UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE …Natal/RN 2011 Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

MESTRADO EM BIOQUÍMICA

ROBERTA LUCIANA DO NASCIMENTO GODONE

ISOLAMENTO DE UMA QUITINASE EXTRAÍDA DO

CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936): AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES

ANTIMICROBIANA E LARVICIDA

NATAL/RN 2011

ROBERTA LUCIANA DO NASCIMENTO GODONE

ISOLAMENTO DE UMA QUITINASE EXTRAÍDA DO CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti

(BURKENROAD, 1936): AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E LARVICIDA

Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Duarte Martins da Matta

Natal/RN 2011

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Bioquímica.

Catalogação da Publicação na Fonte

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Biblioteca Central Zila Mamede

Godone, Roberta Luciana do Nascimento.

Isolamento de uma quitinase extraída do cefalotórax do camarão marinho

Litopenaeus Schmitti (BURKENROAD, 1936) : avaliação de suas atividades

antimicrobiana e larvicida / Roberta Luciana do Nascimento Godone. – Natal, 2011.

100 f. : il.

Orientadora: Adriana Ferreira Uchôa.

Co-orientadora: Luciana Duarte Martins da Matta.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Biociências. Departamento de Bioquímica. Mestrado em Bioquímica.

1. Biotecnologia – Caracterização e aplicação – Dissertação. 2. Invertebrado –

Dissertação. 3. Enzimas – Dissertação. 4. Glicosidases – Dissertação. I. Uchôa,

Adriana Ferreira. II. Matta, Luciana Duarte Martins. III. Universidade Federal do Rio

Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BCZM CDU 577.15(043.3)

Dedico esta obraDedico esta obraDedico esta obraDedico esta obra

A DeusDeusDeusDeus, fonte de aguá viva, meu pai fiel, estais comigo e eu contigo a todo o momento, seja ao meu lado ou me carregando nos braços, obrigada por todas as graças derramadas em minha

vida. Amém!

À minha mãe Aneide Aneide Aneide Aneide e o meu irmão MatheusMatheusMatheusMatheus, por toda paciência, carinho e compreensão, durante toda a minha vida, agradeço a Deus todos os dias desde o momento que acordo ate ir dormir, sei

que sou uma pessoa abençoada, pois tenho vocês.

À minha Orientadora, ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Luciana Duarte Martins da . Luciana Duarte Martins da . Luciana Duarte Martins da . Luciana Duarte Martins da MattaMattaMattaMatta, pela grande oportunidade de ingressar na ciência, pela amizade, atenção, carinho, compreensão e ensinamentos. Para

mim é uma honra inesplicavél, fazer parte do seu tão maravilhoso grupo de pesquisa, e sinto-me mais honrada ainda em poder dizer que fui preparada pela senhora. Quando vejo este trabalho concluído, me emociono, pois trabalhamos juntas e finalmente conseguimos o que tanto sonhavamos. Obrigada

sempre...

Ao Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memoriam),Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memoriam),Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memoriam),Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memoriam), pela oportunidade que me ofereceu, me aceitando como aluna de mestrado e me fazendo participar de seu grupo de pesquisa. Por depositar em mim, uma grande confiança, por acreditar no meu potencial, e ainda me fazer mais forte e determinada. Sou muito grata porisso e levarei comigo grandes lições de vida que aprendi

convivendo ao seu lado. Muito obrigada e sinto saudades.

AGRADECIMENTOS

A DeusDeusDeusDeus meu pai e amigo sinto-me tão feliz, pois sei que nunca me abandonaste e nunca me abandonará.Te amo Deus.

À minha mãezinhamãezinhamãezinhamãezinha e meu irmãozinhoirmãozinhoirmãozinhoirmãozinho por sempre acreditarem em mim, até quando eu não acreditava. Obrigada!

Á minha Orientadora ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Luciana da Matta (Profa). Luciana da Matta (Profa). Luciana da Matta (Profa). Luciana da Matta (Profa), pela confiança e apoio, em minha caminhada científica. A senhora é simplesmente Demais!!!!

Aos meus grandes amigos e cúmplices: Caroline Gabriela (Caroline Gabriela (Caroline Gabriela (Caroline Gabriela (GabiGabiGabiGabi)))), , , , Nerivaldo (Nerivaldo (Nerivaldo (Nerivaldo (NeríNeríNeríNerí)))), Stélio (Stélio (Stélio (Stélio (StelhinhoStelhinhoStelhinhoStelhinho)))) e Simony (Júlia)Simony (Júlia)Simony (Júlia)Simony (Júlia) que a todo tempo sempre estão de prontidão a me ouvir e ajudar, vocês são exemplo de caráter e otimismo. Simplesmente adoro vocês.

Ao Prof. Dr. LuizProf. Dr. LuizProf. Dr. LuizProf. Dr. Luiz RobertoRobertoRobertoRoberto pela ajuda, disponibilidade e contribuições valiosas em minha banca de qualificação, obrigada por ter participado desta etapa tão importante de minha vida.

Ao Prof. Dr. Maurício Pereira de SalesProf. Dr. Maurício Pereira de SalesProf. Dr. Maurício Pereira de SalesProf. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memorian) por ter me aceitado como aluna de mestrado e ter acreditado no meu potencial. Obrigada!

À ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Adriana Uchôa. Adriana Uchôa. Adriana Uchôa. Adriana Uchôa por ter me aceitado como orientanda. Serei sempre grata porisso.

À ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Ana Heloneida. Ana Heloneida. Ana Heloneida. Ana Heloneida por ter aceitado participar de minha banca de qualificação, muitíssimo obrigada.

À ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Vânia Andrade , . Vânia Andrade , . Vânia Andrade , . Vânia Andrade , por ter aberto as portas de seu laboratório, pela orientação nos ensaios microbiológicos, por ter colocando uma de suas melhores alunas para me ajudar e por ter aceitado em participar de minha banca de qualificação, fazendo apontamentos valiosíssimos. Muito Obrigada.

Aos Professores Doutores José Luiz José Luiz José Luiz José Luiz Lima FilhoLima FilhoLima FilhoLima Filho e João Paulo MatosJoão Paulo MatosJoão Paulo MatosJoão Paulo Matos, por terem aceitado participar de minha banca de defesa. Muito Obrigada.

As meninas do LAMEA: Gabriela (Gabi), Raísa e LuizaGabriela (Gabi), Raísa e LuizaGabriela (Gabi), Raísa e LuizaGabriela (Gabi), Raísa e Luiza. Obrigada meninas!!!

O anjinho de candura, Gabriela (Gabi),Gabriela (Gabi),Gabriela (Gabi),Gabriela (Gabi), a qual sem ela eu não teria conseguido realizar nem entender os experimentos na Microbiologia. Obrigada pela paciência e percistência. Gabi você é mil...

À ProfProfProfProfaaaa. Dr. Dr. Dr. Draaaa. Fátima Ximenes. Fátima Ximenes. Fátima Ximenes. Fátima Ximenes, por ter disponibiizado o seu laboratório para a realização dos ensaios com os Aedes aegypti.

À Veterinária Patrícia BarraPatrícia BarraPatrícia BarraPatrícia Barra (Pati)(Pati)(Pati)(Pati), pela amizade incondicional, pelos momentos de descontração e passeios tão divertidos. Sem sua ajuda e ídeias tão pespícazes, eu não teria feito muita coisa. Sei que além de uma colega de trabalho, ganhei uma amiga para vida toda, você foi imprecindível na realização deste trabalho.

A Rafaella (Rafinha)Rafaella (Rafinha)Rafaella (Rafinha)Rafaella (Rafinha), pela amizade, palavras de força e dedicação, sei que sempre poderei contar contigo. E como eu ando dizendo pra você “Tô aqui viu”...

A JoyceJoyceJoyceJoyce, pela amizade tão sincera e carinho para comigo, adorei ter te conhecido e ser sua amiga, conta sempre comigo!

A HenriqueHenriqueHenriqueHenrique, pela amizade tão querida, pela companhia no Lab e pelas conversas tão divertidas e peculiares, que por muitas vezes me fizeram rir horrores... Te amo Lindão!!

Aos meus queridos amigos e companheiros da tão maravilhosa convivência no nosso “céuzinho” chamado LQFP: BrunaBrunaBrunaBruna (Brunete)(Brunete)(Brunete)(Brunete),,,, HenriqueHenriqueHenriqueHenrique (Amore)(Amore)(Amore)(Amore), Juliana, Juliana, Juliana, Juliana (Jú)(Jú)(Jú)(Jú), Paula, Leonardo, Paula, Leonardo, Paula, Leonardo, Paula, Leonardo (Léo)(Léo)(Léo)(Léo), Daniela, Daniela, Daniela, Daniela (Dani)(Dani)(Dani)(Dani) e SíSíSíSílvialvialvialvia, obrigada pelo apoio e ajuda nos experimentos, saibam que estarão sempre em meu coração.

À minha “IC/especial preferida” Bruna (Bruninha/Brunete)Bruna (Bruninha/Brunete)Bruna (Bruninha/Brunete)Bruna (Bruninha/Brunete), pela ajuda incondicional nos experimentos, força, amizade e companheirismo, sempre me colocando pra cima. Sem sua ajuda não sei o que seria de mim. Adoro você minha florzinha.

A Ticiana (Tici)Ticiana (Tici)Ticiana (Tici)Ticiana (Tici) e a CarolCarolCarolCarol (De boa na lagoa)(De boa na lagoa)(De boa na lagoa)(De boa na lagoa) pela convivência, paciência e carinho que sempre tiveram comigo, me lembrarei de vocês com carinho imenso, Obrigada.

A Sheyla VarelaSheyla VarelaSheyla VarelaSheyla Varela e a Dayse CarolineDayse CarolineDayse CarolineDayse Caroline, pela acolhida em minha mudança de laboratório, no início do mestrado e pela convivência tão especial, vocês duas foram muito importantes nesta etapa de minha vida. Meninas, muito obrigada!

Ao pessoal tão querido do BIOPOL PrPrPrProfofofof.... Dr.Dr.Dr.Dr. HugoHugoHugoHugo OliveiraOliveiraOliveiraOliveira, Sara, , Sara, , Sara, , Sara, Mariana, Leandro, PopóMariana, Leandro, PopóMariana, Leandro, PopóMariana, Leandro, Popó, Rafael, , Rafael, , Rafael, , Rafael, NedinaldoNedinaldoNedinaldoNedinaldo, , , , Arthur Arthur Arthur Arthur e JailmaJailmaJailmaJailma.

A JailmJailmJailmJailminhainhainhainha minha amiguinha do peito, muito obrigada pelo apoio, amizade e carinho, nunca esquecerei o que você fez e até hoje faz por mim, pode ter certeza você nunca sairá de meu coração. Convivendo com pessoas como você, só me faz ter mais certeza que ainda existem “os puros de coração”. Os meus mais sinceros agradecimentos.

Aos professores do Departamento de Bioquímica que direta ou indiretamente contribuirão na minha formação.

Aos amigos de departamento que colaborarão com a realização de experimentos: Patrícia,Patrícia,Patrícia,Patrícia, Norberto,Norberto,Norberto,Norberto, Nathália,Nathália,Nathália,Nathália, RaRaRaRaffffaelaelaelaelLLLLa, Joyce, a, Joyce, a, Joyce, a, Joyce, RafaelRafaelRafaelRafael e Ana PaulaAna PaulaAna PaulaAna Paula (minha 1º IC/querida).

Ao querido amigo Paulo Ricardo (Paulindo)Paulo Ricardo (Paulindo)Paulo Ricardo (Paulindo)Paulo Ricardo (Paulindo), pela amizade e ajuda na utilização dos programas estatísticos. Se não fosse você, nem sei. Brigadinha....

Aos companheiros da turma de Mestrado 2009: Clarissa, Alisson, Clarissa, Alisson, Clarissa, Alisson, Clarissa, Alisson, Renata, Ana Keyla, Larissa, Leandro Karlan, Dayse, Dayse Caroline, Renata, Ana Keyla, Larissa, Leandro Karlan, Dayse, Dayse Caroline, Renata, Ana Keyla, Larissa, Leandro Karlan, Dayse, Dayse Caroline, Renata, Ana Keyla, Larissa, Leandro Karlan, Dayse, Dayse Caroline, Dayse Santos, Nathália, Janisson, Angélica, Jana, Rafael, LeonardoDayse Santos, Nathália, Janisson, Angélica, Jana, Rafael, LeonardoDayse Santos, Nathália, Janisson, Angélica, Jana, Rafael, LeonardoDayse Santos, Nathália, Janisson, Angélica, Jana, Rafael, Leonardo NobreNobreNobreNobre, Marcos, Marcos, Marcos, Marcos FelipeFelipeFelipeFelipe, Ruth, Luciana, Leonardo Rêgo, Ruth, Luciana, Leonardo Rêgo, Ruth, Luciana, Leonardo Rêgo, Ruth, Luciana, Leonardo Rêgo e DieDieDieDiegogogogo.

Aos funcionários do Departamento de Bioquímica: Seu Marcos, Creuza, Seu Marcos, Creuza, Seu Marcos, Creuza, Seu Marcos, Creuza, Seu ItamaSeu ItamaSeu ItamaSeu Itamar, Jonas, Ângela, Eliene, Ricardo, Seu Rogérior, Jonas, Ângela, Eliene, Ricardo, Seu Rogérior, Jonas, Ângela, Eliene, Ricardo, Seu Rogérior, Jonas, Ângela, Eliene, Ricardo, Seu Rogério e Dona Dona Dona Dona MargaritaMargaritaMargaritaMargarita.

Aos amigos queridos do DBQ, Virgínia, Raquel, Érika, Ricardo, Marília, Virgínia, Raquel, Érika, Ricardo, Marília, Virgínia, Raquel, Érika, Ricardo, Marília, Virgínia, Raquel, Érika, Ricardo, Marília, Tuane, Luiza, CeTuane, Luiza, CeTuane, Luiza, CeTuane, Luiza, Celina, Carol, Gabriel, Raniere, Cínthia, Richelle, lina, Carol, Gabriel, Raniere, Cínthia, Richelle, lina, Carol, Gabriel, Raniere, Cínthia, Richelle, lina, Carol, Gabriel, Raniere, Cínthia, Richelle, Alexandre, JéssicaAlexandre, JéssicaAlexandre, JéssicaAlexandre, Jéssica,Thiago, Rafael Russi, Hugo,Thiago, Rafael Russi, Hugo,Thiago, Rafael Russi, Hugo,Thiago, Rafael Russi, Hugo e VanessaVanessaVanessaVanessa.

A todos que contribuíram de alguma forma para realização deste trabalho.

A UFRN e agências financiadoras CAPES e CNPq.

“... Não desanime de você, ainda que a colheita de hoje não seja muito feliz. Não coloque um ponto final nas suas esperanças. Ainda há muito o que fazer, ainda há muito o que plantar, e o que amar nessa vida. Ao invés de ficar parado no que você fez de errado, olhe para frente, e veja o que ainda pode ser feito...

A vida ainda não terminou. E já dizia o poeta "que os sonhos não envelhecem...por isso devemos sonhar sempre, sonhar grande,

sonhar lindo, sonhar rindo..."

Padre Fábio de MeloPadre Fábio de MeloPadre Fábio de MeloPadre Fábio de Melo

RESUMO

As quitinases são enzimas envolvidas na degradação da quitina e estão presentes em uma gama de organismos, inclusive os que não contêm quitina, tais como bactérias, vírus, plantas e animais desempenhando importantes papeis fisiológicos e ecológicos. A quitina é hidrolisada por um sistema quitinolítico classificado como: Endo-quitinases, Exo-quitinases e N-acetil-β-D-glucosaminidases. Neste trabalho, a Litochitinase1 foi extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti e purificada 987,32 vezes utilizando-se cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e de exclusão molecular Sephacryl S-200. Esta apresentou massa molecular em torno de 28,5 kDa. Os resultados obtidos, após os testes cinéticos com a Litochitinase1 utilizando-se como substrato o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo, mostraram Km aparente de 0,51 mM, atividade ótima em pH variando de 5,0 a 6,0, temperatura ótima a 55°C e estabilidade de atividade quando pré-incubada nas temperaturas de 25, 37, 45, 50 e 55°C. A enzima apresentou uma faixa de estabilidade nos pHs de 4,0 a 5,5. O HgCl2, inibiu significativamente a Litochitinase1 enquanto que o MgCl2 potencializa levemente sua atividade. Os testes antimicrobianos realizados mostraram que a Litochitinase1 apresenta atividade contra a bactéria gram-negativa Escherichia coli numa concentração que varia 800 a 500 µg/mL. A atividade larvicida contra Aedes aegypti foi investigada com os extratos brutos, F-III (50-80%) e na Litochitinase1 com tempo de 24 e 48 horas. Os resultados obtidos mostraram atividade larvicida em todas estas amostras com valores de EC50 de 6,59 mg/mL para o extrato bruto, 5,36 mg/mL para F-III e 0,71 mg/mL para Litochitinase1 com 24 horas de ensaio e 3,22 e 0,49 mg/mL, para F-III e Litochitinase1 no tempo de 48 horas. Outros experimentos realizados confirmaram a presença de quitina no intestino médio das larvas de Aedes aegypti, as quais podem estar sofrendo a ação da Litochitinase1 provocando suas mortes, como ainda a ausência de proteínas bioativas como inibidores de proteases serínicas e lectinas no extrato bruto, F-III e Litochitinase1, indicando que a morte das larvas é mesmo por ação da Litochitinase1. Observou-se ainda que, as enzimas extraídas do homogenato intestinal das larvas não interferiram na atividade da Litochitinase1. Estes resultados indicam que esta enzima pode ser usada como alternativa para controlar infecções causadas por Escherichia coli, como também na redução da infestação do mosquito vetor da dengue.

Palavras Chaves: Glicosidases, Invertebrados, Purificação, Caracterização e Aplicação Biotecnológica.

ABSTRACT

Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses, plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and N-acetyl-β-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ion-exchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200. These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from 5.0 to 6.0, optimum temperature at 55°C and stability when pre-incubated at temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55°C. The enzyme showed a range of stability at pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity. Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative bacterium Escherichia coli in the 800 µg/mL concentration. The larvicidal activity against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and 0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1, indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the infestation of the mosquito vector of dengue. Keywords: Glucosidases, Invertebrate, Purification, Characterization and Biotechnology application.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 01 Estrutura Química da quitina. (Modificado de SEIDL, 2008).............................................................................................

21

FIGUTA 02 Representação esquemática das estruturas polimórficas de quitina, sendo que as setas representam as cadeias poliméricas no sentido do terminal não redutor para o redutor. (CAMPANA-FILHO, 2006)............................................................................................

22

FIGURA 03 Esquema dos padrões de clivagem de enzimas quitinolíticas. As subunidades da cadeia da quitina são mostradas em azul claro e o açúcar redutor em azul escuro. As tesouras representam as ações enzimáticas. (Modificado de SEIDL, 2008)............................................................................................

23

FIGURA 04 Mapa da distribuição geográfica do camarão branco Litopenaeus schmitti. (MARTINELI, 2005)....................................

29

FIGURA 05 Litopenaeus schmitti..................................................................... 32

FIGURA 06 Fluxograma do fracionamento com sulfato de amônio.................. 37

FIGURA 07 Atividades enzimáticas presentes no extrato bruto e nas frações obtidas da precipitação com sulfato de amônio............................

51

FIGURA 08 Perfil de eluição protéico da F-III em cromatografia de troca iônica e de atividade quitinásica ...................................................

52

FIGURA 09 Perfil de eluição da Litochitinase1 e atividade quitinásica em cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200).............

53

FIGURA 10 SDS-PAGE das amostras protéicas durante o processo de purificação.....................................................................................

55

FIGURA 11 Determinação do Km da Litochitinase1.......................................... 56

FIGURA 12 Efeito da temperatura sobre a atividade da

Litochitinase1.................................................................................

57

FIGURA 13 Efeito da pré-incubação a diferentes temperaturas na atividade da Litochitinase1............................................................................

58

FIGURA 14 Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1.......................... 59

FIGURA 15 Efeito da pré-incubação a diferentes pHs na atividade da Litochitinase1...................................................................................

60

FIGURA 16 Curva de temperatura ótima para a detecção da atividade das enzimas proteolíticas presentes no homogenato intestinal de larvas de A.aegypti........................................................................

67

FIGURA 17 Efeito da pré-incubação com as enzimas digestivas de A.aegypti na atividade da Litochitinase1.......................................................

68

LISTAS DE QUADROS

QUADRO 1 Técnica de Difusão em Disco, cepas selecionadas e concentrações da quitinase utilizada..........................................

43

QUADRO 2 Técnica de Microdiluição em Caldo, cepas selecionadas e concentrações da quitinase ulitizada..........................................

44

LISTA DE TABELAS TABELA 1

Família das glicosil-hidrolases que possuem atividade N-

acetil-β-D-glucosaminidásica..............................................

20

TABELA 2 Algumas quitinases já isoladas e caracterizadas............... 28

TABELA 3 Etapas de purificação da Litochitinase1............................. 54

TABELA 4 Efeitos de íons e compostos sobre a

atividade da Litochitinase1..............................

61

TABELA 5 Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da

Litochitinase1 do cefalotórax do camarão marinho

Litopenaeus schimitti..........................................................

62

TABELA 6 Detecção de quitina em intestinos médios de Aedes

aegypti................................................................................

63

TABELA 7 Concentração efetiva do extrato bruto, F-III e

Litochitinase1 necessária para matar 50% (EC50) das

larvas L4 de Aedes aegypti em 24 e 48 h..........................

64

TABELA 8 Inibição de proteases serínicas.......................................... 65

TABELA 9 Atividade Hemaglutinante no extrato bruto, F-III e

Litochitinase1 com eritrócitos nativos e tratados

enzimaticamente................................................................

66

LISTA DE ABREVIATURAS

α Denota anomericidade alfa

ATCC American Type Culture Collection

β Denota anomericidade beta

BHI Brain Heart Infusion

°C Grau Celsius

cm Centímetros

CTT Cloreto de 2,3,5 – trifenil - tetrazólio

DO Densiometria óptica

EB Extrato Bruto

EDTA Acido etilenodiamino tetra-acético

F-I Extrato protéico precipitado com 0-30% de sulfato de amônio

F-II Extrato protéico precipitado com 30-50% de sulfato de amônio

F-III Extrato protéico precipitado com 50-80% de sulfato de amônio

x g Gravidade

g Grama

GlcNAc N-acetil-β-D-glucosamina

HCl Ácido Clorídrico

IUMBM International Union of Biochemistry and Molecular Biology

HI Homogenato intestinal

kDa Kilodaltons

Km Constante de Michaelis-Menten

EC50 Concentração Efetiva

M Molar

mM Milimolar

min. Minuto

mg Miligramas

µµµµg Microgramas

mL Mililitro

µµµµl Microlitro

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidroxido de Sódio

nm Nanômetro

pH Potencial hidrogeniônico

PNF p-NITROFENIL

SDS Dodecil sulfato de sódio

t Tonelada

TCA Ácido tricloro acético

Tris Tris hidroximetil aminometano

TEMED

[S]

UH

Tetra metileno diaminoetano

Concentração Molar de Substrato

Unidade de Hemaglutinação

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 18 1.1. GLICOSIDASES.......................................................................................... 18

1.1.1. 1.1.1.Glicosil-Hidrolases................................................................................... 19

1.1.2. 1.1.2.Quitinases................................................................................................. 21

1.1.2.1. Ocorrência e Função das Quitinases................................................. 23

1.1.2.2. Aplicações Biotecnologicas................................................................ 26

1.2. Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) COMO FONTE DE QUITINASES..............................................................................................

28

2. OBJETIVOS................................................................................................... 31 2.1. GERAIS....................................................................................................... 31 2.2. ESPECÍFICOS.......................................................................................... 31 3. MATERIAIS................................................................................................... 32

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO............................................................................... 32

3.1.1. Camarão Litopenaeus schmitti............................................................. 32 3.1.1. 3.1.2. Insetos..................................................................................................... 32 3.1.2. 3.1.3. Eritrócitos Humanos............................................................................... 33 3.1.3. 3.1.4. Microorganismos..................................................................................... 33

3.2. SUBSTRATOS SINTÉTICOS DERIVADOS DE AÇUCAR....................... 33 3.3. REAGENTES, SOLUÇÕES, MEMBRANAS E MATRIZES

CROMATOGRÁFICAS............................................................................. 33

3.4. APARELHOS............................................................................................ 34 4. 4. MÉTODOS...................................................................................................... 36

4.1. OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO........................................................... 36 4.2. FRACIONAMENTO COM SULFATO DE AMÔNIO...................................... 36

4.3. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS COM p-NITROFENIL DERIVADOS DE AÇÚCAR....................................................

37

4.4. DOSAGEM DE PROTEÍNAS....................................................................... 38 4.5. PURIFICAÇÃO DA ENZIMA........................................................................ 38

4.5.1. Cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel...................................... 38 4.5.2. Cromatografia de Exclusão Molecular – Sephacryl S – 200.............. 38

4.6. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES DESNATURANTES-SDS/PAGE................................................................

39

4.7. ESTUDOS CINÉTICOS.............................................................................. 40 4.7.1. Determinação da Constante de Michaelis- Menten (Km).................... 40 4.7.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática........................... 40

4.7.3. Influência do pH sobre a atividade enzimática.................................... 41

4.7.4. Influência de diversos sais e EDTA na hidrólise do p-nitofenil-N-acetil-ββββ-D-glucosaminídeo.....................................................................

41

4.8. PREPARAÇÃO DA QUITINASE PARA OS ENSAIOS BIOLÓGICOS......... 42

4.9. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...................................... 42 4.9.1. Análise Qualitativa- Técnica de Difusão em Disco.............................

42

4.9.2. Análise Quantificativa- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)............................................................................................

43

4.10. ENSAIOS COM Aedes aegypti................................................................ 44 4.10.1. Obtenção das larvas de Aedes aegypti.............................................. 44 4.10.2. Dissecação das larvas de Aedes aegypti.......................................... 44 4.10.3. Preparo do homogenato intestinal das larvas.................................. 45 4.10.4. Detecção de quitina no intestino das larvas de Aedes aegypti...... 45

4.10.5. Ensaios com larvas de Aedes aegypti............................................... 45 4.10.6. Determinação da EC50......................................................................... 46 4.10.7. Análises Estatísticas........................................................................... 46 4.10.8. Investigação de proteínas bioativas interferentes no processo

digestório nas larvas de Aedes aegypti.............................................

46 4.10.8.1. Ensaio de inibição de proteases serínicas...................................... 46 a) Preparo do substrato................................................................................... 46 b) Atividade anti-quimotriptica....................................................................... 46 c) Atividade anti-triptica.................................................................................. 47 4.10.8.2. Ensaios de hemaglutinação............................................................. 47 a) Preparo do sangue..................................................................................... 47 b) Tratamento dos eritrócitos com papaína................................................. 47 c) Tratamento dos eritrócitos com tripsina.................................................. 48 d) Ensaio........................................................................................................... 48 4.10.8.3. Efeito do homogenato intestinal das larvas de Aedes aegypti

sobre a atividade quitinolítica...........................................................

48 a) Determinação de atividade azocaseínolítica............................................. 48 b) Efeito da temperatura sobre a atividade azocaseínolitica a pH 7,5........ 49

c) Influencia das enzimas digestivas do Aedes aegypti na hidrólise do p-

nitrofenil-N-acetil-ββββ-D-glucosaminídeo.......................................................

49

5. RESULTADOS ............................................................................................. 50

5.1.IDENTIFICAÇÃO DE GLICOSIDASES E SULFATASES NOS CEFALOTÓRAX DOS CAMARÕES MARINHOS litopenaeus

schmitti...........................................................................................................

50

5.2. PURIFICAÇÃO DA QUTINASE.................................................................... 51 5.2.1. Em cromatografia de troca iônica......................................................... 51

5.2.2. Em cromatografia de exclusão molecular S-200................................. 52 5.2.3. Resumo das etapas de purificação....................................................... 53 5.3. PERFIL ELETROFORÉTICO DAS AMOSTRAS EM SDS-PAGE............... 54

5.4. EXPERIMENTOS CINÉTICOS.................................................................... 55 5.4.1. Determinação do Km............................................................................. 55 5.4.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática........................... 56 5.4.3. Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1............................... 58 5.4.4. Efeito de sais e EDTA sobre a atividade enzimática........................... 60 5.5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...................................... 61 5.5.1. Utilizando a técnica de difusão em disco............................................ 61 5.5.2. Utilizando a técnica de microdiluição em caldo para a

determinação da concentração inibitória mínima (CIM)....................

62 5.6. ENSAIO COM Aedes aegypti...................................................................... 62 5.6.1. Detecção de quitina no intestino médio de larvas de Aedes aegypti 62 5.6.2. Ensaio larvicida em Aedes aegypti...................................................... 63 5.6.3. Detecção de inibidores de proteases serínicas no EB, FIII e

Litochitinase1.........................................................................................

64 5.6.4. Atividade hemaglutinante...................................................................... 65 5.6.5. Determinação da temperatura ótima das atividades proteolíticas

presentes no homogenato intestinal das larvas de Aedes

aegypti.....................................................................................................

66 5.6.6. Influência das enzimas digestivas de Aedes aegypti sobre a

Litochitinase1.........................................................................................

67 6. DISCUSSÃO............................................................................................... 70 7. CONCLUSÕES........................................................................................... 79

REFERÊNCIAS .......................................................................................... 81

18

INTRODUÇÃO

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Roberta L. N. Godone

1. INTRODUÇÃO

1.1 GLICOSIDASES

As glicosidases são um grupo de enzimas que clivam O-glicosídeos, N-

glicosídeos e tio-glicosídeos (DUMONT, 2008; WITHERS, 2010). Estando desta

forma diretamente envolvidas no metabolismo de monossacarídeos, dissacarídeos,

oligossacarídeos e até polissacarídeos (FERREIRA, 2001). Dentre elas destacam-se

as endoglicosidases e exoglicosidases. As endoglicosidases são enzimas que

clivam cadeias liberando dissacarídeos ou oligossacarídeos. Já as exoglicosidases

são um grupo de enzimas que clivam a cadeia oligossacarídica através de sua

porção não redutora liberando monossacarídeos (MALLEY et al.,1989).

As glicosidases formam um grupo altamente heterogêneo de enzimas

hidrolíticas (BHATIA et al., 2002). Tais enzimas são encontradas em diversos

organismos, como bactérias (KATAYEVA et al., 1992; PAAVILAINEN et al., 1993;

SESTELO et al., 2004; ARO et al., 2005) fungos (RICCIO et al., 1999; JAGER et

al., 2001; YUN et al., 2001; BELANCIC et al., 2003) plantas (SUE et al., 2000;

CAMERON et al., 2001; GERARDI, 2001; SARRY; GÜNATA, 2004) e animais

(MARANA et al., 1995; HAYS et al., 1998; MARANA, 1999), (PONTOH; LOW, 2002;

DRUMONT, 2008),como por exemplo em crustáceos (KOSTANJNEK et al., 2010;

ALLARDYCE et al., 2010) e o homem (GRACE et al., 1994; DAY et al., 1998;

NEMETH et al., 2003; GERMAIN, 2004).

A principal reação catalisada por estas enzimas é a hidrólise de ligações β-

glicosídicas. Estas enzimas possuem uma carboxila e um carboxilato responsáveis

pela catálise, um funcionando como nucleófilo e o outro como doador de prótons

(JONES, 2002). A especificidade das β-glicosidases pode variar, pois algumas

destas enzimas podem ser capazes de atuar sobre uma gama enorme de substratos

e outras podem ser mais restritas (FERREIRA, 1998, 2001, 2003; AZEVEDO, 2003).

Desta forma o nome β-glicosidase é dado a diferentes tipos de enzimas capazes de

hidrolisar ligações β-glicosídicas em dissacarídeos, oligossacarídeos e glicosídeos

conjugados (COULON et al., 1998; BHATIA et al., 2002).

19

INTRODUÇÃO


1.1.1 GLICOSIL-HIDROLASES

As glicosil-hidrolases são glicosidases que hidrolisam ligações O-glicosídicas

e são classificadas, pela Enzyme Commission Numbers (EC) a International Union of

Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), com base na sua especificidade pelo

substrato, por exemplo: β-glucosídeo ou β-galactosídeo, e no tipo de ligação, por

exemplo: β-1,4 ou β-1,3. Esta classificação é útil, pois unifica a nomenclatura e evita

as ambigüidades dos nomes triviais. Entretanto, tal classificação não reflete as

características estruturais e correlações evolutivas entre as enzimas (MARANA,

1999).

A fim de estabelecer uma classificação que contemplasse o aspecto estrutural

e evolutivo das glicosil-hidrolases, HENRISSAT (1991), partindo do pressuposto de

que existe uma correlação entre similaridade da seqüência de aminoácidos, e a

estrutura terciária das proteínas, foi realizado um alinhamento de seqüências e

conjuntos de aminoácidos hidrofóbicos das glicosil-hidrolases disponíveis e montou-

se um sistema de classificação para estas enzimas(CHOTIA; LESK, 1986).

Esta classificação baseou-se em um total de 291 seqüências correspondendo

a 39 diferentes EC que puderam ser classificadas em 35 famílias em seguida

HENRISSAT; BAIROCH, (1993), ampliaram ainda mais o sistema de classificação

atingindo um total de 45 famílias. Agrupando as enzimas de origem evolutiva

comum, independentemente das reações que elas catalisam aproximadamente 90

famílias de glicosil-hidrolases são conhecidas (WITHERS, 2002).

Além do critério de similaridade na seqüência de aminoácidos, elas também

podem ser classificadas segundo mecanismos de reação, que as categoriza

segundo dois mecanismos: o de retenção e o de inversão da configuração do

anômero C1 do anel glicosídico. A hidrólise se dá via catálise ácida, onde há um

doador de prótons e um nucleófilo. Em ambos, o doador de prótons está próximo ao

oxigênio glicosídico e o nucleófilo fica na posição vicinal do carbono 2 do anel. A

diferença é que no mecanismo de inversão a distancia do nucleófilo é maior, a fim

de comportar uma molécula de água. Essa distância é cerca de 5,5 Å no mecanismo

de retenção e ~10 Å no de inversão na formação do complexo enzima substrato.

(DAVIS, 1995; KOSHALND, 1953). O ataque nucleofílico é feito pelos dois resíduos

20

INTRODUÇÃO


aproximando-se pelo lado oposto da ligação glicosídica e há a retenção ou inversão

da configuração anomérica do anel glicosídico (HENRISSAT, 1995).

A clivagem da ligação glicosídica entre um resíduo de N-acetil-β-D-

glucosamina e outro resíduo adjacente, pode ser do tipo exo ou endo-

glucosidasicas, e essas se encontram distribuídas em seis famílias de glicosil-

hidrolases: GH3, GH18, GH19, GH20, GH73 e GH84. (LIMA, 2006). A tabela 1

abaixo sumariza as características das seis famílias citadas.

O sistema de classificação glicosil-hidrolase (GH), introduzido e desenvolvido

por HENRISSAT, (1991) e HENRISSAT; BAIROCH, (1993) está disponível em um

banco de dados geral (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~CAZY/index.html) (COUTINHO;

HENRISSAT, 1999; LIMA, 2006).

Tabela 1: Família das glicosil-hidrolases que possuem atividade N-acetil-β-D-glucosaminidásica.

Família Atividades conhecidas

GH3 β-glicosidase (EC 3.2.1. 21); xilano 1,4-β-xilosidase (EC 3.2.1. 37);

β-N-acetilhexosaminidase (EC 3.2.1. 52); glicano 1,3-β-glicosidase

(EC 3.2.1. 58); glicano 1,4-β-glicosidase (EC 3.2.1. 74); exo-1,3-

1,4-glicanase (EC 3.2.1. -); α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1. 55)

GH18 Quitinase (EC 3.2.1. 14); endo-β-N-acetilglicosaminidase (EC

3.2.1. 96)

GH19 Quitinase (EC 3.2.1. 14)

GH20 β-hexosaminidase (EC 3.2.1. 52); lacto-N-biosidase (EC 3.2.1.

140)

GH73 Endo-β-N-acetilglicosaminidase (EC 3.2.1. 96); β-1,4-N-

acetilmuramoilhidrolase

GH84 β-N-acetilglicosaminidase (EC 3.2.1. 52); hialuronidase (EC 3.2.1.

35)

Fonte: (modificado de HENRRISAT ; COUTINHO, 1999).

21

INTRODUÇÃO


1.1.2 QUITINASES

As quitinases são enzimas que clivam ligações O-glicosídicas entre os

carbonos C1 e C4 dos resíduos de β-1,4-N-acetilglucosamina (GlcNAc), constituintes

do polímero de quitina (Figura 01). Estas enzimas são classificadas como glicosil

hidrolases e compreendem cerca de 90 famílias de enzimas descritas. As quitinases

foram colocadas na família 18, 19 e 20, na qual, as da família 18 são encontradas

em vírus, bactérias, fungos filamentosos ou leveduriformes, plantas e animais, e,

portanto, a família é diversa em termos evolucionários. Membros da família 19 são

quase que exclusivas de plantas. A família 20 consiste em N-acetil-β-D-

hexosaminidase ou N-acetil-β-D-glucosaminidases de bactérias, fungos e seres

humanos (HORSCH et al., 1997; WITHERS, 2002; SEIDEL, 2008).

A quitina é a segunda substância orgânica até então conhecida na biosfera

sendo superada apenas pela celulose, mas supera esta última em termos de taxa de

reposição, que chega a ser duas vezes maior que a da celulose (THARANATHAN;

KITTUR 2003; YEN et al., 2009).

Quitina e celulose possuem características estruturais semelhantes e atuam

como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa nos organismos em que

ocorrem. A quitina e/ou polímeros de N-acetil-glucosamina encontra-se na matriz da

estrutura esquelética de invertebrados, como artrópodes, anelídeos, moluscos e

cnidários, em algas diatomáceas, no peptideoglicano da parede celular das bactérias

e também está presente nas paredes celulares de alguns fungos, como

ascomicetos, zigomicetos, basidiomicetos e deuteromicetos (KARAMANOS, 1997;

RIVAS et al., 2002; DUO-CHAN, 2006; ZHANG et al., 2010).

Figura 01: Estrutura Química da quitina. Fonte: (Modificado de SEIDL, 2008)

22

INTRODUÇÃO


Este biopolímero ocorre naturalmente em três diferentes formas α-, β- e γ-

quitina (Figura 02). A α-quitina é encontrada em estruturas rígidas e resistentes,

como a cutícula de artrópodes, e nesses casos ocorre fortemente associada a

proteínas, materiais inorgânicos ou ambos. A α-quitina é a forma mais abundante e

é também considerada a mais estável, visto que a conversão das duas últimas

formas na primeira é irreversível (ROBERTS, 1992). As formas β- e γ-quitina ocorre

em estruturas flexíveis embora também resistentes. Nas lulas do gênero Loligo a α-

quitina constitui uma fina capa que reveste as paredes do esôfago e do estômago, a

β-quitina ocorre como o principal componente das conchas, ou plumas, e a γ-quitina

integra uma espessa cutícula que recobre outras zonas do estômago (ABRAM;

HIGUERA, 2004).

Figura 02: Representação esquemática das estruturas polimórficas de quitina, sendo que as setas representam as cadeias poliméricas no sentido do terminal não-redutor para o redutor.

Fonte: (CAMPANA-FILHO, 2006).

As quitinases podem ser classificadas ainda, quanto ao seu modo de ação

sobre o substrato. A nomenclatura enzimática oficial (EC) classifica as enzimas

quitinolíticas em apenas dois grupos de enzimas: as quitinases, também conhecidas

como endoquitinases, que catalizam a hidrólise randômica de ligações β-1,4 de N-

acetilglucosamina (GlcNac) liberando produto solúveis como quitotetraoses,

quitotriose e diacetilquitobiose; e as N-acetilglucosaminidases, também conhecidas

como exoquitinases, que clivam a quitina em monômeros N-acetilglucosamina.

Entretanto algumas enzimas quitinolíticas não se encaixam nessa

classificação. Assim diferentes classificações foram sugeridas. Dependendo dos

seus padrões de clivagem as quitinases foram divididas em três tipos:

endoquitinases, exoquitinases e N-acetil-β-D-glucosaminidases. As endoquitinases

23

INTRODUÇÃO


clivam as ligações β-1,4 da quitina a partir de qualquer ponto ao longo da cadeia

polimérica liberando produtos (oligossacarídeos) de tamanho aleatório, enquanto as

exoquitinases atuam a partir da porção não-redutora da cadeia e seus produtos

finais geralmente são dímeros de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc)2 (SAHAI;

MANOCHA, 1993; SEIDEL, 2008). As N-acetil-β-D-glucosaminidases são um grupo

de enzimas que hidrolisam componentes O-glicosídicos, removendo resíduos

terminais não-redutores de N-acetil-β-D-glucosamina, sendo assim, considerada

uma exoglicosidase (HORSCH et al., 1997). Estas enzimas também são

denominadas de N-acetil-β-D-hexosaminidases (EC 3.2.1. 52), devido ao fato de

possuírem atividade N-acetil-β-glucosaminidásica bem como atividade N-acetil-β-

galactosaminidásica (KRESSE; GLOSSL, 1987; HORSCH et al., 1997; NIIMI et al.,

2001).( Figura, 03).

Figura 03: Esquema dos padrões de clivagem de enzimas quitinolíticas. As subunidades da cadeia da quitina são mostradas em azul claro e o açúcar redutor em azul escuro. As tesouras representam as ações enzimáticas

Fonte: (Modificado de SEIDL, 2008).

1.1.2.1 OCORRÊNCIA E FUNÇÕES DAS QUITINASES

Diversos estudos apontam o papel fisiológico e ecológico das quitinases. Na

maioria destes estudos conclui-se que elas estão envolvidas em processos de

defesa contra patógenos, mas que também desempenham outros papéis

importantes que serão abordados adiante.

Endoquitinases

Exoquitinases

N-acetilglucosaminidases

24

INTRODUÇÃO


A quitina, além de estar presente em fungos, também se encontra em insetos

e crustáceos (LENARDON et al., 2010; CHEN et al., 2010; QIN et al., 2010). As

quitinases em crustáceos são associadas à degradação parcial do exoesqueleto

durante seu desenvolvimento, por um mecanismo que parece estar sob o controle

hormonal. Assim como nos crustáceos, o desenvolvimento de insetos está

diretamente relacionado com a regulação da síntese e degradação de quitina, que é

o principal componente do seu exoesqueleto (SPINDLER-BARTH, 1993). Além do

papel no desenvolvimento, as quitinases também exercem o papel de defesa contra

patógenos em outros invertebrados

Segundo MULLEN et al. (2004), estudos preliminares mostraram a presença

de altos níveis de exo e endoquitinases em corais infectados por fungos.

As quitinases em fungos parecem ser um fator decisivo na colonização e

predação para obtenção de alimentos (BISHOP et al., 2000). A atividade quitinolítica

é de fundamental importância para patogênese de infestação por fungos, como por

exemplo, Metarhizium anisopliae sf. acridum (SCREEN et al., 2001). Através da

indução com quitina, este microorganismo foi capaz de secretar isoformas básicas e

acidas de endoquitinases (KANG et al.,1999). Estas enzimas são largamente

utilizadas por M. anisopliae na colonização de lagartas de Manduca sexta, digerindo

a cutícula e a membrana peritrófica (SCREEN et al., 2001).

No culicídeo Aedes aegypti, a quitina é um dos componentes principais da

membrana peritrófica (MP) formada no meio intestinal da fêmea adulta após o

repasto sanguineo, o que ocasiona a proteção do sangue ingerido contra micróbios

patogênicos, promovendo assim uma barreira a distribuição e crescimento

subseqüente desses patógenos. (FILHO et al., 2002), desta forma a degradação da

membrana peritrófica nesses insetos pode ocasionar crescimento de

microorganismos promovendo sua infestação como também pode ocasionar a

ruptura no tecido intestinal, o vazamento do fluido celular e o desbalanceamento

osmótico, matando o inseto por desidratação ou inanição (BISHOP et al., 2000).

Estudos mostraram que quando o culicídeo Aedes aegypti se alimenta de

alosamidina X, ocorre a formação atípica da membrana peritrófica (MP), sugerindo a

presença de um sistema quitinolítico no intestino do inseto, responsável pela

modificação e controle da formação da MP. O conhecimento de como este sistema

quitinolítico funciona e sua função na formação da MP pode facilitar o

25

INTRODUÇÃO


desenvolvimento de estratégias que podem ser usadas para manipular o processo

natural, incluindo a interrupção da invasão de patógenos em mosquitos vetores

(FILHO et al., 2002).

As quitinases são também podem ser encontradas em alguns organismos que

não apresentam a quitina em sua constituição, como em bactérias, nematódeos e

plantas (COHEN-KUPIEC; CHET, 1998). Em bactérias como Serratia e

Streptomyces como também em nematódeos (Onchocerca gibsoni) (McNAB;

GLOVER, 1991), sua função está relacionada à nutrição. Dessa forma, a hidrólise de

uma variedade de quitinas encontradas na natureza permite ao organismo utilizar

esses polímeros como fonte de energia (VAN AALTEN et al., 2001; COHEN-

KUPIEC; CHET, 1998). Em nematódeos, as quitinases estão presentes na casca do

ovo e contribuem para a manutenção de sua integridade (ARNOLD et al., 1993).

Quitinases em plantas estão associadas à defesa contra patógenos e fazem

parte do grupo de proteínas denominadas PR (Pathogenesis Related Proteins), que

são proteínas capazes de induzir resistência local ou sistêmica ao ataque de fungos

e outros fitopatógenos. Evidências indicam que as quitinases têm um papel direto

nessa defesa por atacar diretamente os polímeros de quitina, que é o maior

componente da parede celular da maioria dos fungos (COLLINGE et al., 1993;

KUPIEC; CHET, 1998; HODGE et al., 1996).

Nesses casos, essas enzimas possuem um papel de defesa contra

organismos que possuem quitina em sua composição, inibindo in vitro o crescimento

de fungos filamentosos, especialmente em combinação com β-1,3-glucanase

(COHEN-KUPIEC; CHET, 1998; ISELI et al.,1996).

Embora animais vertebrados não sejam produtores de quitina, a presença de

quitinases tem sido verificada no organismo de várias espécies desses animais.

Essas enzimas são encontradas em vários órgãos e tecidos, como no trato

digestivo, participando do metabolismo de carboidratos (JEUNIAUX, 1993). Peixes

que se alimentam de crustáceos ou insetos contêm uma grande concentração de

quitinases em seu suco pancreático (ROTTA, 2003).

A expressão de quitinases em mamíferos não havia sido reportada até 1994

quando HOLLACK et al. identificaram a primeira quitinase humana em

pacientes com a Doença de Gaucher. Em outro estudo BOOT et al. (2001)

identificaram no trato gastrintestinal e pulmões, outra quitinase denominada

AMCase (acidic mammalian chitinase).

26

INTRODUÇÃO


A ocorrência de quitinases em mamíferos e humanos sugere que sua função

esteja relacionada com a metabolização de carboidratos e de participação em

mecanismos de defesa contra agentes patogênicos. No entanto, seu papel

fisiológico em mamíferos e especialmente em humanos ainda não é completamente

conhecido e parece ser um paradoxo, sendo presença da quitotriosidase fortemente

associada também à arteriosclerose e a presença da AMCase associada à asma.

Esses dados sugerem que essas enzimas possam participar de desordens

inflamatórias (DONNELY; BARNES, 2004).

1.1.2.2 APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS

Extensos estudos sobre quitinases estão sendo desenvolvidos devido ao fato

de sua ampla capacidade de aplicação na biotecnologia, nas mais diversas áreas

como na agricultura, medicina e o setor industrial.

A aplicação de quitinases na agricultura objetiva principalmente o controle

biológico seja pelo desenvolvimento de bioinseticidas para controle de insetos,

fungos fitopatogênicos e bactérias ou pelo desenvolvimento de plantas transgênicas

resistentes ao ataque de microorganismos ou ainda na produção de

quitooligossacarídeos biologicamente ativos (PATIL et al., 2000; FLEURI, 2008).

Muitas quitinases de várias fontes têm apresentado atividade contra patógenos de

plantas e contra insetos que causam pestes na agricultura (DAHYIA et al., 2006).

Quitinases de T. harzianum (DEMARCO et al., 2000), Enterobacter sp. NRG4

(DAHYIA et al., 2005), Cellulosimicrobium cellulans 191 (FLEURI; SATO, 2008)

Clonostachys rósea (LU BECK et al., 2009) e de sementes de Acacia confusa (NG et

al., 2010) , já mostraram atividade inibitória contra alguns desses patógenos,

podendo assim ser utilizados como suplementos na produção de fungicidas e

inseticidas. A partir da bactéria Bacillus circulans foi produzido uma quitinase para

ser usada como suplemento bioinseticida da bactéria entomopatogênica Bacillus

thuringiensis para controle de larvas de lepidópteras. Um sistema lítico composto

das seguintes enzimas: quitinase, protease, β-glucanase e lipase foram utilizadas

para o controle de manchas nas folhas de centeio, causadas por Biopolaris

sorokiniana (FLEURI; SATO, 2005).

27

INTRODUÇÃO


Tem sido extensamente pesquisada a utilização das quitinases na produção

de quitooligossacarídeos com atividades biológicas. Estes são potencialmente úteis

na medicina. Por exemplo, a quitohexaose e quitoheptaose mostraram atividade

antitumoral. A combinação específica de enzimas quitinolíticas com altos níveis de

endo-quitinases e baixa atividade de N-acetilglucosaminidases e exo-quitinases

podem ser necessárias para obter o oligossacarídeo desejado. Em contrapartida a

produção de N-acetilglucosamina pode ser obtida utilizando altas proporções de

exo-quitinases e N-acetilglucosaminidases. Este açúcar quando aplicado por via

intramuscular ou oral é um potente antiinflamatório podendo ser utilizado no

tratamento de colites ulcerativas ou doenças gastrointestinais (PATIL et. al., 2000).

Quitinases purificadas podem liberar oligômeros de quitina, a partir da parede

celular fúngica (SCHLUMBAUM et al., 1986) como também podem agir

semelhantemente à lisozima, sobre paredes celulares bacterianas (HERGET et al.,

1990; STINTZI et al., 1993).

A quitina também está presente na membrana peritrófica (MP) de insetos

como o Aedes Aegypti. A MP protege o epitélio intestinal e promove a

compartimentalização das enzimas digestivas, sendo fundamental para o processo

digestório. As quitinases podem ter ação inseticida por interferirem na integridade da

MP. Etapas adicionais de purificação dessa (s) quitinase(s) poderão indicar essas

proteínas como candidatas no controle do inseto transmissor da dengue.

Outro campo em que pode haver utilização de quitina é a bioconversão. O

consumo de camarões no mundo é muito grande, principalmente em países

costeiros. No entanto, somente a carne é consumida e o cefalotórax e a casca, são

descartados. Há dados em que alguns países são produzidos mais de 2,5 milhões

toneladas de lixo dessa natureza (HAKI et al., 2003; DAHYIA, 2006). Assim, o

desenvolvimento de métodos de conversão desse rejeito em produtos derivados de

quitina é de grande importância. E esses derivados de quitina podem ser obtidos

pela degradação desses pelas quitinases. Nos últimos anos várias quitinases

derivadas de diversos organismos foram isoladas, clonadas ou expressas na forma

recombinante (Tabela 2).

28

INTRODUÇÃO


Tabela 2: Algumas quitinases já isoladas e caracterizadas.

Origem Massa Molecular

(kDa)

Autor/Ano

Streptomyces sp. TH-11 29 HOANG et al., 2011

Penaeus monodon 72,4 e 51,9 PROESPRAIWONG et al., 2010

Ipomoea carnea 30,6 PATEL et al., 2010

Pennahia argentatus 42 IKEDA et al., 2009

Pieris rapae 59,5 e 57,2 SHI et al., 2006

Bacillus thuringiensis 74 BARBOZA-CORONA et

al., 2002

Pseudomonas aeruginosa 385

58 THOMPSON et al., 2001

Pseudomonas sp YHS-A2 67 LEE et al., 2000

1.2 Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) COMO FONTE DE

QUITINASES

O camarão branco Litopenaeus schmitti, é o único pertencente ao gênero

Litopenaeus que ocorre em águas brasileiras. Assim como várias outras espécies da

família Penaeidae, possuem alta fecundidade, procriam em águas costeiras e

apresentam estágio larval planctônico por uma semana ou mais, sendo facilmente

disperso pelas correntes (LUVESUTO, 2006).

As áreas estuarinas são zonas adequadas para a nutrição e desenvolvimento

dos camarões (GAMBA; RODRIGUEZ, 1987), onde crescem aproximadamente de

10 mm a 75 mm, durante aproximadamente de 6 a 9 meses (EWALD, 1965; NEIVA

et al., 1971). Os machos da espécie crescem em torno de 170 mm e as fêmeas

comumente atingem um tamanho de 200 mm. Os maiores indivíduos devem ter em

torno de 2 anos, uma vez que os camarões peneídeos possuem baixa longevidade

(1,5 a 2 anos) (ROTHLISBERG et al.,1985).

29

INTRODUÇÃO


A espécie Litopenaeus schmitti popularmente conhecida como “Vila Franca”,

ocorre no Atlântico ocidental desde as Antilhas até o Rio Grande do Sul (Figura 04),

sendo os adultos encontrados em pequenas profundidades de até 47 metros

(PÉREZ-FARFANTE, 1970; SILVA, 1977).

Figura 04: Mapa da distribuição geográfica do camarão branco Litopenaeus schmitti .

Fonte: (MARTINELI, 2005).

O camarão branco apresenta características relacionadas à sua

distribuição e ao seu ciclo de vida que podem influenciar a estruturação em escala

fina de suas populações, como a ocorrência do acasalamento e postura próximos

a costa (entre 20 e 30 metros) e a permanência dos pré-adultos nas proximidades

de regiões estuarinas (SILVA, 1977). Nesta espécie, a postura aparentemente é

realizada em águas marinhas de pequena profundidade e de salinidade elevada

(EWALD, 1965; PÉREZ-FARFANTE, 1970; COELHO; SANTOS, 1994). A maior

parte das fêmeas em postura tem 7 meses de idade, sendo a idade média da

30

INTRODUÇÃO


primeira maturação inferior a 6 meses; poucas se reproduzem novamente aos 10-

12 meses de idade (COELHO; SANTOS, 1994).

Sua distribuição está associada a substratos maciços e lamacentos com um

conteúdo orgânico relativamente alto e alta turbidez da água, característico de águas

estuarinas (DALL et al., 1990).

Há poucos estudos sobre essa espécie de camarão, principalmente quando

se diz respeito à enzimologia. Os trabalhos existentes abrangem outras espécies de

camarão ou aspectos ligados a identificação de genes relacionados ao sistema

imune de Litopenaeus vannamei (LIMA NETO, 2006), bioconversão de resíduos

para produção de quitosana (ASSIS et al., 2008), efeitos de íons mercúrio na

atividade da qutinase (LIN et al., 2005), caracterização dos glicosaminoglicanos

isolados do L. schmitti (SANTOS, 2006) e análise filogenética de quitinases do

camarão Penaeus monodon (PROESPRAIWONG et al., 2010).

Os estudos realizados em nosso laboratório sugerem uma ampla perspectiva

de trabalhos a serem realizados com endo-, exoglicosidases e sulfatases

encontradas em aninais marinhos como, por exemplo, a identificação de

glicodidases e sulfatases em diferentes tecidos do molusco Aplysia cervina (MATTA;

ABREU, 2005), indentificação de uma nova β-N-acetylhexosaminidase do cnidário

Palythoa caribaeorum (SOUZA et al., 2008) e a purificação de uma β-N-

acetylhexosaminidase do mamífero marinho Sotalia fluviatilis (GOMES JÚNIOR et

al., 2010).

O estudo e a purificação destas enzimas e suas utilizações biotecnológicas

como antifúngicos, antibacterianos e bioinseticidas é uma das propostas desta

pesquisa e servirão como ferramentas moleculares na elucidação de estrutura

química de glicoconjugados, dissacarídeos e/ou oligossacarídeos e de

polissacarídeos marinhos de algas marinhas, como ainda a produção de

oligossacarídeos com potenciais atividades farmacológicas.

31

OBJETIVOS


2. OBJETIVOS:

2.1. Gerais

Isolar, caracterizar cineticamente e realizar ensaios microbiológicos e larvicida

com a quitinase, obtida do camarão Litopenaeus schmitti.

2.2. Específicos

• Extrair glicosidases e sulfatases do cefalotórax do camarão marinho

Litopenaeus schmitti;

• Fracionar estas enzimas através de precipitação com sulfato de amônio

e identificar glicosidases e sulfatases nestas frações utilizando

substratos sintéticos específicos;

• Purificar a quitinase utilizando cromatografias;

• Propor a massa molecular da quitinase isolada;

• Realizar testes cinéticos com a Litochitinase1;

• Avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica da Litochitinase1 sobre

cepas de Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida tropicalis,

Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa;

• Investigar a presença de quitina nos intestinos médios das larvas de

Aedes aegypti;

• Avaliar a atividade larvicida das frações ricas em Litochitinase1 contra

larvas de Aedes aegypti;

• Identificar a presença de proteínas bioativas como: proteinases serínicas

e lectinas, nas frações ricas em Litochitinase1;

• Avaliar a influência das enzimas digestivas de A. aegypti sobre a

Litochitinase1.

32

MATERIAIS


3. MATERIAIS 3.1. Material Biológico

3.1.1 Camarão Litopenaeus schmitti

Figura 05: Litopenaeus schmitti. Fonte: Arquivo Próprio

Os camarões da espécie Litopenaeus schmitti foram obtidos no Mercado de

peixes situado na cidade do Natal, Estado do Rio Grande do Norte. Estes foram

mantidos a 4°C durante o transporte e depois armazenados a -20°C até seu

processamento.

3.1.2. Insetos

As larvas do quarto instar de Aedes aegypti foram obtidas da criação mantida

no Laboratório de Entomologia (LABENT) do Departamento de Microbiologia e

Parasitologia da UFRN. Estes experimentos foram realizados com o auxílio da aluna

de pós-graduação, a Veterinária (CRMV- RN 373) Patrícia Barra e da Profa. Dra.

Maria de Fátima F. de M. Ximenes.

Surperfilo: Artropoda

Filo: Crustacea

Classe: Malacostraca

Ordem: Decapoda

Família: Penaeidae

Gênero: Litopenaeus

Espécie: Litopenaeus schmitti

33

MATERIAIS


3.1.3. Eritrócitos Humanos

Os eritrócitos humanos foram obtidos através de doações de bolsas de

sangue pelo HEMOCENTRO-RN. As bolsas fornecidas encontravam-se fora do

prazo de validade para transfusões.

3.1.4. Microorganismos

As cepas de Staphylococcus aureus (25923), Candida tropicalis (13803),

Escherichia coli (25922) e Pseudomonas aeruginosa (27853), foram obtidas do Banco

de Cepas ATCC (Americam Type Culture Collection) e Candida albicans (12) obtida

do banco ICB e mantidas no Laboratório de Micologia Médica e Ambiental (LAMEA)

no Departamento de Microbiologia e Parasitologia da UFRN. Estes experimentos

foram realizados sob a supervisão e orientação da Profa. Dra. Vânia Sousa Andrade e

com o auxílio da aluna de Iniciação Cientifica (Bolsista PROPESQ) Gabriela Medeiros

Araújo.

3.2. Substratos Sintéticos derivados de açúcares

p-nitofenil-sulfato; p-nitrofenil-N-acetil-β-D-Glucosaminídeo; p-nitrofenil-β-D-

glucopiranosídeo; p-nitrofenil-α-D-glucopiranosídeo; p-nitrofenil-N-acetil-α-D-

galactosaminídeo; 4-Nitrofenil N, N’-diacetil-β-D-quitobiosideo; 4-Nitrofenil β-D-N, N’,

N’’-triacetilquitotriose foram adquiridos da Sigma Chemical Company (St Louis, MO,

EUA).

3.3. Reagentes, Soluções, membranas e matrizes cromatográficas

• Acrilamida e bisacrilamida da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA),

dodecil sulfato de sódio (SDS) e ácido acético (C2H4O2) da Reagen, Quimibras

Indústrias Químicas S.A. Indústria Brasileira (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

• Hidróxido de sódio (NaOH), Álcool etílico (C2H6O) foi obtido da CIRQ

Cromato Produtos Químicos LTDA (São Paulo, SP, Brasil);

34

MATERIAIS


• Albumina sérica bovina, ácido etilenodiamino tretra-acético (EDTA),

persulfato de amônio, glicina, N, N,N’ tetra-metileno diamino (TEMED), nitrato de

prata, “Coomassie brilhante blue” G 250, Azocaseína, Proteases Serínicas: Tripsina

e Quimotripsina, Protease Cisteínica: Papaína, da Sigma Chemical Company (St

Louis, MO, EUA);

• Padrões de massa molecular para eletroforese da Fermentas Life Sciences

(Ontário, Canadá);

• Tiossulfato de sódio (Na2S2O3), acetato de sódio (NaC2H3O2), cloreto de

sódio (NaCl), ácido clorídrico (HCL), cloreto de potássio (KCL), sulfato de amônio

((NH2)2SO4), e fosfato de sódio monobásico (Na2HPO4.H2O), acetona, sulfato de

sódio (Na2SO4), fosfato de sódio dibásico (NaH2PO4) e citrato de sódio (NaC6H5O7)

foram adquiridos da VETEC Química Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ, Brasil); ácido

tricloroacético (CCl3COOH) da MERCK (Darmstadt, Germany);

• Membranas de diálise (limite de exclusão: 6.000-8.000 e 12.000-14.000

dáltons) da Spectrum Medical Industries, Inc.(Houston TX, EUA);

• Matriz cromatográfica DEAE-Biogel A 1,5m da Bio Rad Laboratories

(Richmond, CA, EUA);

• Matriz cromatográfica Sephacryl S-200 da Sigma Chemical Company (St

Louis, MO, EUA).

3.4. Aparelhos

• Agitador orbital modelo 2525, Banhos e estufas de temperaturas constantes

da FANEM LTDA (São Paulo, SP, Brasil);

• Balança analítica – SCIENTECH, obtidos da QUIMIS Aparelhos Científicos

LTDA (Diadema – SP, Brasil);

• Bomba peristáltica modelo 18-1110-91 e coletor de frações modelo 18-1003-

64, Pharmacia Biotech, (Uppsala, Sweden);

• Centrifuga refrigerada modelo CR 21 da Hitachi Koki Co. LTDA (Tóquio,

Japão);

• Concentrador 5301 Eppendorf (Hamburgo, Germany);

• Espectrofotômetro Hitachi U 2000 (Tóquio, Japão) ;

• Lupa, Olympus (California, USA)

35

MATERIAIS


• Medidor de pH Digimed (São Paulo, SP, Brasil);

• Microcentrífuga Eppendorf 5410 (Hamburgo, Germany);

• Sistema de eletroforese em gel vertical, modelo Mini-VE da Amersham

Biosciences (Uppsala, Suécia);

• Sistema de ultrapurificação de água Millipore modelo Milli-Q Plus (NYE, EUA)

• Fluxo Lâminar-Purifier Class II Biosafety Cabinet (Kansas City, EUA).

36

MÉTODOS


4. MÉTODOS

4.1. Obtenção do Extrato Bruto

Os camarões da espécie Litopenaeus schmitti foram descongelados, os

cefalotórax foram cuidadosamente separados da musculatura e homogeneizados

com dois volumes de tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, em banho de gelo. Em

seguida centrifugados a 12.000 x g (4°C) e as fases solúveis (extratos brutos)

utilizados para posterior fracionamento utilizando-se sulfato de amônio.

4.2. Fracionamento com Sulfato de Amônio

O fracionamento com sulfato de amônio foi efetuado em três etapas de

saturação: 0-30%, 30-50% e 50-80%. A concentração de sal, correspondente a cada

saturação, foi adicionado lentamente sobre a amostra sofrendo leve agitação e,

posteriormente deixado por 18 horas a 4°C (geladeira). Em seguida foram

centrifugados a 12.000 x g, os precipitados ressuspensos em tampão acetato de

sódio 0,1 M pH 5,0 e dialisados por 18 horas contra o mesmo tampão (quatro

vezes). Todos estes processos foram executados a 4°C. Estas frações foram

denominadas F-I, F-II e F-III, referindo-se aos percentuais de saturação 0-30%, 30-

50% e 50-80%, respectivamente (Figura 06).

37

MÉTODOS


Figura 06: Fluxograma do fracionamento com sulfato de amônio.

4.3. Determinação das Atividades Enzimáticas Com p-Nitrofenil Derivados de

Açúcar

As incubações com p-nitrofenil derivados de açúcar (p-nitrofenil-α-D-

galactopiranosideo, p-nitrofenil-sulfato, p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo, p-nitrofenil-

β-D-N-acetilglucosaminídeo e p-nitrofenil-α-D-glucopiranosídeo, 4-Nitrofenil N, N’-

diacetil-β-D-quitobiosideo, 4-Nitrofenil β-D-N, N’, N’’-triacetilquitotriose) foram

realizadas utilizando-se 10 mM de cada substrato sintético com alíquotas do extrato

bruto, das frações precipitadas com sulfato de amônio e cromatográficas (volume

final de 100 µL). Os ensaios foram realizados no tempo de 30 minutos a 37°C para o

EB e F-III e 2 horas a 55°C para as cromatografias. As reações foram interrompidas

com 1 mL de hidróxido de sódio 0,25 N e o p-nitrofenol liberado lido em

Homogenizado com tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0 12.000 x g – 30’, 4 ºC

0-30% Sulfato de amônio 12.000 xg –30’, 4 ºC



Sobrenadante (Extrato Bruto)

Precipitado (F-I) Sobrenadante

Precipitado (F-II)

Precipitado (F-III)

Sobrenadante

38

MÉTODOS


espectrofotômetro a 405 nm. Para cada ensaio foram feitos controles negativos dos

substratos (substrato e tampão no mesmo volume e concentração do ensaio). Uma

unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de aumentar

em 0,01 unidade de absorbância a 405 nm.

4.4. Dosagem de Proteínas

Para a quantificação das proteínas utilizamos o método de SEDMAK;

GROSSBERG (1977) com albumina sérica bovina como padrão.

4.5. Purificação da Enzima

4.5.1. Cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel

A fração F-III (9,32 mg), proveniente do fracionamento com sulfato de amônio,

foi submetida à cromatografia de troca-iônica DEAE-Biogel. A coluna com cerca de

10 cm3 de gel foi equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0. Para a

remoção das proteínas, que não se complexaram com o gel, foi feita eluição (fluxo

de 1 mL/3min) com o mesmo tampão até que nenhuma proteína fosse detectada no

eluato. Este pico protéico é, geralmente, denominado de não-retido. Em seguida, as

proteínas retidas, foram eluídas da coluna utilizando-se o mesmo tampão, acrescido

de cloreto de sódio nas concentrações de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0M. Todas as etapas

foram realizadas a 4°C. O perfil de eluição protéica das frações da coluna foi

determinado por absorção a 280 nm. Para determinação das atividades enzimáticas,

alíquotas de 20 µL (0,062 µg) destas frações foram ensaiadas a 37°C durante uma

hora com p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo. O p-nitrofenol liberado foi lido a

405 nm em espectrofotômetro.

4.5.2. Cromatografia de Exclusão Molecular – Sephacryl S – 200

Cerca de 2 mL (1 mg), da fração eluída a 0,2 M de NaCl proveniente da

cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel, foi aplicada em cromatografia de

exclusão molecular Sephacryl S-200 (com diâmetro de 104 cm x 0,9 cm), equilibrada

39

MÉTODOS


com tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5.0. As proteínas foram eluídas utilizando-se

o mesmo tampão com o fluxo de 0,4 mL por minuto, sendo coletadas frações de 2

mL/5 min e armazenadas a 4°C até o uso. O perfil de eluição protéica foi monitorado

em espectrofotômetro a 280 nm e para a determinação das atividades enzimáticas,

alíquotas de 50 µL destas frações foram avaliadas a 45°C durante 2 horas com p-

nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo. O p-nitrofenol liberado foi lido a 405 nm em

espectrofotômetro.

4.6. Eletroforese em gel de Poliacrilamida em condições desnaturantes-

SDS/PAGE

Para avaliar o grau de pureza da quitinase e determinar a massa molecular

aparente, alíquotas (20 µg) das frações: extrato bruto, F-III, pico protéico de maior

atividade quitinásica eluído da cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e exclusão

molecular Sephacryl S-200 foram submetidos a uma eletroforese em gel de

poliacrilamida 10% em presença de SDS, de acordo com a metodologia descrita por

LAEMMLI, (1970). As frações foram precipitadas com acido tricloroacético 90% na

razão de 9:1. Após 30 minutos de precipitação em banho de gelo, as amostras foram

centrifugadas durante 15 minutos a 15.000 x g, o sobrenadante foi descartado e ao

precipitado adicionado acetona e uma nova centrifugação foi realizada nas mesmas

condições da anterior. Uma vez descartado o sobrenadante, o precipitado foi

ressuspenso em 20 µL de tampão de amostra (azul de bromofenol 5%, SDS 20% e

sacarose 10%). A corrida eletroforética foi realizada a uma corrente de 30mA por

aproximadamente 2 horas. Para a revelação das bandas protéicas, o gel foi corado

com coomassie blue R 250 0,1% em solução de metanol 40% e ácido acético 10%,

e descorado com a solução de metanol 40% e ácido acético 10%.

Para a detecção de proteínas na ordem de nanogramas, o gel foi corado com

nitrato de prata de acordo com a seguinte metodologia: O gel corado, como já

descrito, foi desidratado seqüencialmente com três lavagens em solução de etanol

50%, por 20 minutos cada. Em seguida, o gel foi colocado sob agitação durante 1

minuto em solução de tiossulfato de sódio 0,02%. Este foi lavado rapidamente três

vezes com água destilada e, em seguida, foi adicionado solução de nitrato de prata

0,2% acrescida de 74 µl de formaldeído 37% mantendo-se por 20 minutos sob

40

MÉTODOS


agitação. O gel foi lavado novamente três vezes com água destilada e adicionou-se

solução reveladora de carbonato de sódio 6%, acrescida de 50 µl de formaldeído

37% e 2 mL de tiossulfato de sódio 0,02%. A reação foi interrompida com acido

acético 13% após obtida a coloração desejada.

4.7. Estudos Cinéticos

Os experimentos cinéticos foram realizados incubando-se a quitinase, obtida

purificada da cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200, com o p-

nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo como substrato. Os ensaios foram realizados

em duplicatas, com seus respectivos controles negativos (tampão e substrato no

mesmo volume, concentrações, temperaturas e pH dos ensaios).

4.7.1. Determinação da constante de Michaelis-Menten (Km)

Com o objetivo de se determinar o Km aparente da quitinase para a hidrólise

do p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo, alíquotas de 50 µl (4,05 µg) da enzima

foram incubadas a 55°C durante 2 h com diferentes concentrações finais do p-

nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo (0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 e

3,5 mM). Os ensaios foram feitos em duplicatas, sendo interrompidos com 1 mL de

NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado lido em espectrofotômetro a 405 nm.

Controles negativos dos substratos foram feitos para cada concentração utilizada.

Os valores de Km foram calculados por meio do programa de computador ORIGIN

5.0.

4.7.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática

A influência da temperatura sobre a atividade da quitinase foi realizada

incubando-se 50 µl (4,05 µg) desta e 1,5 mM do p-nitrofenil-N-acetil-β-D-

glucosaminídeo durante 2 horas nas temperaturas de 4; 25; 37; 45; 50; 55; 60; 70 e

80°C. Transcorrido cada ensaio as reações foram interrompidas como descrito em

3.3.

41

MÉTODOS


A fim de testar a estabilidade da quitinase frente a variadas temperaturas,

foram feitas pré-incubações usando 50 µl (4,05 µg) da enzima durante 30 minutos a

25, 37, 45, 50, 55, 60, 70, 80 e 100°C na ausência do substrato. Transcorrido o

tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado para uma

concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h. Em seguida as

reações foram interrompidas como descrito em 3.3.

4.7.3. Influência do pH sobre a atividade enzimática

Para a realização destes experimentos alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da

quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões: glicina-HCl pH 3,0;

3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0 e

Tris-HCl pH 7,0; 8,0 e 9,0. Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M.

Após a diálise alíquotas de 50 µl (4,05 µg) da enzima dialisada, nos tampões já

citados, foram incubadas com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo

durante 2 horas a 55°C. Transcorrido o tempo de ensaio as reações foram

interrompidas e quantificadas a 405 nm em espectrofotômetro.

A fim de testar a estabilidade da quitinase frente a variações de pHs,

alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra

os tampões: glicina-HCl pH 3,0; 3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato

de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0 e Tris-HCl pH 7,0 ;8,0 e 9,0. Foram feitas pré-incubações

usando 50 µl (4,05 µg) da enzima durante 30 minutos a 50°C na ausência do

substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi

adicionado para uma concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h.

Em seguida as reações foram interrompidas como descrito em 3.3.

4.7.4. Influência de diversos sais e EDTA na hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-ββββ-

D-Glucosaminídeo.

Alíquotas de 50 µL (4,05 µg) da enzima foram pré-incubadas a 50°C, durante

15 minutos, na presença de diversos sais e EDTA a uma concentração final de 10

mM. Transcorrido este tempo, foi adicionado o p-nitrofenol-N-Acetil-β-D-

Glucosaminídeo numa concentração final de 1,5 mM e procedemos com o ensaio a

42

MÉTODOS


55°C, e após 2 h, os ensaios foram interrompidos com 1mL de NaOH 0,25 N e o p-

nitrofenil liberado, lido em espectrofotômetro a 405 nm. Os sais utilizados nesse

experimento foram: Cloreto de Magnésio (MgCl2), Cloreto de Potássio (KCl), Cloreto

de Cálcio (CaCl2), Tiossulfato de sódio pentahidratado (Na2S2O25H2O), Sulfato de

sódio (Na2SO4), Fosfato de sódio dibasico (NaH2PO4), Fosfato de sódio monobásico

(Na2HPO4.H2O), Citrato de sódio(NaC6H5O7), cloreto de sódio (NaCl), além do ácido

etilenodiamino tetra-acético (EDTA).

4.8. Preparação da quitinase para os ensaios biológicos

A Litochitinase1, foi submetida a precipitação em 2 volumes de acetona,na

qual esta foi adicionada lentamente sobre a amostra sofrendo leve agitação e,

posteriormente deixada por 18h a 4°C (geladeira). Em seguida foi centrifugada a

12.000 x g, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso em tampão

acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 para a realização dos ensaios biológicos. Todos estes

processos foram executados a 4°C.

4.9. Avaliação da atividade antimicrobiana

4.9.1. Análise Qualitativa- Técnica de Difusão em Disco

Para avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da quitinase foi

inicialmente aplicada à técnica de difusão em disco (BAUER et al., 1966). A partir

de cultivo em Ágar Mueller-Hinton e Ágar Saboraund foram preparadas suspensões

ajustadas pela escala 0,5 Mc Farland, para as bactérias (Staphylococcus aureus) e

leveduras (Candida albicans e Candida tropicalis). Em seguida as suspensões foram

plaqueadas em Ágar Mueller-Hinton e Saboraund para as bactérias e leveduras,

respectivamente. Posteriormente Discos de papel filtro (Whatman 6 mm), foram

impregnados, com 20 µL da quitinase nas concentrações de 676 µg/mL e 1600

µg/mL, e fixados sobre a superfície do meio inoculado (Quadro 1). As placas foram

incubadas em estufa bacteriológica por 24 horas, a 35 ºC. Os halos de inibição do

crescimento bacteriano e fúngico foram medidos em milímetros com auxílio de uma

régua milimetrada. Foi realizado o controle negativo utilizando, água destilada e/ ou

tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,0.

43

MÉTODOS


Quadro 1: Técnica de Difusão em Disco, cepas selecionadas e concentrações da quitinase utilizada

TÉCNICA MICROORGANISMO AMOSTRA TESTADA

(QUITINASE)

Difusão em disco

S. aureus 676 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0

C. albicans 1600 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0

1600 µg/mL água

C. tropicalis 1600 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0

4.9.2. Ánalise Quantificativa- Determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM)

A CIM foi obtida por meio do método de Microdiluição em caldo, de acordo

com a metodologia descrita no Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI

2003). Os microorganismos utilizados nesta técnica foram: Staphylococcus aureus,

Candida albicans, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

A quitinase apartir de diluições seriadas foi testadas nas concentrações finais

de 800, 400, 200 e 100 µg/mL. O teste foi realizado pela distribuição em placas de

microdiluição estéreis contendo 96 poços, em cada orifício teste e de controle de

crescimento foram adicionados 20 µL de inoculo microbiano e 100 µL dos meios BHI

e caldo Saboraund para bactérias e leveduras, respectivamente. Os orifícios testes

receberam também 50 µL da quitinase na concentração inicial de 1.600 mg/mL, já os

orifício contendos os controles negativos continham 50 µL de tampão acetato de

sódio 100 mM, pH 5,0 e os controles positivos continham 20 µL de gentamicina na

concentração de 40 µg (Quadro 2). Em seguida, as placas foram incubadas em

estufa bacteriológica por 24 horas, a 37 ºC para as bactérias e por 24 horas, a 28 ºC

para as leveduras. Para leitura, que foi realizada visualmente, após o tempo de 3 h,

foram adicionados 20 µL de cloreto de, 2,3,5 – trifenil – tetrazólio (CTT) em cada

orifício, indicador de multiplicação bacteriana, que apresenta coloração

avermelhada na presença de células viáveis.

44

MÉTODOS


Quadro 2: Técnica de Microdiluição em Caldo, cepas selecionadas e concentrações da quitinase utilizada

TÉCNICA MICROORGANISMO AMOSTRA TESTADA

(QUITINASE)

Microdiluição em Caldo

C. albicans 800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0

800 µg/mL água

S. aureus 800 µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0

E. coli

800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0

800 µg/mL água

P.aeruginosa 800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0

*Para os ensaios de microdiluição em caldo foram realizadas diluições seriadas

4.10. Ensaios com Aedes aegypti

4.10.1. Obtenção das larvas de Aedes aegypti

Armadilhas (Ovitrampas) foram colocadas em diversos pontos no Campus

Universitário da UFRN e no Bairro Nordeste (elevado índice de infestação predial),

Natal-RN. Semanalmente as palhetas foram trazidas para o LABENT, Laboratório

de Entomologia Médica da UFRN, e após a contagem dos ovos, foram submersas

em uma bandeja plástica (30 cm x 20 cm x 15 cm) com água limpa contendo ração

para peixes autoclavada. Após a eclosão as palhetas foram removidas e as larvas

identificadas em microscópio estereoscópico como sendo de Aedes aegypti, onde

posteriormente foram utilizadas nos ensaios.

4.10.2. Dissecação das larvas de A. aegypti

Cem larvas de A. aegypti no quarto instar foram dissecadas em banho de

gelo, com o auxílio de uma lupa, e trato intestinal das larvas foi exposto utilizando-se

pinças e transferido para microtubos de ensaio contendo solução tampão Tris-HCl

45

MÉTODOS


50 mM pH 7,5. Todos os materiais coletados foram mantidos a -20°C, até a extração

do homogenato intestinal e utilização nos ensaios de inibição.

4.10.3. Preparo do homogenato intestinal das larvas

O homogenato intestinal foi preparado seguindo a metodologia estabelecida

por TERRA et al. (1997), com algumas modificações. Os intestinos das larvas dos

insetos foram homogeneizados com o auxílio de um pistilo em tubos eppendorff, em

banho de gelo, por aproximadamente 10 minutos, usando-se como extrator 800 µL

de Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Em seguida os homogenatos foram centrifugados a

10.000 x g durante 15 minutos a 4°C. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados

posteriormente para os ensaios de inibição.

4.10.4. Detecção de quitina no intestino das larvas de A. aegypti

Os intestinos das larvas foram retirados com auxílio de pinça e bisturi, e em

seguida reservados. Os intestinos foram então lavados para a remoção dos

conteúdos luminais remanescentes. A presença da quitina foi verificada por meio do

teste de Von Wisselingh (ROGER; PERKINS, 1968). Este teste qualitativo detecta

quitosana produzida após tratamento térmico do material contendo quitina, com

NaOH saturado por 15 minutos a 160 °C. Resíduos foram lavados com diferentes

concentrações de álcool etílico: 10, 20, 30, 40, 80 e 95%. Após a reação, a presença

de quitina foi observada com solução de lugol e, em seguida, ácido sulfúrico a 1%.

Controle positivo foi feito utilizado quitina de lagosta e para controle negativo foi

utilizado celulose.

4.10.5. Ensaios com larvas de A. aegypti

A atividade larvicida da Litochitinase1 foi avaliada utilizando uma adaptação

da Organização Mundial de Saúde (1981). Cinco larvas do quarto estádio (L4) foram

colocadas em recipientes plásticos descartáveis contendo os extratos brutos, F-III e

S-200. As concentrações utilizadas para o extrato bruto foram 1,55; 3,8; 5,7 e 7,22

mg/mL. Já as concentrações para a F-III foram 1,23; 1,84; 3,08 e 4,31 mg/mL e para

a Litochitinase1 foram utilizadas as seguintes concentrações: 0,472; 0,675; 0,9 e

1,12 mg/mL. O volume final do ensaio larvicida foi de 20 mL de solução de teste ou

controle negativo. Os ensaios foram realizados em quadruplicatas e a taxa

46

MÉTODOS


de mortalidade das larvas foi determinada após 24 e 48 h de incubação a 28 ± 2 ° C

com fotoperíodo de 12/12 h (claro-escuro). As larvas foram consideradas mortas

quando não respondiam a estímulos mecânicos como, por exemplo, a agitação aos

recipientes plásticos.

4.10.6. Determinação da EC50

A concentração da quitinase que mata 50% das larvas L4 da Aedes aegypti

foi determinada pela construção de uma curva regressão linear simples a qual

relaciona o percentual de mortalidade com a concentração de enzima utilizada no

ensaio.

4.10.7. Análises Estatísticas

A análise estatística dos dados experimentais foi realizada utilizando o

software de computador GraphPad Prisma 5® para Windows® (GraphPad Software,

Inc, USA), para determinar a significância das diferenças (p <0,05) entre os

tratamentos, por meio dos testes ANOVA e Kruskal-Wallis.

4.10.8. Investigação de proteínas bioativas interferentes no processo

digestório nas larvas de Aedes aegypti

4.10.8.1. Ensaio de inibição de proteases serínicas

a) Preparo do Substrato

Azocaseína a 1% e 1,5% (substrato protéico) foi solubilizada em 50 mL de

tampão Tris-HCL 50 mM pH 7,5. A solução foi fervida por cerca de 10 minutos. Após

resfriamento o volume foi completado com água destilada. A solução foi conservada

a -20 ºC até sua utilização.

b) Atividade anti-quimotríptica

A atividade inibitória sobre a quimotripsina foi determinada utilizando 20 µL de

solução de quimotripsina bovina (0,2 mg/mL em tampão Tris-HCL 50 mM, pH 7,5,

contendo CaCl2 20 mM) pré-incubada em tampão Tris-HCL 50 mM, pH 7,5, contendo

CaCl2 20 mM e 100 µL das amostras enzimáticas (EB (1557,7 µg) , F-III (1121,4 µg)

47

MÉTODOS


e a Litochitinase1 (8,1µg)) por 15 minutos a 37 °C. Após esse período, a reação foi

iniciada adicionando-se 200 µL de azocaseína 1%. Descorridos 30 minutos, a

reação foi interrompida adicionando-se 300 µL de solução de TCA 20%. A mistura

da reação foi centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante

alcalinizado com NaOH 2 N na proporção de 1:1. A absorbância foi medida em

espectrofotômetro a 440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram

realizados em triplicatas.

c) Atividade anti-tríptica

A atividade anti-tríptica foi determinada utilizando azocaseína como substrato

alíquotas de 20 µL de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampão Tris-HCl 50

mM pH 7,5), foram pré-incubadas por 15 minutos a 37 °C, com 120 µL de HCl 2,5

mM, 350 µL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e 200 µL da amostra (EB (3115,4

µg), F-III (2242,8 µg) e a Litochitinase1(16,1 µg)). Após isso a reação foi iniciada

adicionando-se 200 µL de azocaseína 1%. Descorridos 30 minutos, a reação foi

interrompida adicionando-se 300 µL de solução de TCA 20%. A mistura da reação

foi centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante alcalinizado com

NaOH 2 N na proporção de 1:1. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a

440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram realizados em

triplicatas.

4.10.8.2. Ensaios de Hemaglutinação

a) Preparo do sangue

Alíquotas de 2 mL de sangue foram lavadas com 8 mL de solução salina

fisiológica e centrifugadas a 924 x g, até a obtenção de uma massa de eritrócitos

íntegros livre de soro e material hemolisado.

b) Tratamento dos eritrócitos com Papaína

Uma solução estoque de papaína de 1 mg/mL em solução salina foi

adicionada aos eritrócitos, previamente lavados na proporção de 1:1 (v/v). A mistura

48

MÉTODOS


foi incubada por 30 minutos a 37 °C, com leve agitação ocasional, Em seguida foi

centrifugada a 924 x g, por 5 minutos e seu precipitado foi lavado 6 vezes com

solução salina. Realizou-se o hematócrito e em seguida uma solução de eritrócitos

na concentração de 4% foi preparada.

c) Tratamento dos eritrócitos com Tripsina

Uma solução estoque de tripsina na concentração de 1mg/mL foi preparada e

adicionada a 1 mL de eritrócitos, previamente lavados. A mistura foi deixada em

repouso por 1 hora, a temperatura ambiente, com leve agitação ocasional. Em

seguida, foi centrifugada a 924 x g, por 5 minutos e seu precipitado lavado por 6

vezes com solução salina. Realizou-se o hematócrito e uma solução de eritrócitos

diluída a 4% em solução salina foi preparada.

d) Ensaio

Os testes de hemaglutinação foram realizados por meio de diluição seriada

das amostras testes em microplacas com fundo em “V”. No primeiro poço foram

adicionados 25 µL da amostra (EB (389,4 µg) e/ou F-III (280,3 µg) e/ou

Litochitinase1 (2 µg)) e 25 µL de uma suspensão de eritrócitos a 4% tratados

enzimaticamente enquanto que, a partir do segundo em diante foram adicionados 25

µL de solução salina, 25 µL da amostra diluída seriadamente e 25 µL da suspensão

de eritrócitos a 4%, submetido a tratamentos enzimáticos. A reação foi incubada por

1 hora, a temperatura ambiente. O grau de aglutinação foi observado visualmente e

o título expresso em unidade de hemaglutinação (UH), que é definido como o

inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação

(MOREIRA et al., 1977).

4.10.8.3. Efeito do homogenato intestinal das larvas de A. aegypti sobre a

atividade quitinolítica

a) Determinação de atividade Azocaseinolítica

A atividade azocaseinolítica foi pesquisada por incubação de 30, 50 e 70 µL

de homogenato intestinal com 450 µL de tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 e 500 µL de

49

MÉTODOS


solução de azocaseína 1,5% por 30 minutos a 37 °C. A reação foi paralisada com

150 µL de TCA 20%. Transcorridos 30 minutos, a suspensão foi centrifugada por 15

minutos, a 12000 x g a temperatura ambiente. Alíquotas de 800 µL do sobrenadante

foram alcalinizadas com 800 µL de NaOH 2 N. Todos os ensaios foram feitos em

triplicatas e provas em branco foram realizadas. A atividade azocaseinolítica foi

medida pela absorbância a 440 nm.

b) Efeito da temperatura sobre a atividade azocaseinolítica a pH 7,5

O efeito da temperatura foi avaliado utilizando as seguintes temperaturas: 5,

10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90 °C. Os ensaios foram realizados com descrito no

item 4.11.4.

c) Influência das enzimas digestivas do A. aegypti na hidrólise do p-

nitrofenil-N-acetil-ββββ-D-Glucosaminídeo

Alíquotas de 50 µL (4,05 µg) da Litochitinase1 foram pré-incubadas a 50°C,

durante 15 minutos, na presença do homogenato intestinal das larvas do mosquito

A. aegypti. Transcorrido este tempo, foi adicionado o p-nitrofenol-N-Acetil-β-D-

Glucosaminídeo numa concentração final de 1,5 mM e procedemos com o ensaio a

55°C, e após 2 h, o ensaio foi interrompido com 1 mL de NaOH 0,25 N e o p-

nitrofenil liberado, lido em espectrofotômetro a 405 nm.

50

RESULTADOS


5. RESULTADOS

5.1. Identificação de glicosidases e sulfatases nos cefalotórax dos camarões

marinhos Litopenaeus schmitti

A identificação das atividades enzimáticas foi pesquisada no EB e nas frações

precipitadas com sulfato de amônio (F-I, F-II e F-III) obtidas dos cefalotórax dos

camarões. Para isso foram utilizados alguns substratos sintéticos derivados de

açúcar. Os resultados mostraram a presença de quase todas as atividades

enzimáticas pesquisadas no extrato bruto, F-I, F-II e F-III (Figura 07).

É possível observar ainda, no gráfico da figura 07, que os ensaios utilizando o

EB e as amostras F-I, F-II e F-III, mostraram que, de todas as atividades

pesquisadas, a N-acetil-β-D-glucosaminidase (quitinase) foi a que mais se

sobressaiu em todos estes testes apresentado maior atividade específica na F-III.

Devido a isto a F-III, foi submetida ao fracionamento em cromatografia de troca

iônica DEAE-Biogel.

51

RESULTADOS


5.2. Purificação da Quitinase

5.2.1. Em cromatografia de troca-iônica DEAE-Biogel

A fração F-III, por ser mais rica na atividade quitinásica, foi submetida (9,32

mg) a cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel. Nesta etapa de purificação

observou-se inicialmente a eluição de um pico não retido, eluído com o tampão de

equilíbrio da coluna e, em seguida, a eluição de picos protéicos utilizando-se as

concentrações de NaCl de: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0M (Figura 08). Todas as frações

eluídas da cromatografia foram incubadas com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-

glucosaminídeo para o acompanhamento da atividade enzimática e eluição da

quitinase. Estes testes mostraram a eluição da quitinase apenas no pico protéico

eluído com 0,2 M de NaCl. Nas outras molaridades de NaCl, não observou-se a

Figura 07: Atividades enzimáticas presentes no extrato bruto e nas frações obtidas da precipitação com sulfato de amônio do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti. Alíquotas das frações do extrato bruto, F-I, F-II e F-III foram incubadas com cada p-nitrofenil para uma concentração final de 10 mM a 37 ºC, durante 30 minutos. Estas foram interrompidas pela adição de 1 mL de NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado é lido em espectrofotômetro a 405 nm. Onde: Bruto, é o extrato bruto antes da precipitação com sulfato de amônio, F-I, F-II e F-III, frações precipitadas com 0-30%, 30-50% e 50-80% de sulfato de amônio, respectivamente. A atividade específica foi encontrada através da relação entre a quantidade de p-nitrofenol liberado e a massa em µg de proteína contida no volume de cada fração ensaiada, por um período de 30 minutos.

Frações

Bruto F-I F-II F-III

β-D-glucosaminidase

α-D-glucosaminidase

Sulfatase

α-D-galactosaminidase

N-acetil-β-D-glucosaminidase

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

52

RESULTADOS


presença de atividade enzimática (Figura 08). O pico protéico e de atividade

quitinásica eluído com 0,2 M de NaCl foram reunidos, dialisados contra tampão

acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, concentrados com dois volumes de acetona e

aplicado em cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200.

5.2.2. Em cromatografia de Exclusão molecular

O pico protéico eluído com 0,2 M de NaCl oriundo da cromatografia de troca-

iônica que apresentou atividade enzimática, foi aplicado em cromatografia de

exclusão molecular Sephacryl S-200. Esta cromatografia revelou um pico protéico de

elevada absorbância a 280 nm, mas sem atividade enzimática (Figura 09). A

quitinase foi eluída em um pequeno pico protéico, anterior ao principal, e com

elevada atividade específica. Este pico protéico foi visualizado em SDS-PAGE e

Figura 08: Perfil de eluição protéico da F-III em cromatografia de troca iônica e de atividade quitinásica. Cerca de 2 mL da F-III (~9,32 mg) foi submetida a cromatografia de troca iônica. A coluna com cerca de 10 cm3 de gel foi equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0. A eluição (fluxo de 1 mL/3 min) foi realizada com o mesmo tampão até que a leitura de proteínas se aproximasse de zero, em seguida, utilizamos como tampão de eluição (fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0 acrescido de NaCl nas concentrações de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 M). As proteínas das frações eluidas (1 mL) foram lidas a 280 nm e o perfil das atividades realizado com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo com leituras a 405 nm.

00,050,10,150,20,250,30,350,40,450,5

00,020,040,060,08

0,10,120,140,160,18

0,2

1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97 105

D.O

. 40

5 n

m

D.O

. 28

0 n

m

Frações

proteina N-acetil-beta-D-glucosaminidase

NR 0,2 M 0,4 M 0,6 M 0,8 M 1 M

Atividade

53

RESULTADOS


posteriormente utilizado nos testes cinéticos. Esta fração por ser rica em atividade

quitinásica, a enzima foi denominada Litochitinase1.

5.2.3. Resumo das etapas de purificação protéica

As etapas utilizadas na purificação da Litochitinase1 estão sumarizadas na

tabela de purificação (Tabela 3). É possível identificar um índice de purificação final

de 987,32 vezes e uma recuperação de 2,62%, com a remoção de uma grande

quantidade de proteínas durante o processo de isolamento entre as etapas F-III e as

cromatografias.

Figura 09: Perfil de eluição da Litochitinase1 e atividade quitinásica em cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). A coluna foi equilibrada e eluída com tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. Foram coletadas frações de 2 mL/5 min. A eluição das proteínas foi monitorada em espectrofotômetro a 280 nm e o perfil das atividades com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo determinadas por leitura a 405

54

RESULTADOS


Etapas Proteína

total (mg)

Ativ. total

(U)

Ativ.

Específica

(U)

Purificação

(X)

Recuperação

(%)

EB 4501,06 1551,200 0,34 1 100

F-III 396,414 265,625 0,67 2 17,12

DEAE-Biogel 51,026 37,050 0,72 2,12 2,38

Litochitinase1 0,12129 40,716 335,69 987,32 2,62

5.3. Perfil eletroforético das amostras em SDS-PAGE

Para avaliar o grau de pureza e determinar a massa molecular aproximada da

Litochitinase1, alíquotas do EB, F-III, pico 0,2 M da DEAE-Biogel e pico de atividade

da S-200 foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de

SDS (Figura 10). A análise do gel mostrou um grau de pureza relevante do pico com

atividade da S-200 onde apenas uma banda protéica é observada na região de 28,5

kDa. Esse valor foi determinado pela correlação entre o logarítimo do peso

molecular das proteínas padrões versus o logarítimo de migração das proteínas.

Tabela 3: Etapas de purificação da Litochitinase1

Tabela construída utilizando-se os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo. Onde: Atividade Total (U) = 1U corresponde a 0,01 unidade de absorbância a 405 nm; Purificação = Razão entre a atividade específica em cada passo de purificação e a atividade específica do extrato bruto; Recuperação = Percentual de atividade total em cada passo de purificação em relação a atividade total no extrato bruto (100%).

55

RESULTADOS


5.4. Experimentos cinéticos

A Litochitinase1 foi utilizada para realizar os estudos cinéticos. Nestes

experimentos foi utilizado p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo como substrato,

variando-se sua concentração, como também as condições de temperatura e pH dos

ensaios.

5.4.1. Determinação do Km

Estes experimentos foram realizados incubando-se a Litochitinase1 com

diferentes concentrações do substrato (Figura 11). Os resultados mostraram um Km

aparente de 0,51 mM obitido pelo calculo utilizando o programa ORIGIN 5.0.

Observa-se ainda que a partir da concentração de 1,5 mM de substrato, a atividade

enzimática tende a estabilizar até atingir a velocidade máxima da reação.

Figura 10: SDS-PAGE das amostras protéicas durante o processo de purificação

Onde: M- mistura de proteínas de diferentes pesos moleculares utilizadas como padrão, EB- extrato bruto, F-III, fração precipitada com 50-80% de sulfato de amônio, 0,2M de NaCl na cromatografia de troca-iônica e Litochitinase1 eluída na cromatografia de exclusão molecular.

kDa

M EB F-III 0,2 M Litochitinase1

28,5 kDa

230

130

95

72

56

36

28

56

RESULTADOS


0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

Data: Data1_meanModel: HyperblChi^2 = 0.00046P1 0.61317 ±0.02175P2 0.51232 ±0.0667

Abs

orbâ

ncia

(40

5 nm

)

[S]

5.4.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática

Neste estudo incubou-se a Litochitinase1 com o substrato sob diferentes

temperaturas. Após o ensaio foi observado que a 55°C ocorre maior atividade

quitinásica (Figura 12), embora na temperatura de 50°C ainda se observe quase

73% da atividade enzimática, mas esta decai consideravelmente em temperaturas

acima de 55°C.

Figura 11: Determinação do Km da Litochitinase1 50 µl da quitinase (4,05 µg) foram incubadas a 55 ºC por 2 horas com diferentes concentrações (0,25; 0,50; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 2; 2,5; 3 e 3,5 mM) de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo. Transcorrido este tempo, as reações foram interrompidas e o p-nitrofenil lido a 405 nm. O experimento foi realizado em duplicatas e o resultado apresentado, no gráfico representa as médias com seus respectivos desvios padrões.

Km 0, 51232

V

eloc

idad

e (V

)

57

RESULTADOS


4 °C 25°C 37°C 45°C 50°C 55°C 60°C 70°C 80°C

0

20

40

60

80

100

120

Ativ

idad

e %

Temperatura 0C

A estabilidade térmica foi pesquisada pré-incubando a Litochitinase1, em

diferentes temperaturas. A Figura 13 mostra que nas temperaturas de 25, 37 e 45°C

a atividade enzimática permanece estável. No entanto observa-se que nas

temperaturas de 50 e 55°C ocorre uma potencialização da atividade enzimática e

que coincide com a temperatura ótima de atividade da enzima. Ainda observa-se

uma atividade considerável a uma temperatura de 60°C e que cai até a completa

perda de atividade enzimática a 70, 80 e 100°C.

Figura 12: Efeito da temperatura sobre a atividade da Litochitinase1

50 µl da quitinase (4,05 µg) foram incubados com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo em diferentes temperaturas durante 2 horas. Transcorrido o tempo, as reações foram interrompidas como descrito em métodos. O experimento foi realizado em duplicatas e o resultado apresentado no gráfico representa as médias com seus respectivos desvios padrões.

58

RESULTADOS


30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

20

40

60

80

100

120

140

Ativ

idad

e re

sidu

al (

%)

Temperatura de pré-incubação (0C)

5.4.3. Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1

O efeito do pH sobre a catálise do substrato foi avaliado. Observou-se que a

maior atividade enzimática sobre o substrato ocorreu na faixa entre os pH 5,0 e 6,0

(Figura 14), embora o gráfico mostre atividade ótima em pH 5,5, os erros

experimentais (não plotados) demonstram que estas diferenças não são

significativas. Em pH 4,0 e 8,0 a atividade da enzima cai consideravelmente.

Figura 13: Efeito da pré-incubação a diferentes temperaturas na atividade da Litochitinase1 50 µl da quitinase (4,05 µg) foi pré-incubada durante 30 minutos a 25, 37, 45, 50, 55, 60, 70, 80 e 100°C na ausência do substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado para uma concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h. Em seguida as reações foram interrompidas como descrito em métodos.

59

RESULTADOS


3 4 5 6 7 8 9

0

20

40

60

80

100

120

Tampão Glicina Tampão Acetato de sódio Tampão Fosfato de sódio Tampão Tris

Ativ

idad

e (%

)

pH

A estabilidade frente ao pH foi estimada pela determinação da atividade da

Litochitinase1, após pré-incubação por 30 minutos a diferentes pHs. De acordo com

o gráfico da figura 15, a quitinase não é estável em pHs muito ácidos e muito

básicos, perdendo completamente a sua atividade. A estabilidade da enzima é

atingida numa faixa de pH entre 4,0 – 5,5, embora a Litochitinase1 apresente um

pico de atividade no pH 7,0.

Figura 14: Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1

Alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões: glicina-HCl pH 3,0; 3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0 e Tris-HCl pH 7,0;8,0 e 9,0. Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M. Após a diálise alíquotas de 50 µl da enzima foram incubadas com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo durante 2 horas a 55°C. Transcorrido o tempo de ensaio as reações foram interrompidas e quantificadas a 405 nm em espectrofotômetro.

60

RESULTADOS


3 4 5 6 7 8 9-50-40-30-20-10

0102030405060708090

100110

Glicina-HCl Acetato de Sódio Fosfato de Sódio Tris-HCl

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%)

pH

Alíquotas de 200 µl da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões: glicina-HCl pH 3,0 e 3,5; acetato de sódio pH 4,0 e 5,0; fosfato de sódio pH 5,5 e 6,0; e Tris-HCl pH 7,0, 8,0 e 9,0. Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M. Após a diálise alíquotas de 50 µl das enzimas foram pré-incubadas durante 30 minutos em suas temperaturas ótimas, na ausência do substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado na concentração de 10 mM e incubado na temperatura ótima da enzima durante 2 h. Em seguida as reações foram interrompidas como descrito na metodologia.

5.4.4. Efeito de sais e EDTA sobre a atividade enzimática

O efeito de sais e EDTA sobre a atividade da Litochitinase1 foi estimada pela

determinação da atividade, após a pré-incubação com vários compostos. De acordo

com a tabela 4, a Litochitinase1 apresentou sua atividade enzimática levemente

reduzida na presença do Na2HPO4 (5%). Por outro lado, os sais NaCl, KCl, NaH2PO4

e HgCl2, afetaram de forma expressiva a atividade enzimática, reduzindo-a em

aproximadamente: 28, 30, 40 e 98%, respectivamente (valores aproximados). O sal

MgCl2 foi o único que estimulou (~8%) levemente a atividade enzimática da

quitinase. CaCl2, Na2SO4, EDTA e o NaC6H5O7 não interferiram na atividade da

enzima.

Figura 15: Efeito da pré-incubação a diferentes pHs na atividade da Litochitinase1

61

RESULTADOS


Tabela 4: Efeitos de íons e compostos sobre a atividade da Litochitinase1

Sais e EDTA Ativ. Residual (%)

MgCl2 107,6 ± 4,2

KCl 71,4 ± 3,4

CaCl2 100,09 ± 5,3

Na2S2O25H2O 99,09± 4,07

Na2SO4 99,59 ± 2,26

HgCl2 1,09 ± 0,137

NaH2PO4 57,635 ± 7,04

Na2HPO4 91,405 ± 3,68

NaC6H5O7 98,025 ± 1,58

NaCl 80,39 ± 9,07

EDTA 96,075 ± 0,40

A enzima foi pré-incubada durante 15 minutos com cada sal e/ou EDTA antes de ser iniciado o ensaio. Os resultados foram apresentados com as médias seguidas de seus respectivos desvios padrões.

5.5. Avaliação da atividade antimicrobiana

5.5.1. Utilizando a técnica de difusão em disco

Para se avaliar as atividades antimicrobianas foi, inicialmente, utilizada a

técnica de difusão em disco. Os resultados obtidos com a Litochitinase1 em estudo,

não produziram halos de inibição para os microrganismos testados, sugerindo

ausência de atividade antimicrobiana sobre estirpes de: S. aureus, C. tropicalis, e C.

albicans. Os discos utilizados como controle negativo (tampão acetato de sódio 100

mM, pH 5,0/água), também não demonstraram qualquer atividade inibitória sobre os

microorganismos (Dados não mostrados).

62

RESULTADOS


5.5.2. Utilizando a técnica de microdiluição em caldo para determinação da

Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Na técnica de microdiluição em caldo os valores de CIM foram obtidos por

diluições sucessivas e determinados por leitura visual. Os resultados obtidos com a

Litochitinase1, não apresentaram atividade contra os microorganismos: S. aureus, C.

albicans e P. aeruginosa. Apresentando atividade antimicrobiana apenas para o

microorganismo E. coli variando de uma concentração de 800 a 500 µg/mL (Tabela

5).

Tabela 5: Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da Litochitinase1 do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti.

Cepas utilizadas Concentração

utilizada

Atividade

antimicrobiana

S. aureus - -

C. albicans - -

E. coli 800 - 500 mg/mL +

P. aeruginosa - -

(-) Não apresentou atividade antimicrobiana nas concentrações testadas; (+) Apresentou atividade antimicrobiana nas concentrações testadas.

5.6. Ensaios com os Aedes aegypti

5.6.1. Detecção de quitina no intestino médio de larvas de Aedes aegypti

A fim de detectar a presença de quitina no intestino médio das larvas de Aedes

aegypti foi utilizado o método químico qualitativo de Von Wisseling. Os resultados

confirmaram a presença de quitina no intestino médio de larvas destes insetos

(Tabela 6).

63

RESULTADOS


Tabela 6: Detecção de quitina em intestinos médios de Aedes aegypti

Teste de Von Wisseling Coloração marrom (lugol)

Coloraçao violeta (H2SO4)

Quitina de lagosta + +

Intestinos de Aedes aegypti

+ +

Algodão ND ND

(ND) não detectado; (+) detecção. Controle positivo: quitina de lagosta; Controle negativo: algodão

5.6.2. Ensaio larvicida em Aedes aegypti

Estes experimentos foram feitos com o intuito de analisar o efeito larvicida da

Litochitinase1 sobre larvas do quarto instar de A. aegypti. Cinco larvas (L4) foram

colocadas em recipientes plásticos descartáveis contendo alíquotas do EB, F-III e a

Litochitinase1, em concentrações crescentes, e seus respectivos controles

negativos, com volume final do ensaio de 20 mL. Os ensaios foram realizados em

quadruplicatas e a taxa de mortalidade das larvas foi determinada após 24 e 48 h de

incubação a 28 ± 2 ° C com fotoperíodo de 12/12 h (claro-escuro). Os resultados

obtidos apontam que todas as amostras testadas apresentaram atividade larvicida

contra A. aegypti de forma dose dependente, onde a Litochitinase1 revelou-se mais

eficiente do que as outras amostras testadas, tendo como valores de EC50 para 24

horas de ensaio 0,71 mg/mL e para 48 horas de 0,49 mg/mL. Para as outras frações

como EB o valor de EC50 foi de 6,59 mg/mL e para F-III a EC50 para 24 e 48 horas

foi de 5,36 e 3,22 respectivamente. No ensaio com o EB, no tempo de 48 horas,

todas as larvas morreram. As análises estatísticas realizadas por meio dos testes

ANOVA e Kruskal-wallis, mostraram significância entre os resultados destes quando

se utilizou o EB, FIII e a Litochitinase1 em diferentes concentrações, nos tempos de

24 e 48 horas, com p< 0,05. As larvas do grupo controle apresentaram grande

mobilidade, cuja locomoção foi percebida por meio das contrações do corpo,

reagindo rapidamente a qualquer toque. Os valores da EC50 estão sumarizados na

tabela 7.

64

RESULTADOS


Tabela 7: Concentração Efetiva do Extrato bruto, F-III e Litochitinase1 necessária para matar 50% (EC50) das larvas L4 de Aedes aegypti em 24 e 48 h.

Amostras EC/ Tempo (h)

EC50

/24h EC50

/48h

EB 6,59 mg/mL *

F-III 5,36 mg/mL 3,22 mg/mL

Litochitinase1 0,71 mg/mL 0,49 mg/mL

*Todas as larvas mortas. Onde EC: concentração letal de proteínas necessárias para matar 50% (EC) de larvas de A. aegypti L4 em 24 e 48 h.

5.6.3. Detecção de inibidores de proteases serínicas no EB, FIII e

Litochitinase1

Considerando que as enzimas digestivas de Aedes aegypti são proteases

serinicas e que inibidores destas enzimas poderiam comprometer o processo

digestório e o conseqüente desenvolvimento dessas larvas, foi verificada a presença

de inibidores de proteases. O EB, a F-III e a Litochitinase1, oriundas do cefalotórax

do camarão marinho Litopenaeus schmitti, foram submetidas à avaliação de

atividade inibitória sobre tripsina e quimotripsina. Os resultados confirmaram a

ausência de inibidores de proteinases serinicas em todas as amostras analisadas

(Tabela 8).

65

RESULTADOS


Tabela 8: Inibição de Proteases Serínicas

Enzimas Amostras Inibição

Tripsina

EB ND

FIII ND

Litochitinase1 ND

Quimotripsina

EB ND

FIII ND

Litochitinase1 ND

(ND) não detectado

5.6.4. Atividade hemaglutinante

Com o objetivo de avaliar a presença de lectinas nas amostras do cefalotórax

do camarão aliquotas do EB, F-III e Litochitinase1, foram submetidas a ensaios de

hemaglutinações com eritrócitos do sistema ABO tratados ou não com enzimas,

visando elucidar qual tipo sanguíneo apresentaria maior título de hemaglutinação e

qual tratamento enzimático se apresentaria mais eficiente na exposição de

carboidratos na superfície das células. Os resultados obtidos não apontaram a

presença de atividade hemaglutinante em nenhuma das frações testadas tanto com

eritrócitos sem tratamento nem com os tratados. No entanto a F-III apresentou um

leve potencial hemolítico em todos os tipos sanguíneos não tratados ou tratados

(Tabela 9).

66

RESULTADOS


Tabela 9: Atividade hemaglutinante no extrato bruto, F-III e Litochitinase1

com eritrócitos nativos e tratados enzimaticamente

SISTEMA ABO FRAÇÕES PROTEÍCAS (UH)*

Sem tratamento EB F-III Litochitinase1

A ND hemólise ND

B ND hemólise ND

O ND hemólise ND

Tratamento com tripsina

A ND hemólise ND

B ND hemólise ND

O ND hemólise ND

Tratamento com papaína

A ND hemólise ND

B ND hemólise ND

O ND hemólise ND

*UH: Unidade de hemaglutinação; (ND) não- detectado

5.6.5. Determinação da temperatura ótima das atividades proteolíticas

presentes no homogenato intestinal das larvas de A. aegypti

Para analisar a temperatura ótima de atividade das enzimas proteolíticas no

homogenato intestinal das larvas de A.aegypti, as mesmas foram incubadas com o

substrato azocaseína 1,5% em diferentes temperaturas. As enzimas presentes nos

homogenatos intestinais foram ativas na faixa de temperatura de 10 a 60°C (Figura

16). Sendo assim a temperatura do ensaio realizado para analisar se as enzimas

digestivas dos insetos inibiriam a atividade da Litochitinase1 poderia ser feita na

temperatura ótima desta que é de 55°C.

67

RESULTADOS


Figura 16: Curva de temperatura ótima para a detecção da atividade das enzimas proteolíticas presentes no homogenato intestinal de larvas de A.aegypti. Alíquotas de 50 µL de homogenato intestinal foram utilizadas nos ensaios

5.6.6. Influência das enzimas digestivas do A. aegypti sobre a Litochitinase1

Com o intuito de avaliar se as enzimas digestivas do A. aegypti teriam algum

efeito inibitório ou degradativo sobre a atividade da Litochitinase1, foi realizado um

ensaio por meio da pré-incubação de 50 µl (4,05 µg) desta enzima na presença do

homogenato intestinal do inseto, na temperatura ótima da enzima, por 15 minutos.

Após a pré-incubação, o substrato foi adicionado e incubado na temperatura ótima

da enzima, durante 2 horas. Transcorrido o tempo de ensaio a reação foi

interrompida e quantificada a 405 nm em espectrofotômetro. Controles da enzima

pré-incubada e não-incubada foram feitos. De acordo com o gráfico da figura 17, a

Litochitinase1 apresentou atividade inalterada na presença do homogenato intestinal

do A. aegypti.

68

RESULTADOS


Figura 17: Efeito da pré-incubação com as enzimas digestivas de A.aegypti na atividade da Litochitinase1. 50 µl da Litochitinase1 foram pré-incubados durante 15 minutos com o homogenato intestinal, na ausência do substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado na concentração de 10 mM e incubado na temperatura ótima da enzima durante 2 h. Em seguida as reações foram interrompidas como descrito na metodologia. Onde: CNI- Controle da Litochitinase1 não pré-incubado; CI- Controle da Litochitinase1 pré-incubado sem enzimas do homogenato e EHI- Litochitinase1 pré-incubada com enzimas do homogenato intestinal.

70

DISCUSSÃO


6. DISCUSSÃO

Em 2003, a produção mundial de camarão foi de 4.630.000 toneladas sendo

que 1.630.000 t (35,21% do total) foram produzidas por cultivo (REVISTA

PANORAMA DA AQÜICULTURA, 2004). No Brasil, a pesca extrativa marinha

produziu 35.451,5 toneladas de camarão em 2007 (ESTATÍSTICA DA PESCA,

2007). A carcinicultura, após um pico de produção de 90.190 t em 2003, manteve

uma produção de 65.000 t anuais de camarão no período de 2005 a 2007 (ROCHA,

2008). O processamento de cerca de 100.000 t anuais de camarão no Brasil gera

uma enorme quantidade de rejeitos, principalmente durante a etapa de retirada da

casca e do cefalotórax (GOMES et al., 2010).

Algumas das propostas para eliminar este resíduo da indústria pesqueira

incluem a elaboração de farinha de casca de camarão (para a utilização em

alimentos) e o aproveitamento da quitina para diversos usos, como na produção de

catalisadores, em complementos alimentares para redução do colesterol e controle

do peso (SHAHIDI et al., 1999; KIM; RAJAPAKSE, 2005) ou como agente

imobilizador de enzimas e microorganismos (PALLA et al., 2011). A transformação

dos rejeitos da indústria de processamento do camarão em quitosanas ou

quitinooligossacarídeos com massas molares médias e níveis de desacetilação

controlados seria uma alternativa viável, gerando produtos com alto valor agregado

para usos biotecnológicos (GOMES et al., 2010).

Dentre as principais tecnologias que surgiram desde a década de 70, a

biotecnologia tem atraído maior atenção por ter se revelado capaz de gerar enorme

riqueza e influência em cada setor da economia com destaque para a saúde,

produção e processamento de alimentos, agricultura, proteção ambiental e produção

de materiais (GAVRILESCU; CHISTI, 2005).

A indústria de enzimas é resultado de um desenvolvimento rápido, alcançado

nas últimas quatro décadas, graças à evolução da biotecnologia moderna. O

desenvolvimento dos processos de purificação e fermentação, ocorrido durante a

última metade do século passado, permitiu a produção de enzimas mais puras, bem

caracterizadas e em larga escala (KIRK, 2002). O mercado mundial de enzimas

movimentou em 2007 cerca de 2,3 bilhões de dólares e espera-se para 2012 um

movimento superior a 2,7 bilhões, com um aumento anual de 4% (THAKORE, 2008).

71

DISCUSSÃO


As enzimas quitinolíticas apresentam inúmeras aplicações biotecnológicas no

ramo da indústria e agricultura. As quitinases podem ser utilizadas no controle de

fungos patógenos de plantas e insetos, como ainda na produção de

quitinooligossacarídeos biologicamente ativos (PATIL, et al,2000).

O objetivo principal deste trabalho foi estudar uma quitinase purificada e

extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti, porção esta

normalmente descartada sem qualquer tipo de aproveitamento tecnológico

(FOGAÇA; LEGAT, 2009) e avaliar sua aplicabilidade biotecnológica como agente

microbicida e larvicida.

Os resultados iniciais utilizando os p-nitrofrofenís derivados de açúcar como

substrato mostraram a presença de quase todas as atividades enzimáticas

pesquisadas no EB, F-I, F-II e F-III. Estes não foram tão surpreendentes, pois

extratos enzimáticos nos primeiros passos de purificação geralmente são ricos em

diversas atividades glicosidásicas e sulfatásicas. Fato este já observado nos extratos

dos celenterados Palythae coribaerum (SOUZA, 2003); Palythoa voriabitis

(FERREIRA, 2003); no molusco Aplysia cervina (MATTA; ABREU, 2005);

Echinometra lucunter (LIMA, 2006) e no microcrustáceo Artemia franciscana

(NASCIMENTO, 2008). As possíveis funções dessas enzimas seriam a degradação

de carboidratos complexos, como polissacarídeos e glicosaminoglicanos (KRESSE;

GROSSI, 1987; STAM et al., 2005). De todas as frações testadas com os substratos

sintéticos derivados de açúcar a F-III apresentou maior atividade específica,

ressaltando que nesta fração a atividade quitinásica se sobressai das demais.

Resultados semelhantes foram encontrados no molusco Chiton sp. (VIEIRA, 2002),

Strombus goliath (ARAÚJO, 2002), Paliythoa caribaeorum (SOUZA, 2003) e no

Echinoderma marinho Echinometra lucunter (LIMA, 2006) onde a enzima que

apresentou atividade quitinolítica também mostrou maior atividade específica nas

frações protéicas extraídas destes animais.

Para a obtenção de quitinases purificadas, diferentes métodos são utilizados

tais como, precipitação com sulfato de amônio (IKE et al., 2006), cromatografia de

interação hidrofóbica (DUO-CHAN, 2005), cromatografia de troca iônica (IKE et al.,

2006), cromatografia de afinidade a quitina (KIM et al., 2007) dentre outras. Para

uma purificação total geralmente se faz necessário a utilização de mais de um dos

métodos acima. Para a purificação da quitinase extraída do cefalotórax do camarão

marinho Litopenaeus Schmitti combinou-se cromatografia de troca iônica e exclusão

72

DISCUSSÃO


molecular S-200, onde foi obtida a enzima purificada 987,32 vezes com um

rendimento de 2,62 %. Este baixo rendimento pode ter sido causado pela perda de

atividade enzimática ao longo do processo de purificação. Acredita-se que, por

serem glicoproteínas, estas enzimas possam perder sua porção carboidrática ao

longo do processo de purificação, o que compromete sua atividade (PASTORE,

2003). A enzima assim purificada recebeu o nome de Litochitinase1.

Resultados de purificações elevadas foram encontrados na literatura com N-

acetilhexosaminidases como é o caso de SOUZA (2003) e GOMES-JÚNIOR (2010)

que obtiveram alto grau de purificação, 4826 vezes e 2232 vezes, respectivamente.

Para avaliar o grau de pureza e determinar a massa molecular aproximada da

Litochitinase1 uma eletroforese em gel de poliacrilamida em condições

desnaturantes revelou que esta possui uma banda protéica com o peso de 28,5 kDa.

Em geral a literatura traz exemplos de quitinases com massas moleculares variando

em uma ampla faixa que vai de 40 a 240 kDa (PETERS et al., 1998; CIFALI; DIAS

FILHO, 1999; AMUTHA, 1999), porém recentemente foi descrito por GOMES et al .

2010 duas quitinases com peso molecular de 24 e 30 kDa extraída de Vitis vinífera e

ainda L. KOPPARAPU et al. (2011) descreveram uma quitinase extraída de Punica

granatum cujo peso molecular é de 29 kDa, peso este bem próximo ao encontrado

no gel de SDS–PAGE apresentado neste trabalho.

O valor de Km aparente de 0,51 mM encontrado demonstra que essa enzima

possui grande afinidade por seu substrato e que sua hidrólise obedeceu à cinética

de Michaelis-Menten. O valor de Km obtido não diferiu significativamente de alguns

valores encontrados em outros trabalhos, como no caso da quitinase de Pennahia

argentatus onde foi observado um Km de 0,52 mM (IKEDA et al., 2009) e da

quitinase de Hexagrammos otakii (MATSUMIYA et al., 2006) que apresentou um Km

de 0,494 mM. Entretanto, muitos estudos encontraram valores de Km mais elevados

como no caso da quitinase de ovos de Halocynthia roretzi (MATSUURA et al., 1993)

que apresentou Km de 1,2 mM, e quitinase do vírus Autographa californica (DI MARO

et al., 2010) onde se observou um Km de 3,5 mM.

A temperatura ótima observada para a Litochitinase1, após duas horas de

ensaio a diferentes temperaturas, foi de 55°C. Essa atividade decai em temperaturas

abaixo e acima deste ponto, podendo indicar desnaturação proteíca. Estudos

cinéticos realizados com exoquitinases de diversas outras fontes demonstraram para

esse tipo de glicosidase temperaturas estáveis entre 37 e 50°C (TSUJIBO et al.,

73

DISCUSSÃO


1995; MATSUO et al., 1999; KAMEI et al., 1999; ARAÚJO, 2002; VIEIRA, 2002).

Recentemente KOPPARAPU et al. (2011) relataram uma temperatura ótima de 70°C

para a quitinase extraída da romã (Punica granatum). Outras quitinases purificadas

de uva, tamarindo, abacaxi, látex de Ficus microcarpa e do camarão Penaeus

monodon apresentaram temperaturas ótimas de 40, 45, 60 e 55°C, respectivamente

(ANO et al., 2003; TAIRA et al., 2005a, 2005b; RAO; GOWDA, 2008;

PROESPRAIWONG et al., 2010). Temperaturas estas, muito próximas a

temperatura ótima da quitinase estudada neste trabalho.

A pré-incubação da enzima por 30 minutos a várias temperaturas revelou que

a Litochitinase1 é estável de 25 a 60° C. Entre 50 e 55° C sofre uma leve ativação

aumentando em aproximadamente 20% sua atividade de catálise do substrato. Isto

indica que a Litochitinase1, ao ser submetida a estas temperaturas, de alguma

maneira elas afetam positivamente sua atuação sobre o substrato. Temperaturas

acima de 60ºC as inativaram rapidamente. Recentemente, PATEL et al., (2010),

isolaram uma quitinase do látex de Ipomoea carnea que apresentou estabilidade até

a temperatura de 80ºC. Uma estabilidade relativa até a temperatura de 40ºC foi

observada em uma quitinase recombinante, purificada do camarão tigre negro

(Penaeus monodon) (PROESPRAIWONG et al., 2010).

O pH ótimo encontrado para a hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-β-D-

glucosaminídeo foi entre os pH 5,0 e 6,0. Em pH 4,0 e 8,0 a atividade da enzima cai

consideravelmente. Uma quitinase purificada do vírus Autographa californica (DI

MARO et al., 2010) mostrou estabilidade em pH que variava de 5,0 a 7,0, resultado

este semelhante ao encontrado para a enzima aqui estudada. Da mesma forma

CHEN et al., (2011), purificou uma enzima presente no látex do mamão que

apresentava atividade ótima no pH 5,0 e PATEL et al., (2010), purificaram uma

quitinase do látex da Ipomoea carnea que apresentou atividade máxima no pH 5,5.

A Litochitinase1 não é estável em pHs muito ácidos e muito básicos, perdendo

completamente as suas atividades. Isso possivelmente é devido ao fato de que

nesses pHs a enzima perde sua conformação nativa, devido a mudanças no estado

de ionização das cadeias laterais dos aminoácidos localizados no sitio ativo desta,

alterando assim a distribuição de cargas, interferindo de sobremaneira na estrutura

da proteína e na atividade enzimática. A estabilidade da enzima é atingida numa

faixa de pH entre 4,0 – 5,5, embora apresente um pico de atividade no pH 7,0.

74

DISCUSSÃO


O efeito de vários sais e EDTA sobre a hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-β-D-

glucosaminídeo pela Litochitinase1 foi estudado. A enzima apresentou sua atividade

levemente reduzida na presença do Na2HPO4 (5%). Por outro lado, os sais KCl,

HgCl2, NaH2PO4, e NaCl afetaram de forma expressiva a atividade enzimática,

reduzindo sua atividade em 28, 98, 40 e 30%, respectivamente. O MgCl2 estimulou

só levemente (~8%) a atividade da Litochitinase1, porém concentrações mais

elevadas do sal, possam estimular ainda mais a enzima. CaCl2, Na2SO4, EDTA e o

NaC6H5O7 não interferiram na atividade da enzima. O efeito de sais (íons) e

compostos é amplamente variável, dependendo da enzima em estudo. O efeito

inibitório observado com a adição de HgCl2 (íon Hg2+ ) é geralmente observado

em outras glicosidases (CHEN et al., 1994; WEI et al., 1996; NAKANO et al., 1998;

RIOU et al., 1998; HAYASHI et al., 1999; LUCAS et al., 2000; YAZDI et al., 2003;

ZANOELO et al., 2004; LI et al., 2005). O íon Hg2+ é reconhecido agente oxidante de

grupos sulfidril (-SH), e a inibição provocada por este íon pode indicar o

envolvimento de importantes grupos sulfidril no sítio catalítico da enzima (PAINBENI

et al., 1992; GUEGUEN et al., 1995a, 1997b; WEI et al., 1996; NAKANO et al., 1998;

OH et al., 1999). No entanto, a inibição observada na presença de Hg2+ pode não

estar apenas relacionada à ligação deste íon com grupos sulfidril, mas também à

interação deste íon com resíduos de triptofano e/ou grupamentos carboxil em

aminoácidos da enzima (LUSTERIO et al., 1992).

O EDTA, reagente com a capacidade de quelar íons metálicos, é empregado

em diversos testes bioquímicos visando, entre outros, diminuir a ação de

metaloproteinases em extratos brutos. Entretanto, o EDTA pode tornar-se

problemático caso as enzimas dependam de íons como o Ca+2 (MATEO; DI

STEFANO, 1997). Nas concentrações utilizadas, este reagente não apresentou

efeito sobre a atividade da Litochitinase1, desta forma estes estudos sugerem que a

não interferência do EDTA indica que a catálise não é dependente de íons Ca+2,

similarmente a outros estudos, sugerindo que a enzima não requer co-fatores

metálicos (DRIDER et al., 1993; GUEGUEN et al., 1995a; NAKANO et al., 1998;

RIOU et al., 1998; YAN et al., 1998; KIMURA et al., 1999; OH et al., 1999;

ZANOELO et al., 2004; LI et al., 2005; FERREIRA, 2010).

A literatura a respeito da ação antifúngica e antibacteriana de produtos

naturais é escassa, sendo que a maioria dos estudos verifica seu potencial como

antiinflamatórios e produtos dermatológicos. Produtos naturais como substâncias

75

DISCUSSÃO


antimicóticas e bactericidas derivados de origem protéica não são muito estudados.

A maioria das substâncias empregadas como agentes microbicidas são de origem

vegetal, e já foi demonstrado, por exemplo, o efeito antifúngico de plantas como

estragão e tomilho (DUKE, 1985; BRANTNER et al., 1996), de substancias como o

própolis (NOSTRO et al., 2006; PONTIN et al., 2008), ação antibacteriana do

Anacardiun occidentale (cajueiro) que foi estudado mostrando-se efetivo para

bactérias gram-positivas e gram-negativas (KUDI, 1999) e a atividade

antimicrobiana do extrato bruto da folha de Baccharis dracunculifolia (DA

SILVA FILHO et al., 2008).

No presente estudo, testes microbiológicos utilizando a quitinase purificada

foram realizados e os resultados obtidos pela técnica de difusão em disco, para as

cepas testadas de S. aureus, as leveduras C. tropicalis e C. albicans não

apresentaram halos de inibição, logo, a Litochitinase1 não foi capaz de inibir o

crescimento desses microorganismos, isto pode ser atribuído a dificuldades na

padronização e comparação de técnicas de difusão em disco, devido à interferência

das características de algumas amostras na capacidade de difusão (SILVEIRA et

al., 2009), pois em se tratando de avaliação de produtos naturais RIBEIRO;

SOARES (2000) afirmam que as características de solubilidade do material em teste

interferem na difusão do mesmo no meio de cultura.

Diferente dos resultados obtidos neste estudo, já é relatado na literatura à

ação de quitinases extraídas do amedoim e do microorganismo Trichoderma

harzianum contra bactérias gram-positivas como S. aureus (WANG et al., 2007; LIN

et al., 2009). Várias enzimas têm sido estudadas como agentes antifúngicos em

potencial. A ação fungicida deve-se principalmente à hidrólise dos componentes da

parede celular (FLEURI; SATO, 2007). Porém a maioria dos estudos relacionados à

ação de quitinases como agentes antifúngicos é aplicada em fungos fitopatogênicos

como revela estudos desenvolvidos por YE; NG (2005), WANG (2007), FLEURI;

SATO (2008) e LAM; NG (2010).

Para os resultados de microdiluição em caldo dentre as quatro cepas testadas,

a Litochitinase1 não apresentou atividade antimicrobiana para S. aureus, C. albicans

e P. aeruginosa. Estudos realizados com quitinases de outras fontes como a da

planta Brassica Junceae se mostraram ativas contra estes microorganismos (GUAN

et al., 2008). No entanto a Litochitinase1 apresentou-se efetiva contra o

microorganismo E. coli, inibindo-o partindo de uma concentração inicial de 800

76

DISCUSSÃO


µg/mL, concentração bem inferior a de outros trabalhos que utilizaram a mesma

cepa e o mesmo teste de microdiluição, como mostrado no estudo de

CHOWDHURY (2008) onde uma proteína extraída da Solanum villosum consegue

efeito bactericida contra E. coli partindo de uma concentração de 1800 µg/mL.

Escherichia coli é a espécie predominante entre os diversos microrganismos

anaeróbios facultativos e comumente encontrada na microbiota normal no trato

gastrointestinal humano (GILL et al., 2006) e outros vertebrados, com o qual

geralmente estabelece associações comensais. Esse microrganismo pertence à

família Enterobacteriaceae e entre suas principais características destacam-se:

bacilos gram-negativos, não esporulados capazes de fermentar glicose com

produção de ácido e gás (FRANCO; LANDGRAF, 2003).

Seres humanos saudáveis tipicamente, têm mais de um bilhão de células de

E. coli no intestino. Estima-se que metade das células vivas de E. coli estão fora do

seu hospedeiro, em seu habitat secundário (SAVAGEAU, 1983). Além destes

habitats, algumas estirpes têm o potencial de causar um amplo espectro de

doenças intestinais e extra-intestinais, como infecção do trato urinário, septicemia,

meningite e pneumonia em humanos e animais (DONNENBERG, 2002) e como

também aumento da inflamação da mucosa gástrica em pacientes com doença de

Crohn (BARNICH et al., 2010). Com a sua vasta gama de patologias, a E. coli é uma

das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, causando a

cada ano mais de dois milhões de mortes por diarréia infantil (BISSON et al., 2002;

RODRÍGUEZ-BAÑO et al., 2006) e infecções extra-intestinais (principalmente

septicemia derivados de infecção urinária) e também é responsável por

aproximadamente 150 milhões de casos de cistite simples (DU et al., 2002).

Durante a última década, tem havido um marcado aumento nas infecções por

E. coli resistentes a antibióticos, tais como: Fluoroquinolona. Esta crescente

resistência limita as opções de tratamento e podem afetar o prognóstico da doença

(LAUTENBACH et al., 2001), como também ocorrer o uso inadequado de

antimicrobianos ocasionando atrasos na terapia correta. O aumento da resistencia

bacteriana, justifica a necessidade urgente por novos agentes antibióticos que atuem

por mecanismos de ação diferentes dos fármacos em uso (PAYNE et al., 2007;

COATES; HU, 2007).

77

DISCUSSÃO


As novas estratégias da pesquisa em produtos naturais, envolvendo a busca

de substâncias pouco exploradas para o acesso da descoberta de novos antibióticos

extremamente importantes num cenário de rápido desenvolvimento de resistência

pelas bactérias aos agentes terapêuticos disponíveis, indica que a Litochitinase1

pode vir a ser utilizada como uma possível alternativa no combate das doenças

causadas pela E.coli.

A dengue é a mais importante e global arbovirose da atualidade, causando de

50-100 milhões de casos/ano em mais de 100 países (REGIS et al., 2008) e

submetendo 2,5 bilhões de pessoas ao risco de se infectarem, principalmente em

países tropicais e subtropicais onde as condições climáticas (temperatura e

umidade) são favoráveis a proliferação do mosquito transmissor, o Aedes aegypti

(POLANCZYK et al., 2003, SIMAS et al., 2004). Como não há vacina disponível para

prevenção, o controle da dengue tem sido limitada ao combate do vetor e centrado

na aplicação de inseticidas químicos (CARVALHO et al., 2004; LIMA et al., 2005a;

MACORIS et al., 2007; SILVA; MENDES, 2007), especialmente os organofosforados

e piretróides para os adultos e organofosforados para as larvas (LIMA et al., 2006).

Todavia, relatos de populações de insetos resistentes (RODRIGUES et al, 2001) a

esses inseticidas apontam para a necessidade de pesquisas que busquem novas

alternativas de controle, isentas de risco para a saúde humana e ao meio ambiente.

Não obstante os trabalhos realizados por COSTA et al. (2005); SILVA et al.

(2007); LUZ et al. (2008); MEDEIROS, (2007) e FERREIRA et al. (2009) utilizando

como fontes produtos naturais contra as larvas de Aedes nenhum utilizavam

quitinases. Por isso resolveu-se verificar o potencial larvicida da Litochitinase1.

Os ensaios in vivo apontam que todas as amostras testadas apresentaram

atividade contra larvas do quarto estádio de A. aegypti de forma dose dependente.

Essa atividade aumenta à medida que se utiliza material com maior grau de

purificação (EB: EC50 6,59 mg/mL, F-III: EC50 5,36, Litochitinase1: EC500,71 mg/mL)

sugerindo que a molécula responsável pela morte das larvas tenha sido a

Litochitinase1, e que, supostamente esta poderia estar atuando na quitina presente

no exoesqueleto e/ou na membrana peritrófica do inseto. A membrana peritrófica é

um revestido do intestino médio constituída por proteínas e quitina, cuja presença foi

confirmada pelo teste de Von Wisselingh, e vem sendo bastante estudada como alvo

para a ação de bioinseticidas (HARPER, HOPKINS; CZAPLA, 2001). A favor dessa

segunda hipótese verificamos a não degradação da Litochitinase1 pelas enzimas

78

DISCUSSÃO


digestivas de A. aegypti e, adicionalmente, a ausência de outras moléculas bioativas

que poderiam também interferir no processo digestório das larvas, como inibidores

de proteases serinicas e lectinas nas frações testadas, indicando mais uma vez que

a morte das larvas está ocorrendo por ação da Litochitinase1.

As enzimas digestivas de A. aegypti são proteases serinicas tipo tripsina e

quimotripsina (KUNZ, 1978). Ensaios com outros insetos mostram que a inibição

destas enzimas compromete o processo digestório e o consequente

desenvolvimento e/ou morte das larvas, por privação de nutrientes. A maioria dos

inibidores de proteases tem sido obtidos de fontes como órgãos de reservas de

plantas (XAVIER-FILHO, 1992; ARAÚJO et al., 2004), todavia trabalhos recentes na

literatura descrevem inibidores de proteinases serínicas em invertebrados marinhos

como no camarão Fenneropenaeus chinensis (KONG et al., 2009) e Penaeus

momodon (VISETNAN et al., 2009; DONPUDSA et al., 2010). .

Lectinas tem sido encontradas em quase todos os organismos, sendo

amplamente distribuídas entre vegetais, vírus, bactérias, mamíferos e vários grupos

de invetebrados (GERLACH et al., 2005) como por exemplo: nos camarões Penaeus

paulensis (MARQUES; BARRACO, 2000), Penaeus monodon (LUO et al., 2005) e

Penaeus japonicus (YANG et al., 2007). As lectinas ligantes de N-

acetilglucosamina, oriundas das plantas Moringa Oleifera (COELHO et al., 2009) e

Myracroduom urundeuva (SÁ et al., 2009) mostraram atividade larvicida contra

Aedes aegypti.

Mesmo diante da necessidade de estudos complementares que esclareçam o

mecanismo pelo qual a quitinase provoca a morte de larvas de A. aegypti, e

comprovem a ausência de efeitos deletérios ambientais e sanitários, percebe-se o

potencial dessas moléculas para serem utilizadas como ferramentas auxiliares no

controle do vetor transmissor da dengue.

79

CONCLUSÃO


7. CONCLUSÃO

• Pôde-se observar a presença de atividades glicosidásicas e sulfatásicas nos

extratos enzimáticos obtidos do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus

schmitti;

• A fração F-III (50-80%) apresentou maior atividade quitinolítica;

• A Litochitinase1 foi purificada na ordem de 987,32 vezes e com recuperação de

2,62% apresentando massa molecular de aproximadamente 28,5 kDa;

• A temperatura ótima para a catálise do substrato sintético pela Litochitinase1 é

de 55°C e elevada estabilidade térmica permanecendo com 100% de sua

atividade quando pré-incubada nas temperaturas de 25, 37 e 45°C e

apresentando aumento desta nas temperaturas de 50 e 55°C;

• A atividade ótima para atuação da Litochitinase1 ocorre em uma faixa de pH,

entre 5,0 e 6,0, com faixa de estabilidade nos pHs 4,0 a 5,5;

• O HgCl2 na concentração de 10mM inibe significativamente a Litochitinase1

enquanto que o MgCl2 na mesma molaridade potencializa sua atividade;

• A Litochitinase1 apresentou constante de Michaelis-Menten (Km) de 0,51 mM,

indicando que a enzima possui alta afinidade pelo substrato quando comparadas

com dados da literatura;

• A Litochitinase1 demonstrou potencial microbicida contra a bactéria gram-

negativa E. coli demonstrado pela inibição de seu crescimento, avaliado pelo

método de microdiluição em caldo, podendo ser utilizada no combate de

infecções causadas por este patógeno ;

• A Litochitinase1 apresentou atividade larvicida contra larvas de Aedes aegypti de

maneira dose dependente e, de acordo com os outros resultados obtidos como:

ausência de proteínas contaminantes como inibidores de proteinases serínicas e

lectinas, esta atividade se confirma indicando-a para ser usada como alternativa

de controle eficaz na redução da infestação pelo mosquito vetor.

80

CONCLUSÃO


• No Brasil, a carcinicultura marinha é uma das atividades agroindustriais mais

atrativas economicamente, concentrando 93% de sua produção no Nordeste. No

entanto, durante o processamento do camarão, cerca de 50% do peso do animal

resulta em subproduto (cefalotórax, segmentos abdominais e carapaças),

descartado sem qualquer tipo de aproveitamento tecnológico (FOGAÇA; LEGAT,

2009). Diante de tal fato, a utilização dos cefalotórax para extração de enzimas

com enormes aplicabilidades, constitui-se numa via alternativa de

aproveitamento destes resíduos.

81

REFERÊNCIAS


REFERENCIAS

ABRAM, A. P.; HIGUERA, I. Em Quitina y quitosano: obtencion, caracterizacion y aplicaciones;. ed.; Programa Cyted 2004, - Pontificia Universidad Catolica Del Peru/Fondo Editorial: Lima, 2004, cap 1.

ALLARDYCE, B. J; LINTON, S. M; SABOROWSKI, REINHARD. The last piece in the cellulase puzzle: the characterisation of β-glucosidase from the herbivorous gecarcinid land crab Gecarcoidea natalis. The Journal of Experimental Biology. v, 213. p, 2950-2957, 2010.

AMUTHA, B.; KHIRE, J. M.; KHAN, M. I. Active site characterization of the exo-N acetyl-β-D-glucosaminidase from thermotolerant Bacillus sp. NCIM 5120: involvement of tryptophan, histidine and carboxylate residues in catalytic activity. Biochimica et Biophysica Acta BBA-General Subjects, v. 1427, p.121-132, 1999.

ARAÚJO, C. L..; BEZERRA, I. W.L.; DANTAS, I. W. L; LIMA, T. V. S; OLIVEIRA, A. S.; MIRANDA, M. R. A; LEITE, E. L.; SALES, M. P. Biological activity of proteins from pulps of tropical fruits. Food Chemistry. V. 85, p. 107-110, 2004.

ARAÚJO, C. M. D. B. Purificação e caracterização parcial de uma ββββ-N acetilglucosaminidase extraída do molusco Strombus goliath. Dissertação de Mestrado em bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte- RN, 2002.

ARO, N.; PAKULA, T.; PENTTILA, M. Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi. FEMS Microbiology Reviews, Oxford, v. 29, p. 719-739, 2005.

ASSIS, A. S.; STAMFORD, T. C. M.; STAMFORD, T. L. M. Bioconversão de Resíduos de camarão Litopenaeus vannamei (Bonner, 1931) para produção de Biofilme de Quitosana. Revista Iberoamericana de Polímeros, v. 9, p. 480-499, 2008.

BARBOZA-CORONA. J. E; MAZZOCCO, E. N; VELAZQUEZ-ROBLEDO, R; HERNANDEZ, RUBE´N SALCEDO-; BAUTISTA, M; JIMENEZ, B; IBARRA, J. E. Cloning, Sequencing, and Expression of the Chitinase Gene chiA74from Bacillus thuringiensis. APPLIED ANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY. p. 1023–1029, 2003. BARNICH, N; DENIZOT, J; DARFEUILLE-MICHAUD, A. E. coli-mediated gut inflammation in genetically predisposed Crohn’s disease Patients. Pathologie Biologie. 2010. BAUER, A.W., KIRB, W.M.M., SHERRIS, J.C. Antibiotics susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Pathology, v.19, p.493 496, 1966.

BELANCIC, A.; GUNATA, Z.; VALLIER, M. J.; AGOSIN E. β-glucosidase from the native yeast Debaryomyces vanrijiae: purification, characterization, and its effect on

82

REFERÊNCIAS


monoterpene content of a Muscat grape juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 51, p. 1453-1459, 2003.

BHATIA, Y., MISHRA, S., BISARIA, V. S. Microbial β-glucosidases: Cloning, properties and applications. Critical Reviews in Biotechnology, Philadelphia; v. 22, p. 375-407, 2002.

BISHOP, J. G.; DEAN; A. M.; MITCHELL-OLDS, T. Rapid evolution in plant chitinases: Molecular targets of selection in plant-pathogen coevolution. PNAS. V. 97, p. 5322–5327, 2000. BISSON, G; FISHMAN, NO; PATEL, JB. Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species: risk factors for colonization and impact of antimicrobial formulary interventions on colonization prevalence. Infect Control Hosp Epidemiol. v. 23, p. 254-60, 2002. BOOT, R.G; BLOMMAART, E. F. C.; SWART, E.;GHAUHARALI-VAN DER VLUGT, K; BIJL, N.; MOE, C.; PLACE, A.; AERTS, J. M. F. G. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. The Journal of Biological Chemisty. V. 276, p. 6770-6778, 2001. BRANTNER, A; MALES, Z; PEPELJNJAK, S; ANTOLIC, A. Antimicrobial activity of Paliurus spina-christi Mill. Journal of Ethonpharm. V. 52, p. 119-122, 1996.

CAMERON, R. G.; MANTHEY, J. A.; BAKER, R. A.; GROHMANN K. Purification and characterization of a beta-glucosidase from Citrus sinensis var. Valencia fruit tissue. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 49, p. 4457-4462, 2001.

CAMPANA FILHO, S. P.; BRITTO, D.; CURTI, E.; ABREU, F. R.; CARDOSO, M. B.; BATTISTI, M. V.; SIM, P. C.; GOY, R. C.; SIGNINI, R.; LAVALL, R. L. Extração, estruturas e propriedades de αααα- e ββββ- quitina. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040422007000300026&script=sci_a ttext&tlng=pt> Acesso em: 28.Out.2008.

CARVALHO, M. S. L.; CALDAS, E. D.; DEGALLIER, N.; VILARINHOS, P. T. R.; SOUZA, L. C. K. R.; YOSHIZAWA, M. A. C.; KNOX, M. B.; OLIVEIRA, C. Suscetibilidade de larvas de Aedes aegypti ao inseticida temefós no Distrito Federal. Revista de Saúde Pública, v.38(5). p, 623-629, 2004.

CHEN, H.; LI, X.; LJUNGDAHL, L. G. Isolation and properties of an extracellula β-glucosidase from the polycentric rumen fungus Orpinomyces sp. strain PC-2 Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 60, p. 64-70, 1994. CHEN, J; TANG, B; CHEN, H; YAO, Q; HUANG, X; CHEN, J; ZHANG, D; ZHANG, W. Different Functions of the Insect Soluble and Membrane- Bound Trehalase Genes in Chitin Biosynthesis Revealed by RNA Interference. PLoS ONE. v. 5, p. 10133, 2010,

83

REFERÊNCIAS


CHEN, L; CHUNG, Y. C; CHANG, YA-M; CHANG, CHEN-T. Characterisation of a b N-acetylhexosaminidase from a commercial papaya latex preparation. Food Chemistry. v. 124, p. 1404–1410, 2011. CHOTIA,C. AND LESK,A.M. The relation between the divergence of sequence and structure in proteins. EMBO J. v. 5, p. 823–826.1986. CHOWDHURY, NANDITA; LASKAR, SUBRATA; CHANDRA, GOUTAM. Mosquito larvicidal and antimicrobial activity of protein of Solanum villosum leaves. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 62, p.1-6, 2008.

CIFALI, A. P.; DIAS FILHO, B. P. Purification and partial chatacterization of N-acetyl-beta-D-glucosaminidase from Tritrichomonas foetus. Parasitol. Res, v. 85, p. 256-262, 1999.

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. v. 23, n. 2. 6 ed. Approved standard M7-A6. 2003. COATES, A. R. M; HU, Y. BR. J. Pharmacol, v. 152, p. 1147, 2007. COELHO, J. S; SANTOS, N. D.L; NAPOLEÃO, T. H; GOMES, F. S; FERREIRA, R. S; ZINGALI, R. B; COELHO, L. C.B.B; LEITE, S.P; NAVARRO, D. M.A.F; PAIVA, P. M.G. Effect of Moringa oleifera lectin on development and mortality of Aedes aegypti larvae. Chemosphere. v. 77, p. 934–938, 2009.

COELHO, P. A.; SANTOS, M. C.F. Ciclo biologico de Penaeus schmitti em Pernambuco (Crustacea, Decápoda, Penaeidae). Bol. Tecn. Cient.. CEPENE, Rio Formoso, v. 2, p. 35-50, 1994.

COHEN-KUPIEC, R; CHET, I. The molecular biology of chitin digestion. Currrent Opinion in Biotechnology. v. 9, p, 270-277, 1998. COLLINGE, D. B; KRAGH, K. M; MIKKELSEN, J. D; NIELSEN, K. K.; RASMUSSEN, U. & VAD, K. Plant chitinases. The Plant Jounal v. 3, p. 31–40, 1993. COSTA, J. G. M.; RODRIGUES, F. F. G. ANGÉLICO, E. C., SILVA, M. R. MOTA, M. L. SANTOS, N. K. A.; CARDOSO, A. L. H.; LEMOS, T. L. G. Estudo químico-biológico dos óleos essenciais de Hyptis martiusii, Lippia sidoides e Syzigium aromaticum frente às larvas do Aedes aegypti. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15(4), p.304-309, 2005.

COULON, S.; CHEMARDIN, P.; GUEGUEN, Y.; ARNAUD, A.; GALZY, P. Purification and characterization of an intracellular β-glucosidase from Lactobacillus casei ATCC 393. Applied Biochemistry and Biotechnology, Totowa, v. 74, p. 105-114, 1998.

84

REFERÊNCIAS


COUTINHO, P. M; HENRISSAT, B. Carbohydrate-active enzymes: na integrated database approach. In Gilbert, H.J., Davies, g., Henrissat, B. and Svensson, B. (eds), Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, p, 3-12, 1999.

DA SILVA FILHO, A.A.; SOUSA, J.P.B.; SOARES, S. Antimicrobial activity of the extract and isolated compounds from Baccharis dracunculifolia D. C. (Asteraceae). Journal of Biosciences, v.63 p.40-46, 2008.

DALL, W.; HILL, B.; ROTHLISBERG, P .C.; SHARPLES, D . J. The biology of Penaeidae. Advances in Marine Biology, Academic Press, London. v. 27, p. 489, 1990.

DAVIES, G.; HENRISSAT, B. Structures and mechanisms of glycosyl Hydrolases. Structure. v. 3, p.853-859, 1995. DAY, A. J.; DUPONT, M. S.; RIDLEY, S.; RHODES, M.; RHODES, M. J. C.; MORGAN, M. R. A.; WILLIAMSON, G. Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides by human small intestine and liver β-glucosidase activity. FEBS Letters, Amsterdam, v. 436, p. 71-75. 1998. DE MARCO,J.L; LIMA, L. H. C; SOUSA, M. V; FELIX, C. R.A. Trichoderma harzianum chitinase destroys the cell wall of the phytopathogen Crinipellis the causal agent of witches beoom disease of cocoa. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v. 16, p. 383-386, 2000. DI MARO, A; TERRACCIANO, I; STICCO, L; FIANDRA, L; RUOCCO, M; CORRADO, G; PARENTE, A; RAO, R. Purification and characterization of a viral chitinase active against plant pathogens and herbivores from transgenic tobacco. Journal of Biotechnology. v. 147, p. 1–6, 2010. DONNENBERG, MS. Escherichia coli Virulence mechanisms of a versatile pathogen. Baltimore: Academic press, Elsevier Science, 2002. DONNELLY, L. E.; BARNES, P. J. Acidic mammalian chitinase – a potencial target ashma therapy . Trends in pharmacological Sciences. v. 25, p. 509 511, 2004. DONPUDSA, S; PONPRATEEP, S; PRAPAVORARAT, A; VISETNAN, S; TASSANAKAJON, A; RIMPHANITCHAYAKIT, V. A Kazal-type serine proteinase inhibitor SPIPm2 from the black tiger shrimp Penaeus monodon is involved in antiviral responses. Developmental and Comparative Immunology. v. 34, p.1101 1108, 2010. DRIDER, D. et al. Isolation and characterization of the exocellular β-glucosidase of Candida cacaoi: possible use in carbohydrates degradation. LWT – Food Science and Technology, Amsterdam, v. 26, p. 198-204, 1993.

85

REFERÊNCIAS


DUMONT, A. F. β β β β-glicosidases intestinais da larva de Diatrea saccharalis: clonagem e seqüenciamento dos cDNA, expressões e algumas propriedades.Dissertação de Mestrado em Ciências Bioquímicas – Universidade de São Paulo – SP, 2008.

DUO-CHUAN, L. Review of fungal chitinases. Mycopathologia, v. 60, p.161:345, 2006. DU, B; LONG, Y; LIU, H. Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae bloodstream infection: risk factors and clinical outcome. Intensive Care Med. v, 28. p, 1718-23, 2002.

ESTATÍSTICA DA PESCA, 2007, Brasil Grandes Regiões e Unidades da Federação, Brasília- DF, Dezembro 2007.

EWALD, J .J. Estúdios sobre la biologia del camarón blanco, Penaeus schmitti. Acta Cientifica Venezuelana, Venezuela. v. 3, p. 190-200, 1967.

FERREIRA, A. H. P; MARANA, S.; TERRA, W. R; FERREIRA, C. Purification, sequencing, and properties of a beta-glycosidase purified from midgut lúmen of Tenebrio molitor (Coleoptera) larvae. Insect Biochem. Molec. Biol. v. 31, p. 1065 1076, 2001.

FERREIRA, A. H. P; TERRA, W. R; FERREIRA, C. Characterization of a beta glycosidase higghly active on disaccharides and of a beta-galactosidase from Tenebrio molitor midgut lúmen, Insect Biochem. Molec. Biol. v. 33, p. 253-265, 2003.

FERREIRA, A. H. P; TORRES, B. B.; TERRA, W. R. Substrate specificities of midgut beta-glycosidases from insects insects of different orders. Comp. Biochem. Physiol. v. 119b, p. 219-225, 1998.

FERREIRA, H. J. PURIFICAÇÃO PARCIAL E ESTUDOS CINÉTICOS DE N-ACETIL-ββββ-D-GLUCOSAMINIDASES EXTRAÍDAS DO HEPATOPÂNCREAS DA LAGOSTA PANULIRUS ARGUS (LATREILLE, 1804). Monografia- Universidade Federal do Ri Grande do Norte- RN, 2010.

FERREIRA, P. A. Purificação parcial e caracterização de uma ββββ-N acetilglucosaminidase de Palythoa variabilis. Dissertação de Mestrado em bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte- RN, 2003.

FERREIRA, P.M.P., CARVALHO, A.F.U., FARIAS, D.F., CARIOLANO, N.G., MELO, V.M.M., QUEIROZ, M.G.R., MARTINS, A.M.C., MACHADO-NETO, J.G.,. Larvicidal activity of the water extract of Moringa oleifera seeds against Aedes aegypti and its toxicity upon laboratory animals. Anais Acad. Brasil. Ciên. v.81, p. 207–216, 2009.

FLEURI, L. F.; SATO, H. H. β-1,3 glucanase. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento, v. 37, p. 40-43, 2007.

86

REFERÊNCIAS


FLEURI, L. F; SATO, H. H. PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO, CLONAGEM E APLICAÇÃO DE ENZIMAS LÍTICAS. Quim. Nova, v. 28, p. 871-879, 2005.

FOGAÇA, F. H. S.; LEGAT, J. F. A. Ensilagem de resíduos do beneficiamento do camarão marinho. Sigera. Florianópolis, SC. 2009.

FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microrganismos Patogênicos de Importância em Alimentos In: FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, p. 33-81 , 2003.

GAMBA, A. L. & RODRIGUEZ, G. Migratory behavior of postlarval white, Penaeus schmitti, and river shrimps, Macrobrachium olfersi and Macrobrachium acanthurus in their zone of overlap in a tropical lagoon. Bulletin of Marine Science, v. 40, p. 454 463,1987.

GAVRILESCU, M. CHISTI, Y. Biotechnology a sustainable alternative for chemical industry. Review. Biotechnol. Adv., v. 23, p.471-499. 2005.

GERARDI, C.; BLANDO, F.; SANTINO, A.; ZACHEO, G. Purification and characterization of a β-glucosidase abundantly expressed in ripe sweet cherry (Prunus avium L.) fruit. Plant Science, Clare, v. 160, p. 795-805, 2001.

GERLACH, D; SCHLOTT, B. ZAHRINGER, V; SCHIMIDIT, K. N-acetil-D galactosamine/N-acetil-D-glucosamina-recognized lectin from the snail Cepaea hortensis: purification, chemical characterization, cloning and expression in E. coli. Immunology and Medicinal Microbiology, v. 43. p. 223-232, 2005.

GERMAIN, D. P. Gaucher’s disease: a paradigm for interventional genetics. Clinical Genetics, Oxford, v. 65, p. 77-86, 2004.

GILL, S. R., M. POP, R. T. DEBOY, P. B. ECKBURG, P. J. TURNBAUGH, B. S. SAMUEL, J. I. GORDON, D. A. RELMAN, C. M. FRASER-LIGGETT, AND K. E. NELSON. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. v. 312, p.1355–1359, 2006. GOMES - JÚNIOR, J. E; SOUZA, D. S. L; NASCIMENTO, R. M ; LIMA, Á. L. M ; MELO, J. A. T.; MILLER, R. N. G.; FRANCO, O. L.; GROSSI-DE-SA, M. F.; ABREU, L. R. D. . Purification and Characterization of a Liver-derived b-N Acetylhexosaminidase from Marine Mammal Sotalia fluviatilis. The Protein Journal. v. 29, p. 188-194, 2010. GOMES, L. P; OLIVEIRA, C. I. R; SILVA, M. C; ANDRADE, C.T; AGUILA, E. M. D; SILVA, J. T; PASCHOALIN, V. M. F. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUITINASE DE UVA (Vitis vinífera L. CV RED GLOBE) PARA A PRODUÇÃO DE QUITOSANA A PARTIR DE QUITINA DE CAMARÃO. Quim. Nova, v. 33, p. 1882-1886, 2010.

87

REFERÊNCIAS


GRACE, M. E.; NEWMAN, K. M.; SCHEINKER, V.; BERG-FUSSMAN, A.; GRABOWSKI, G. A. Analysis of human acid beta-glucosidase by site-ditected mutagenesis and heterologous expression. Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 269, p. 2283-2291, 1994.

GUAN, Y; RAMALINGAM, S; NAGEGOWDA, D; TAYLOR, P. W. J.; CHYE, MEE L. Brassica juncea chitinase BjCHI1 inhibits growth of fungal phytopathogens and agglutinates Gram-negative bacteria. Journal of Experimental Botany, v. 59, p. 3475–3484, 2008. GUEGUEN, Y. et al. Enzymatic synthesis of dodecil.β-D-glucopyranoside catalyzed by Candida molischiana 35M5N β-glucosidase. Bioresource Technology, Oxford, v. 53, p. 263-267, 1995b. GUEGUEN, Y. et al. Purification and characterization of an intracellular β glucosidase from Botrytis cinerea. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 17, p. 900-906, 1995a. GUEGUEN, Y. et al. Purification and characterization of an intracellular β glucosidase from a new strain of Leuconostoc mesenteroides isolated from cassava. Jounal of Applied Microbiology, Oxford, v. 82, p. 469-476, 1997b. HAKI, G. D.; RAKSHIT, S.KDevelopments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresource Technology.v. 89, p.17-34,2003. HAYASHI, S. Purification and characterization of the intracellular β-glucosidase from Aureobasidium sp ATCC 20524. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Heidelberg, v. 22, p. 160 – 163, 1999.

HAYS, W. S.; VANDERJAGT, D. J.; BOSE, B.; SERIANNI, A. S.; GLEW R. H. Catalytic mechanism and specificity for hydrolysis and transglycosylation reactions of cytosolic β-glucosidase from guinea pig liver. Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 273, p. 34941-34948, 1998.

HENRISSAT, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemistry Journal. v. 280, p. 309-316, 1991. HENRISSAT, B.; BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemical Journal. v. 293, p. 781–788, 1993. HENRISSAT, B.; CALLBAUT, I.; FABREGA, S.; LEHN, P.; MORNON, J.P.; DAVIES, G. Conserved catalytic machinery and prediction of a common fold for several families of glycosyl hidrolases. PNAS. v. 92, p. 7090-7094, 1995.

HOANG, KIM-CHI; LAI, TZU-HSUAN; LIN, CHUNG-SHENG; CHEN, YING-TSONG; LIAU, CHUN-YI. The Chitinolytic Activities of Streptomyces sp. TH-11. International Journal of Molecular Sciences. v, 12. p, 56-65, 2011.

88

REFERÊNCIAS


HOLLAK, C.E.; VAN WEELY, S.; VAN OERS, M.H.; AERTS, J.M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity: A novel hallmark of Gaucher disease. J. Clin. Invest. v. 93,p. 1288–1292,1994.

HORSCH, M.; MAYER, C.; SENNHAUSER, U.; RAST, D. M. β-N acetylhexosaminidase: A target for the Design of Antifungical Agents. Pharmacol. Ther, v. 76, p. 187-218, 1997.

HOPKINS, T. L.; HARPER, M. S. Lepidopteran Peritrophic Membranes and Effects of Dietary Wheat Germ Agglutinin on Their Formation and Structure. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. v. 47, p. 100-109, 2001.

IKEDA M, MIYAUCHI K, MOCHIZUKI A, MATSUMIYA M. Purification and characterization of chitinase from the stomach of silver croaker Pennahia argentatus. Protein Expression and Purification. v.65(2), p.214-222, 2009.

ISELI, B.; ARMAND, S.; BOILER, T.; NEUHAUS, J.M.; HENRISSAT, B. Plant chitinases use two different hydrolytic mechanisms. FEBS Letters, v. 382:186- p.188, 1996.

JAGER, S.; BRUMBAUER, A.; FEHÉR, E.; RÉCZEY, K.; KISS, L. Production and characterization of β-glucosidase from different Aspergillus strains. World Journal of Microbiology & Biotechnology, New York, v. 17, p. 455-461, 2001.

JEUNIAUX, C. Chitinolytic systems in the digestive tract of vertebrates: a review. In Chitin Enzymology. 233-244 R.A.A. Muzzarelli, ed European Chitin Society, Italy. 1993.

KAMEI, A.; HAYASHI, S. Properties of partially purified beta-N acetylglucosaminidase from bovine crystalline lens. Biol. Pharm. Bull. v. 22(8), p. 866 869, 1999.

KARAMANOS, Y. Endo- N-acetyl-β-D-glucosaminidase and their potential substrates: structure/function relations ships. Res Microbiol, v. 148, p. 661- 671, 1997.

KATAYEVA, I. A.; GOLOVCHENKO, N. P.; CHUVILSKAYA N, A.; AKIMENKO, V. K. Clostridium thermocellum β-glucosidases A and B: purification, properties, localization, ans regulation of biosynthesis. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 14, p. 407, 1992.

KIM, S. K. AND RAJAPAKSE, N. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review. Carbohydrate Polymers. v. 62, p.357–368, 2005.

KIMURA, I.; YOSHIOKA, N.; TAJIMA, S. Purification and characterization of a β glucosidase with β-xylosidase activity from Aspergillus sojae. Journal of Bioscience and Bioengineering, Osaka, v. 87, p. 538-541, 1999.

89

REFERÊNCIAS


KIRK, O., BORCHERT, T.B., FUGLSANG, C.C. Industrial enzyme applications. Curr. Op. Biotechnol. v. 13, p.345-351. 2002. KITTL, R; WITHERS, S. G. New approaches to enzymatic glycoside synthesis through directed evolution. Carbohydrate Research. v. 345, p.1272–1279, 2010. KONG, H. J. ; CHO, H. K ; PARK, E. M ; HONG, G. E; KIM; Y. O; NAM; B. H; KIM; W. J; LEE, S.J; HAN, H. S; JANG, I. K; LEE, C. H; CHEONG, J; CHOI, T. J. Molecular cloning of Kazal-type proteinase inhibitor of the shrimp Fenneropenaeus chinensis. Fish & Shellfish Immunology. v. 26, p. 109-114, 2009. KOPPARAPU, N. K; LIU, Z; YAN, Q; JIANG, Z; ZHANG, S. A novel thermostable (PJC) from pomegranate (Punica granatum) juice. Food Chemistry, v. 127, p. 1569 1575, 2011. KOSHLAND, D.E. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Reviews. v. 28, p.416-436, 1953. KOSTANJNEK, R; MILATOVIB, M; KTRUS, J. Endogenous origin of endo-β-1,4-glucanase in common woodlouse Porcellio scaber (Crustacea, Isopoda). J Comp Physiol B. v. 180, p. 1143–1153, 2010.

KRESSE, H.; GLOSSL, J. Glycosaminoglycans degradation. Adv. Enzymol., v. 60,p. 217-311, 1987.

KUNZ, A. S. Resolution and properties of the proteinase in the larva of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochem. v. 8, p. 43-51, 1978.

KUSAYKIN, M.I.; BURTSEVA, Y.V.; SVETASHEVA, T.G., SOVA, V.V.; ZVYAGINTSEVA, T.N. Distribution of O-glycosilhydrolases in marine invertebrates. Enzymes of the marine mollusk Littorina kurila that catalyse fucoidan transformation. Biochemistry (Moscow), v.68, n.3, p.384- 392, 2003.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, August 1970, v. 227, no. 5259, p. 680-685.

LAM, S. K; NG, T. B. Acaconin, a chitinase-like antifungal protein with cytotoxic and anti-HIV-1 reverse transcriptase activities from Acacia confuse seeds. ACTAABP. v. 57, 2010. LAUTENBACH, E; STROM, BL; BILKER, WB. Epidemiological investigation of fluoroquinolone resistance in infections due to extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Clin Infect Dis. v. 33, p. 1288-1294, 2001. LEE, H.S; HAM, D.S; CHOI, S.J; KIM, D,S; BAI, D.H; YU, J.H. Purification, characterization, and primary structure of a chitinase from Pseudomonas sp. YHS-A2. App. Microbiol. Biotechnol.v, 54. p, 397-405, 2000.

90

REFERÊNCIAS


LENARDON, M. D; MUNRO, C. A; GOW, N. AR. Chitin synthesis and fungal pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. v, 13. p, 416–423, 2010. LE TRAON-MASSON, M. P.; PELLERIN, P. Purification and characterization of two β-D-glucosidases from an Aspergillus niger enzyme preparation: affinity and specificity toward glucosylated compounds characteristic of the processing of fruits. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 22, p. 374-382, 1998.

LI, X. et al. Expression, purification and characterization of a recombinant β- glucosidase from Volvariella volvacea. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 27, p. 1369-1373, 2005.

LIMA NETO, E. C. Identificação de genes Relacionados ao Sistema Imune do Camarão marinho Litopenaeus vannamei. Dissertação de Mestrado em Recursos Pesqueiros e Aqüicultura – Universidade Federal Rural de Pernanbuco, Pernambuco-PE, 2006.

LIMA, A. L. M. Purificação e caracterização parcial de duas N-acetil-ββββ hexosaminidases do equinoderma marinho Echinometra lucunter. Dissertação de Mestrado em Bioquímica - Universidade Federal do Rio Grande do Norte - RN, 2006.

LIMA, E. P.; OLIVEIRA FILHO, A. M.; LIMA, J. W. O.; RAMOS JUNIOR, A. N.; CAVALCANTI, L. P. G.; PONTES, R. J. S. Resistência do Aedes aegypti ao Temefós em Municípios do Estado do Ceará. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v.39(3), p.259-263, 2006.

LIMA, J. B. P.; MELO, N. V.; VALLE, D. Residual effect of two Bacillus thuringiensis var. israelensis products assayed against Aedes aegypti (diptera: culicidae) in laboratory and outdoors at Rio de Janeiro, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. v. 47(3), p.125-130. 2005b.

LIN, J. C.; XIE, X. L.; GANG, M.; WANG, Q.; CHEN, Q. X. Effects of mercuric íon on the conformation and activity of Penaeus vannamei β-N-acetyl-D-glucosaminidase. International Journal of Biological Macromolecules. v. 36, p. 327-330, 2005. LIN, S. B., LIN, Y. C., & CHEN, H. H. Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase: Characterisation and antibacterial activity. Food Chemistry. v, 116. p. 47–53, 2009. LINEWEAVER, H.; BURK, D. The determination of enzyme dissociation constants. Journal of the American Chemical Society, Washington, v. 56, p. 658-666, 1934. LOURENÇO-DE-OLIVEIRA R, VAZEILLE M, DE FILIPPIS AMB, FAILLOUX AB. Aedes aegypti in Brazil: genetically differentiated populations with high susceptibility to dengue and yellow fever viruses. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene.;v. 98, P. 43-54. 2004.

91

REFERÊNCIAS


LUCAS, R. et al. β-glucosidase from Chalara paradoxa CH32: purification and properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v. 48, p. 3698-3703, 2000.

LUNA, J. D. S. M. F; ANJOS, A. F; KUWABARA, E. F. NAVARRO-SILVA, M. A. Susceptibility of Aedes aegypti to temephos and cypermethrin insecticides. Revista de Saúde Publica. Brazil, v. 38, p. 1-2, 2004.

LUO, T; YANG, H; LI, F; ZHANG, X; XU, X. Purification, characterization and cDNA cloning of a novel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp Penaeus monodon. Developmental & Comparative Immunology, v. 20, p. 1-11, 2005. LUSTERIO, D. D. et al. Alkali resistant, alkaline endo-1,4-β-glucanase produced by Bacillus sp. PKM-5430. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Tokyo, v. 56, p. 1671-1672, 1992.

LUVESUTO, E. Analise genética e morfométrica da estrutura populacional do camarão branco Litopenaeus schmitti (Decápoda, Crustácea) na costa do Rio Grande do Norte, Brasil: uma abordagem em fina escala. Dissertação de Mestrado em Ecologia em Recursos Naturais- Universidade Federal de São Carlos, São Paulo-SP, 2006.

LUZ, C.; TAI, M. H. H.; SANTOS, A. H.; SILVA, H. H. G. Impact of moisture on survival of Aedes aegypti eggs and ovicidal activity of Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 103(2), p.214-215, 2008.

MACORIS, M. L. G.; ANDRIGHETTI, M. M. T.; OTRERA, V. C. G,; CARVALHO, L. R.; CALDAS JUNIOR, A. L., BROGDON, W. G. Association of insecticide use and alteration on Aedes aegypti susceptibility status. Memórias do Instituto. Oswaldo Cruz. v. 102(8),p. 895-900, 2007.

MALEY, F.; TRIMBLE, R.B.; TARENTINO, A. L.; PLUMMER, T. H. JR. Characterization of glycoproteins and their associated oligosaccharides through the use of endoglicosidases. Analytical Biochemisty, v. 180, p. 195-204, 1989.

MARANA, S. R.; TERRA, W, R; FERREIRA, C. Midgut β-glucosidases from Abracris flavolineta (Orthoptera: Acrididae). Physycal properties, substrate soecificities and function. Insect Biochemistry ans Molecular Biology, Oxford, v. 25, p. 835-843, 1995.

MARANA, S.R. Purificação e caracterizaçã das ββββ-glicosidases digestivas de Spodoptera frugiperda (Lepidóptera). Tese de Doutorado em Bioquímca-Universidade de São Paulo - São Paulo, SP, 1999.

MARQUES, M. R.F; BARRACCO, M. A. Lectins, as non-self-recognitin factors, in crustaceans. Aquaculture, v. 191, p. 23-44, 2000.

92

REFERÊNCIAS


MARTINELLI, J. M. Estrutura populacional dos camarões Penaeidae no estuário do rio Caeté, litoral Norte do Brasil. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Pará, p. 174, 2005.

MATEO, J. J.; DI STEFANO, R. Description of the β-glucosidase activity of wine yeasts. Food Microbiology, London, v. 14, p. 583-591, 1997.

MATSUMIYA, M; ARAKANE, Y; HAGA, A; MUTHUKRISHNAM, S; KRAMER, K. J. Substrate specificity of chitinases from two species of fish, greenling, Hexagrammos otakii, and common mackerel, Scomber japonicas, and the insect, tobacco hornworm, Manduca sexta. Biosci Biotechnol Boichem. v. 70, p. 971-979, 2006.

MATSUO, Y.; KURITA, M.; PARK, J. K.; TANAKA, K.; NAKAGAWA, T.; KAWAMUKAI, M.; MATSUDA, H. Purification, characterization and gene analysia of N-acetylglucosaminidase from Enterobacter sp. G-1. Biosci. Biotechnol. Biochem., v. 63, p. 1261-1268, 1999.

MATSUURA, K.; SAWADA, H.; YOKOSAWA, H. Purification and properties of N acetylglucosaminidase from eggs os the ascidian, Halocynthia roretzi. Eur. J. Biochem., v. 218, n. 2, p. 535-541, 1993.

MATTA, L. D. M.; ABREU, L. R. D. Glicosidases e sulfatases no molusco marinho Aplysia cervina. Arq. Inst. Biol., v. 72, p. 205-210, 2005.

MEDEIROS, V. F. Potencial larvicida de extratos de plantas regionais no controle de larvas de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Dissertação de Mestrado em Ciências Biológicas – Universidade Federal do Rio Grande do Norte – RN, 2007.

MORAIS, H. Liquid chromatographic and electrophoretic characterization of extracellular β-glucosidase of Pleurotus ostreatus grown in organic waste. Journal of Chromatography B, Amsterdam, v. 770, p. 111-119, 2002.

MOREIRA, R. A; MONTEIRO, A. C. O; HORTA, A. C. G; OLIVEIRA, J. T. A; CAVADA, B. S. Isolation and characterization of Dioclea altíssima var. megacarpa seed lectin. Phytochemistry, v. 46, p. 139-144, 1977.

MULLEN, K. M.; PETERS, E. C.; HARVELL, C. D. Coral Resistance to Disease. In E.Rosenberg & Y.Loya (eds) Coral Health & Disease, Springer-Verlag. 2004. NAKANO, H. et al. Purification and characterization of a novel β-glucosidase from Clavibacter michiganense that hydrolyzes glucosyl ester linkage in steviol glycosides. Journal of Fermentation and Bioengineering, Osaka, v. 85, p. 162 168, 1998.

NASCIMENTO, R. M. Purificação e caracterização parcial de uma ββββ-D glicosidase de Artemia franciscana com ação sobre celobiose e lactose. Dissertação de Mestrado em bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte- RN, 2008.

93

REFERÊNCIAS


NEIVA, G. S.; MOURA, S. J. C. Sumário sobre a exploração de recursos marinhos do litoral brasileiro: situações atuais e pespectivas. PDP, Série de documentos ocasionais, v. 27, p. 44, 1971.

NEMETH, K.; PLUMB, G. W.; BERRIN, JG.; JUGE N,; JACOB, R.; NAIM, H. Y.; WILLIAMSON, G.; SWALLOW, D. M.; KROON, P. A. Deglycosylation by small intestinal epithelial cell β-glucosidases is a critical step in the absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in humans. European Journal of Nutrition, Darmastadt, v. 42, p. 29-42, 2003.

NIIMI, K.;SHEPHERED, M. G; CANNON, R. D. Distinguishing Candida Species by β-N-acetylhexosaminidase activity. Journal of Clinical Microbiology, v. 39, p. 2089-2097, 2001.

NOSTRO, A; CELLINI, L; DI BARTOLOMEO, S; DI CAMPLI, E; GRANDE, R; CANNATELLI, MA. Antibacterial effect of plant extracts against Helicobacter pylori. Phytother Res. v. 19, p. 198–202, 2005.

OH, K. B. et al. Isolation and properties of an extracellular β-glucosidase from a filamentous fungus, Cladosporium resinae, isolated from kerosene. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1999.

PAAVILAINEN, S.; HELLMAN, J.; KORPELA, T. Purification, characterization, gene cloning, and sequencing of a new β-glucosidase from Bacillus circulans subsp. Alkalophilus. Applied and Enviromenmental Microbiology, Washington, v. 59, p. 927-932, 1993.

PAINBENI, E. et al. Purification and characterization of a Bacillus polymyxa β- glucosidase expressed in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, Washington, v. 174, p. 3087-3091, 1992. PAYNE, D. J; GWYNN, M. N; HOLMES, D. J; PAMPLIANO, D. L. Drug Discovery Nat. Rev. v. 6, p. 29, 2007. PALLA, C. A; PACHECO, C; CARRÍN, M. E. Preparation and modification of chitosan particles for Rhizomucor miehei lipase immobilization. Biochemical Engineering Journal. 2011.

PASTORE GM, R S, KOBLITZ MGB. Purificação parcial e caracterização bioquímica de lipase extracelular produzida por nova linhagem de Rhizopus sp . v.23(4), p.135-140, 2003.

PATEL, A. K; SHING, V. K; YADAV, R. P; et al.Purification and characterization of a new chitinas e from latex of Ipomoea carnea. Process Biochemistry.v.45(5), p.675-681, 2010.

PATIL, R. S.; GHORMADE, V.; DESHPANDE, M. V.; Enzyme Microb. Technol. v. 26, p. 473, 2000.

94

REFERÊNCIAS


PÉREZ-FARFANTE, I. Sinopsis de datos biológicos sobre el camarón blanco Penaeus schmitti. FAO Fishery Reports, Bunkenroad, v. 37, p. 1417-1438, 1970.

PETERS, G.; SABOROWSKI, R.; MENTLEIN, R.; BUCHHOLZ, F. Isoforms of an N-acetyl-β-D-glucosaminidase and antibody production. Comparative Biochemistry and Physiology part B 120, 1998.

POLANCZYK, R. A.; GARCIA, M. O.; ALVES, S. B. Potencial de Bacillus thuringiensis israelensisBerliner no controle de Aedes aegypti. Revista de Saúde Pública. v. 37(6), p.813-816, 2003.

PONTIN, K; DA SILVA FILHO, AA; SANTOS, FF; ANDRADE E SILVA, ML. CUNHA, WR; NANAYAKKARA, NPD. In vitro and in vivo antileishmanial activities of a Brazilian green propolis extract. Parasitol Res. v, 103. p, 487-92, 2008.

PONTOH, J.; LOW, N. H. Purification and characterization of β-glucosidase from honey bees (Apis mellifera). Insect Biochemistry and Molecular Biology, Oxoford, v. 32, p. 67690, 2002.

PROESPRAIWONG, P; TASSANAKAJON, A.; RIMPHANITCHAYAKIT, V. Chitinases from the black tiger shrimp Penaeus monodon: Phylogenetics, expression and activities. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. v. 156, p. 86 96, 2010. QIN, Y; LU, X; SUN, N; ROGERS, R. D. Dissolution or extraction of crustacean shells using ionic liquids to obtain high molecular weight purified chitin and direct production of chitin films and fibers. Green Chem. v, 12. p, 968–971, 2010. RAO, D., & GOWDA, L. Abundant class III acidic chitinase homologue in Tamarind (Tamarindus indica) seed serves as the major storage protein. Journal of Agricultural Food Chemistry. v. 56,p. 2175–2182, 2008. REGIS, L.; MONTEIRO, A. M.; MELO-SANTOS, M. A. V.; SILVEIRA JR, J. C.; FURTADO, A. F.; ACIOLI, R. V.; SANTOS, G. M.; NAKAZAWA, M.; CARVALHO, M. S.; RIBEIRO JR, P. J.; SOUZA, W. V. Developing new approaches for detecting and preventing Aedes aegypti population outbreaks: basis for surveillance, alert and control system. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v. 103(1), p. 50-59, 2008.

REVISTA PANORAMA DA AQUICULTURA, 2004, 14, 21, http://www.panoramadaaquicultura.com.br, acessada em Janeiro 2010.

RIBEIRO, M.C. & SOARES, M.M.S.R. Microbiologia prática: roteiro e manual. São Paulo: Atheneu, 2000.

RICCIO, P. et al. Extraction and immobilization in one step of two β-glucosidases released from a yeast strain of Debaryomyces hansenii. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 24, p. 123-129, 1999.

95

REFERÊNCIAS


RIOU, C. et al. Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β-glucosidase from Aspergillus oryzae. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 64, p. 3607-3614, 1998.

RIVAS, B.; GARCIA, J. L.; LOPES, R.; GARCIA, P. Purification and polar localization of pneumococcal LytB, a putative endo-beta-N acetylglucosaminidase: the chain-dispersing murein hydrolases. J. Bacteriol, v. 184, p. 4988-5000, 2002.

ROBERTS, G. A. F.; Chitin Chemistry, Mc Millan Press Ltd: London, 1992, cap 1.

ROCHA, I. P.; Revista da ABCC. V. 20. 2008.

RODRÍGUEZ-BAÑO, J; NAVARRO, MD; ROMERO, L. Clinical and molecular epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli as a cause of nosocomial infection or colonization: implications for control. Clin Infect Dis. v. 42, p. 37-45, 2006. RODRIGUES, M. M.; BISSET, J.; FERNANDEZ, D. M.; LAUZÁN, L.; SOCA, A. Detection of insecticide resistance in Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) from Cuba and Venezuela. Journal of Medical Entomology. v. 38, p.623-628, 2001.

ROGER, H. J; PERKINS, H.R. Cell walls of filamentous fungi. E. and F. N. Spon: London, 23, cap 9, 153-160. 1968.

ROTA, M. A. Aspectos Gerais da Fisiologia e Estrutura do Sistema Digestivo dos Peixes Relacionados a Piscicultura. Embrapa Pantanal, p. 48. 2003.

ROTHLISBERG, P.; JACKSON, C. J.; PENDREY, R. C. Distribution and abundance of early penaeid larvae in the Gulf of Carpentaria, Second Australian National Prawn Seminal NPS2. Australia, p. 23-30, 1985.

SÁ, R. A; SANTOS, N. D. LI; SILVA, C. S. B; NAPOLEÃO, T. H; GOMES, F. S; CAVADA, B. S; COELHO, L. C. B. B; NAVARRO, D. M. A. F; BIEBER, L. W; PAIVA, P. M. G. Larvicidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva on Aedes aegypti. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C. v. 149, p. 300–306, 2009. SAHAI, A.S; MANOCHA, M.S. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. FEMS Microbiol. Rev. v. 11, p. 317-338, 1993. SAMOSHINA, N. M; SAMOSHIN, V. V. The Michaelis constants ratio for two substrates with a series of fungal (mould and yeast) β-galactosidases. Enzyme and Microbial Technology, New York, v. 36, p. 239-251, 2005. SANTANA, T. T. S. Imobilização de uma n-acetil-β-d-glucosaminidase extraída do camarão marinho Litopenaeus schmitti em Dacron ferromagnético. Monografia – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte- RN, 2009.

96

REFERÊNCIAS


SANTOS, V. O. Polissacarídeos Sulfatados de Interesse Farmacológico no Camarão Marinho Litopenaeus schmitti. Dissertação de Mestrado em Bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Norte - RN, 2006.

SARRY, J. E.; GÜNATA, Z. Plant and microbial glycoside hydrolases: volatile release from glycosidic aroma precursors. Food Chemistry, Oxford, v. 87, p. 509 521, 2004. SAVAGEAU, MA. Escherichia coli habitats, cell types, and molecular mechanisms of gene control. Am Nat. v, 122. p, 732–744, 1983. SHAHIDI, F; ARACHCHI, J. K. V; JEON, Y. J. Food applications of chitin and chitosans. Trends in Food Science & Technology. v, 10. p, 37 – 51, 1999.

SCHLUMBAUM, A.; MAUCH, F.; VÖGELI, U.; BOLLER, T. Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth. Nature, v. 324, p.365–367, 1986.

SEDMAK J & GROSSBERG SE. A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using coomassie brilhant blue G250. Analytical Biochemistry. 1977, 79, 544-552.

SEIDL, V. Chitinases of filamentous fungi: a large group of diverse proteins with multiple physiological functions. Fungal Biology Reviews, Austria, v. 22, p. 36-42, 2008.

SESTELO, A. B. F.; POZA, M.; VILLA, T. G. β-glucosidase activity in a Lactobacillus plantarum wine strain. World Journal of Microbiology & Biotechnology, New York, v. 20, p. 633-637, 2004.

SHI, Y; JIANG, Z; HAN, P; ZHENG G-X; SONG, K-K; CHEN, Q-X. Purification and some properties of b-N-acetyl- D-glucosaminidase from the cabbage butterfly (Pieris rapae). Biochimie.v. 89, p. 347-354, 2007. SILVA, H. H. G.; GERIS, R.; RODRIGUES FILHO, E.; ROCHA, C.; SILVA, I. G. Larvicidal activity of oil-resin fractions from the Brazilian medicinal plant Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) against Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v. 40(3), p.264-267, 2007.

SILVA, J. J.; MENDES, J. Susceptibility of Aedes aegypti (L) to the insect growth regulators diflubenzuron and methoprene in Uberlândia, State of Minas Gerais. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.40(6), p. 612-616, 2007.

SILVA, O. Aspectos Bioecológicos e pesqueiros de três especies de camarões do gênero Penaeus nas costa do estado do Rio de Janeiro e Experimentos de cultivo. Dissertação de Mestrado, Pós-Graduação em Zoologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, 1977.

97

REFERÊNCIAS


SILVA, W.J., DÓRIA, G.A.A., MAIA, R.T., NUNES, R.S., CARVALHO, G.A., BLANK, A.F., ALVES, P.B., MARÇAL, R.M., CAVALCANTI, S.C.H.,. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresour. Technol.v. 99, p.3251–3255, 2008. SILVA, W.J., DÓRIA, G.A.A., MAIA, R.T., NUNES, R.S., CARVALHO, G.A., BLANK, A.F., ALVES, P.B., MARÇAL, R.M., CAVALCANTI, S.C.H. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresour. Technol. v. 99,p. 3251–3255, 2008. SILVEIRA, L.M.S.; OLEA, R.S.G.; MESQUITA, J.S. et al. Metodologias de atividade antimicrobiana aplicadas a extratos de plantas: comparação entre duas técnicas de Agar difusão. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.90, n.2, p.124-128, 2009. SIMAS, N. K.; LIMA, E. C.; CONCEIÇÃO, S. R.; KUSTER, R. M.; OLIVEIRA FILHO, A. M. Produtos naturais para o controle da transmissão da dengue - Atividade larvicida de Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e de terpenóides e fenilpropanóides. Química Nova, v.27(1), p.46-49, 2004.

SOUZA, DJAIR S L ; GROSSI SÁ, M. F. ; FRANCO, O. L. ; G JÚNIOR, JOSÉ EDILSON ; ABREU, L. R. D. Identification of a novel b-N-acetylhexosaminidase (Pcb-NAHA1) from marine Zoanthid Palythoa caribaeorum (Cnidaria, Anthozoa, Zoanthidea). Protein Expression and Purification.v, 58. p, 61-69. 2008.

SPINDLER-BARTH, M. Hormonal regulation of chitin metabolism in insect cell lines. In Chitin Enzymology. p. 75-82. R.A.A. Muzzarelli, ed. European Chitin Society, Italy. 1993.

STINTZI, A.; HEITZ, T.; WIEDEMANN, M. S.; KAUFFMANN, S.; GEOFFROY, P. Plant “pathogenesis-related” proteins and their role in defense against pathogens. Biochemie. v. 75, p. 687-706, 1993.

SUE, M.; ISHIHARA, A.; IWAMURA, H. Purification and characterization of a β glucosidase from rue (Secale cereal L.) seedlings. Plant Sciences, Clare, v. 155, p. 67-74, 2000.

TAIRA, T., OHDOMARI, A., NAKAMA, N., SHIMOJI, M., & ISHIHARA, M. Characterization and antifungal activity of Gazyumaru (Ficus microcarpa) latex chitinases: Both the chitin binding and the antifungal activities of class I chitinase are reinforced with increasing ionic strength. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry.v. 69,p. 811–818, 2005a. TAIRA, T., TOMA, N., & ISHIHARA, M. Purification, characterization, and antifungal activity of chitinases from pine apple (Ananas comosus) leaf. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. v.69, p. 189–196, 2005b. THAKORE, Y.B. Enzymes for Industrial Applications. BBC RESEARCH. BIO030 Published: January 2008.

98

REFERÊNCIAS


TERRA, W. R; FERREIRA, C; DE BIANCHI, A.G. Action pattern, kinetical properties and electophoretical studies of an alpha-amylase present in midgut homogenates from Rhynchonsciara Americana (Diptera) larvae. Comparative Biochemistry and Physiology, v.56B, p. 201-209. 1997.

THARANATHAN, R.N.; KITTUR, F.S. Chitin—the undisputed biomolecule of great potential, Critical Reviews in Food Science and Nutrition. v. 43, p. 61–87, 2003.

THOMPSON SE, SMITH M, WILKINSONS MC, PEEK K. Identification and characterization of a chitinase antigen from Pseudomonas aeruginosa strain 385. Appl Environ Microbiol. v. 67, p.4001-4008, 2001.

TSUJIBO, H., FUJIMOTO, K., TANNO, H., MIYAMOTO, K., KIMURA, Y; IMADA, C., OKAMI, Y. AND INAMORI, Y. Molecular cloning of the gene which encodesb-N-acetylglucosaminidase from a marine bacterium,Alteromonassp. Strain O-7.Appl Environ Microbiol. v. 61, p. 804–806,1995.

TU , S; QIU, X; CAO, L; HAN, R; ZHANG, Y; LIU, X. Expression and characterization of the chitinases from Serratia marcescensGEI strain for the control of Varroa destructor, a honey bee parasite. Journal of Invertebrate Pathology.v. 104, p.75–82, 2010.

VIEIRA, V. K. B. Detecção e caracterização parcial da ββββ-N acetilglucosaminidase em extratos de gônadas do molusco Chiton sp. Dissertação de Mestrado em bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte-RN, 2002.

VISETNAN, S; DONPUDSA, S; SUPUNGUL, P; TASSANAKAJON, A; RIMPHANITCHAYAKIT, V. Kazal-type serine proteinase inhibitors from the black tiger shrimp Penaeus monodon and the inhibitory activities of SPIPm4 and 5. Fish & Shellfish Immunology. v. 27, p. 266–274, 2009. YAN, T. R.; LIAU, J. C. Synthesis of cello-oligosaccharides from cellobiose with β-glucosidase II from Aspergillus niger. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 20, p. 591-594, 1998. YANG, H; LUO, T; LI, F; LI,S ; XU, X. Purification and characterization of a calcim-independent lectin (PjLec) from the haemolymph of the shrimp Penaeus japonicus. Fish & Shellfish Immunology, v. 22, p. 88-97, 2007.

YE X; NG T. B. A chitinase with antifungal activity from the mung bean. Protein Expression and Purification. v. 40, p. 230–236, 2005.

YEN, M. T.; YANG, J. H.; MAU, J. H. Physicochemical characterization of chitin and chitosan from crabs shells. Carbohydrate polymers. v. 75, p. 15-21, 2009. YUN, S. I.; JEONG, C. S.; CHUNG, D. K.; CHO, H. S. Purification and some properties of a β-glucosidase from Trichoderma harzianum type C-4. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Tokio, v. 65, p. 2028-2032, 2001.

99

REFERÊNCIAS


YAZDI, M. T. et al. Purification and characterization of two intracellular β- glucosidases from the Neurospora crassa mutant cell-1. World Journal of Microbiology & Biotechnology, New York, v. 19, p.79-84, 2003.

XAVIER-FILHO, J. The biological roles of serine and cysteine proteinase inhibitors in plants. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. v. 4, 1992.

ZANOELO, F. F. et al. β-Glucosidase activity from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum is stimulated by glucose and xylose. FEMS Microbiology Letters, Oxford, v. 240, p. 137-143, 2004.

ZHANG, J; SUN, Y; LI, F; HUANG, B; XIANG, J. Molecular characterization and expression analysis of chitinase (Fcchi-3) from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis. Mol Biol Rep.v, 37. p. 1913–1921, 2010. WANG, S; SHAO, B; RAO, P; LEE; Y; YE; X . Hypotin, a Novel Antipathogenic and Antiproliferative Protein from Peanuts with a Sequence Similar to Those of Chitinase Precursors. J. Agric. Food Chem., v. 55, p. 9792–9799, 2007. WEI, D. L. et al. Purification and characterization of an extracellular β- glucosidase from the wood-grown fungus Xylaria regalis. Current Microbiology, New York, v. 33, p. 297-301, 1996. World Health OrganizationInstructions for Determining the Susceptibility or Resistance of Mosquito Larvae to Insecticides. WHO/VBC/81.807, pp. 1-6. , 1981.

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE …Natal/RN 2011 Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito