliamente
utilizada para intentar mimetizar los efectos biológicos de la activación de
SMasas endógenas eucariotas en cultivos tisulares y se ha observado que es
capaz de inducir la apoptosis de la célula al ser expresada en el interior celular
(Zhang, P. et al., 1997; Birbes et al., 2001). En L. ivanovii se ha descrito que
SmcL contribuye a la disrupción de la vacuola fagocítica y a la correspondiente
liberación de la bacteria al citoplasma de la célula hospedadora promoviendo su
Capítulo 1 Introducción
24
proliferación intracelular (González-Zorn et al., 1999; González-Zorn et al.,
2000). Asimismo, se ha asociado la producción de esta SMasa durante la
infección intracelular de L ivanovii con una elevación de los niveles de
ceramida en la célula hospedadora, lo que se correlaciona con un aumento de la
muerte celular por apoptosis (González-Zorn, 2001).
1.5.1. β-toxina de S. aureus.
La β-toxina o β-hemolisina de S. aureus es producida por la mayoría de
las cepas aisladas de IIM bovinas (75-100%) mientras que las cepas humanas
raramente la expresan (Matsunaga et al., 1993; Aarestrup et al., 1999; Larsen et
al., 2002). Estas evidencias epidemiológicas apoyarían la hipótesis de que la
β-toxina podría jugar un papel importante en la patogénesis de las infecciones
intramamarias de rumiantes por S. aureus, sin embargo, y a pesar de los estudios
realizados hasta el momento, su participación en la patogénesis no ha sido
demostrada concluyentemente.
Se han llevado a cabo diversos estudios con la toxina purificada que
deben ser interpretados con cautela por la posible presencia de contaminantes,
principalmente α-toxina, en las preparaciones. En estos estudios se ha visto
que la β-toxina induce cambios inflamatorios moderados (infiltración difusa de
neutrófilos) en la glándula mamaria de ratón (Calvinho et al., 1993) y conejo
(Ward et al., 1979) y es citotóxica para células epiteliales mamarias bovinas en
cultivo, sumando su efecto al de la α-toxina (Cifrian et al., 1996). Ambas
observaciones apuntan hacia la hipótesis de que la β-toxina es un importante
factor de virulencia en la mastitis bovina. También se ha descrito que la
β-toxina tiene una acción citotóxica selectiva sobre neutrófilos (Marshall et al.,
2000) y monocitos (Walev et al., 1996), pero no sobre granulocitos o linfocitos
(Walev et al., 1996).
Los estudios genéticos, utilizando mutantes que no expresen la
β-toxina, son escasos y poco concluyentes. Bramley et al. (1989), en un modelo
de mamitis en ratón, observaron que un mutante que no expresaba la β-toxina,
Capítulo 1 Introducción
25
por inserción del fago φ42E en el gen codificante (hlb), era menos virulento, se
recuperaba de la glándula mamaria en mayor número que su cepa parental y,
sorprendentemente, estimulaba el flujo de neutrófilos al lugar de infección en
mayor medida que ésta.
Cifrian et al. (1996), a su vez, encontraron que mutantes β-toxina
negativos, obtenidos por inserción de un gen de resistencia a gentamicina en el
gen hlb, presentaban una menor adherencia en un cultivo primario de células
epiteliales mamarias y una menor proliferación que su cepa parental y
sugirieron que la β-toxina podía favorecer la colonización de la glándula
mamaria bovina por S. aureus.
Utilizando modelos no mamarios, como un modelo murino de artritis
séptica (Nilsson et al., 1999) y un modelo de queratitis en conejo (O'Callaghan
et al., 1997; Dajcs et al., 2002), no se han encontrado diferencias apreciables en
la virulencia entre cepas parentales y mutantes β-toxina negativos obtenidos
por inserción de un fago en el gen hlb, observándose, además, en el segundo
modelo, que la β-toxina era responsable únicamente del edema escleral, lo que
se correlaciona con el alto contenido en SM presente en las membranas de las
células epiteliales esclerales.
Por otro lado, como hemos visto anteriormente, S. aureus es capaz de
ser internalizado por una gran variedad de tipos celulares y se ha descrito que
puede escapar del endosoma e inducir la apoptosis de la célula (Bayles et al.,
1998). La β-toxina podría estar implicada tanto en la ruptura del endosoma
como en la apoptosis celular. En este sentido se ha observado que, tras la
internalización de S. aureus, se produce la activación del sistema regulador Agr,
que se correlaciona con un aumento en la expresión de α-toxina y β-toxina,
dando lugar a la permeabilización de la membrana endosomal y a la liberación
de la bacteria al citoplasma de la célula (Shompole et al., 2003). Posteriormente
se produce un segundo pico de expresión de Agr que coincide con la máxima
expresión de α-toxina y β-toxina y origina un incremento en la permeabilidad
de la membrana celular (Shompole et al., 2003).
2. OBJETIVOS
29
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
Capítulo 2
OBJETIVOS
S. aureus es una bacteria muy ubicua, habitante natural de la piel y
mucosas de los mamíferos y las aves, y causante de diversas enfermedades en el
hombre y los animales domésticos. En estos últimos, S. aureus está
principalmente implicado en las IIM, que ocasionan importantísimas pérdidas
económicas en la producción bovina, ovina y caprina (Sutra y Poutrel, 1994).
Debido al fracaso de los tratamientos antibióticos, desde hace muchos
años el desarrollo de vacunas para controlar la infecciones intramamarias
producidas por S. aureus en los rumiantes ha recibido una atención preferente y
han sido muchos y muy variados los preparados vacunales ensayados: células
vivas, bacterinas, toxoides, bacterinas-toxoides, paredes celulares aisladas,
polisacáridos capsulares, etc. (Nordhaug et al., 1994a; Nordhaug et al., 1994b;
McKenney et al., 1999; Tollersrud et al., 2001; Leitner et al., 2003). La eficacia de
la mayoría de las vacunas ensayadas, sin embargo, es bastante limitada en
condiciones de campo (Leitner et al., 2003), por lo que se hace necesario el
desarrollo de nuevas vacunas y/o la mejora de las existentes de una forma
racional, basándonos en el conocimiento de los mecanismos moleculares
íntimos de interacción patógeno-hospedador.
A raíz de la descripción de S. aureus subsp. anaerobius (De la Fuente et al.,
1985), un estafilococo catalasa negativo causante de la enfermedad de los
abscesos, nuestro grupo se planteó el objetivo, en el que se enmarca esta Tesis
Doctoral, de investigar el posible papel que la catalasa, una enzima implicada
en el metabolismo básico, puede jugar en la patogénesis tanto de S. aureus
subsp. anaerobius como de S. aureus (Sanz et al., 2000; Díez, 2002). En algunas
bacterias, como Mycobacterium tuberculosis (Manca et al., 1999), Campylobacter jejuni
(Day et al., 2000) y Helicobacter pylori (Basu et al., 2004), se ha demostrado que la
catalasa influye en su capacidad de supervivencia intracelular protegiéndolas
frente al metabolismo oxidativo de las células eucariotas, sin embargo, en
Capítulo 2 Objetivos
30
S. aureus no se ha determinado con precisión hasta la fecha el posible papel que
esta enzima pueda jugar en su patogénesis.
Por otro lado, la β-toxina, una toxina citolítica expresada por S. aureus,
podría desempeñar un papel significativo durante el ciclo de vida intracelular
de la bacteria, al igual que ocurre en Listeria ivanovii, donde se ha descrito que
una esfingomielinasa, similar a la β-toxina, está implicada en la ruptura de la
vacuola fagocítica y posterior liberación de la bacteria al citoplasma de la célula
infectada y en la inducción de apoptosis celular a través de la liberación de
ceramida (González-Zorn et al., 1999; González-Zorn et al., 2000; González-
Zorn, 2001). No obstante, la posible contribución de la β-toxina a la
patogénesis de S. aureus no se ha demostrado concluyentemente hasta la fecha.
Basándonos en estos hechos, en este trabajo nos planteamos investigar
el posible papel de la catalasa y de la β-toxina, así como del efecto combinado
de ambas, en la patogenicidad de S. aureus utilizando diversos modelos
biológicos.
Llegar al objetivo final de esta Tesis pasaría por la consecución de los
siguientes objetivos concretos:
Construir mutantes simples por delección de los genes katA (catalasa
negativo) y hlb (β-toxina negativo) y un mutante doble por delección de
ambos genes.
Estudiar la capacidad de supervivencia de los mutantes ∆katA, ∆hlb y
∆katA ∆hlb en comparación con la de su cepa parental en la línea
celular de macrófagos murinos J774A.1 y en la línea celular epitelial
mamaria bovina MAC-T.
Investigar la virulencia de los mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb de
S. aureus en comparación con la de su cepa parental en un modelo
murino de infección experimental.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
33
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
Capítulo 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES POR DELECCIÓN DEL
GEN katA, DEL GEN hlb Y DE AMBOS EN S. aureus.
La investigación en el campo de la patogénesis bacteriana está
encaminada al estudio de posibles factores de patogenicidad, determinando
principalmente su papel durante el proceso infeccioso, sus mecanismos de
actuación y cómo están regulados. La manipulación genética constituye una
importante herramienta para este fin, ya que permite la obtención de mutantes
en genes puntuales de una forma precisa mediante el uso de técnicas de
recombinación de ADN o por inserción de un transposón. Tradicionalmente,
se ha investigado el papel de los factores de virulencia en la patogenicidad de
S. aureus comparando la virulencia de un mutante deficiente en un gen con la
de su cepa parental, sin embargo, debido a que la patogenicidad de S. aureus es
multifactorial y a que los potenciales factores de virulencia que produce son
numerosos, los esfuerzos en los últimos años se han centrado en la
identificación de determinantes cromosómicos que afecten a la expresión de
estos factores de virulencia. De cualquier modo, en vista de la continua
aparición de cepas multirresistentes a los antibióticos, el conocimiento de la
patogénesis de S. aureus a nivel molecular es crucial en la lucha contra este
patógeno, ya que puede ayudar en el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
Con el fin de iniciar un estudio detallado de la posible contribución de
la catalasa y la β-toxina a la patogénesis de S. aureus mediante una aproximación
genética, el primer objetivo de este trabajo fue la construcción de mutantes
simples por delección del gen de la catalasa y del gen de la β-toxina y de un
mutante doble por delección de ambos genes en una cepa de S. aureus de origen
bovino aislada de un caso de mamitis clínica, la 2386. Utilizando esta técnica
genética nos asegurábamos de que la inactivación de los genes fuera estable,
impidiendo la reversión al fenotipo salvaje, y de que no se producían
Capítulo 3 Resultados y discusión
34 34
mutaciones secundarias para poder relacionar así las diferencias que pudieran
aparecer en estudios posteriores con el gen estudiado.
3.1.1. Construcción del mutante ∆katA.
Para la obtención del mutante catalasa negativo se transformó S. aureus
2386 con el plásmido temperatura sensible pERkat (apartado 4.2.1) que
vehicula la secuencia necesaria para llevar a cabo la delección del gen katA por
recombinación homóloga, formada por dos fragmentos de aproximadamente
500 pb, que limitan el gen katA, unidos entre sí. La transformación se llevó a
cabo mediante protoplastos, según se detalla en el apartado 4.7. Los
transformantes se seleccionaron en medio sólido con eritromicina (5 µg/ml)
(resistencia conferida por el plásmido) y se comprobó que el plásmido portaba
un fragmento de ADN del tamaño adecuado (1 kb) (figura 3.1A).
Figura 3.1A. Comprobación por PCR de la transformación de S. aureus 2386 con pERkat. (1) Marcador de peso molecular. (2) Fragmento con un tamaño aproximado de 1 kb correspondiente a la secuencia clonada en pERkat. Para esta reacción se usaron los oligonucleótidos KAT 1 y KAT 2 y plásmido extraído del transformante. Figura 3.1B. Comprobación por PCR de la delección del gen katA en S. aureus 2386. Se amplifica un fragmento de aproximadamente 1 kb de tamaño, indicativo de la delección. El gen katA tiene un tamaño aproximado de 1,5 kb, en caso de no haberse producido la delección las bandas tendrían un tamaño de 2,5 kb. En esta reacción de amplificación se utilizaron los oligonucleótidos KAT 1 y KAT 2 y ADN extraído de los mutantes. (1) Marcador de peso molecular. (2), (3) y (4) Clones de S. aureus 2386 ∆katA.
1 2 1 2 3 4
A B
1,0 kb
1,0 kb
Capítulo 3 Resultados y discusión
35
A continuación se indujo la mutagénesis por recombinación homóloga
de uno de los transformantes según se describe en el apartado 4.8. Los
mutantes se seleccionaron en medio sólido sin antibiótico por la ausencia de
actividad catalasa al ser puestos en contacto con peróxido de hidrógeno al 3%
y se comprobó mediante PCR que se había producido la delección del gen
katA (figura 3.1B). El gen katA tiene un tamaño aproximado de 1,5 kb y la
delección realizada es casi completa, conservando solamente 9 pb, ATGTCA
en el extremo 5’ y TAA en el extremo 3’ del gen (véase figura 4.1).
3.1.2. Construcción del mutante ∆hlb.
Para conseguir el mutante β-toxina negativo se transformó S. aureus
2386 con el plásmido temperatura sensible pERhlb (apartado 4.2.1) en el que
está clonada la secuencia apropiada para inducir la delección del gen hlb
mediante recombinación homóloga. Esta secuencia está formada por dos
fragmentos de aproximadamente 1 kb, que limitan el gen hlb, unidos entre sí.
Figura 3.2A. Comprobación por PCR de la transformación de S. aureus 2386 con pERhlb. (1) Marcador de peso molecular. (2) Fragmento con un tamaño aproximado de 2 kb correspondiente a la secuencia clonada en pERhlb. Para esta reacción se usaron los oligonucleótidos HLB 1 y HLB 2 y plásmido extraído del transformante. Figura 3.2B. Comprobación por PCR de la delección del gen hlb en S. aureus 2386. Se amplifica un fragmento de aproximadamente 2 kb de tamaño, indicativo de la delección. El gen hlb tiene un tamaño aproximado de 1 kb, en caso de no haberse producido la delección las bandas tendrían un tamaño de 3 kb. En esta reacción de amplificación se utilizaron los oligonucleótidos HLB 1 y HLB 2 y ADN extraído de los mutantes. (1) Marcador de peso molecular. (2), (3) y (4) Clones de S. aureus 2386 ∆hlb.
1 2 1 2 3 4
A B
2,0 kb 2,0 kb
Capítulo 3 Resultados y discusión
36 36
La transformación se realizó utilizando protoplastos según el método
detallado en el apartado 4.7. Los transformantes se seleccionaron en medio
sólido por presentar la resistencia a eritromicina conferida por el plásmido y se
comprobó que éste contenía un fragmento de ADN del tamaño apropiado
(figura 3.2A).
Posteriormente se provocó la mutagénesis por recombinación
homóloga en uno de los transformantes utilizando las condiciones descritas en
el apartado 4.8. Los mutantes se seleccionaron en agar Columbia con un 5% de
sangre de cordero por carecer del amplio halo de hemólisis incompleta con que
se manifiesta la actividad β-toxina. Asimismo, se observó la ausencia del
característico efecto CAMP en forma de “pala” en presencia de Rhodococcus equi
(figura 3.3) y que es consecuencia de la actividad esfingomielinasa de la
β-toxina. Finalmente se comprobó mediante PCR que se había producido la
delección del gen hlb (figura 3.2B). El gen hlb tiene un tamaño aproximado de 1
kb y la delección realizada es casi completa, conservando únicamente 12 pb,
Figura 3.3. Actividad hemolítica y reacción de CAMP en agar Columbia con un 5% de sangre de cordero. Los mutantes β-toxina negativos carecen del halo de hemólisis incompleta y de la reacción de CAMP en forma de “pala” que presenta la cepa salvaje en presencia de R. equi. La complementación de los mutantes da lugar a la recuperación de estas características. (A) S. aureus 2386. (B) S. aureus 2386 ∆hlb. (C) S. aureus 2386 ∆hlb (pHhlb). (D) S. aureus 2386 ∆katA ∆hlb. (E) S. aureus 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb).
A
B
C
D
E
Capítulo 3 Resultados y discusión
37
ATGGTG en el extremo 5’ y AAATAG en el extremo 3’ del gen (véase figura
4.1).
3.1.3. Construcción del doble mutante ∆katA ∆hlb.
Para la construcción de este doble mutante se partió de S. aureus 2386
∆hlb, al que se transformó con el plásmido pERkat empleando la técnica de
transformación por protoplastos igual que en los casos anteriores. Las bacterias
transformadas se seleccionaron en medio sólido por expresar la resistencia a
eritromicina proporcionada por el plásmido y se verificó por PCR que el
plásmido vehiculaba el fragmento de ADN de 1 kb.
Utilizando las condiciones descritas en el apartado 4.8 se indujo la
mutagénesis por recombinación homóloga. Los mutantes se seleccionaron por
carecer de actividad catalasa al ser puestos en contacto con peróxido de
hidrógeno al 3% y por presentar un fenotipo β-toxina negativo en agar
Columbia con un 5% de sangre de cordero (figura 3.3). Posteriormente se
comprobó por PCR que presentaban las dos delecciones (figura 3.4).
Figura 3.4. Comprobación por PCR de la delección de los genes katA y hlb en S. aureus 2386. La reacción se realizó a partir de ADN extraído del doble mutante. (1) Marcador de peso molecular. (2) Fragmento de aproximadamente 1 kb que verifica la delección del gen katA en S. aureus 2386 ∆katA ∆hlb. En esta reacción de amplificación se emplearon los oligonucleótidos KAT 1 y KAT 2. (3) Fragmento de un tamaño aproximado de 2 kb indicativo de la delección del gen hlb en S. aureus 2386 ∆katA ∆hlb. Para esta reacción se utilizaron los oligonucleótidos HLB 1 y HLB 2.
1 2 3
2,0 kb
1,0 kb
Capítulo 3 Resultados y discusión
38 38
3.2. COMPLEMENTACIÓN DE LOS MUTANTES OBTENIDOS.
Con el fin de descartar la presencia de cambios ajenos a la mutación
deseada, como mutaciones en otros genes o efectos de polaridad, que puedan
simular la existencia de la mutación cuando ésta realmente no se ha producido,
hemos realizado experimentos de complementación en trans de los mutantes
con un plásmido multicopia en el que se expresa el gen que ha sido mutado.
De esta forma, si el proceso de mutagénesis se ha producido correctamente, los
mutantes complementados recuperarán la actividad del gen y presentarán el
mismo comportamiento que la cepa salvaje.
Para la complementación de los mutantes se utilizaron los plásmidos
pHkat, pHhlb y pHkathlb (apartado 4.2.2), que portaban el gen katA, el gen hlb
y ambos, respectivamente. La complementación se realizó mediante la técnica
de transformación por protoplastos y los transformantes se seleccionaron en
medio sólido con eritromicina (5 µg/ml). Asimismo, se comprobó que los
mutantes complementados habían recuperado el fenotipo de la cepa salvaje
(figura 3.3) y mediante PCR se verificó que los plásmidos vehiculaban los genes
correspondientes (figura 3.5).
Figura 3.5. Comprobación por PCR de la complementación de los mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb de S. aureus 2386 con los plásmidos pHkat, pHhlb y pHkathlb, respectivamente. (1) y (3) Marcador de peso molecular. (2) Fragmento de aproximadamente 1,6 kb, clonado en los plásmidos pHkat y pHkathlb, que contiene el gen katA de S. aureus 2386. Para esta amplificación se usaron los oligonucleótidos CAT –1 y CAT 2. (4) Fragmento de aproximadamente 3 kb, clonado en los plásmidos pHhlb y pHkathlb, que contiene el gen hlb de S. aureus 2386. La reacción se llevó a cabo con los oligonucleótidos HLB 1 y HLB 2.
1 2 3 4
1,6 kb 3,0 kb
Capítulo 3 Resultados y discusión
39
3.3. CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE LOS MUTANTES
OBTENIDOS.
Iniciamos el estudio de los mutantes obtenidos analizando en detalle su
fenotipo con el fin de detectar la posible presencia de alteraciones en otros
caracteres como consecuencia de la ausencia de actividad catalasa y/o β-toxina.
Para ello, se analizó la capacidad de crecimiento en medio BHI a 37ºC (figura
3.6), la morfología y pigmentación de las colonias, el perfil bioquímico
(analizado con el sistema API STAPH) y el patrón de utilización de azúcares
(analizado con el sistema API 50CH) de los mutantes en comparación con los
de la cepa parental, no detectándose diferencias significativas en ningún caso.
Figura 3.6. Curvas de crecimiento bacteriano de S. aureus 2386 y sus mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb.
0,01
0,1
1
10
0 4 8 12 16 20 24Tiempo (horas)
D.O
. (60
0 nm
)
Figura 3.6. Curvas de crecimiento de S. aureus 2386 y sus mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb cultivados en BHI a 37ºC durante 24 horas. La densidad óptica se midió a 600 nm. Se puede observar que las cuatro cepas presentan cinéticas de crecimiento prácticamente idénticas.
2386 2386 ∆katA 2386 ∆hlb 2386 ∆katA ∆hlb
Capítulo 3 Resultados y discusión
40 40
3.4. ESTUDIOS DE SUPERVIVENCIA INTRACELULAR.
S. aureus ha sido considerado tradicionalmente como un patógeno
extracelular. Sin embargo, estudios in vitro, con cultivos primarios y líneas
celulares (Hudson et al., 1995; Bayles et al., 1998; Menzies y Kourteva, 1998;
Hess et al., 2003), así como estudios in vivo (Hébert et al., 2000; Brouillette et al.,
2003) han puesto de manifiesto la capacidad de esta bacteria para internalizarse
en diferentes tipos celulares, pudiendo sobrevivir y, en ocasiones, multiplicarse
en el interior celular, incluso en células fagocíticas (Gresham et al., 2000;
Hébert et al., 2000; Brouillette et al., 2003). Tras la internalización, S. aureus
puede escapar del endosoma, multiplicarse en el citoplasma e inducir la
apoptosis de las células invadidas (Bayles et al., 1998; Wesson et al., 1998; Kahl
et al., 2000; Wesson et al., 2000; Qazi et al., 2001). La internalización de S. aureus
por las células del hospedador puede contribuir a la persistencia de la infección
al proporcionar una resistencia frente al sistema inmune y frente a los
tratamientos antibióticos (Ferens y Bohach, 2000).
La supervivencia intracelular de S. aureus puede estar determinada por
su capacidad para hacer frente a los mecanismos bactericidas de las células
eucariotas. Así, en bacterias como M. tuberculosis (Manca et al., 1999), C. jejuni
(Day et al., 2000) y H. pylori (Basu et al., 2004) la catalasa, una enzima
responsable de la degradación del peróxido de hidrógeno ha demostrado ser un
factor esencial para su supervivencia en el interior de diversos tipos celulares.
Igualmente, la β-toxina, una enzima que actúa degradando la
esfingomielina presente en las membranas celulares, podría jugar un papel
importante durante el ciclo de vida intracelular de S. aureus, como ocurre en
L. ivanovii, donde se ha observado que una esfingomielinasa, similar a la
β-toxina, está implicada en la ruptura de la vacuola fagocítica y en la apoptosis
de la célula infectada (González-Zorn et al., 1999; González-Zorn et al., 2000;
González-Zorn, 2001).
Basándonos en estos hechos, nos planteamos investigar la posible
participación de la catalasa y la β-toxina en la supervivencia y proliferación de
Capítulo 3 Resultados y discusión
41
S. aureus en el medio intracelular de dos tipos celulares bajo condiciones in vitro.
Concretamente elegimos para estos estudios la línea celular de macrófagos
murinos J774A.1 y la línea celular epitelial mamaria bovina MAC-T, dos
modelos que nos parecen relevantes para el estudio de la patogénesis de
S. aureus.
3.4.1. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386 y sus respectivos
mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb en la línea celular J774A.1.
Los macrófagos constituyen una de las piezas esenciales de la
inmunidad innata, y participan activamente en la presentación de antígenos
para inducir una inmunidad adquirida satisfactoria. J774A.1 es una línea celular
de macrófagos de origen murino que mantiene la capacidad de activar los
mecanismos oxígeno-dependientes necesarios para llevar a cabo una acción
bactericida y ha sido ampliamente utilizada para el estudio de patógenos
intracelulares (Wadsworth y Goldfine, 1999; Day et al., 2000). Las condiciones
bajo las que se realizó este experimento se recogen en el apartado 4.12.
Los análisis de significación (véase apartado 4.14) para comparar los
resultados obtenidos en los experimentos de supervivencia intracelular en la
línea J774A.1 entre S. aureus 2386 y sus respectivos mutantes se llevaron a cabo
con los valores obtenidos en tres experimentos independientes. Se realizaron
recuentos de las bacterias supervivientes transcurridas 4, 8 y 24 horas
postinfección. El número de UFC (unidades formadoras de colonia)
supervivientes en cada tiempo se expresó como un porcentaje referido a la
cantidad total de UFC que habían sido fagocitadas.
En las figuras 3.7, 3.8 y 3.9 se muestra la capacidad de supervivencia
intracelular de S. aureus 2386 frente a la de cada uno de sus mutantes, así como
la de los mutantes complementados. Los valores que se representan son las
medias aritméticas de los porcentajes de las UFC supervivientes obtenidas en
los diferentes experimentos. Asimismo, se representa la desviación estándar
(DS) para cada media aritmética. En cada figura se muestra, además, una tabla
donde se detallan los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido
Capítulo 3 Resultados y discusión
42 42
en el análisis de varianza. En la figura 3.9 se muestra una segunda tabla en la
que se detalla el intervalo de confianza de la diferencia de las medias aritméticas
para un nivel de significación del 95% obtenido en el test de Tukey-Kramer.
Diversos estudios han mostrado que S. aureus es fagocitado eficazmente
por macrófagos y puede sobrevivir en su interior. Hébert et al. (2000), por
ejemplo, observaron la presencia de S. aureus viables en macrófagos aislados de
muestras de leche de vacas con mamitis crónicas, incluso en mayor porcentaje
que en células epiteliales alveolares, sugiriendo que las bacterias estaban más
protegidas en el interior de macrófagos. Asimismo, Brouillette et al. (2003),
utilizando un modelo de mamitis en ratón, encontraron bacterias vivas y con
evidencias de multiplicación dentro de macrófagos, neutrófilos y células
epiteliales. Por último, Seral et al. (2003) han descrito que S. aureus es capaz de
proliferar intracelularmente en macrófagos J774. Sin embargo, en los
experimentos con la línea J774A.1 realizados en este trabajo, no se observó la
existencia de proliferación intracelular (entendiendo por tal, en este estudio, el
incremento en el número de bacterias intracelulares viables) ni en S. aureus 2386
ni en ninguno de los mutantes utilizados.
En la figura 3.7 se muestran los resultados de supervivencia intracelular
en la línea J774A.1 de S. aureus 2386, del mutante ∆katA y del mutante
complementado. El comportamiento de las tres bacterias, como puede verse
en la gráfica, fue análogo y en el análisis de varianza no se encontraron
diferencias significativas en ninguno de los tiempos considerados, hallándose
una disminución progresiva de las bacterias viables. Por lo tanto, parece que la
catalasa por sí sola no es un factor que influya en la supervivencia intracelular
de esta bacteria en esta línea celular. Este resultado concuerda con lo descrito
por otros autores, quienes observaron que la catalasa no parecía contribuir por
sí misma a la protección de S. aureus frente a la actividad de leucocitos
humanos (Nishihara et al., 1985).
En el supuesto de que las sustancias generadas en el metabolismo
oxidativo jueguen un papel en la actividad bactericida de las células fagocíticas,
es posible que S. aureus utilice otras enzimas, además de la catalasa, para
Figura 3.7. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado en la línea celular J774A.1.
Figura 3.7. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado, fagocitados por macrófagos de la línea celular J774A.1 durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla adjunta se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 40,1% 16,77% 1,53%
2386 ∆katA 45,67% 18,1% 0,2%
2386 ∆katA (pHkat) 58,47% 21,13% 2,15%
p 0,3015 0,8979 0,2454
2386 2386 ∆katA
2386 ∆katA (pHkat)
0
20
40
60
80
100
120
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
Porc
enta
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degradar el peróxido de hidrógeno, como la tiol peroxidasa (Bcp) o la alquil
hidroperóxido reductasa (AhpC) (Horsburgh et al., 2001a), que han sido
descritas, también, en otras bacterias patógenas, como E. coli y M. tuberculosis
(Jeong et al., 2000). Asimismo, se ha relacionado la actividad de una metionina
sulfoxido reductasa con la resistencia al peróxido de hidrógeno en S. aureus
(Singh y Moskovitz, 2003).
Por otro lado, S. aureus puede haber desarrollado mecanismos
alternativos para protegerse del H2O2 cuando éste no es degradado. En este
sentido, en N. gonorrhoeae, se ha descrito un mecanismo de defensa frente al
H2O2, que actúa sobre una de las rutas secundarias por las que se dirige este
compuesto cuando no es degradado (Lorenzen et al., 2000). Este mecanismo
consiste en la producción de una proteína, una porina, que actúa sobre la
membrana del fagosoma, impidiendo la fusión de los gránulos azurófilos, que
transportan la mieloperoxidasa. De esta forma se evita que la MPO utilice el
H2O2 no degradado para la formación de otros compuestos oxidantes más
tóxicos, como son el ácido hipocloroso o las cloraminas, que ejercen su acción
tóxica sobre los microorganismos que se encuentran aislados en el fagosoma.
Este mismo mecanismo ha sido descrito en H. pylori y Y. enterocolitica (Tufano et
al., 1994a; Tufano et al., 1994b).
Además del peróxido de hidrógeno pueden existir otras sustancias
reactivas de oxígeno, así como mecanismos oxígeno-independientes que actúen
como principales responsables de la destrucción de S. aureus en el interior de las
células fagocíticas. Esto explicaría el hecho de que la destrucción de S. aureus en
el medio intracelular sea casi completa, independientemente de la presencia o
de actividad catalasa o cualquier otro mecanismo para protegerse del H2O2. En
este sentido, Aratani et al. (2000) descartan que el H2O2 sea un elemento crucial
en la destrucción de S. aureus, otorgando ese papel a otros compuestos
oxidantes como el peroxinitrito. Asimismo, Reeves et al. (2002) y Ahluwalia et
al. (2004) consideran que son las proteasas granulares (elastasa, catepsinas, etc.),
vertidas al fagosoma tras la fusión de los gránulos azurófilos, las principales
responsables de la destrucción de las bacterias por las células fagocíticas y que
la función de las sustancias oxígeno reactivas sería la de proporcionar las
Figura 3.8. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular J774A.1.
Figura 3.8. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado, fagocitados por macrófagos de la línea celular J774A.1 durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla adjunta se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 40,1% 16,77% 1,53%
2386 ∆hlb 52,8% 19,35% 1,7%
2386 ∆hlb (pHhlb) 48,17% 11,37% 0,4%
p 0,5531 0,6187 0,4014
2386 2386 ∆hlb
2386 ∆hlb (pHhlb)
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Capítulo 3 Resultados y discusión
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condiciones adecuadas para la activación de estas enzimas, provocando la
entrada de iones K+ y, en consecuencia, un aumento del pH en el interior de la
vacuola fagocítica.
Los resultados de los experimentos de supervivencia intracelular en la
línea J774A.1 realizados con S. aureus 2386 y su mutante ∆hlb aparecen
reflejados en la figura 3.8. Al comparar estos resultados no se encontraron
diferencias significativas en ninguno de los tiempos observados, por lo que
parece que la β-toxina, uno de los factores membranolíticos que posee
S. aureus, no jugaría por sí sola un papel importante en la supervivencia
intracelular de esta bacteria en la línea celular utilizada.
Coincidiendo con este resultado, González-Zorn et al. (1999, 2000)
tampoco observaron diferencias en el comportamiento intracelular de un
mutante de L. ivanovii que no expresaba SmcL, una SMasa C similar a la
β-toxina de S. aureus, con respecto a su cepa parental en células J774A.1 y
atribuyeron este resultado al hecho de que el mutante expresaba niveles
normales de los otros determinantes membranoactivos de Listeria,
conservando, por tanto, su capacidad para escapar del fagosoma, y al bajo
contenido en esfingomielina que presentan las membranas de estas células de
origen murino.
Finalmente decidimos analizar el efecto conjunto que la ausencia de la
catalasa y la β-toxina podría tener en el ciclo de vida intracelular de S. aureus en
macrófagos J774A.1. Cuando se compararon los datos obtenidos en los
estudios de supervivencia intracelular de S. aureus 2386 y su doble mutante
∆katA ∆hlb en esta línea celular (figura 3.9) se observó que, contrariamente al
comportamiento mostrado por los mutantes simples, el doble mutante
presentaba una mayor persistencia intracelular que la cepa parental,
encontrándose diferencias estadísticamente significativas en el análisis de
varianza a las 4 (p= 0,0053), 8 (p= 0,0015) y 24 horas (p= 0,0080). Mediante el
test de Tukey-Kramer se comprobó que las diferencias observadas se debían
exclusivamente a la delección de estos dos genes puesto que no se encontraron
diferencias entre la cepa parental y el mutante complementado.
Figura 3.9. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular J774A.1.
Figura 3.9. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado, fagocitados por macrófagos de la línea celular J774A.1 durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla superior se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo. En la tabla inferior se analizan los resultados por parejas mediante el test de Tukey-Kramer y se muestra el intervalo de confianza (IC) de la diferencia de las medias aritméticas calculado para un nivel de significación del 95%.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 40,1% 16,77% 1,53%
2386 ∆katA ∆hlb 86,03% 74,33% 9,4%
2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb) 48,27% 23,17% 0,55%
p 0,0053 0,0015 0,0080
Tiempo 2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb 2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb) 2386 ∆katA ∆hlb vs 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb)
4 horas -74,18 a 17,69 -36,41 a 20,08 9,52 a 66,01 8 horas -86,06 a 29,07 -34,89 a 22,09 22,67 a 79,66 24 horas -13,94 a 1,80 -5,09 a 7,06 2,78 a 14,92
2386 2386 ∆katA ∆hlb 2386 ∆katA ∆hlb
(pHkathlb)
0
20
40
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Tiempo (horas)
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Capítulo 3 Resultados y discusión
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Hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios para determinar qué
papel podrían desempeñar estas dos enzimas, de manera conjunta, en la
supervivencia intracelular de S. aureus. En esta bacteria se ha descrito la
persistencia intracelular que presentan las variantes de colonia pequeña (SCVs)
(Balwit et al., 1994; Vesga et al., 1996; von Eiff et al., 1997; von Eiff et al., 2001).
Estas subpoblaciones se caracterizan por ser auxotróficas en hemina o
menadiona, dos compuestos necesarios para la síntesis de citocromos y
menaquinona, respectivamente, componentes de la cadena respiratoria
implicados en el transporte de electrones (von Eiff et al., 1997; McNamara y
Proctor, 2000). Este defecto en la cadena respiratoria se traduce en múltiples
cambios fenotípicos, que incluyen, entre otros, un crecimiento más lento,
ausencia de pigmentación, reducido rango de utilización de carbohidratos,
mayor resistencia a antibióticos y una disminución en la producción de factores
de virulencia, concretamente se ha visto que las SCVs producen niveles muy
bajos de hemolisinas, proteína A y catalasa (McNamara y Proctor, 2000;
Yarwood et al., 2001). Se ha sugerido que la menor producción de hemolisinas,
principalmente de α-toxina, es la causa de la mayor persistencia intracelular que
presentan las SCVs, al no ser capaces de lisar la célula hospedadora (von Eiff et
al., 1997). En este sentido, se ha observado que mutantes deficientes en la
producción de α-toxina (Vann y Proctor, 1988) y mutantes en el regulador Agr
(Wesson et al., 1998), que controla la producción de hemolisinas, presentan una
mayor persistencia intracelular. Asimismo, Schwan et al. (2003) han observado
que un mutante Agr negativo presenta una supervivencia selectiva, con
respecto a la cepa parental, durante infecciones mixtas en abscesos y heridas en
ratón y atribuyen este resultado a la pérdida de expresión de hemolisinas en el
mutante. Sin embargo, en relación a los resultados obtenidos en este trabajo, la
mayor persistencia intracelular observada en S. aureus 2386 ∆katA ∆hlb no
puede ser atribuida únicamente a la falta de expresión de β-toxina, puesto que
el mutante simple ∆hlb no presentó este comportamiento, sino al efecto
combinado de la ausencia de actividad catalasa y β-toxina.
Capítulo 3 Resultados y discusión
49
3.4.2. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386 y sus respectivos
mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb en la línea celular MAC-T.
MAC-T es una línea de células epiteliales mamarias de origen bovino
que mantiene la capacidad de diferenciación y secreción de productos
específicos de la leche (Huynh et al., 1991) y ha sido empleada en varios
estudios para caracterizar la invasión intracelular por S. aureus (Almeida et al.,
1996; Bayles et al., 1998; Wesson et al., 1998; Qazi et al., 2001). Asimismo, se ha
descrito la presencia de S. aureus viables en el interior de células epiteliales
mamarias in vivo, en un modelo murino de mamitis (Brouillette et al., 2003). Las
condiciones bajo las que se realizó este experimento se recogen en el apartado
4.12.
En las figuras 3.10, 3.11 y 3.12 se muestra la capacidad de supervivencia
intracelular de S. aureus 2386 frente a la de cada uno de sus mutantes, así como
la de los mutantes complementados en la línea celular MAC-T.
Coincidiendo con lo descrito por otros autores (Bayles et al., 1998;
Wesson et al., 1998; Qazi et al., 2001), S. aureus 2386 fue capaz de invadir células
MAC-T y multiplicarse intracelularmente. Este hecho queda patente en el
recuento realizado a las 4 horas, momento en el cual se observa una clara
proliferación intracelular, siendo el número de bacterias intracelulares viables
aproximadamente 1,7 veces superior al número de bacterias internalizadas
(véase figura 3.10). A las 8 y 24 horas postinfección, el número de bacterias
intracelulares viables disminuyó, permaneciendo únicamente el 7,33% de las
bacterias internalizadas a las 24 horas.
La destrucción de S. aureus observada podría estar asociada a la muerte
celular debida a un aumento en la permeabilidad de la membrana de las células
invadidas por acción de las hemolisinas (Shompole et al., 2003), o a la apoptosis
de dichas células desencadenada por factores secretados por S aureus y
regulados por Agr y SarA (Wesson et al., 1998), como la α-toxina (Menzies y
Kourteva, 2000; Bantel et al., 2001) o la β-toxina (Bayles et al., 1998),
provocando la entrada en contacto de la bacteria con la gentamicina presente
Capítulo 3 Resultados y discusión
50
en el medio extracelular. Apoyando esta hipótesis, se ha observado que la
multiplicación intracelular de S. aureus y la liberación de toxinas provocan
cambios citotóxicos en las células en cultivo tras periodos largos de incubación
(Agerer et al., 2003).
Por otro lado, la destrucción de S. aureus en el interior de células
MAC-T puede estar causada también por la acción de mecanismos bactericidas
similares a los que poseen las células fagocíticas profesionales. En este sentido,
se ha observado que la supervivencia intracelular de bacterias, como C jejuni
(Day et al., 2000) y E. coli (Day et al., 2000; Battistoni et al., 2004), en células
epiteliales, está limitada por la generación de superóxido por una NADPH
oxidasa similar a la que poseen los fagocitos profesionales. Asimismo, otros
autores han descrito que el peróxido de hidrógeno juega un papel importante
en la actividad antimicrobiana de las células endoteliales frente a
microorganismos como Pseudomonas aeruginosa (De Assis et al., 2000) o Rickettsia
conorii (Feng y Walker, 2000).
Como se puede apreciar en la figura 3.10 el mutante nulo en catalasa
(∆katA) mostró un comportamiento diferente al de la cepa parental. Así, se
encontraron diferencias estadísticamente significativas a las 4 horas
(p= 0,0017), comprobándose, mediante el test de Tukey-Kramer, que estas
diferencias se debían a la delección del gen katA, puesto que no se hallaron
diferencias entre la cepa parental y el mutante complementado.
Como se observa en la gráfica de la figura 3.10, la carencia de catalasa
inhibió en buena medida la proliferación intracelular de la bacteria en las
células MAC-T durante las primeras horas postinfección, es decir, que la
catalasa parece jugar un papel determinante en la proliferación intracelular
temprana de S. aureus en esta línea celular. Este hecho podría deberse a que en
esta línea celular los mecanismos oxígeno-dependientes (estrés oxidativo)
desempeñen un papel significativo en la defensa frente a los microorganismos,
de manera que la catalasa protegería a la bacteria del peróxido de hidrógeno
generado por la célula. Esta hipótesis se ve apoyada por las observaciones de
Figura 3.10. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T.
Figura 3.10. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla superior se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo. En la tabla inferior se analizan los resultados por parejas mediante el test de Tukey-Kramer para el tiempo 4 y se muestra el intervalo de confianza (IC) de la diferencia de las medias aritméticas calculado para un nivel de significación del 95%.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 168,35% 47,73% 7,33%
2386 ∆katA 74,08% 31,51% 6,13%
2386 ∆katA (pHkat) 150,48% 52,96% 5,83%
p 0,0017 0,1786 0,8563
Tiempo 2386 vs 2386 ∆katA 2386 vs 2386 ∆katA (pHkat) 2386 ∆katA vs 2386 ∆katA (pHkat)
4 horas 41,39 a 147,16 -35,01 a 70,76 -129,28 a 23,52
2386 2386 ∆katA
2386 ∆katA (pHkat)
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50
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150
200
250
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
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Day et al. (2000) y Battistoni et al. (2004) de que la supervivencia bacteriana en
el interior de células epiteliales está limitada por la generación de superóxido
por la célula. Además, coincidiendo con los resultados de este experimento,
Battistoni et al. (2004) observaron que la destrucción bacteriana originada por
los radicales oxidantes se producía, principalmente, en las primeras fases de la
entrada de la bacteria en las células epiteliales.
Los estudios de supervivencia intracelular en la línea MAC-T de
S. aureus 2386 en comparación con su mutante ∆hlb (figura 3.11) revelaron que
el porcentaje de bacterias intracelulares viables del mutante a las 8 (p= 0,0036)
y 24 horas (p= 0,0083) eran significativamente mayores a los encontrados con
la cepa parental y el mutante complementado, que mostraron un
comportamiento similar entre sí. Con el test de Tukey-Kramer se confirmó que
las diferencias eran debidas a la delección del gen hlb.
La delección del gen de la β-toxina, por lo tanto, no afectó a la
proliferación de la bacteria en células MAC-T durante las primeras horas post-
infección pero si tuvo efecto sobre su persistencia intracelular a más largo
plazo. El hecho de que la carencia de β-toxina no afecte a la proliferación
durante las primeras horas podría indicar que las otras toxinas membranolíticas
que posee S. aureus, especialmente la α-toxina, serían suficientes para permitir a
la bacteria escapar del endosoma y multiplicarse en el citoplasma. Diversos
autores han descrito que mutantes en el regulador Agr, que expresan niveles
muy bajos de estas toxinas permanecen englobados en el endosoma y no son
capaces de multiplicarse en el interior celular (Wesson et al., 1998; Shompole et
al., 2003). Según estos resultados, la β-toxina no ejercería un papel fundamental
en la ruptura del endosoma en este tipo celular, sino que podría sumar su
efecto al de las otras toxinas membranoactivas de S. aureus. Esto mismo sucede
en L. ivanovii, donde se ha observado que un mutante nulo en SmcL pero capaz
de expresar el resto de determinantes membranolíticos de Listeria escapa del
endosoma y prolifera en el interior de células epiteliales MDBK, aunque en
menor medida que su cepa parental (González-Zorn et al., 1999; González-
Zorn et al., 2000). Contrariamente a nuestras observaciones, Cifrian et al.
(1996), utilizando cultivos primarios de células epiteliales mamarias bovinas,
Figura 3.11. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T.
Figura 3.11. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla superior se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo. En la tabla inferior se analizan los resultados por parejas mediante el test de Tukey-Kramer para los tiempos 8 y 24 y se muestra el intervalo de confianza (IC) de la diferencia de las medias aritméticas calculado para un nivel de significación del 95%.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 168,35% 47,73% 7,33%
2386 ∆hlb 175,87% 90,01% 14,47%
2386 ∆hlb (pHhlb) 158,45% 50,28% 5,99%
p 0,7379 0,0036 0,0083
Tiempo 2386 vs 2386 ∆hlb 2386 vs 2386 ∆hlb (pHhlb) 2386 ∆hlb vs 2386 ∆hlb (pHhlb)
8 horas -70,26 a 14,32 -30,52 a 25,42 11,77 a 67,71 24 horas -13,31 a 0,98 -4,83 a 7,5 2,32 a 14,65
2386 2386 ∆hlb
2386 ∆hlb (pHhlb)
0
50
100
150
200
250
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Capítulo 3 Resultados y discusión
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observaron que un mutante β-toxina negativo de S. aureus presentaba una
menor adherencia y proliferación que la cepa parental.
El efecto de la ausencia de β-toxina sobre la mayor persistencia
intracelular de la bacteria en esta línea celular podría deberse a que la β-toxina
participe en la lisis de la célula hospedadora, incrementando la permeabilidad
de la membrana por la hidrólisis de la esfingomielina o desencadenando la
apoptosis de la célula por mediación de la ceramida producida en esta
hidrólisis, lo que permitiría el contacto de la bacteria con la gentamicina
extracelular. En este sentido, se ha visto que mutantes α-toxina negativos
presentan una mayor persistencia intracelular al ser incapaces de lisar las células
invadidas (Vann y Proctor, 1988). Esta persistencia intracelular también ha sido
observada en las SCVs de S. aureus, que producen niveles muy bajos de
hemolisinas (Balwit et al., 1994; von Eiff et al., 1997; von Eiff et al., 2001) y en
mutantes en el regulador Agr, que controla la expresión de las hemolisinas
(Wesson et al., 1998). El papel que pueda desempeñar la β-toxina de S. aureus
en la producción de apoptosis en las células hospedadoras no se conoce por el
momento, sin embargo, dado los resultados obtenidos con otras
esfingomielinasas bacterianas (Zhang, P. et al., 1997; González-Zorn, 2001;
Tseng et al., 2004), es probable que la β-toxina participe en este fenómeno.
Coincidiendo con la mayor persistencia observada en el mutante ∆hlb, aunque
en un modelo completamente distinto (mamitis murina), Bramley et al. (1989)
hallaron que un mutante β-toxina negativo era recuperado en mayor número
que su cepa parental.
En los ensayos realizados con el doble mutante nulo en catalasa y
β-toxina (∆katA ∆hlb) en la línea celular MAC-T (figura 3.12) se detectó un
claro efecto tanto en la proliferación como en la persistencia intracelular,
observándose un efecto sinérgico y potenciador entre las dos mutaciones. Las
diferencias encontradas en los tres tiempos considerados, 4 (p= 0,0192), 8
(p< 0,0001) y 24 horas (p= 0,0055) fueron estadísticamente significativas y
atribuibles, como muestra el test de Tukey-Kramer, a la delección de los genes
katA y hlb.
Figura 3.12. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T.
Figura 3.12. Supervivencia intracelular de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado en la línea celular MAC-T durante un periodo de tiempo de 24 horas. En los puntos de la gráfica correspondientes a las 4, 8 y 24 horas se muestran las medias del número de bacterias viables, más-menos su desviación estándar (+DS), expresado como porcentaje referido al total de bacterias presentes en el medio intracelular en el tiempo cero. En la tabla superior se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza para cada tiempo. En la tabla inferior se analizan los resultados por parejas mediante el test de Tukey-Kramer para los tiempos 4, 8 y 24 y se muestra el intervalo de confianza (IC) de la diferencia de las medias aritméticas calculado para un nivel de significación del 95%.
4 horas
Tiempo
8 horas 24 horas
2386 168,35% 47,73% 7,33%
2386 ∆katA ∆hlb 118,68% 196,66% 22,2%
2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb) 170,5% 65,18% 6,85%
p 0,0192 <0,0001 0,0055
Tiempo 2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb 2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb) 2386 ∆katA ∆hlb vs 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb)
4 horas 3,65 a 95,7 -48,18 a 43,88 -97,85 a 5,8 8 horas -190,18 a -107,69 -58,69 a 23,79 90,26 a 172,73 24 horas -25,9 a -3,85 -10,55 a 11,5 4,33 a 26,37
2386 2386 ∆katA ∆hlb 2386 ∆katA ∆hlb
(pHkathlb)
0
50
100
150
200
250
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (horas)
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Capítulo 3 Resultados y discusión
56
La proliferación del mutante fue más lenta que la de la cepa parental y
la del mutante complementado alcanzándose más tarde el máximo de bacterias
intracelulares viables (aproximadamente 2 veces el número de bacterias
internalizadas) con respecto a la cepa parental. Este comportamiento se traduce
en un aumento de la persistencia intracelular del doble mutante con respecto a
su cepa parental. La mayor permisividad mostrada por las células MAC-T, en
comparación con las células J774A.1, para la replicación del doble mutante,
probablemente sea consecuencia de su menor patogenicidad para las células.
La reducción del número de bacterias intracelulares viables en el doble
mutante se inicia más tarde, pero, al igual que en la cepa parental, ocurre
cuando éste ha duplicado su número. Es posible que la muerte bacteriana sea
debida a la entrada en contacto de S. aureus con la gentamicina del medio
extracelular tras provocar la lisis de las células y que la multiplicación de
S. aureus en el interior celular sea necesaria para que se produzca esta lisis. En
este sentido, se ha visto que la multiplicación intracelular de S. aureus en una
línea de células epiteliales de pulmón precede a la apoptosis de las células (Kahl
et al., 2000).
Las características observadas en el doble mutante se asemejan, de
alguna manera, a las descritas en las variantes de colonia pequeña de S. aureus
que, como se ha mencionado anteriormente, presentan un crecimiento más
lento, una mayor persistencia intracelular y una disminución en la producción
de toxinas extracelulares, entre ellas hemolisinas y catalasa (Yarwood et al.,
2001).
Al comparar los resultados obtenidos con las dos líneas celulares
utilizadas se pone claramente de manifiesto la diferente permisividad que
tienen para la supervivencia y proliferación de las bacterias investigadas. La
línea macrofágica J774A.1 parece ser menos permisiva, puesto que no permitió
la proliferación de S. aureus 2386 ni de ninguno de sus mutantes y el número de
bacterias intracelulares viables, tanto en la cepa salvaje como en los mutantes,
disminuyó mucho más rápidamente que en la línea epitelial mamaria MAC-T.
Además, no parece que estas líneas celulares utilicen los mismos mecanismos
Capítulo 3 Resultados y discusión
57
microbicidas, o al menos el peso relativo de ellos no sería el mismo, ya que la
catalasa promueve la proliferación en las células MAC-T en las primeras horas
postinfección pero no tiene un efecto detectable en la línea macrofágica.
Abundando en las diferencias, otro tanto cabe decir de la β-toxina, que
no mostró ningún efecto en las células macrofágicas pero tuvo un efecto
negativo a las 8 y 24 horas sobre la persistencia de la bacteria (su carencia
aumentó el número de bacterias intracelulares) en las células MAC-T. Esto
puede deberse a que las células MAC-T, que son de origen bovino, presenten
una mayor porcentaje de esfingomielina en sus membranas que las células
J774A.1, de origen murino, lo que les haría más susceptibles a la acción
citolítica de esta toxina y se traduciría en un incremento de la destrucción
bacteriana asociada a la muerte celular.
Por último, los resultados obtenidos con el doble mutante en las dos
líneas celulares, aunque cuantitativamente diferentes, apuntan en la misma
dirección desde el punto de vista cualitativo: una mayor permisividad de
replicación y una mayor persistencia, como consecuencia probablemente de su
menor patogenicidad.
3.5. ENSAYOS DE VIRULENCIA EN UN MODELO MURINO.
Con el fin de evaluar el efecto en la virulencia de la delección de los
genes katA, hlb y ambos, se estimó la dosis letal 50 (DL50) de S. aureus 2386, de
sus mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb y de estos mutantes complementados
en un modelo murino de infección experimental utilizando el procedimiento
detallado en el apartado 4.13.
Para determinar la DL50 de cada cepa se emplearon 5 lotes, con cinco
ratones Swiss cada uno. La vía de inoculación fue intraperitoneal, inoculando a
cada ratón 0,4 ml de la suspensión bacteriana que le correspondía a cada lote.
Las dosis probadas oscilaron entre 1x106 y 1x1011 UFC/ml.
Capítulo 3 Resultados y discusión
58
Figura 3.13. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado en un modelo murino.
0,00E+00
2,00E+09
4,00E+09
6,00E+09
DL50 (UFC)
2386 2386 ∆katA 2386 ∆katA (pHkat)
DL50 (UFC) 2,8x109 5,68x108 4,26x108
p 0,1304
Figura 3.13. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA y dicho mutante complementado en un modelo murino. En la gráfica se muestran las medias del número de UFC necesario para producir la muerte en el 50% de los individuos de estudio, más su desviación estándar (+DS). En la tabla adjunta se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza.
2386 2386 ∆katA 2386 ∆katA (pHkat)
Capítulo 3 Resultados y discusión
59
Se realizaron tres experimentos independientes para la determinación
de la DL50. Con los datos obtenidos se estimaron las medias aritméticas con su
desviación estándar, para poder comparar así los resultados de S. aureus 2386
con los de cada mutante y su complementado. Los análisis de significación
(véase apartado 4.14.) se realizaron mediante análisis de varianza y en los casos
en los que el valor de p fue < 0,05 se llevó a cabo un test de Tukey-Kramer
para un nivel de confianza del 95%.
Los valores obtenidos de DL50 para S. aureus 2386, sus mutantes ∆katA,
∆hlb y ∆katA ∆hlb y estos mutantes complementados aparecen reflejados en las
figuras 3.13, 3.14 y 3.15. Los valores que se representan son las medias
aritméticas de las DL50 obtenidas en los diferentes experimentos. Asimismo, se
representa la desviación estándar (DS) para cada media aritmética. En cada
figura se muestra, además, una tabla en la que se detallan los valores de las
medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza. En la
figura 3.15 aparece una segunda tabla con el intervalo de confianza de la
diferencia de las medias aritméticas para un nivel de significación del 95%
obtenido en el test de Tukey-Kramer.
Como se muestra en la figura 3.13, las DL50 del mutante ∆katA y el
mutante complementado fueron inferiores (casi 5 veces) a las de la cepa
parental 2386, si bien en el análisis de varianza estas diferencias no fueron
estadísticamente significativas. Según estos resultados, se puede concluir que, al
menos para la cepa de S. aureus utilizada y en este modelo, la catalasa por sí sola
no es un factor que participe significativamente en su virulencia.
En la mayor parte de los estudios sobre la capacidad de virulencia que
se han realizado con anterioridad con cepas de S. aureus con diferente actividad
catalasa, e incluso aquellos que comparaban la virulencia de algunas cepas con
mutantes con nula o muy baja actividad catalasa, no se ha empleado el método
de DL50 por vía intraperitoneal, por lo que no existen trabajos directamente
comparables.
Capítulo 3 Resultados y discusión
60
Figura 3.14. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en un modelo murino.
0,00E+00
2,00E+09
4,00E+09
6,00E+09
8,00E+09
DL50 (UFC)
2386 2386 ∆hlb 2386 ∆hlb (pHhlb)
DL50 (UFC) 2,8x109 3,75x109 1x108
p 0,2416
Figura 3.14. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆hlb y dicho mutante complementado en un modelo murino. En la gráfica se muestran las medias del número de UFC necesario para producir la muerte en el 50% de los individuos en estudio, más su desviación estándar (+DS). En la tabla adjunta se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza.
2386 2386 ∆hlb 2386 ∆hlb (pHhlb)
Capítulo 3 Resultados y discusión
61
Nishihara et al. (1985) determinaron la DL50 por vía intravenosa de una
cepa de S. aureus y de un mutante derivado de ésta que se había hallado de
forma accidental en el laboratorio y que presentaba un nivel de actividad
catalasa extremadamente bajo y, a pesar de que encontraron diferencias entre
las DL50, concluyeron que la menor virulencia del mutante parecía estar
asociada a otros factores además del descenso en actividad catalasa.
Más recientemente, Horsburgh et al. (2001a) han observado que un
mutante catalasa negativo es igual de virulento a la hora de producir abscesos
cutáneos en un modelo murino que su cepa parental. Asimismo, Messina et al.
(2002) estudiaron la capacidad de virulencia de un mutante catalasa negativo de
S. aureus en comparación con aislados clínicos de S. aureus catalasa positivos,
midiendo la capacidad de supervivencia bacteriana en el hígado de ratones
inoculados por vía intravenosa y concluyeron que la ausencia de actividad
catalasa no disminuye por sí sola la virulencia de S. aureus.
Tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas entre
las DL50 del mutante ∆hlb, el mutante complementado y la cepa parental (figura
3.14). La β-toxina, por sí misma, tampoco parece tener un papel significativo
en la patogenicidad de S. aureus en este modelo. En estudios realizados con
anterioridad para determinar el papel desempeñado por la β-toxina en la
virulencia de S. aureus tampoco se ha utilizado el método de DL50 por vía
intraperitoneal. Utilizando otros modelos, los resultados obtenidos con
respecto al papel de la β-toxina en la virulencia de S. aureus son diversos, así,
mientras que en un modelo murino de mamitis se ha descrito la menor
virulencia de un mutante β-toxina negativo con respecto a su cepa parental
(Bramley et al., 1989), en modelos de artritis séptica en ratón (Nilsson et al.,
1999) y queratitis en conejo (O'Callaghan et al., 1997; Dajcs et al., 2002) no se
han observado diferencias significativas en la virulencia.
La DL50 del doble mutante fue más de 5 veces superior a la de la cepa
parental y a la del mutante complementado, siendo esta diferencia
estadísticamente significativa (figura 3.15). El doble mutante fue, por lo tanto,
significativamente menos patógeno que su cepa parental en el modelo
Capítulo 3 Resultados y discusión
62
Figura 3.15. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado en un modelo murino.
0,00E+00
4,00E+09
8,00E+09
1,20E+10
1,60E+10
2,00E+10
DL50 (UFC)
2386 2386 ∆katA ∆hlb 2386 ∆katA ∆hlb
(pHkathlb)
DL50 (UFC) 2,8x109 1,41x1010 5,77x108
p 0,0032
2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb
2386 vs 2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb)
2386 ∆katA ∆hlb vs 2386 ∆katA ∆hlb
(pHkathlb)
IC (95%) -1,89x1010 a -3,75x109 -5,35x109 a 9,79x109 5,97x109 a 2,11x1010
Figura 3.15. DL50 de S. aureus 2386, su mutante ∆katA ∆hlb y dicho mutante complementado en un modelo murino. En la gráfica se muestran las medias del número de UFC necesario para producir la muerte en el 50% de los individuos en estudio, más su desviación estándar (+DS). En la tabla superior se muestran los valores de las medias aritméticas y el valor de p obtenido en el análisis de varianza. En la tabla inferior se analizan los resultados por parejas mediante el test de Tukey-Kramer y se muestra el intervalo de confianza de la diferencia de las medias aritméticas calculado para un nivel de significación del 95%.
2386 2386 ∆katA ∆hlb 2386 ∆katA ∆hlb
(pHkathlb)
Capítulo 3 Resultados y discusión
63
murino utilizado. Estos resultados indican claramente que el efecto combinado
de la catalasa y la β-toxina desempeña un papel relevante en la virulencia de
S. aureus en este modelo. La menor virulencia presentada por el mutante ∆katA
∆hlb en este modelo es achacable al hecho de carecer de dos factores de
patogenicidad que parecen actuar sinérgicamente, aunque la ausencia de uno u
otro factor de forma independiente no afecte a la virulencia.
Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que factores que de
forma individual no han podido ser claramente implicados en la patogénesis de
S. aureus pueden ejercer un papel relevante al actuar conjuntamente con otros
factores, resaltando que la patogenicidad de S. aureus es el resultado de la acción
combinada de sus factores de virulencia.
La mayor permisividad de replicación y persistencia intracelulares, así
como, la menor patogenicidad, mostradas por el mutante ∆katA ∆hlb, le
convierten en un candidato para su posible uso como vacuna atenuada frente a
los procesos causados por S. aureus. De hecho, la evaluación de la seguridad y la
eficacia de este mutante como vacuna atenuada frente a la mamitis
estafilocócica de los rumiantes domésticos es uno de los objetivos prioritarios
de nuestro grupo de investigación. Nuestros resultados proporcionan la base
conceptual para el desarrollo de una estrategia alternativa en la obtención de
nuevas cepas vacunales, basada en el efecto combinado de distintos factores,
aparentemente no relacionados, pero que actúan de forma sinérgica en la
patogénesis de S. aureus.
Los resultados presentados en este trabajo constituyen el primer paso
en un largo camino que nos queda por recorrer, al final del cual esperamos
llegar a descifrar con precisión cuál es el verdadero papel jugado por estas
enzimas en la virulencia de S. aureus y en el proceso patogénico que resulta de
la interacción de este microorganismo con los tejidos del hospedador. Hoy en
día, aún se desconocen muchos aspectos sobre la patogenicidad intracelular de
S. aureus que sería interesante descubrir porque quizás en ellos esté la clave del
tratamiento frente a las infecciones crónicas y recurrentes producidas por esta
bacteria, especialmente, las infecciones intramamarias.
4. MATERIAL Y MÉTODOS
67
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
Capítulo 4
MATERIAL Y MÉTODOS
4.1. CEPAS BACTERIANAS, MEDIOS Y CONDICIONES DE
CULTIVO.
Las cepas bacterianas empleadas en este estudio aparecen detalladas en
la tabla 4.1.
El medio de cultivo empleado habitualmente para el crecimiento de
S. aureus fue el caldo infusión cerebro y corazón (BHI; Difco), al que se añadió
agar (Panreac, Oxoid) al 1,5% cuando se requirió medio sólido. El medio se
complementó con eritromicina (5 µg/ml) (Sigma) cuando las bacterias
portaban los plásmidos derivados de pE194 y pHpS9. También se empleó agar
Columbia con un 5% de sangre de cordero (BioMérieux) en los casos en que
fue necesario observar la actividad hemolítica.
Para el crecimiento de las cepas de E. coli DH5α y TOP10, utilizadas en
las técnicas de clonaje molecular, se empleó el medio Luria-Bertani (LB; 10 g
de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro sódico en un volumen
final de 1 litro) con ampicilina (50 µg/ml) (Sigma) cuando contenían el
plásmido pCR2.1 o eritromicina (300 µg/ml) si presentaban el plásmido
pHpS9. Para facilitar la selección de clones con inserto mediante la técnica de
α-complementación de la actividad β-galactosidasa se añadió al medio sólido
IPTG (40 µl de una solución 100 mM) (isopropil-β-D-tioglucopiranósido;
Sigma) y X-Gal (40 µl de una solución de 40 mg/ml) (5-bromo-4-cloro-3-
indolil-β-D-galactopiranósido).
Para la regeneración de protoplastos de S. aureus se utilizó el medio de
cultivo DM3 (succinato sódico 0,5M, 100 ml de hidrolizado de caseína al 5%,
25ml de dextrosa al 20%, 100 ml de tampón fosfato potásico pH 7,4, cloruro
Capítulo 4 Material y métodos
68
magnésico 1M y 10 ml de BSA al 5% en un volumen final de 1 litro) con
eritromicina (5 µg/ml).
Los cultivos de S. aureus y E. coli se incubaron rutinariamente a 37ºC y
en agitación cuando se utilizó medio líquido. Las cepas bacterianas
transformadas con los plásmidos termosensibles pERkat y pERhlb se
incubaron a 32ºC para evitar la curación del plásmido. Para inducir la
mutagénesis por recombinación homóloga en estas cepas se incrementó la
temperatura hasta 43ºC con el fin de forzar la integración del plásmido en el
cromosoma bacteriano.
Los perfiles bioquímicos y de utilización de azúcares se determinaron
con los sistemas API STAPH (BioMérieux) y API 50CH (BioMérieux),
respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4.2. PLÁSMIDOS.
En la tabla 4.2 aparecen reflejados todos los plásmidos empleados en
este estudio. La construcción de los distintos plásmidos se detalla a
continuación.
4.2.1. Construcción de los plásmidos pERkat y pERhlb.
Para la construcción de mutantes de S. aureus por delección del gen
katA, del gen hlb o de ambos mediante recombinación homóloga se recurrió,
en primer lugar, a la transformación de las cepas bacterianas con un vector
temperatura sensible. El vector elegido fue el plásmido pE194 (Horinouchi y
Weisblum, 1982), derivado de S. aureus que confiere resistencia a la
eritromicina, al que se le había insertado, en el sitio de corte de la enzima de
restricción Xba I, un fragmento del sitio de clonaje múltiple del plásmido
pCR2.1 (Invitrogen) comprendido entre los sitios de corte de Spe I y Xba I
(Díez, 2002).
Tabla 4.1. Cepas bacterianas empleadas en este estudio.
Cepas bacterianas Genotipo Fenotipo Utilización Procedencia
Staphylococcus aureus
2386 * katA hlb Kat+, Hlb+, Ems Transformación por protoplastos.
Estudios comparativos.
Aislada de caso de mamitis clínica en vacuno lechero.
2386 (pERkat) 2386 Ω pERkat Kat+, Hlb+, Emr Mutagénesis por recombinación. Este estudio.
2386 ∆katA ∆katA hlb Kat-, Hlb+, Ems Transformación por protoplastos.
Estudios comparativos.
Este estudio.
2386 ∆katA (pHkat) 2386 ∆katA Ω pHkat Kat+, Hlb+, Emr Estudios comparativos. Este estudio.
2386 (pERhlb) 2386 Ω pERhlb Kat+, Hlb+, Emr Mutagénesis por recombinación. Este estudio.
2386 ∆hlb katA ∆hlb Kat+, Hlb-, Ems Transformación por protoplastos.
Estudios comparativos.
Este estudio.
2386 ∆hlb (pHhlb) 2386 ∆hlb Ω pHhlb Kat+, Hlb+, Emr Estudios comparativos. Este estudio.
2386 ∆hlb (pERkat) 2386 ∆hlb Ω pERkat Kat+, Hlb-, Emr Mutagénesis por recombinación. Este estudio.
2386 ∆katA ∆hlb ∆katA ∆hlb Kat-, Hlb-, Ems Transformación por protoplastos.
Estudios comparativos.
Este estudio.
2386 ∆katA ∆hlb (pHkathlb) 2386 ∆katA ∆hlb Ω pHkathlb Kat+, Hlb+, Emr Estudios comparativos. Este estudio.
Escherichia coli
TOP10 Técnicas de clonaje molecular. Invitrogen.
DH5α Técnicas de clonaje molecular. Nuestro laboratorio.
Rhodococcus equi Test de CAMP. Nuestro laboratorio.
*Cepa cedida por el Dr. Eduardo Yus Respaldiza. Emr: resistente a eritromicina; Ems: sensible a eritromicina.
Capítulo 4 Material y métodos
70
Utilizando ADN extraído de S. aureus 2386, se amplificaron por PCR
dos fragmentos de aproximadamente 500 pb a ambos lados del gen katA y de
aproximadamente 1000 pb a ambos lados del gen hlb. Estos fragmentos se
unieron mediante PCR recombinante y las construcciones obtenidas se
clonaron en el plásmido pCR2.1.
Posteriormente las construcciones fueron liberadas mediante la
digestión de pCR2.1 con la enzima BstX I y, finalmente, se realizó la ligación de
cada una de ellas en el plásmido pE194 modificado, dando lugar a los
plásmidos pERkat y pERhlb, que vehiculaban las secuencias necesarias para la
delección de los genes katA y hlb respectivamente.
En la figura 4.1 se muestra un esquema de la construcción de los
plásmidos pERkat y pERhlb.
Tabla 4.2. Plásmidos utilizados en este estudio
Plásmidos Descripción Referencia
pCR2.1 Vector para el clonaje directo de productos de PCR. Ampicilinar.
Invitrogen.
pE194 Plásmido termosensible de S. aureus para intercambio alélico. Eritromicinar.
Horinouchi y Weisblum (1982).
pERkat pE194 conteniendo la secuencia apropiada para la delección del gen katA de S. aureus.
Este estudio.
pERhlb pE194 conteniendo la secuencia apropiada para la delección del gen hlb de S. aureus.
Este estudio.
pHpS9 Plásmido multicopia bifuncional E. coli / Bacillus subtilis. Eritromicinar.
Haima et al. (1990).
pHkat pHpS9 + fragmento de 1,6 kb con el gen katA deS. aureus 2386.
Este estudio.
pHhlb pHpS9 + fragmento de 3 kb con el gen hlb deS. aureus 2386.
Este estudio.
pHkathlb pHpS9 + fragmento de 1,6 kb con el gen katA y fragmento de 3 kb con el gen hlb de S. aureus 2386.
Este estudio.
Figura 4.1. Construcción de los plásmidos termosensibles pERkat y pERhlb.
Digestión con BstX I
Ligación
Digestión con BstX I
Ligación
pE194 3,7 kb
BstX
I
BstX
I
Spe I
Xba
I
Xba I
pERkat 4,7 kb
pERhlb 5,7 kb
S. aureus 2386
pCR2.1 3,9 kb
ATGTCATAA
BstX I BstX I
KAT 1 KATR 1 KATR 2 KAT 2
KAT 1 KAT 2
katA
S. aureus 2386
pCR2.1 3,9 kb
ATGGTGAAATAG
BstX I BstX I
HLB 1 HLBR 1 HLBR 2 HLB 2
HLB 1 HLBR 1 HLBR 2 HLB 2
hlb
Capítulo 4 Material y métodos
72
4.2.2. Construcción de los plásmidos pHkat, pHhlb y pHkathlb.
La complementación de los mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb
requería la construcción de plásmidos multicopia que vehicularan los genes
katA, hlb y ambos. Para ello se utilizó el plásmido pHpS9 (Haima et al., 1990),
un plásmido multicopia de 5,7 kb con capacidad de replicación en gram
negativos y gram positivos.
A partir de ADN extraído de S. aureus 2386 se amplificaron por PCR
dos fragmentos de 1,6 y 3 kb que contenían los genes katA y hlb,
respectivamente. El fragmento con el gen katA se clonó, en primer lugar, en el
plásmido pCR2.1, a continuación, se liberó mediante la digestión con EcoR I y,
finalmente, se llevó a cabo la ligación con pHpS9 para dar lugar a pHkat. El
fragmento con el gen hlb se insertó directamente en pHpS9, en el sitio de corte
de la enzima Sma I, obteniéndose el plásmido pHhlb. Por último, para la
construcción de pHkathlb se insertó el fragmento con el gen katA, liberado de
pCR2.1, en el plásmido pHhlb.
En la figura 4.2 se muestra un esquema de la construcción de los
plásmidos pHkat, pHhlb y pHkathlb.
4.3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
4.3.1. Oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos utilizados en este estudio para la amplificación de
fragmentos de ADN (véase tabla 4.3) fueron diseñados en nuestro laboratorio
a partir de secuencias del genoma de S. aureus COL (TIGR Microbial Database) y
sintetizados por Isogen Bioscence B.V. Los oligonucleótidos para PCR
recombinante fueron diseñados conforme a lo descrito por Vallejo et al. (1994).
Figura 4.2. Construcción de los plásmidos de complementación pHkat, pHhlb y pHkathlb.
Digestión con EcoR I
Ligación
S. aureus 2386
CAT -1 CAT 2katA
EcoR I EcoR I
pCR2.13,9 kb
pHpS9 5,7 kb
EcoR I
pHkat 7,3 kb
pHkathlb 10,3 kb
Digestión con EcoR I
Ligación
S. aureus 2386
HLB 1 HLB 2hlb
pHpS9 5,7 kb
Corte con Sma I
Ligación
pHhlb 8,7 kb
EcoR I
Capítulo 4 Material y métodos
74
4.3.2. Reacción de PCR.
Cada reacción de PCR se hizo generalmente en un volumen de 50 µl
siendo su composición la siguiente:
2 µl (50 ng) de ADN cromosómico previamente extraído. En la
PCR recombinante fue sustituido por los dos fragmentos de ADN a
unir, amplificados previamente por PCR y purificados.
5 µl de tampón de PCR 10x (Applied Biosystems Roche) (Tris-HCl
100 mM, pH 8,3; KCl 500 mM).
3 µl de solución de cloruro de magnesio (Applied Biosystems
Roche) (MgCl2 25 mM).
8 µl de la mezcla de dNTPs (Applied Biosystems Roche) (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP; 1,25 mM de cada uno).
1 µl de cada oligonucleótido empleado (0,5 mg/ml).
Tabla 4.3. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de ADN.
Oligonucleótidos Secuencia (5’-3’) Posición
KAT 1 ATGACCACAATGCCCAATACA (-504)-(-484)*
KATR 1 ATCAAATTTATGACATAGTCATCCCTCCAC (-14)-6 y
1515-1524*
KATR 2 GACTATGTCATAAATTTGATATGTAGTTTC (-4)-6 y
1515-1534*
KAT 2 TTCCGCTTTGAAATTTTAAAT 2004-2024*
HLB 1 AACTTTCTTTGTTCCATTTTT (-745)-(-725)#
HLBR 1 AGCACTATTTCACCATCATTATCACTCCTT (-14)-6 y
988-997#
HLBR 2 AATGATGGTGAAATAGTGCTGAACTAACTA (-4)-6 y
988-1007#
HLB 2 TTATTCAGAGACGATTAGTTA 1718-1738#
CAT –1 AGTCTCCCATCTATTTAAAT (-199)-(-180)*
CAT 2 TCATAAACTGCTCAACTACGC 1541-1561*
* y # Posición de los oligonucleótidos referida al codón de iniciación ATG de los genes katA y
hlb de S. aureus COL, respectivamente.
Señaladas en azul y rojo aparecen las secuencias complementarias entre cada pareja de
oligonucleótidos diseñados para PCR recombinante.
Capítulo 4 Material y métodos
75
0,25 µl de ADN polimerasa Amplitaq Gold (Applied Biosystems
Roche) (5 U/µl).
30,75 µl de agua bidestilada.
Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador Eppendorf
Mastercycler Gradient utilizando lo siguientes parámetros generales:
Desnaturalización inicial durante 10 minutos a 94ºC.
30 ciclos de amplificaciones consistentes en una fase de
desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto; una fase de hibridación de
oligonucleótidos durante 1 minuto a la temperatura adecuada, calculada
de acuerdo con la fórmula general T=[2x(A+T)+3x(G+C)]-5, y una
fase de elongación a 72ºC durante 1-4 minutos en función del tamaño
del fragmento a amplificar (1 kb ~ 1 minuto).
Elongación final durante 10 minutos a 72ºC.
Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1% en
TAE (TAE 50x: 242 g de Tris base, 57,1 ml de ácido acético glacial y 37,2 g de
Na2EDTA·2H2O pH 8 en un volumen final de 1 litro) con bromuro de etidio
(1 mg/ml). Como marcador de peso molecular se utilizó DNA Molecular Weight
Marker X (0,07-12,2 kbp) (Roche).
4.4. EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSÓMICO.
Las extracciones de ADN cromosómico se realizaron con el sistema comercial
GFXTM Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) con
algunas modificaciones.
4.5. CLONAJE Y TRANSFORMACIÓN DE FRAGMENTOS DE
ADN.
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR y los obtenidos
mediante digestión con enzimas de restricción se purificaron con dos sistemas
Capítulo 4 Material y métodos
76
comerciales: Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), para purificación directa del
producto de PCR y Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen), para purificación a
partir de geles de agarosa.
El clonaje directo de productos de PCR purificados se llevó a cabo en
el plásmido pCR2.1, y se transformaron en E coli TOP10 mediante el sistema
comercial TOPOTM TA Cloning (Invitrogen). La selección de colonias
transformadas se hizo por PCR para amplificar el fragmento clonado a partir
de bacterias lisadas en agua bidestilada estéril durante 10 minutos a 100ºC.
Los clonajes realizados en el plásmido pHpS9 se transformaron en
E. coli DH5α mediante choque térmico de las bacterias tratadas con CaCl2. La
selección de colonias transformadas se llevó a cabo de la misma forma que en
el caso anterior. En el caso de los clonajes en el plásmido pE194, la
transformación se hizo directamente en S. aureus mediante protoplastos (véase
apartado 4.7).
4.6. EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS.
Para la extracción de plásmidos se utilizaron dos sistemas comerciales,
RPM® Kit BIO 101 (QBIOgene) y Plasmid Purification Kit (Qiagen), añadiendo
una incubación con lisostafina durante 30 minutos a 37ºC durante la fase de
lisis en el caso de S. aureus.
4.7. TRANSFORMACIÓN DE PROTOPLASTOS.
El método utilizado para la transformación de protoplastos de S. aureus
fue el descrito por Götz et al. (1981).
Para la preparación de protoplastos se procedió del siguiente modo: un
volumen de 50 ml de PAB (Bacto Penassay Broth, Difco) 2x se inoculó con 2 ml
de un cultivo bacteriano que había crecido a 37ºC, en agitación, durante 18
Capítulo 4 Material y métodos
77
horas y se prolongó su incubación hasta alcanzar una DO540nm de 0,5. Las
bacterias se recogieron por centrifugación, se lavaron con 30 ml de SMM 1x
(glucosa 0,5M, ácido maleico 0,02M, MgCl2 0,02M) y, finalmente, se
resuspendieron en 5 ml de SMM 1x. En ese momento se añadió lisostafina
(concentración final de 50 µg/ml) que se dejó actuar a 32ºC durante 10
minutos. La lisis de la pared bacteriana se detuvo añadiendo 20 ml de SMMP
(SMM 2x : PAB 4x [v/v]) y se hicieron dos lavados con SMMP. Finalmente los
protoplastos se resuspendieron en SMMP en un volumen final de 5 ml, se
distribuyeron en alícuotas de 500 µl y se conservaron a –80ºC.
La transformación de los protoplastos se realizó añadiendo 0,1-1 µg de
ADN plasmídico a 500 µl de protoplastos, en presencia de SMM 2x y de PEG
al 40% (Polietilen glicol 8000). Transcurrido un minuto se añadieron 5 ml de
SMMP y se dejó un minuto más a temperatura ambiente. Seguidamente se
centrifugó para eliminar el PEG, se resuspendieron los protoplastos en 500 µl
de SMMP y se mantuvieron durante 4 horas a 32ºC para permitir la expresión
del plásmido. Transcurrido este tiempo los protoplastos se sembraron en
placas de medio de regeneración de protoplastos, DM3 (succinato sódico 0,5
M, 100 ml de hidrolizado de caseína al 5%, 25 ml de dextrosa al 20%, 100 ml
de tampón fosfato potásico, pH 7,4, cloruro magnésico 1 M y 10 ml de BSA al
5% en un volumen final de 1 l) con un 0,8% de agar, en presencia de
eritromicina (5 µg/ml) (resistencia conferida por el plásmido) y se incubaron a
32ºC durante 2 o 3 días.
Para la selección de colonias transformadas con pERkat o pERhlb se
realizó la amplificación por PCR de los fragmentos clonados a partir de
plásmido extraído. En el caso de los plásmidos pHkat, pHhlb o pHkathlb, los
transformantes se seleccionaron por haber recuperado el fenotipo de la cepa
original y se comprobó mediante PCR que las mutaciones seguían presentes en
su ADN y que portaban el plásmido de complementación.
Capítulo 4 Material y métodos
78
4.8. MUTAGÉNESIS POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA.
Para llevar a cabo la delección de los genes katA y hlb en S. aureus 2386
se recurrió a la mutagénesis por recombinación homóloga con las
construcciones clonadas en los plásmidos termosensibles pERkat y pERhlb.
Las bacterias transformadas con estos plásmidos se mantuvieron a
32ºC en caldo BHI con eritromicina (5 µg/ml) hasta llegar a fase estacionaria.
En ese momento se inocularon en medio de cultivo fresco y se incubaron a
43ºC durante 6 horas para forzar la integración del plásmido en el cromosoma
bacteriano. Transcurrido este tiempo se hicieron diluciones 1/100 a partir de
este cultivo en caldo BHI sin antibiótico, reduciendo la temperatura de
incubación a 37ºC para facilitar la pérdida del plásmido. Estas diluciones se
repitieron varias veces y se sembraron en agar BHI para obtener colonias
aisladas. Tras una incubación a 37ºC durante 24 horas las colonias se
analizaron para comprobar la presencia de mutantes. Los mutantes ∆katA se
seleccionaron en medio sólido por la ausencia de actividad catalasa al ser
puestos en contacto con peróxido de hidrógeno al 3%. Los mutantes ∆hlb se
seleccionaron en agar Columbia con un 5% de sangre de cordero por carecer
de halo de β-hemólisis y ser CAMP negativos en presencia de Rhodococcus equi.
Posteriormente, se comprobó que los mutantes hubieran perdido la resistencia
a eritromicina, si aún eran resistentes se continuaron las incubaciones a 37ºC
hasta conseguir la curación del plásmido. Por último se extrajo su ADN para
confirmar la delección del gen mediante técnicas de PCR
En la figura 4.3 se representa esquemáticamente el proceso de
recombinación.
4.9. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALASA.
Se realizó de forma cualitativa, poniendo en contacto las colonias
bacterianas, crecidas en medio sólido, con una solución de peróxido de
hidrógeno (H2O2) al 3%. Se observó si se producía o no la liberación de
Capítulo 4 Material y métodos
79
burbujas, característica de la prueba de la catalasa por la descomposición del
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Figura 4.3. Delección de un gen mediante mutagénesis por recombinación homóloga.
4.10. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD β-HEMOLÍTICA.
Se determinó de forma cualitativa creciendo las colonias bacterianas en
agar Columbia con un 5% de sangre de cordero. Se observó la presencia o
ausencia de un amplio halo de hemólisis incompleta tras la incubación a 37ºC
Curación del plásmido.
Cromosoma bacteriano
Plásmido termosensible Gen Em
Em Plásmido
termosensible
Cromosoma bacteriano
Recombinación homóloga por sobrecruzamiento.
Gen
Em Integración del plásmido recombinante en el cromosoma bacteriano.
Gen
Em Recombinación homóloga por sobrecruzamiento.
Gen
Capítulo 4 Material y métodos
80
que se aclaraba al incubar posteriormente a 4ºC (hemólisis “calor-frío”).
También se comprobó la aparición o no de una reacción hemolítica
cooperativa en forma de “pala” en presencia de Rhodococcus equi (reacción de
CAMP). Ambos fenómenos son debidos a la actividad esfingomielinasa de la
β-toxina (González-Zorn, 2001).
4.11. CURVAS DE CRECIMIENTO.
Para estudiar las características de crecimiento de S. aureus 2386 y sus
mutantes ∆katA, ∆hlb y ∆katA ∆hlb se decidió realizar sus curvas de
crecimiento. Para ello se inocularon 200 µl de cultivos en fase estacionaria
crecidos a 37ºC en matraces de 250 ml que contenían 100 ml de caldo BHI
(dilución 1/500). Estos cultivos se incubaron a 37ºC en agitación (175 rpm) y
se tomaron muestras cada hora durante las 8 primeras horas y una última
muestra a las 24 horas para medir la densidad óptica (DO) a una longitud de
onda de 600 nm. Las mediciones se realizaron sobre diluciones de cultivo, de
forma que la DO nunca fuese superior a 1 y posteriormente se multiplicaron
por el factor de dilución correspondiente. De esta forma se garantizaba la
linearidad de los resultados.
4.12. ESTUDIOS IN VITRO DE SUPERVIVENCIA
INTRACELULAR.
Para los ensayos de supervivencia intracelular se utilizaron las líneas
celulares J774A.1 y MAC-T. La línea J774A.1 (ATCC TIB-67) es una línea de
macrófagos de origen murino, concretamente de la cepa BALB/c. La línea
MAC-T es una línea epitelial mamaria de origen bovino (Huynh et al., 1991).
4.12.1. Mantenimiento de las líneas celulares.
El mantenimiento de la línea celular J774 se realizó con el medio de
cultivo RPMI 1640 (Gibco) al que se añadió un 10% de suero fetal bovino
inactivado (Gibco) y un 1% de Pen/Strep/Fungizone mix (Biowhittaker). Para
Capítulo 4 Material y métodos
81
la línea celular MAC-T se utilizó el medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagle
medium (DMEM; Gibco) complementado con un 10% de suero fetal bovino,
un 1% de Pen/Strep/Fungizone mix, 5 µg/ml de insulina (Sigma) y 1 µg/ml
de hidrocortisona (Sigma). La incubación se hizo a una temperatura de 37ºC en
una estufa con un aporte constante de un 5% de CO2.
4.12.2. Preparación de las suspensiones bacterianas.
Los cultivos se incubaron en 100 ml de caldo BHI con o sin
eritromicina (5 µg/ml) durante 18-20 horas en agitación. Transcurrido este
tiempo las bacterias se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 minutos, se
lavaron dos veces con PBS (Oxoid), se resuspendieron en un volumen final de
20 ml de PBS con un 20% de glicerol (Panreac) y se distribuyeron en alícuotas
de 1 ml, conservándose a –80ºC.
Para determinar la concentración bacteriana de las alícuotas se
descongeló una, se recogieron las bacterias a 4500 rpm durante 10 minutos, se
lavaron dos veces y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Posteriormente se
hicieron diluciones seriadas, se sembraron alícuotas de 100 µl en placas de agar
BHI y se incubaron a 37ºC para realizar el recuento de bacterias al día
siguiente.
En el momento de realizar los ensayos, se descongelaron las alícuotas
necesarias y se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 minutos. Posteriormente
se hicieron dos lavados con PBS y se resuspendieron en medio de invasión
(medio de mantenimiento celular sin Pen/Strep/Fungizone mix) ajustando la
concentración para una multiplicidad de infección (MOI) de 10: 1 en el caso de
células J774 y de 50: 1 en el caso de MAC-T.
4.12.3. Ensayos de supervivencia intracelular.
Los ensayos se realizaron en placas de 24 pocillos. Aproximadamente
dos días antes del experimento los pocillos se inocularon con 1 ml de una
suspensión de células con una concentración aproximada de 3x104 células/ml y
Capítulo 4 Material y métodos
82
se mantuvieron a 37ºC con un aporte constante de un 5% de CO2. Al día
siguiente se sustituyó el medio de cultivo por medio de invasión y el día del
experimento se comprobó mediante recuento de las células presentes en uno
de los pocillos que hubiera aproximadamente de 5-6x104 células/pocillo.
Para llevar a cabo el ensayo se renovó, en primer lugar, el medio celular
añadiendo 500 µl de medio de invasión a cada pocillo. Seguidamente se añadió
a los pocillos correspondientes el mismo volumen de las suspensiones
bacterianas en estudio. En este momento las placas se centrifugaron a 1500
rpm durante 5 minutos para facilitar el contacto bacteria-célula y así
incrementar el porcentaje de internalización, proceso que se llevó a cabo
posteriormente a una temperatura de 37ºC con un 5% de CO2 durante una
hora. Pasado este tiempo se realizaron dos lavados con PBS y se añadió medio
de invasión con gentamicina (100 µg/ml) para lisar las bacterias presentes en el
medio extracelular. Los periodos de incubación con la gentamicina variaron en
función de la medición que se fuera a hacer. El tiempo denominado cero
correspondió a un periodo de una hora con la gentamicina y los tiempos
denominados 4, 8 y 24 se correspondieron con un periodo de incubación con
el antibiótico de 4, 8 y 24 horas, respectivamente. Tras la incubación con la
gentamicina se realizaron dos lavados con PBS y se añadió Triton X-100 al
0,2% para lisar las células y liberar las bacterias supervivientes del medio
intracelular. En ese momento el contenido de los pocillos se diluyó y se
sembró en placas de agar BHI que fueron incubadas a 37ºC durante 24 horas
para realizar el recuento de UFC. El número de bacterias presentes en el
tiempo cero (bacterias internalizadas) se tomó como referencia para seguir la
evolución de éstas a lo largo del tiempo, expresando el número de UFC
contabilizadas en cada tiempo como porcentaje de las obtenidas en el tiempo
cero.
Capítulo 4 Material y métodos
83
4.13. DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL 50 EN UN MODELO
MURINO.
4.13.1. Animales de experimentación.
En estos experimentos se utilizaron hembras Swiss de 4 semanas de
edad y un peso aproximado de 21-23 g. Para cada cepa bacteriana se emplearon
25 ratones divididos en cinco grupos de cinco animales cada uno.
4.13.2. Preparación de las suspensiones bacterianas.
El día anterior al experimento se prepararon los cultivos bacterianos en
100 ml de caldo BHI con o sin eritromicina (5 µg/ml). Estos cultivos se
mantuvieron en agitación durante 18-20 horas a 37ºC para alcanzar la fase
estacionaria. El día del experimento se recogieron las bacterias mediante una
centrifugación a 4.500 rpm durante 10 minutos y se sometieron a dos lavados
con 10 ml de PBS estéril. Finalmente se resuspendieron las bacterias en 5 ml de
PBS obteniendo de esta forma la dosis más alta a inocular y a partir de ella se
hicieron diluciones seriadas para preparar las demás dosis. Las dosis utilizadas
oscilaron entre 1x106 y 1x1011 UFC/ml.
4.13.3. Inoculación y determinación de la dosis letal 50.
Cada grupo de animales se inoculó con una dosis bacteriana diferente
con el objeto de determinar la dosis letal 50 (DL50). La vía de inoculación fue
intraperitoneal utilizándose un volumen de 0,4 ml de suspensión bacteriana
(Hasegawa y Kondo, 1984). El periodo de observación tras el día de la
inoculación fue de 7 días. El cálculo de la DL50 se realizó según el método de
Reed y Muench (1938).
Capítulo 4 Material y métodos
84
4.14. MÉTODOS ESTADÍSTICOS.
Todos los experimentos realizados para los estudios de supervivencia
intracelular en las líneas celulares J774A.1 y MAC-T y la determinación de
dosis letal 50 en el modelo murino se hicieron por triplicado y con los datos
obtenidos se estimaron las medias aritméticas con su desviación estándar. En
todos los estudios se compararon los resultados de la cepa salvaje de S. aureus
con los de cada mutante y su complementado buscando diferencias que fuesen
estadísticamente significativas.
Los análisis de significación se realizaron mediante análisis de varianza y en los
casos en los que el valor de p fue < 0,05 se llevó a cabo un test de
Tukey-Kramer para un nivel de confianza del 95%. Para todos los análisis
estadísticos se utilizó el programa informático GraphPad InStat versión 3.05.
5. CONCLUSIONES
87
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
Capítulo 5
CONCLUSIONES
PRIMERA
La catalasa promueve la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales
mamarias bovinas MAC-T, contribuyendo a la defensa de la bacteria durante las primeras
horas postinfección, pero no influye significativamente en la supervivencia de S. aureus en el
interior de células macrofágicas murinas J774A.1. Esto revela que existen diferencias en el
peso relativo del sistema citotóxico oxígeno-dependiente en la actividad bactericida de estos
dos tipos celulares.
SEGUNDA
La β-toxina no juega un papel relevante en la proliferación intracelular de S. aureus
en células epiteliales mamarias bovinas, sin embargo, presenta un ligero efecto sobre la
persistencia en estas células que no se produce en las células macrofágicas murinas, lo que
podría estar relacionado con la diferente composición en esfingomielina de estos dos tipos
celulares.
TERCERA
La catalasa y la β-toxina actúan de forma sinérgica durante el ciclo de vida
intracelular de S. aureus. La carencia simultánea de ambas enzimas se traduce en un retraso
en la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas y en un
notable incremento en su persistencia en los dos tipos celulares estudiados, esto último
como consecuencia, posiblemente, de una menor patogenicidad para la célula.
CUARTA
La catalasa y la β-toxina, por sí solas, no juegan un papel decisivo en la virulencia de
S. aureus en un modelo murino de infección, sin embargo, el efecto combinado de ambas
enzimas juega un papel determinante en la virulencia de la bacteria en este modelo.
RESUMEN
91
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
RESUMEN
S. aureus es un microorganismo ubicuo causante de diversas enfermedades tanto en el
hombre como en los animales domésticos. En medicina veterinaria destaca principalmente por su
implicación en las infecciones intramamarias, que ocasionan importantísimas pérdidas económicas
en la producción bovina, ovina y caprina.
S. aureus ha sido considerado tradicionalmente como un patógeno extracelular, sin
embargo, en los últimos años se ha puesto de manifiesto la capacidad de esta bacteria para
internalizarse, sobrevivir y, en ocasiones, multiplicarse en diferentes tipos celulares, incluidas células
fagocíticas. La capacidad de supervivencia intracelular que presenta S. aureus puede jugar un papel
importante en la patogénesis contribuyendo a la persistencia de la infección en el organismo al
proteger a la bacteria de la actividad del sistema inmune y de los tratamientos antibióticos y facilitar
su diseminación, lo que explicaría las formas crónicas y recurrentes de las infecciones producidas
por S. aureus, especialmente, las infecciones intramamarias.
La supervivencia intracelular de S. aureus puede estar determinada por su capacidad para
hacer frente a la acción bactericida derivada del metabolismo oxidativo de las células eucariotas. Así,
mientras que en bacterias como M. tuberculosis, C. jejuni y H. pylori se ha demostrado que la catalasa,
una enzima responsable de la degradación del peróxido de hidrógeno generado durante este
metabolismo en agua y oxígeno molecular, es un factor esencial para su supervivencia en el interior
de diversos tipos celulares, en S. aureus, sin embargo, no se ha determinado con precisión hasta la
fecha el posible papel que esta enzima pueda jugar en su patogénesis. La mayoría de las
investigaciones que se han realizado hasta el momento se han basado en el estudio de aislados
clínicos de cepas con diferente nivel de actividad catalasa o de mutantes catalasa negativos
obtenidos por mutagénesis química o hallados de forma accidental en el laboratorio. Que tengamos
conocimiento, únicamente en un estudio se ha comparado la patogenicidad de un mutante catalasa
negativo obtenido mediante técnicas genéticas con la de su cepa parental, no encontrándose
diferencias entre ambos en un modelo murino de abscesos cutáneos.
Igualmente, la β-toxina, una enzima que actúa degradando la esfingomielina presente en las
membranas celulares, podría jugar un papel importante durante el ciclo de vida intracelular de
S. aureus, participando, al igual que otras esfingomielinasas bacterianas, en la ruptura de la vacuola
fagocítica, y posterior liberación de la bacteria al citoplasma de la célula infectada, y en la inducción
de apoptosis celular a través de la liberación de ceramida. No obstante, la posible contribución de la
Resumen
92
β-toxina a la patogénesis de S. aureus no se ha demostrado concluyentemente hasta la fecha. La
mayoría de los estudios realizados se han centrado en determinar el efecto de la β-toxina sobre
diversos tipos celulares y tejidos, utilizando para ello toxina purificada y deben ser considerados con
cautela por la posible presencia de contaminantes. Asimismo, los intentos de utilizar una estrategia
genética para descifrar el papel de la β-toxina en la virulencia han sido escasos y poco concluyentes.
Basándonos en estos hechos, el objetivo principal que se planteó para esta Tesis Doctoral
fue determinar el posible papel de la catalasa y de la β-toxina, así como del efecto combinado de
ambas, en la patogénesis de S. aureus.
Para ello en una primera etapa se construyeron mutantes simples por delección de los
genes katA (catalasa negativo) y hlb (β-toxina negativo) y un mutante doble por delección de ambos
genes a partir de una cepa de S. aureus, la 2386, que había sido aislada de un caso clínico de mamitis
en ganado bovino.
Posteriormente se comparó el comportamiento de los mutantes con el de la cepa parental
utilizando diversos modelos biológicos. Concretamente se estudió su capacidad de supervivencia
intracelular en la línea macrofágica murina J774A.1 y en la línea epitelial mamaria bovina MAC-T y
su virulencia en un modelo murino de infección experimental, mediante la estimación de la DL50.
En los ensayos realizados de supervivencia intracelular de S. aureus 2386 en comparación
con su mutante ∆katA en la línea celular J774A.1 no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas atribuibles a la catalasa. En la línea celular MAC-T, sin embargo, la ausencia de
actividad catalasa afectó de forma significativa a la proliferación de la bacteria en las primeras horas
postinfección. De este resultado se deduce que la catalasa promueve la proliferación intracelular de
S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas, contribuyendo a la defensa de la bacteria durante
las primeras horas postinfección, pero no influye significativamente en la supervivencia de S. aureus
en el interior de células macrofágicas murinas, revelando la existencia de diferencias en el peso
relativo del sistema citotóxico oxígeno-dependiente en la actividad bactericida de estos dos tipos
celulares.
Cuando se comparó la supervivencia intracelular de S. aureus 2386 con la de su mutante
∆hlb en células J774A.1 no se encontraron diferencias estadísticamente significativas atribuibles a la
β-toxina. En células MAC-T, por el contrario, se observaron diferencias significativas a favor del
mutante en la persistencia intracelular de la bacteria pero no en su proliferación. La β-toxina, por
tanto, no juega un papel relevante en la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales
mamarias bovinas, presentando, sin embargo, un ligero efecto sobre la persistencia en estas células
Resumen
93
que no se produce en las células macrofágicas murinas, lo que podría estar relacionado con la
diferente composición en esfingomielina de estos dos tipos celulares.
Finalmente, en los estudios realizados sobre la capacidad de supervivencia intracelular de
S. aureus 2386 y su mutante ∆katA ∆hlb se hallaron diferencias estadísticamente significativas a favor
del doble mutante en las dos líneas celulares utilizadas. Estos estudios muestran que la catalasa y la
β-toxina actúan de forma sinérgica durante el ciclo de vida intracelular de S. aureus, de manera que la
carencia simultánea de ambas enzimas se traduce en un retraso en la proliferación intracelular de
S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas y en un notable incremento en su persistencia en
los dos tipos celulares estudiados, esto último como consecuencia, posiblemente, de una menor
patogenicidad para la célula.
Los ensayos de virulencia en el modelo murino (DL50) indican que la catalasa y la β-toxina,
por sí solas, no juegan un papel decisivo en la virulencia de S. aureus, sin embargo, el efecto
combinado de ambas enzimas juega un papel determinante en la virulencia de la bacteria en este
modelo.
La mayor permisividad de replicación y persistencia intracelulares, así como la menor
patogenicidad, mostradas por el doble mutante, le convierten en un buen candidato para su posible
uso como vacuna atenuada frente a los procesos causados por S. aureus.
SUMMARY
97
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
SUMMARY
S. aureus is an ubiquitous microorganism which causes several diseases both in humans and
in domestic animals. In Veterinary Medicine S. aureus is mainly involved in intramammary
infections, which cause severe economic losses in the bovine, ovine and caprine dairy produce.
Although S. aureus is traditionally considered as an extracellular pathogen, it has been
demonstrated recently that S. aureus is able to be internalized, survive and, at times, multiplies inside
different cell types, including phagocytic cells. The ability of S. aureus to survive in the eukaryotic
intracellular environment may be important in bacterial pathogenesis. Internalization could
promote the persistence of the infection in the host, providing a means of protection against the
host immune system and antibiotics and enhancing bacterial dissemination. This would explain the
recurrent and chronic forms of the S. aureus infections, especially, the intramammary infections.
The intracellular survival of S. aureus could depend on its ability to resist the bactericidal
activity derived fron the oxidative metabolism of eukaryotic cells. In bacteria such as M. tuberculosis,
C. jejuni and H. pylori, catalase, an enzyme that breaks up the hydrogen peroxide generated by the
oxidative metabolism into water and molecular oxygen, has been demonstrated to be an essential
factor for the bacterial survival inside several cell types. However, the possible role of this enzyme
in the S. aureus pathogenesis has not been determined precisely up to date. Most of the works done
to the present are based on the study of clinical isolates with different levels of catalase or catalase
negative mutants obtained by chemical mutagenesis or spontaneously in the laboratory. To the best
of our knowledge, only one study has compared the pathogenicity of a catalase negative mutant
obtained by genetic techniques with that of its respective wild type strain, and it did not report any
differences in a murine skin abscess model of infection.
In addition, β-toxin, an enzyme that degrades the sphingomyelin of the cellular
membranes, could play an important role during the intracellular life cycle of S. aureus. This enzyme,
like other bacterial sphingomyelinases, could take part in the disruption of the phagocytic vacuole,
and the subsequent release of bacteria into the cytosol of the infected cell, and in the induction of
cellular apoptosis by ceramide generation. Nevertheless, the possible contribution of β-toxin to the
S. aureus pathogenesis has not been demonstrated unequivocally up to date. Most of studies have
been phocused on researching the effect of purified β-toxin on several cell types and tissues and
they should be considered with caution because of the possible presence of contaminants.
Summary
98
Moreover, the attempts to utilize a genetic strategy to decipher the role of β-toxin in the virulence
have been few and scarcely conclusive.
Based on these facts the principal objective of this Doctoral Thesis was to determine the
possible role of catalase and β-toxin, as well as of the combined effect of both, on the pathogenesis
of S. aureus.
Firstly, we constructed catalase-, β-toxin- and catalase/β-toxin null-mutants by deletion of
katA and hlb genes from S. aureus strain 2386, isolated from a case of mastitis in cow.
Subsequently, we compared the behavior of the mutants with their wild type strain in
several biologic models. We investigated their ability to survive intracellularly in the murine
macrophagic cell line J774A.1 and in the bovine mammary epithelial cell line MAC-T and their
virulence in a murine model of experimental infection, by DL50 estimation.
In the experiments of intracellular survival of S. aureus 2386 in comparison with its ∆katA
mutant in the J774A.1 cell line we did not find any statistically significant difference due to the
catalase. However, in the MAC-T cell line the lack of catalase activity significantly affected the
bacterial proliferation during the first hours postinfection. In view of these results, we propose that
catalase promotes the intracellular proliferation of S. aureus in bovine mammary epithelial cells,
contributing to the defense of the bacteria during the first hours postinfection, but it does not
significantly influence the intracellular survival of S. aureus in murine macrophages. This fact reveals
the existence of differences in the relative weight of the oxygen-dependent cytotoxic system in the
bactericidal activity of both cell types.
When we compared the intracellular survival of S. aureus 2386 with that of its ∆hlb mutant
we did not find any statistically significant difference due to the β-toxin. Contrariwise, in MAC-T
cells we found statistically significant differences in favor of the ∆hlb mutant in the bacterial
intracellular persistence but not in the bacterial proliferation. Therefore, β-toxin does not play a
relevant role in the intracellular proliferation of S. aureus in bovine mammary epithelial cells;
however it has a slight effect on the bacterial persistence in these cells that does not happen in
murine macrophages. This last fact could be related with the different sphingomyelin content in
both cell types.
Lastly, in the experiments about the ability of intracellular survival of S. aureus 2386 and its
∆katA ∆hlb mutant we found statistical significant differences in favor of the double mutant in
Summary
99
both cell lines studied. These experiments show that catalase and β-toxin act sinergically during the
S. aureus intracellular life cycle. The lack of both enzymes causes a delay in the intracellular
proliferation of S. aureus in bovine mammary epithelial cells and a remarkable increment in its
persistence in both studied cell types studied, possibly because of a decreased pathogenicity to the
cell.
From the virulence assays in the murine model (DL50) it may be concluded that catalase
and β-toxin by themselves do not play a decisive role in the virulence of S. aureus. However, the
combined effect of both enzymes play an important role in the bacterial virulence in this model.
The higher ability of the double mutant to persist and replicate intracellularly, as well as its
decreased pathogenicity, make it a good candidate for its possible use as an attenuated vaccine for
the processes caused by S. aureus.
BIBLIOGRAFÍA
103
Influencia de la catalasa y de la β-toxina en la patogénesis de Staphylococcus aureus
BIBLIOGRAFÍA Aarestrup, F. M., H. D. Larsen, N. H. Eriksen, C. S. Elsberg and N. E. Jensen. 1999. Frequency of
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