UNIVERSITAS ISLAM NEGERI FAKULTAS SAINS DAN …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/27589/1/MAYA INA... · PROFIL PROTEIN JARINGAN OTOT DAGING AYAM POTONG ... Gambaran

  • View
    226

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of UNIVERSITAS ISLAM NEGERI FAKULTAS SAINS DAN...

  • PROFIL PROTEIN JARINGAN OTOT DAGING AYAM POTONG

    PRA-PENYEMBELIHAN ELECTRICAL STUNNING DAN

    NON ELECTRICAL STUNNING

    MAYA INA SHOLAIKAH

    PROGRAM STUDI KIMIA

    FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

    UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH

    JAKARTA

    2015 M/1436 H

  • PROFIL PROTEIN JARINGAN OTOT DAGING AYAM POTONG

    PRA-PENYEMBELIHAN ELECTRICAL STUNNING DAN

    NON ELECTRICAL STUNNING

    SKRIPSI

    Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

    Program Studi Kimia

    Fakultas Sains dan Teknologi

    Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

    Oleh:

    MAYA INA SHOLAIKAH

    1111096000058

    PROGRAM STUDI KIMIA

    FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

    UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH

    JAKARTA

    2015 M/1436 H

  • PROFIL PROTEIN JARINGAN OTOT DAGING AYAM POTONG

    PRA-PENYEMBELIHAN ELECTRICAL STUNNING DAN

    NON ELECTRICAL STUNNING

    Skripsi

    Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

    Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi

    Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

    Oleh:

    MAYA INA SHOLAIKAH

    1111096000058

  • PENGESAHAN UJIAN

    Skripsi berjudul PROFIL PROTEIN JARINGAN OTOT DAGING AYAM

    POTONG PRA-PENYEMBELIHAN ELECTRICAL STUNNING DAN NON

    ELECTRICAL STUNNING yang ditulis oleh Maya Ina Sholaikah, NIM

    1111096000058 telah diuji dan dinyatakan LULUS dalam sidang Munaqosyah

    Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

    Jakarta pada tanggal 1 Juli 2015. Skripsi ini telah diterima sebagai salah satu

    syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Kimia.

  • PERNYATAAN

    DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH

    HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI

    SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU

    LEMBAGA MANAPUN.

    Jakarta, 1 Juli 2015

    Maya Ina Sholaikah

    NIM. 1111096000058

  • ABSTRAK

    Maya Ina Sholaikah. Profil Protein Jaringan Otot Daging Ayam Potong Pra-

    Penyembelihan Electrical Stunning Dan Non Electrical Stunning. Dibimbing oleh

    SANDRA HERMANTO dan ANNA MUAWANAH.

    Perlakuan pra-penyembelihan ayam potong dengan electrical stunning

    dapat mempengaruhi aspek kehalalan daging ayam potong. Electrical stunning

    dapat menyebabkan ayam potong mati sebelum dilakukan penyembelihan

    mencapai sekitar 1035%. Penelitian tentang identifikasi protein biomarker terkait

    kehalalan ayam potong dengan perlakuan pra penyembelihan electrical stunning

    dan non electrical stunning telah dilakukan. Masing-masing sampel (6 ekor ayam

    potong usia 4 minggu bobot 1 kg dan 6 ekor usia 5 minggu bobot 1,7 kg)

    dilakukan proses pra-penyembelihan dengan 3 perlakuan; yaitu sampel A

    disembelih dengan cara electrical stunning halal (100 mA 25 Volt selama 10

    detik); sampel B dengan electrical stunning haram (100 mA, 220 Volt selama 30

    detik); dan sampel C sebagai non electrical stunning halal (kontrol, 0 V, 0 A).

    Masing-masing perlakuan diulang sebanyak dua kali. Proses ekstraksi jaringan

    otot daging ayam potong menggunakan buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,8 dan

    analisis kandungan protein ditentukan menggunakan metode Lowry. Pemisahan

    profil protein menggunakan elektroforesis SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate

    polyacrylamide gel electrophoresis) dan analisis densitogram untuk

    mengidentifikasi karakteristik BM profil protein yang dihasilkan melalui software

    Images J 1.46. Penelitian ini menghasilkan pita-pita protein yang tersebar pada

    kisaran 10-140 kDa dan 9 pita protein dominan dengan intensitas yang relatif

    berbeda. Hasil analisis densitogram menunjukkan 1 pita protein spesifik (BM

    30,19952 kDa) dengan intensitas yang lebih tinggi pada electrical stunning

    dibandingkan dengan non electrical stunning. Dengan demikian jenis protein ini

    diharapkan dapat dijadikan sebagai kandidat protein biomarker dalam mendeteksi

    kehalalan produk pangan ayam potong yang disembelih dengan perlakuan

    electrical stunning.

    Kata Kunci: Protein biomarker, electrical stunning, otot ayam, SDS-PAGE,

    densitometri.

  • ABSTRACT

    Maya Ina Sholaikah. Protein Profile Of Muscle Tissue Broilers Chicken with

    Pre-Slaughtering Electrical Stunning And Non Electrical Stunning. Supervised by

    SANDRA HERMANTO and ANNA MUAWANAH.

    Slaughter process broiler chicken with electrical stunning influence

    associated of halal. Electrical stunning of broiler chicken die causes prior to the

    slaughter of approximately 10 35%. Research on identification of protein

    biomarkers associated halal chicken with different pre-slaughter electrical

    stunning and non electrical stunning has been performed. Each sample (6 chickens

    aged 4 weeks, weighs 1 kg and 6 chickens age 5 weeks, weighs 1,7 kg) was

    prepared through the process of pre-slaughter with 3 conditions; that is a sample

    of A slaughtered by electrical stunning as halal (100 mA 25 Volts for 10 seconds);

    sample B with electrical stunning of haram (100 mA 220 volts for 30 seconds);

    and sample C as non electrical stunning as halal (controls, 0 V, 0 A). Each

    condition was repeated twice. Process extraction of muscle tissue meat chicken

    using buffer Tris-HCl pH 8,8 M 0,05 and analysis of protein content was

    determined using the method of Lowry. Separation of protein profile using

    electrophoresis SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel

    electrophoresis) and densitogram analysis to identify the characteristics of BM

    profile protein produced through software Images J 1.46. This research resulted

    profil protein scattered in the range of 10-140 kDa and 9 dominant with relative

    intensity is different. Densitogram analysis results showed 1 profil protein specific

    (BM 30,19952 kDa) with a higher intensity on the electrical stunning compared

    with non electrical stunning. Thus the type of protein is expected to serve as a

    candidate protein biomarkers in detecting the halal food products chicken that are

    slaughtered with electrical stunning treatment.

    Keywords: Protein biomarkers, electrical stunning, chicken muscle, SDS-PAGE,

    densitometry.

  • i

    KATA PENGANTAR

    Segala puji hanya milik Allah Taala, karena atas izin-Nya saya dapat

    menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada

    Nabi Muhammad Shallallahu alaihi wasallam, beserta keluarganya, para

    sahabatnya dan para pengikutnya hingga hari akhir. Skripsi yang berjudul Profil

    Protein Jaringan Otot Daging Ayam Potong Pra-Penyembelihan Electrical

    Stunning Dan Non Electrical Stunning ini disusun sebagai salah satu syarat

    dalam menempuh penelitian program S1 di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

    Skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa pihak-pihak yang terus

    memberikan bimbingan dan dukungannya, sehingga ucapan terimakasih yang

    sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada :

    1. Dr. Agus Salim, M.Si, sebagai Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN

    Syarif Hidayatullah Jakarta.

    2. Drs. Dede Sukandar, M.Si sebagai Ketua Program Studi Kimia Fakultas Sains

    dan Teknologi UIN Syarif Hidyatullah Jakarta.

    3. Isalmi Aziz, M.T selaku Sekretaris Program Studi Kimia Fakultas Sains dan

    Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

    4. Sandra Hermanto, M.Si, sebagai Dosen Pembimbing I yang telah

    membimbing pemikiran, saran dan dorongan kepada penulis dalam

    menyelesaikan skripsi ini.

    5. Anna Muawanah, M.Si, sebagai Dosen Pembimbing II yang telah

    membimbing dan memberikan saran selama proses penulisan skripsi ini.

  • ii

    6. Seluruh Dosen Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN

    Syarif Hidayatullah Jakarta atas ilmu yang telah diberikan.

    7. Keluarga terkasih yang sangat dicintai: Bapak (Larto), Ibu (Partini) dan adik

    (Aisyah Aji Furqonah) yang tidak pernah lelah dalam memberikan perhatian

    dan dukungannya baik secara moril maupun materil.

    8. Guru-guru, keluarga besar serta ulama yang telah membantu memberi

    dukungan moril dan doa pada peneliti.

    9. Seluruh peneliti, staf, dan karyawan Pusat Laboratiorium Terpadu (PLT) UIN

    Syarif Hidayatullah, Jakarta yang banyak membantu dalam penelitian ini.

    10. Ka Pipit, Ka Prita, Ka Nita, Ka Wahyu dan Ka Fuad selaku laboran kimia

    yang telah sabar membantu dan mendukung dalam proses untuk jalannya

    penelitian.

    11. Teman satu tim penelitian Suci dan teman laboratorium yang telah membantu

    dan saling memberi semangat selama proses penelitian.

    12. Teman-teman seperjuangan di Program Studi Kimia Angkatan 2011 yang

    sudah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak langsung.

    13. Teman-teman KKN SIAP untuk semangat, dukungan, canda tawa dan

    motivasinya.

    Saya menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari

    sempurna, maka saran dan kritik yang membangun sangat saya harapkan.

    Jakarta, 1 Juli 2015

    Penulis

  • iii

    DAFTAR ISI

    Halaman

    KATA PENGANTAR ......................................................................................... i

    DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii

    DAFTAR TABEL ............................................................................................... vi

    DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii

    DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... ix

    BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1

    1.1 Latar Belakang ................................................................................................ 1

    1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................... 5

    1.3 Hipotesa Penelitian ......................................................................................... 5

    1.4 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 6

    1.5 Manfaat Penelitian .......................................................................................... 6

    BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 7

    2.1 Sejarah dan Klasifikasi Ayam ......................................................................... 7

    2.2 Komposisi Gizi Daging Ayam Potong ........................................................... 9

    2.2.1 Protein Jaringan Otot Daging Ayam Potong ......................................... 11

    2.2.2 Pengujian Kadar Protein Metode Lowry ............................................... 14

    2.3 Penyembelihan Ayam Potong ......................................................................... 14

    2.3.1 Penyembelihan dengan Pemingsanan (Stunning) .................................. 16

    2.3.2 Penyembelihan Tanpa Pemingsanan (Non Stunning) atau Manual ...... 18

    2.4 Biomarker ....................................................................................................... 19

    2.5 Proteomik ........................................................................................................ 20

  • iv

    2.6 Elektroforesis .................................................................................................. 21

    2.6.1 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-

    PAGE) ............................................................................................................. 24

    2.6.2 Analisis Densitometri ............................................................................. 26

    BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 29

    3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................................... 29

    3.2 Alat dan Bahan ................................................................................................ 29

    3.2.1 Alat ......................................................................................................... 29

    3.2.2 Bahan ..................................................................................................... 29

    3.3 Prosedur Penelitian ......................................................................................... 30

    3.3.1 Proses Penyembelihan dan Isolasi Sampel ............................................ 30

    3.3.2 Pengukuran Kadar Protein. ................................................................... 31

    3.3.2.1 Penentuan Nilai (Panjang Gelombang) Maksimum ................ 31

    3.3.2.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi ....................................................... 32

    3.3.2.3 Pengukuran Sampel ................................................................... 32

    3.3.3 Elektroforesis Dodecyl Sulphate Poliacrilmide Gel Electrophoresis

    (SDS-PAGE) .......................................................................................... 33

    3.3.3.1 Preparasi Sampel untuk Elekroforesis ....................................... 33

    3.3.3.2 Preparasi Gel Elekroforesis ........................................................ 33

    3.3.3.3 Loading Sampel ......................................................................... 34

    3.3.3.4 Pewarnaan Gel ........................................................................... 34

    3.3.3.5 Analisa Berat Molekul dan Tingkat Ekspresi Protein ................ 34

    3.4 Desain Penelitian ............................................................................................ 36

  • v

    BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 37

    4.1 Karakteristik Ayam Potong Sebelum dan Sesudah Penyembelihan ............... 37

    4.2 Isolasi Protein dari Jaringan Otot Daging Ayam Potong ............................... 40

    4.3 Kadar Protein Ekstrak Jaringan Otot Daging Ayam Potong ......................... 42

    4.4 Profil Protein Isolat Jaringan Otot Daging Ayam Potong hasil SDS-PAGE ......

    ......................................................................................................................... 46

    BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 57

    5.1 Kesimpulan ..................................................................................................... 57

    5.2 Saran ............................................................................................................... 57

    DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 58

    LAMPIRAN ......................................................................................................... 67

  • vi

    DAFTAR TABEL

    Halaman

    Tabel 1. Standar bobot badan ayam broiler berdasarkan jenis kelamin pada

    umur 1 sampai 6 minggu ....................................................................... 8

    Tabel 2. Gambaran nilai gizi daging ayam potong (Broiler) ............................... 10

    Tabel 3. Protein dari otot rangka ayam ................................................................ 13

    Tabel 4. Rekomendasi konsentrasi gel ................................................................. 25

    Tabel 5. Kandungan protein jaringan otot daging ayam potong dengan metode

    Lowry ..................................................................................................... 44

    Tabel 6. Jenis pita protein spesifik yang muncul pada jaringan otot daging

    Ayam potong berdasarkan berat molekulnya......................................... 50

    Tabel 7. Data intensitas profil protein berat molekul kisaran 28-36 kDa

    (Rf diantara 700-800) ............................................................................ 51

  • vii

    DAFTAR GAMBAR

    Halaman

    Gambar 1. Pembentukan protein dari asam amino ............................................ 10

    Gambar 2. Gambaran struktur sel otot .............................................................. 11

    Gambar 3. Saluran darah, oeshopagus dan trakhea diantara leher dan kepala

    ayam ................................................................................................ 15

    Gambar 4. Diagram skema pemingsanan ayam dengan waterbath electrical

    stunning ............................................................................................ 18

    Gambar 5. Cara kerja elektroforesis .................................................................. 23

    Gambar 6. Alat elektroforesis SDS-PAGE ....................................................... 26

    Gambar 7. Ayam potong sebelum penyembelihan (a) Usia 4 minggu (1 kg)

    (b) Usia 5 minggu (1,7 kg) .............................................................. 37

    Gambar 8. Warna sampel daging ayam potong setelah proses penyembelihan ....

    ......................................................................................................... 38

    Gambar 9. Ekstrak kasar protein jaringan otot daging ayam potong bagian

    paha ................................................................................................ 40

    Gambar 10. Reaksi pembentukan kompleks pewarnaan biru pada metode

    Lowry ............................................................................................. 43

    Gambar 11.Gel ke-1 Pemisahan Elektroforesis Jaringan Otot Daging Ayam

    Potong 1, 2 (Duplo Ayam Potong 4 minggu (1 Kg)); A

    (Perlakuan Stunning Halal); B (Perlakuan Stunning Haram); C

    (Perlakuan Non Stunning Halal) dan Marker (M) ......................... 47

  • viii

    Gambar 12.Gel ke-2 Pemisahan Elektroforesis Jaringan Otot Daging Ayam

    Potong 3, 4 (Duplo Ayam Potong 5 minggu (1,7 Kg)); A

    (Perlakuan Stunning Halal); B (Perlakuan Stunning Haram); C

    (Perlakuan Non Stunning Halal) dan Marker (M) ......................... . 47

    Gambar 13.Perbedaan intensitas pada densitogram masing-masing sanpel

    jaringan otot daging ayam potong 1 (Ayam Potong 4 minggu (1

    Kg)); 3 (Ayam Potong 5 minggu (1,7 Kg)); A (Perlakuan

    Stunning Halal); B (Perlakuan Stunning Haram); C (Perlakuan

    Non Stunning Halal ........................................................................ . 52

    Gambar 14. Alur elektroporasi ........................................................................... 54

  • ix

    DAFTAR LAMPIRAN

    Halaman

    Lampiran 1. Gambar bahan dan alat penelitian ................................................... 66

    Lampiran 2. Gambar metode penelitian ............................................................... 68

    Lampiran 3. Komposisi reagen dan larutan ......................................................... 70

    Lampiran 4. Pembuatan deret konsentrasi BSA pada uji kadar protein

    sampel dengan metode Lowry ........................................................ 72

    Lampiran 5. Nilai serapan pada metode Lowry ................................................... 73

    Lampiran 6. Kandungan kadar protein pada sampel............................................ 74

    Lampiran 7. Hasil persamaan garis kurva standar marker protein ...................... 76

    Lampiran 8. Tampilan software ImageJ 1.46 ...................................................... 79

    Lampiran 9. Data gel elektroforesis ..................................................................... 80

  • 1

    BAB I

    PENDAHULUAN

    1.1 Latar Belakang

    Kualitas kehidupan masyarakat yang sehat memerlukan adanya kebutuhan

    pangan yang sempurna. Salah satu pangan yang sempurna adalah terpenuhinya

    komposisi gizi berupa protein sebagai zat pembangun dan pengatur dalam tubuh.

    Sumber protein terbesar dalam tubuh adalah daging (Winarno, 2002). Diantara

    sumber protein daging yang banyak dikonsumsi adalah daging ayam. Pusat

    Informasi dan Pasar Unggas Nasional (Pinsar) menyebutkan bahwa produksi

    ayam potong nasional tahun 2014 mencapai hingga 2,4 miliar ekor. Pemilihan

    ayam potong sebagai sumber protein dikarenakan harganya yang relatif murah,

    mudah diperoleh dan mudah dalam pengolahan (Winedar et al., 2006).

    Pemenuhan daging ayam potong sebagai sumber protein dari hari kehari

    semakin meningkat. Hal ini membuat Rumah Potong Hewan (RPH), harus

    memenuhi kebutuhan daging ayam potong tersebut. Namun, sebagian besar RPH

    di Indonesia belum memiliki sertifikat halal. Faktanya adalah dari 700 RPH di

    seluruh Indonesia hanya 120 RPH yang disertifikasi halal oleh MUI (LPPOM

    MUI, 2012).

    Salah satu perhatian khusus terhadap aspek kehalalan produk pangan

    hewan ternak adalah terkait dengan pra-penyembelihan, penyembelihan dan

    pasca-penyembelihan (Farouk, 2013). Salah satu riwayat Hadist nabi menyatakan;

  • 2

    Bahwasanya Allah memerintahkan berbuat baik atas segala sesuatu, jika

    kalian membunuh, bunuhlah yang baik dan jika kamu menyembelih, sembelihlah

    dengan baik, hendaklah diantara kamu menajamkan pisaunya dan mempercepat

    mematikan sembelihannya (HR. Muslim dari Syaddad bin Aus ra.).

    Berdasarkan Hadits tersebut, perlu adanya penanganan penyembelihan

    dengan metode yang islami baik cara maupun penyiapan prasarananya. Saat ini

    banyak dilakukan penyembelihan secara modern, yaitu banyaknya jumlah hewan

    yang disembelih dalam satu waktu sehingga memerlukan waktu yang sangat cepat

    dan dibutuhkan perlakuan khusus untuk penyembelihannya. Salah satu perlakuan

    khusus tersebut adalah pemberian electrical stunning atau pemingsanan dengan

    cara melemahkan hewan sebelum proses penyembelihan menggunakan arus

    listrik. Banyak ulama yang melarang adanya proses tersebut, namun sebagian

    ulama yang membolehkan harus sesuai dengan syarat bahwa hewan tidak mati

    sebelum disembelih dan tidak membuat cidera permanen pada hewan (Prastowo,

    2014).

    Menurut Yenrina et al. (2010), penggunaan electrical stunning dapat

    menyebabkan ayam potong mati sebelum dilakukan proses penyembelihan

    mencapai sekitar 1035% kematian. Hal ini dapat terjadi karena dari kekuatan

    setiap hewan terhadap proses stunning sangat bervariasi, dipengaruhi oleh kondisi

    tubuh hewan, usia dan lainnya. Misalnya pada ayam potong jenis betina memiliki

    hambatan listrik lebih tinggi dibanding ayam potong jantan sehingga dibutuhkan

    arus listrik yang sesuai dengan kondisi ayam potong masing-masing (Rawles et al,

    1995).

  • 3

    Menurut Reilly (1994) electrical stunning dengan tegangan listrik sebesar

    220 V selama 4 detik dapat menyebabkan kerusakan otak pada ayam broiler yang

    parah hingga menyebabkan kematian, akibatnya cara ini termasuk cara yang

    menyiksa hewan dan menjadikan kehalalannya diragukan. Berdasarkan syarat

    penyembelihan dengan electrical stunning halal, tegangan listrik yang digunakan

    harus sebesar 10-25 V selama 5-10 detik melalui waterbath (LPPOM MUI, 2012).

    Perbedaan daging ayam potong yang diperoleh melalui pra-penyembelihan

    yang sudah ataupun belum memperhatikan aspek kehalalan, dapat dilakukan

    dengan pemeriksaan terhadap protein biomarker spesifik. Protein biomarker

    adalah protein yang terekspresi secara spesifik dengan adanya perlakuan tertentu

    sebagai akibat dari respon fisiologi dan neurologis yang terjadi baik di dalam

    maupun di luar sel. Protein biomarker ini berkaitan dengan pengembangan

    metode analisa kehalalan pangan khususnya bersumber dari ayam potong yang

    dilakukan pra-penyembelihan berbeda (Bendixen , 2005).

    Penelitian sebelumnya telah dilakukan oleh Doherty et al., (2004) yang

    menyatakan pertumbuhan ayam potong sejak usia 1 hari hingga 27 hari yang

    disembelih dengan gas stunning CO2, menunjukkan tingkat ekspresi protein yang

    berbeda setiap sampelnya. Penelitian lainnya yang dilakukan oleh Zaman et al.,

    (2012) melalui perbedaan metode penyembelihan ayam potong dengan memutus

    leher hingga terpisah dari badannya dan hanya memutus tiga saluran,

    menunjukkan karakteristik protein yang terekspresi pada daerah bobot molekul

    45-66 kDa. Selain itu metode pra-penyembelihan berbeda telah dilakukan oleh

    Samah et al.,(2011) yang menunjukkan bahwa ayam potong akibat perlakuan

  • 4

    stunning dengan arus listrik 0,75 A dan 70 V menghasilkan spot protein yang

    relatif berbeda jika dibandingkan dengan kontrol yang tidak dilakukan stunning.

    Melalui beberapa metode penyembelihan ayam potong tersebut, hingga

    saat ini belum banyak informasi atau penelitian yang mengidentifikasi profil

    protein biomarker yang diisolasi dari jaringan otot daging ayam potong dengan

    pra-penyembelihan yang berbeda terutama dengan perlakuan electrical stunning

    pada rentang berat tubuh atau usia yang berbeda. Jaringan otot merupakan salah

    satu jenis sel yang paling banyak pada daging dan bersifat kontraktil serta

    memiliki fungsi khusus dalam metabolisme yang sangat bergantung pada

    sejumlah besar protein di dalam bagian jenis dan bagian dagingnya (Ohlendieck,

    2011).

    Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi protein-protein spesifik

    yang terekspresi pada jaringan otot daging ayam potong yang dilakukan dengan

    pra-penyembelihan berbeda yakni melalui electrical stunning dan non electrical

    stunning. Hasil analisis proteomik ini diharapkan dapat diperoleh informasi

    mengenai beberapa jenis protein berbeda yang terekspresikan di dalam jaringan

    otot daging ayam potong. Selain itu, analisis proteomik juga diarahkan untuk

    memetakan profil protein spesifik yang nantinya dapat digunakan sebagai

    kandidat biomarker untuk analisa kehalalan produk pangan.

  • 5

    1.2 Rumusan Masalah

    1. Bagaimanakah profil protein jaringan otot daging ayam potong pada pra-

    penyembelihan electrical stunning dan non electrical stunning

    berdasarkan tingkat ekspresi dan berat molekul nya?

    2. Apakah terdapat protein spesifik yang terekspresi dan dapat dijadikan

    sebagai kandidat biomarker untuk mendeteksi kehalalan akibat perlakuan

    pra-penyembelihan electrical stunning dan non electrical stunning?

    1.3 Hipotesis Penelitian

    1. Terdapat perbedaan profil protein jaringan otot daging ayam potong pada

    pra-penyembelihan electrical stunning dan non electrical stunning

    berdasarkan tingkat ekspresi dan berat molekul nya.

    2. Perlakuan Over Voltage pada electrical stunning akan menghasilkan

    protein tertentu yang spesifik dan dapat dijadikan sebagai kandidat

    biomarker pendeteksi kehalalan daging ayam potong.

  • 6

    1.4 Tujuan Penelitian

    1. Mengidentifikasi perbedaan profil protein jaringan otot daging ayam

    potong yang terekspresi pada pra-penyembelihan secara electrical

    stunning dan non electrical stunning.

    2. Mengidentifikasi protein spesifik yang diduga sebagai kandidat biomarker

    dari jaringan otot daging ayam potong pada pra-penyembelihan secara

    electrical stunning dan non electrical stunning berdasarkan tingkat

    ekspresi dan berat molekul protein.

    1.5 Manfaat Penelitian

    Penelitian yang dilakukan ini diharapkan dapat memberikan informasi

    mengenai profil protein spesifik sebagai kandidat biomarker yang dapat

    digunakan dalam pendeteksian kehalalan produk pangan pada daging ayam

    potong dengan pra-penyembelihan yang berbeda (secara electrical stunning dan

    non electrical stunning). Selain itu hasil penelitian ini diharapkan dapat

    memberikan kontribusi dalam pengembangan metode analisa kehalalan pangan

    terutama untuk produk-produk pangan berbasis hewani.

  • 7

    BAB II

    TINJAUAN PUSTAKA

    2.1 Sejarah dan Klasifikasi Ayam

    Menurut sejarahnya, ayam jinak yang dipelihara manusia sekarang adalah

    berasal dari ayam liar. Keturunan ayam yang telah menjadi jinak kemudian

    disilang-silangkan atau dikawin-kawinkan oleh manusia. Menurut teori terdahulu,

    ayam liar ini adalah ayam hutan atau Gallus gallus. Hirarki klasifikasi ayam

    menurut Sarwono et al.,(2003) adalah sebagai berikut:

    Kingdom : Animalia

    Subkingdom : Metazoa

    Phylum : Chordata

    Subphylum : Vertebrata

    Divisi : Carinathae

    Kelas : Aves

    Ordo : Galliformes

    Family : Phasianidae

    Genus : Gallus

    Spesies : Gallus gallus domestica sp

    Ayam potong atau ayam broiler atau ayam ras merupakan hasil rekayasa

    genetika yang dihasilkan dengan cara menyilangkan sesama spesies ayam.

    Kebanyakan induknya diambil dari Amerika dan prosesnya diawali dengan

    mengawinkan sekelompok ayam dalam satu keluarga, kemudian dipilihlah

    turunannya yang tumbuh paling cepat. Diantaranya saling disilangkan kembali

    dan keturunannya diseleksi lagi, hasil keturunan yang cepat tumbuh kemudian

    dikawinkan dengan sesamanya. Demikian seterusnya hingga diperoleh ayam yang

    paling cepat tumbuh maka disebut ayam broiler (Indro, 2004).

  • 8

    Ayam potong adalah ayam jantan atau betina yang umumnya dipanen pada

    umur 5-6 minggu dengan tujuan sebagi penghasil daging. Ayam potong berumur

    dibawah delapan minggu dengan berat hidup 1,52,8 kg bahkan pemasaran ayam

    potong dikelompokkan berdasarkan berat hidup, yaitu 0,81 kg; 11,2 kg; 1,21,4

    kg; 1,41,6 kg; 1,61,8 kg dan lebih dari 1,8 kg dengan masa pemeliharaan

    selama 2540 hari (Suharti, 2008). Pertumbuhan yang paling cepat terjadi sejak

    menetas sampai umur 4-6 minggu, kemudian mengalami penurunan dan terhenti

    sampai mencapai dewasa (Kartasudjana et al., 2006). Standar bobot badan ayam

    broiler dapat dilihat pada Tabel 1.

    Tabel 1. Standar bobot badan ayam broiler berdasarkan jenis kelamin pada umur

    1 sampai 6 minggu.

    Umur

    (minggu) Jantan (g) Betina (g)

    1 152 144

    2 376 344

    3 686 617

    4 1085 965

    5 1576 1344

    6 2088 1741

    Sumber: NRC (1994)

    Periode pertumbuhan ayam broiler dibagi menjadi 2 yaitu; periode starter

    dan periode finisher. Periode starter pada ayam broiler dimulai sejak umur 1 hari

    sampai umur 21 hari dan periode finisher dimulai sejak umur 21 hari sampai

    panen (Rasyaf, 1996). Ayam broiler mengalami pertumbuhan yang berlangsung

    cepat pada periode starter yang kemudian pertumbuhan akan berlangsung

    melambat dan terjadi karena penimbunan lemak tubuh (Wahju, 1997).

  • 9

    2.2 Komposisi Gizi Daging Ayam Potong

    Ditinjau dari segi mutu, daging ayam memiliki nilai gizi yang lebih tinggi

    dibandingkan hewan ternak lainnya. Daging ayam mempunyai kandungan protein

    yang lebih tinggi, komposisi protein ini sangat baik karena mengandung semua

    asam amino esensial yang mudah dicerna dan diserap oleh tubuh. Akan tetapi

    daging ayam juga mempunyai kadar lemak yang cukup tinggi dibandingkan

    hewan ternak lainnya (Surisdiarto et al., 1990). Kandungan gizi yang dimiliki

    jenis daging ayam (100 gram) adalah kadar protein 23,6%, lemak 7%, kolesterol

    62 mg dan kalori 135 Kkal (Anggorodi, 1995).

    Protein adalah komponen bahan kering yang terbesar dalam daging. Nilai

    nutrisi daging yang lebih tinggi disebabkan karena daging mengandung beberapa

    asam amino esensial yang lengkap dan seimbang. Kandungan protein di dalam

    otot yaitu 16% - 22%. Secara umum, komposisi kimia daging terdiri atas 75% air,

    18% protein, 3,5% lemak dan 3,5% zat-zat non protein yang dapat larut (Lawrie,

    2003).

    Protein merupakan makro molekul yang berlimpah di dalam sel dan

    menyusun lebih dari setengah berat kering hampir pada semua organisme

    (Lehninger, 1998). Molekul protein terutama tersusun oleh atom karbon (51,0-

    55,0%), hidrogen (6,5-7,3%), oksigen (21,5-23,5%), nitrogen (15,5-18,0%) dan

    sebagian besar mengandung sulfur (0,5-2,0%) dan fosfor (0,0-1,5%) (Anggorodi,

    1979). Nilai gizi protein ditentukan oleh kandungan dan daya cerna asam-asam

    amino esensial. Daya cerna akan menentukan ketersediaan asam-asam amino

    tersebut secara biologis. Selain itu pengertian protein (Gambar 1) adalah

    makromolekul yang terdiri atas asam-asam -amino yang saling berikatan

  • 10

    dengan ikatan kovalen diantara gugus -karboksil asam amino dengan gugus -

    amino dari asam amino yang lain. Ikatan di antara asam amino disebut ikatan

    peptida. Beberapa unit asam amino yang berikatan dengan ikatan peptida

    disebut polipeptida. Molekul protein dapat terdiri atas satu atau sejumlah rantai

    polipeptida dan setiap rantai dapat terdiri atas ratusan hingga jutaan residu asam

    amino (Girindra, 1986).

    Gambar 1. Pembentukan protein dari asam amino (Puri, 2013).

    Disebutkan presentase bagian dada ayam potong berdasarkan berat ayam

    potong adalah 22,70%, bagian paha sebesar 19,01% (Triyantini et al., 1997).

    Lebih rincinya gambaran nilai gizi daging ayam potong (broiler) dapat dilihat

    pada Tabel 2.

    Tabel 2. Gambaran nilai gizi daging ayam potong (Broiler)

    Sajian (100 g

    tanpa kulit)

    Protein Kalori Lemak Kolestrol Sodium Zat Besi

    Broiler Utuh 23 g 134 4,1 g 76 mg 73 mg 1 mg

    Daging Dada 24 g 116 1,5 g 72 mg 63 mg 0,9 mg

    Sayap 23 g 147 5,6 g 72 mg 76 mg 1 mg

    Paha Bawah 21 g 131 3,8 g 79 mg 81mg 1,1 mg

    Sumber : Dinas Peternakan dan Kesehatan Hewan Pemerintahan Lampung (2014).

  • 11

    2.2.1 Protein Jaringan Otot Daging Ayam Potong

    Otot (Gambar 2) mengandung protein sekitar 19% dengan kisaran 16%-

    22% (Forrest et al., 1975). Otot terbuat dari kumpulan sel yang disebut serabut

    otot. Setiap sel penuh dengan filamen yang terbuat dari dua protein yaitu aktin dan

    myosin. Ini termasuk kelompok protein sepanjang membran, yang mengelilingi

    setiap serat dalam membantu sel untuk menjaga sel-sel otot bekerja dengan benar.

    Protein yang terdapat dalam jaringan otot terdiri atas 70% protein struktural

    berupa protein fibril serta 30% protein larut-air. Protein fibril mengandung sekitar

    32-38% miosin, 13-17% aktin, 2-7% tropomiosin dan 6% protein stroma.

    Gambar 2. Gambaran struktur sel otot (http://mda.org )

    http://mda.org/

  • 12

    Protein larut-air terdiri atas mioglobin dan enzim yang berperan dalam

    proses metabolisme sel otot. Protein ini mudah dipisahkan dengan cara ekstraksi

    dengan larutan garam lemah (kekuatan ion < 0,1). Miosin merupakan protein otot

    dengan jumlah yang paling besar dan merupakan molekul asimetrik dengan bobot

    molekul sekitar 500 kDa, dengan kandungan -helik sebesar 60-70%. Miosin

    dapat dipisahkan dengan ultrasentrifugasi menjadi dua sub unit, meromiosin berat

    (220 kDa) dan meromiosin ringan (20 kDa). Protein fibril lainnya, aktin terdapat

    dalam dua bentuk, yang pertama berupa monomer disebut aktin-G dengan bobot

    molekul 47 kDa dan aktin-F (fibrous) dengan bobot molekul yang lebih tinggi.

    Unit aktin bergabung membentuk heliks ganda dengan panjang yang tidak

    tentu. Aktomiosin merupakan kompleks aktin-F dengan miosin dan

    bertanggungjawab atas proses kontraksi dan relaksasi otot. Mikrofilamen yang

    lain yang terdapat pada zona H yaitu tropomiosin dan troponin yang terdiri dari

    tiga jenis molekul, troponin I, C dan T. Keberadaan tropomiosin dan troponin

    dalam sel otot berperan dalam proses pengikatan miosin (Nazar, 2007). Peran

    struktural mikrofilamen dalam sitoskeleton ialah untuk menahan tegangan (gaya

    tarik). Bergabungnya dengan protein lain, mikrofilamen sering membentuk jalinan

    tiga dimensi yang berada tepat di dalam membran plasma dan membantu

    mendukung bentuk sel untuk gerakan molekul miosin yang menempel di

    mikrofilamen.

  • 13

    Sebanyak 53 jenis protein telah ditemukan terdapat dalam otot rangka

    ayam seperti yang tersaji dalam Tabel 3.

    Tabel 3. Protein dari otot rangka ayam

    Sumber : Doherty et al., (2004)

    No Identifikasi Nilai

    BM

    % Ca-

    kupan

    Pasangan

    Peptida

    Massa

    BM

    pI Spesies No .

    Acc

  • 14

    2.2.2 Pengujian Kadar Protein Metode Lowry

    Metode yang dilakukan untuk penetapan kadar protein pada penelitian ini

    adalah dengan metode Lowry. Metode Lowry merupakan salah satu metode untuk

    menentukan konsentrasi protein. Metode ini merupakan pengembangan dan

    penggabungan dari metode Biuret dan metode Folin yang dikembangan pada

    tahun 1959 dengan menggunakan reagen pendeteksi Folin-Ciocalteu. Dalam

    bentuk yang paling sederhana reagen Folin-Ciocalteu dapat mendeteksi residu

    tirosin (dalam protein), karena kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu

    mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang merupakan konstituen utama

    reagen Folin-Ciocalteu menjadi kompleks tungsten dan molybdenum yang

    berwarna biru. Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorpsi yang lebar pada

    daerah merah dari spektrum sinar tampak (600-800 nm).

    Sensitifitas dari metode Folin-Ciocalteu ini mengalami perbaikan yang

    cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu (metode Biuret). Kompleks

    Cu-protein yang dihasilkan oleh reagen biuret akan menyebabkan reduksi pula

    pada fosfotungstat dan fosfomolibdat dalam reagen Folin-Ciocalteu. Sekitar 75%

    dari reduksi yang terjadi diakibatkan oleh adanya kompleks Cu-protein tersebut,

    sementara residu-residu tirosin dan triptofan mereduksi 25% sisanya.

    2.3 Penyembelihan Ayam Potong

    Penyembelihan dalam agama Islam disebut dzakah yang secara lutghoh

    diartikan membaikkan (membaikkan dalam memakannya), secara syari'ah

    (istilah) diartikan memotong bagian tertentu. Bagi negara yang mayoritas muslim

    penyembelihan dengan metode Islam, yaitu dengan sistem dzabh dengan

  • 15

    memotong mari' (kerongkongan), hulqum (jalan pernapasan) dan dua urat darah

    leher (Nuhriawangsa, 1999).

    Pada tempat penyembelihan ayam, ayam yang disembelih adalah melalui

    bagian leher dekat kepala dengan memotong vena jugularis dan arteri karotid

    (Gambar 3) menggunakan metode pemotongan yang religius (Parry, 1989).

    Arteri karotid (ka)

    Arteri karotid (ki)

    Vena jugularis (ka)

    Vena jugularis (ki)

    Oeshopagus

    Trakhea

    Gambar 3. Saluran darah, oeshopagus dan trakhea diantara leher dan kepala ayam

    (Gregory, 1989)

    Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam penyembelihan secara

    Islam yang digolongkan menjadi empat persoalan. Syarat pertama berhubungan

    dengan hewan sembelihan: hewan masih dalam keadaan hidup dan termasuk yang

    dihalalkan. Syarat kedua berhubungan dengan alat untuk menyembelih: alat harus

    benar-benar tajam dan terbuat dari logam, batu dan kayu. Syarat yang ketiga

    berhubungan dengan orang yang menyembelih meliputi: (1) orang yang telah

    disepakati boleh melakukan penyembelihan yaitu Islam, lelaki dewasa, berakal

    dan tidak melalaikan sholat, (2) orang yang dilarang untuk melakukan

  • 16

    penyembelihan yaitu orang-orang musyrik penyembah berhala, (3) orang yang

    masih diperselisihkan dalam menyembelih yaitu ahli kitab, Majusi dan Shabi'in,

    wanita dan anak-anak, orang gila, orang mabuk, orang yang melalaikan sholat,

    pencuri dan perampas harta orang lain. Syarat keempat berhubungan dengan saat

    penyembelihan: menyebut nama Allah, menghadapkan hewan sembelihan ke

    kiblat dan niat saat menyembelih (Nuhriawangsa, 1999).

    2.3.1 Penyembelihan dengan Pemingsanan (Stunning)

    Rumah pemotongan ayam biasa dilakukan proses pemingsanan sebelum

    penyembelihan dengan alat pemingsan elektronik atau electrical stunning

    (Mountney, 1976). Pemingsanan biasa dilakukan dengan menggunakan aliran

    listrik pada suatu water bath yang berjalan dengan memasang electrode (Gambar

    4). Dengan metode model electric stunning via water bath, ayam kurang berisiko

    banyak menyebabkan kematian yang berarti. Dengan pengaturan arus listrik yang

    tepat, untuk stunning ayam potong berkisar: 15-25 volt, 0,1-0,3 ampere, 5-10

    detik dan

  • 17

    Cara-cara penyembelihan hewan dengan sistem mekanisasi stunning yang

    digambarkan oleh Komisi Fatwa MUI :

    1. Bahwa penggunaan mesin untuk pemingsanan dimaksudkan mempermudah

    roboh dan jatuhnya hewan yang akan disembelih di tempat pemotongan dan

    untuk meringankan rasa sakit hewan.

    2. Bahwa hewan yang roboh dipingsankan di tempat penyembelihan apabila

    tidak disembelih akan bangun sendiri lagi segar seperti semula keadaanya.

    3. Bahwa penyembelihan dengan sistem ini tidak mengurangi keluarnya darah

    mengalir, bahkan akan lebih banyak dan lebih lancar sehingga dagingnya

    lebih bersih (LPPOM MUI, 1976).

    Syarat-syarat yang harus diperhatikan dalam penyembelihan ayam dengan

    stunning adalah sebagai berikut:

    1. Pemingsanan ayam harus dilakukan segera mungkin untuk menghilangkan

    rasa sakit, namun demikian dihindarkan ayam mati karena arus listrik.

    2. Ayam yang telah pingsan segera disembelih dan ditunggu hingga pengeluaran

    darah sempurna untuk diproses lebih lanjut.

    3. Apabila ayam belum juga pingsan, maka ayam harus dilepas dari penggantung

    kaki dan dipisah. Selanjutnya diistirahatkan sementara untuk diulang proses

    pemingsanan dari mulai sejak awal.

    4. Petugas yang melayani proses pemingsanan ayam harus paham tugasnya,

    termasuk cara penyembelihan yang benar dan baik sesuai syarat Islam.

    5. Hanya petugas yang berkompetensi penguasaan operasional alat stunning

    ayam yang berhak menangani peralatan tersebut.

  • 18

    6. Ayam harus segera disembelih dalam waktu 10 detik setelah pingsan dengan

    pisau tajam.

    7. Ayam harus dipastikan telah mati karena disembelih dan baru dapat

    dimasukkan ke dalam air panas (scalding tank) untuk proses pencabutan bulu

    (Prastowo, 2014).

    Gambar 4. Diagram skema pemingsanan ayam dengan waterbath electrical stunning

    (Kettlewell, 1990)

    2.3.2 Penyembelihan Tanpa Pemingsanan (Non Stunning) atau Manual

    Tata cara menyembelih binatang secara tradisional atau manual atau tanpa

    pemingsanan yaitu dengan tanpa pemotongan menggunakan mesin, diantaranya :

    1. Menyiapkan terlebih dahulu lubang penampung darah.

    2. Peralatan yang akan digunakan untuk menyembelih disiapkan terlebih dahulu.

    3. Binatang yang akan disembelih dibaringkan menghadap kiblat, lambung kiri

    bawah.

    4. Leher binatang yang akan disembelih diletakkan di atas lubang penampung

    darah yang sudah disiapkan.

  • 19

    5. Kaki binatang yang akan disembelih dipegang kuat-kuat atau diikat.

    6. Mengucap basmalah, kemudian alat penyembelihan digoreskan pada leher

    binatang yang disembelih sehingga memutuskan jalan makan, minum, nafas,

    serta urat nadi kanan dan kiri pada leher binatang (Nugroho, 2013).

    2.4 Biomarker

    Perkembangan ilmu pengetahuan yang sangat pesat dewasa ini,

    memungkinkan saling menunjangnya perkembangan berbagai disiplin ilmu

    pengetahuan. Beberapa kemajuan tersebut antara lain adalah perkembangan ilmu

    biologi molekuler yang memungkinkan diperolehnya suatu marker (penanda) gen

    (Widodo, 2003).

    Marker dalam teknik uji hayati, dapat mengetahui metabolit atau

    perangkat metabolit yang dapat dipakai untuk menguji ketidaknormalan dalam

    suatu sistem biologis. Marker (penanda) secara kimiawi dapat mengetahui banyak

    senyawa yang akan ditentukan. Marker ini dapat pula disebut sebagai senyawa

    penciri yang bersifat aktif. Senyawa penciri dapat bersifat aktif dan tidak aktif,

    tapi bersifat stabil selama proses. Pencirian ini dapat dimasukkan pada suatu

    metode identifikasi senyawa murni dan juga metode untuk menentukkan golongan

    apa yang terdapat dalam campuran kasar (Robinson, 1995).

    Biomarker adalah protein, lemak atau makromolekul lain yang dapat

    diukur secara objektif dan berhubungan dengan proses biologis, mekanisme

    regulasi atau respons terhadap suatu intervensi terapeutik (Mueller, 2008).

    Biomarker dipahami sebagai suatu biomolekul yang timbul akibat suatu proses

    fisiologik maupun patologik (Capelastegui et al, 2006). Secara lebih spesifik,

  • 20

    sebuah biomarker menunjukkan perubahan dalam ekspresi atau keadaan protein

    yang berkorelasi dengan perlakuan yang diberikan (Michels et al., 2003).

    2.5 Proteomik

    Semua sifat dan mekanisme biologis yang terkait dengan aktifitas makhluk

    hidup dikendalikan oleh serangkaian gen dan tingkat ekspresi protein pada

    makhluk hidup tersebut. Sifat-sifat biologis telah banyak dipelajari oleh para ahli

    genetika, fisiologi, biologi sel dan biokimia yang melakukan berbagai eksperimen

    selama puluhan tahun untuk mencirikan mekanisme biologis di balik variabilitas

    sifat-sifat makhluk hidup. Semua aspek yang berkaitan dengan variabilitas

    makhluk hidup dapat ditelusuri melalui pendekatan genomik dan proteomik.

    Dalam ilmu pertanian serta dalam semua ilmu kehidupan lainnya, pendekatan

    genomik dan proteomik merupakan langkah penting dalam menunjang

    peningkatan kualitas produk dan pengembangan metode produksi ternak yang

    lebih berkelanjutan (Bendixen, 2005).

    Menurut definisi klasik, proteomik merupakan kumpulan protein dari

    suatu genom (Wilkins et al., 1996). Proteomik mengacu pada kajian ilmiah

    mengenai karakteristik seluruh protein komplemen yang diekspresikan dalam sel

    atau suatu jaringan. Tujuan dari pendekatan proteomik adalah untuk memperoleh

    informasi tentang ekspresi protein seluler, dengan demikian juga mengungkapkan

    fungsi gen, untuk menjelaskan bagaimana faktor keturunan dan lingkungan

    berinteraksi dalam mengontrol fungsi seluler dan membentuk ciri-ciri fisiologis

    suatu organisme hidup.

  • 21

    Proteomik adalah studi skala besar protein, khususnya struktur dan fungsi.

    Proteome adalah komplemen seluruh protein dan proteomik menegaskan

    kehadiran protein serta menyediakan ukuran langsung dari jumlah ini. Para

    ilmuwan sangat tertarik pada proteomik karena memberikan pemahaman yang

    lebih baik dari suatu organisme dari genomik.

    Tujuan dari ekspresi proteomik adalah untuk menemukan penanda

    molekuler, atau sering disebut biomarker. Eksplorasi biomarker saat ini telah

    mendapatkan banyak perhatian dalam semua ilmu biologi, yang dapat digunakan

    untuk meningkatkan berbagai aplikasi, termasuk metode yang digunakan dalam

    produksi dan pengolahan daging (Pan et al., 2005).

    2.6 Elektroforesis

    Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

    bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik

    (Westermeier, 2004). Ada juga yang menyebutkan bahwa elektroforesis

    merupakan teknik untuk memisahkan molekul-molekul seperti protein atau

    fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan migrasi melewati gel

    elektroforesis. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan

    mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis

    adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan

    molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan di dalam

    medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan.

    Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negative akan bergerak dari

    kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis (Lawrence, 1989).

  • 22

    Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada

    muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat di gunakan

    untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul

    yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,

    atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer (Yuwono, 2005). Alasan

    elektroforesis sering digunakan dalam penelitian, karena memiliki peran sangat

    penting dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi khususnya protein.

    Karena disamping metode tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer,

    tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang

    cukup kecil. Protein yang dialirkan dalam medium yang mengandung medan

    listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak dalam larutan

    sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul

    merupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul dan besar tipe muatan (Bachrudin,

    2000).

    Elektroforesis (Gambar 5) untuk makromolekul memerlukan matriks

    penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus

    listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks

    penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

    Elektroforesis yang sering digunakan adalah matriks bahan polyacrylamide gel

    electrophoresis (PAGE) (Hames, 1990; Matsudaira, 1993).

  • 23

    Gambar 5. Cara kerja elektroforesis (Schagger, 1987)

    Pergerakan protein pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor

    sebagai berikut:

    1. Ukuran molekul

    Molekul kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang

    tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.

    2. Konsentrasi gel.

    Konsentrasi gel yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul

    protein sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah protein

    berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah

    molekul protein berukuran besar untuk melintasi gel.

    3. Bentuk Molekul

    Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat

    melewati gel.

  • 24

    4. Pori-pori gel.

    Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan protein

    melewati gel.

    5. Voltase.

    Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul. Hal

    tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.

    6. Larutan buffer.

    Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik

    sehingga migrasi molekul akan lebih cepat.

    2.6.1 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-

    PAGE)

    SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan

    polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam

    praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE

    biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic

    mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan

    tingkat migrasi dan berat molekulnya (BM) dalam sebuah medan listrik). Protein

    yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi berdasarkan berat

    molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (KDa). Satu dalton sama dengan satu

    hidrogen molekul (Bachrudin, 1999).

    Penggunaan SDSPAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada

    protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat

    SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut (Dunn et

    al,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang

  • 25

    mengandung merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide),

    gliserol dan SDS (Walker, 1988). Muatan asli protein akan digantikan oleh

    muatan negatif dari anion yang terikat sehingga kompleks proteinSDS memiliki

    rasio muatan per berat molekul yang konstan (Hames, 1989).

    Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akrilamida

    dengan N.N` bisakrilamida. Kisikisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul

    sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk

    mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan

    untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor

    pemurnian protein (Walker, 1988). Tabel 4 di bawah memberikan komposisi yang

    disarankan dari gradien linier, yang berkaitan dengan berbagai konsentrasi

    akrilamida pada rentang molekul protein yang tepat.

    Tabel 4. Rekomendasi konsentrasi gel

    Sumber: Thermo Scientific (2014)

    Sampelsampel ekstrak protein yang diinjeksikan ke dalam sumur gel

    (Gambar 6) diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi

    pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat

    molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan

    protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Walker, 1988).

    Kisaran BM protein (kDa) Rekomendasi gel ( %)

    ~5-50 18

    ~10-80 14

    ~20-150 12

    ~30-200 10

    ~40-250 8

    ~60-300 6

    ~100-400 4

  • 26

    Gambar 6. Alat elektroforesis SDS-PAGE (http://lh3.ggpht.com)

    2.6.2 Analisis Densitometri

    Densitas merupakan kemampuan sebuah material untuk menyerap atau

    memantulkan sinar. Densitas dapat dibedakan menjadi dua bagian yaitu densitas

    transmisi yang merupakan kemampuan lapisan material untuk menyerap sinar

    yang datang dan yang kedua adalah densitas refleksi yaitu kemampuan lapian

    material untuk memantulkan sinar yang datang. Pengukuran densitas dapat

    menggunakan sebuah alat ukur yang disebut densitometer. Densitometer

    merupakan alat yang berfungsi untuk mengukur besarnya densitas atau dengan

    kata lain merupakan alat yang digunakan untuk mengukur derajat kehitaman atau

    kepekatan (densitas optis) suatu model atau bahan semi-transparan (Siregar M.L,

    2009).

    http://lh3.ggpht.com/

  • 27

    Analisis densitometri merupakan salah satu cara untuk mengkonfirmasi

    hasil elektroforesis. Hasil analisis densitometri terhadap pita-pita gel hasil

    elektroforesis dapat digunakan untuk konfirmasi keberadaan pita dan untuk

    kuantifikasi proporsi penyusun protein yang dielektroforesis (Aulanniam, 2004).

    Suatu pita menandakan adanya akumulasi protein pada gel hasil elektroforesis

    yang diidentifikasi oleh suatu puncak (peak). Masing-masing puncak memiliki

    karakteristik ketinggian (height) sebagai intensitas densitograf dan luas daerah di

    bawah kurva (area) sebagai gambaran kuantitas protein pada pita tersebut.

    Ketebalan pita pada gel hasil SDS-PAGE dikuantifikasi dalam bentuk luas daerah

    dibawah kurva pada kurva densitograf (Mustofa et al.,2006).

    Kuantifikasi intensitas pita dapat dilakukan dengan sistem digitalisasi

    automotik menggunakan software ImageJ 1.46. Software ini merupakan domain

    publik Java untuk pengolahan gambar dan program analisis yang terinspirasi dari

    NIH Image untuk Macintosh. Software ini didapat baik sebagai applet online atau

    sebagai aplikasi gratis yang dapat diunduh, pada setiap komputer dengan mesin

    virtual Java 1,5 atau yang lebih baru. Software ini dapat menampilkan, mengedit,

    menganalisa, memproses, menyimpan dan mencetak gambar 8-bit, 16-bit dan 32-

    bit. Software ini dapat membaca banyak format gambar termasuk TIFF, GIF,

    JPEG, BMP, DICOM, FITS dan data 'mentah'. Hal ini banyak sekali keuntungan,

    sehingga operasi tidak memakan waktu seperti membaca file gambar yang bisa

    dilakukan secara paralel dengan operations1 lainnya. Melalui software ini dapat

    menghitung luas dan nilai pixel statistik pilihan yang ditetapkan pengguna dan

    dapat mengukur jarak dan sudut. Selain itu, dapat membuat histogram dan plot

    profil garis. Pengukuran pita dalam penelitian ini, dilakukan pemindaian sebagai

  • 28

    JPEG dalam format 8 bit grayscale pada 600 dpi dan intensitas pixel. Derajat

    kehitaman pada gel SDS-PAGE digunakan software ini untuk menganalisa pita

    dan diukur dalam bentuk pixel. Pixel adalah unsur gambar atau representasi

    sebuah titik terkecil dalam suatu gambar grafis yang dihitung per inci (Rezvani et

    al., 2009).

  • 29

    BAB III

    METODE PENELITIAN

    3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

    Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pangan Pusat Laboratorium

    Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang dilaksanakan pada bulan

    November 2014-April 2015.

    3.2 Alat dan Bahan

    3.2.1 Alat

    Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, pisau,

    timbangan analitik, mikropipet 10-1000 L dan tip, vortex, stopwatch, shaker,

    homogenizer (Tokebi), tabung Eppendorf, tabung microtube, vial 10 mL, kuvet,

    High centrifuge Sorvall SC35, Microsentrifuge Sorvall, Spektrophotometer

    UV/Vis (Lambda 25 Perkin Elmer Precisely), Mini Protean II Cell

    Electrophoresis (Bio-Rad), lemari pendingin, penangas air, seperangkat alat

    electrical stunner, analisa BM dilakukan dengan menggunakan software Images J

    1.46.

    3.2.2 Bahan

    Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama

    yaitu 12 ekor ayam potong jenis ras strain Hubbard jantan yang dibagi menjadi 2

    kelompok, yaitu 6 ekor ayam potong dengan berat tubuh 1 kg (usia 4 minggu) dan

    6 ekor ayam potong dengan berat tubuh 1,7 kg (usia 5 minggu). Sampel diperoleh

    dari peternakan ayam potong lokal di kawasan Bekasi-Jawa Barat. Bahan-bahan

  • 30

    lainnya terdiri dari Aquabidest, BSA (Bovine Serum Albumin), reagen Lowry 1

    dan reagen Lowry 2, SDS (resodium dodecyl sulfat) 10%, Tris-HCl 0,05 M pH

    8,8, triton X-100 0,1%, PMSF (Phenil Methane Sulfonyl Fluoride),Buffer

    sample,-mercaptoetanol, Gel Acrylamide solution (30%T; 2,67oC) Bio-Rad,

    Resolving Buffer dan Stacking Buffer Bio-Rad, Ammonium peroksida disulfate

    (APS) 10%, N,N,NN-Tetramethylethylenediamine (TEMED), Running buffer 1

    kali Sigma, Staining solution coomasie blue R-250 Bio-Rad, Destaining solution,

    standar protein catalog #161-0318 (Bio-Rad) (Lampiran 3).

    3.3 Prosedur Penelitian

    3.3.1 Proses Penyembelihan dan Isolasi Sampel (Zaman et al., 2012)

    Sampel (daging ayam potong) masing-masing usia dibagi menjadi 3

    kelompok perlakuan: (i) Sampel ayam pertama adalah ayam potong yang

    disembelih dengan cara konvensional (non electrical stunning/ 0A, 0Volt)

    menggunakan pisau tajam dan diperlakukan sesuai dengan syariat islam

    (membaca basmalah dan hewan dibiarkan mati tanpa diikat) yang dijadikan

    sebagai kontrol; (ii) Sampel kedua, dilakukan penyembelihan dengan kaki ayam

    diikat menggunakan tali serta disembelih dengan cara electrical stunning dan

    sesuai dengan syariat islam (halal electrical stunning dengan pemberian arus

    listrik sebesar 100 mA, 25 Volt selama 10 detik); (iii) Sampel ketiga, dilakukan

    penyembelihan dengan kaki ayam diikat menggunakan tali serta disembelih

    dengan cara haram electrical stunning yang tidak sesuai dengan syariat islam

    (dengan pemberian arus listrik sebesar 100 mA, 220 Volt selama 30 detik).

    Jumlah arus dan voltase yang digunakan dipantau melalui amperometer. Masing-

  • 31

    masing perlakuan diulang sebanyak dua kali ulangan untuk masing-masing

    sampel. Fasilitas electrical stunner dirancang melalui power supply dengan arus

    dan tegangan yang bisa diatur secara manual. Elektroda positif dari electrical

    stunner dan terminal negatif amperometer direndam dalam wadah 35x25x10 cm3

    yang berisi air (Lampiran 2a). Sampel yang sudah disembelih dibiarkan hingga

    benar-benar mati dan dicabuti bulunya serta dibersihkan dari jeroan dan darah

    yang masih menempel dengan air hangat (45oC). Selanjutnya daging ayam

    tersebut diambil bagian pahanya kemudian dipotong dengan pisau hingga ukuran

    lebih kecil.

    Masing-masing jaringan otot daging ayam potong pada bagian paha

    dicacah sebanyak 20 g sampel dan dihomogenisasi di dalam es menggunakan 50

    ml Tris-HCl 0,05 M pH 8,8 dengan penambahan 50 L 0,1% triton X-100 dan

    250 L PMSF selama 5 menit. Larutan kemudian dimasukkan kedalam microtube

    dan disentrifugasi pada 6000 rpm selama 20 menit pada suhu 4C dan supernatan

    dikumpulkan (Lampiran 2d). Selanjutnya disimpan dalam vial 10 mL pada -80oC

    hingga digunakan untuk pengujian kadar protein dan SDS-PAGE.

    3.3.2 Pengukuran Kadar Protein (Lowry, 1959)

    3.3.2.1 Penentuan Nilai (Panjang Gelombang) Maksimum

    Larutan blanko dimasukkan kedalam kuvet pertama dan kuvet kedua diisi

    dengan larutan standar konsentrasi 80 ppm. Absorbans larutan dibaca pada

    kisaran panjang gelombang 600-800 nm dengan interval 5 mm menggunakan

    spektrofotometer uv-vis. Setiap interval panjang gelombang diukur dengan larutan

    standar dan blanko. Kemudian dibuat kurva hubungan panjang gelombang dengan

  • 32

    absorbans standar tersebut. Panjang gelombang yang tepat, selanjutnya ditentukan

    dan digunakan untuk pengukuran protein lainnya.

    3.3.2.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi

    Larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm dibuat dengan

    menimbang serbuk BSA sebanyak 3 mg kemudian dilarutkan dengan aquabides

    sebanyak 3 ml. Kemudian dilakukan pengenceran dengan seri konsentrasi 0, 40,

    80, 120, 160, dan 200 ppm (Lampiran 4).

    Larutan standar dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi

    sebanyak 1 ml, lalu ditambahkan dengan 5 ml reagen Lowry I, selanjutnya

    campuran divortex 5 detik dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.

    Kemudian campuran tersebut ditambahkan 0,5 ml reagen Lowry II, divortex 5

    detik dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Absorbansi larutan standar

    dibaca pada panjang gelombang maksimum dan dibuat kurva kalibrasi.

    3.3.2.3 Pengukuran Sampel

    Pengukuran kadar protein pada masing-masing sampel dilakukan dengan

    cara menambahkan 5 l larutan sampel (supernatan) dan 995 l Tris-HCl 0,05 M

    pH 8,8 dengan 5 ml reagen Lowry I, selanjutnya campuran divortex 5 detik dan

    diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian campuran tersebut

    ditambahkan 0,5 ml reagen Lowry II, divortex 5 detik dan diinkubasi pada suhu

    ruang selama 30 menit. Absorbansi larutan sampel protein dibaca pada panjang

    gelombang 600-800 nm. Kadar protein ditentukan melalui persamaan regresi

    linier dari kurva standar protein dengan bovine serum albumin (BSA) sebagai

    standarnya (Lampiran 5).

  • 33

    3.3.3 Elektroforesis Dodecyl Sulphate Poliacrilmide Gel Electrophoresis

    (SDS-PAGE) (Laemli, 1970)

    Elektroforesis sodium dodecyl sulphate poliacrilamide gel electrophoresis

    (SDS-PAGE) dilakukan dengan menggunakan metode standar menggunakan alat

    Mini-Protean II Slab Cell Electrophoresis (Bio Rad).

    3.3.3.1 Preparasi Sampel untuk Elekroforesis

    Sampel protein (ekstrak jaringan otot daging ayam potong) didenaturasi

    dengan buffer sample (Buffer Laemli) dengan perbandingan protein dan buffer

    1:4. Sebanyak 20 l sampel protein dicampurkan dengan 80 l buffer sample lalu

    dididihkan selama 5 menit, setelah dingin disentrifugasi pada 12000 rpm selama

    10 menit dan siap untuk dielektroforesis.

    3.3.3.2 Preparasi Gel Elekroforesis

    Gel poliakrilamid dibuat dari larutan stok akrilamid dan bisakrilamid

    (30%T, 2,67C), stacking buffer (Tris-HCl 0,5M pH 6,8), resolving buffer (Tris-

    HCl 1,5M pH 8,8), 10% SDS, APS10% dan TEMED. Formulasi gel untuk

    resolving gel adalah 14% (DDI H2O 2,7 ml, Acrilamid 4,7 ml, Resolving Gel

    Buffer 2,5 ml, SDS 10% 0,1 ml, APS 10% 0,2 ml dan TEMED 10 l). Sedangkan

    untuk stacking gel adalah 6% (DDI H2O 2,7 ml, Acrilamid 1 ml, Resolving Gel

    Buffer 1,25 ml, SDS 10% 50 l , APS 10% 100 l dan TEMED 10 L).

    Gel poliakrilamid dicetak diantara dua buah lempengan kaca dengan

    ketebalan 0,75 mm. Terlebih dulu campuran resolving gel dimasukkan dalam

    gelas plate melalui dindingnya agar tidak terbentuk gelembung, hingga kira-kira

    satu cm dari batas atas. Setelah gel mengering, larutan stacking gel yang telah

    dibuat dimasukkan ke dalam cetakan di atas resolving gel dan permukaan gel

  • 34

    dipasang sisir berlubang untuk membuat cetakan sumuran hingga mengeras.

    Setelah gel mengeras, cetakan gel dipindahkan ke perangkat elektroforesis dan

    siap untuk ditempatkan protein sampel.

    3.3.3.3 Loading Sampel

    Elektroforesis dimulai dengan memasang gelas plate dan dirangkai

    dengan frame dari Bio-Rad. Masing-masing sampel protein dengan kadar protein

    yang sama (Lampiran 5) dan 5 l marker yang telah dipreparasi dimasukkan ke

    dalam sumuran. Elektroforesis dijalankan dengan tegangan 150 volt. Proses ini

    dihentikan setelah warna biru turun (Buffer Laemmli turun) hingga 0,5 cm dari

    batas bawah plate.

    3.3.3.4 Pewarnaan Gel

    Pewarnaan gel hasil elektroforesis, dilakukan perendaman gel dalam

    larutan staining Coomasie briliant blue 0.1% (w/v) dengan shaker selama 30

    menit. Hasil staining dicuci dalam larutan destaining menggunakan campuran

    metanol:asam asetat (40%:7,5%). Protein yang telah didestaining discan untuk

    analisa lebih lanjut.

    3.3.3.5 Analisa Berat Molekul dan Tingkat Ekspresi Protein

    Setelah didapatkan gambar elektroforegram profil protein dalam bentuk

    soft copy, selanjutnya dilakukan analisis dengan menggunakan software ImageJ

    1.46 (http://imagej.nih.gov/ij), dimana ketebalan (intensitas) pita masing-masing

    protein dianalisis berdasarkan jarak migrasi atau nilai Rf (retention factor). Hasil

    analisis Rf dibandingkan untuk setiap pita protein marker yang sudah diketahui

    berat molekulnya melalui persamaan regresi linier Y = a + bX (Lampiran 7). Nilai

    Rf dijadikan sebagai sumbu x dan log berat molekul sebagai sumbu y, untuk

  • 35

    mendapat nilai berat molekul maka dibuat antilog berat molekul tersebut.

    Selanjutnya profil protein masing-masing sampel dianalisis intensitasnya dengan

    membandingkan puncak-puncak yang dihasilkan pada masing-masing perlakuan

    dengan software ImageJ 1.46.

  • 36

    3.4 Desain Penelitian

    Sampling Peternakan

    6 Ekor Ayam Potong 1 kg

    (usia 4 minggu)

    6 Ekor Ayam Potong 1,7

    kg (usia 5 minggu)

    Electrical Stunning Halal

    (100mA 25 Volt selama 10

    detik)

    Electrical Stunning

    Haram (100mA, 220

    Volt selama 30 detik)

    Non Electrical Stunning

    halal (kontrol, 0 V, 0 A)

    Penyembelihan

    Manual

    Isolasi Protein

    Uji Kadar Protein

    (Metode Lowry)

    Pemisahan Protein

    (SDS-PAGE)

    Analisis Densitometri

    (BM protein

    elektroforesis)

    Kandidat Protein

    Biomarker

  • 37

    BAB IV

    HASIL DAN PEMBAHASAN

    4.1 Karakteristik Ayam Potong Sebelum dan Sesudah Penyembelihan

    Sampel ayam potong jenis strain Hubbard yang dijadikan bahan penelitian

    diambil dari satu sumber peternakan dikawasan Bekasi-Jawa Barat. Ayam jenis

    strain Hubbard memiliki ciri-ciri yaitu bulu berwarna putih, bentuk badan padat,

    warna badan yang putih kemerahan, jengger dan pial berwarna merah. Berikut

    adalah gambar ayam potong jenis Hubbard yang digunakan dalam penelitian,

    yaitu usia ayam potong 4 minggu dan 5 minggu (Gambar 7).

    (a) (b)

    Gambar 7. Ayam potong sebelum penyembelihan

    (a) Usia 4 minggu (1 kg) (b) Usia 5 minggu (1,7 kg)

    Seluruh sampel yang diujikan dalam penelitian ini, memilki karakteristik

    dan ciri-ciri yang sama. Pengambilan ayam potong usia 4 minggu dilakukan,

    karena sebagian besar dari peternakan mulai melakukan penen dan penyebaran ke

    pengumpul ayam pada usia tersebut. Selanjutnya proses pengiriman ayam dari

    pengumpul hingga kepada konsumen biasanya ayam potong telah mencapai usia 5

    minggu (Winedar et al., 2006).

    Selanjutnya ayam potong dengan usia 4 minggu mulai dilakukan

    penyembelihan karena berat tubuhnya telah mencapai 1 kg, dalam kondisi ini

    sampel diambil pada masa periode starter (usia 1 hari sampai 21 hari) dan pada

  • 38

    periode finisher (usia 22 hari sampai 42 hari) untuk sampel ayam potong lain

    dengan usia 5 minggu berat 1,7 kg (Rasyaf, 1996). Pemilihan sampel dengan usia

    ayam potong yang berbeda bertujuan pula untuk melihat keterkaitan antara

    pengaruh adanya perlakuan pra-penyembelihan dengan electrical stunning dan

    usia ayam potong. Menurut Doherty et al., (2004) melalui elekroforesis 2D

    menyatakan bahwa profil protein pada ayam potong akan semakin beragam dan

    lebih spesifik seiring bertambahnya usia ayam. Hal tersebut yang dikhawatirkan

    menjadi pengaruh pada hasil perlakuan electrical stunning dalam penelitian ini.

    Proses penyembelihan dilakukan secara manual oleh orang yang sudah

    berkompeten dibidangnya dan sesuai dengan peraturan dan syarat penyembelihan

    (Hukum syari). Setelah proses penyembelihan pada masing-masing perlakuan

    (electrical stunning dan kontrol) ayam potong tersebut, terlihat perbedaan pada

    warna dagingnya (Gambar 8).

    Gambar 8. Warna sampel daging ayam potong setelah proses penyembelihan

    (i) non electrical stunning (ii) halal electrical stunning (iii) haram electrical stunning

    Sampel daging ayam potong dengan perlakuan (i) cara konvensional (non

    electrical stunning 0 mA, 0 Volt) dan (ii) halal electrical stunning dengan

    pemberian arus listrik sebesar 100 mA, 25 Volt selama 10 detik, daging ayam

    potong terlihat segar berwarna putih kemerahan, sedangkan (iii) haram electrical

    (i) (ii) (iii)

  • 39

    stunning dengan pemberian arus listrik sebesar 100 mA, 220 Volt selama 30 detik

    daging ayam potong berwarna merah gelap (Gambar 8).

    Menurut Asmara et al., (2006) daging ayam yang disembelih dengan cara

    yang benar dapat mengeluarkan darah dengan sempurna seperti pada sampel (i)

    dan (ii). Sesuai dengan pernyataan Cross (1988) bahwa warna merah pada daging

    ayam, disebabkan provitamin A yang terdapat pada lemak daging dan pigmen

    oksimioglobin. Hal ini didukung pula oleh penelitian Lawrie (2003) bahwa

    pigmen oksimioglobin adalah pigmen penting pada daging segar ayam potong.

    Berbeda dengan warna gelap pada daging ayam, yaitu diakibatkan pengeluaran

    darah berupa pigmen haemoglobin yang tidak sempurna (Lawrie, 2003). Daging

    ayam sampel (iii) pada penelitian ini berasal dari ayam sehat tetapi mengalami

    kerusakan fisik akibat electrical stunning yang over voltage dan sengaja dibiarkan

    mati tanpa proses penyembelihan. Perlakuan tersebut menyebabkan tidak

    terjadinya proses pengeluaran darah hingga ayam mengalami kematian. Pigmen

    haemoglobin yang masih terdapat di dalam daging ayam inilah yang

    menyebabkan perubahan warna daging menjadi gelap.

    4.2 Isolasi Protein dari Jaringan Otot Daging Ayam Potong

    Isolasi protein yang diperoleh dari jaringan otot daging ayam potong

    dilakukan pada bagian paha daging ayam. Menurut Soeparno (2005), otot paha

    adalah daging bagian tubuh ayam yang secara kuantitatif paling berat selain dada.

    Daging paha dapat digunakan sebagai pedoman penilaian kualitas daging atau

    produk ayam, dengan tingkat ketepatan sekitar 65% (Soeparno,1998). Daging

    ayam bagian paha termasuk kedalam jenis otot merah. Otot merah mengandung

  • 40

    mioglobin yang berfungsi sebagai pengikat besi dan pembawa komponen oksigen.

    Mioglobin sama seperti hemoglobin pada manusia, yaitu sebagai pigmen warna

    merah pembawa oksigen pada darah menuju otot (Nesheim et al., 1979). Aktivitas

    dari otot paha lebih banyak mempunyai cekaman untuk berdiri dan menyangga

    tubuh, sehingga warnanya pun menjadi lebih gelap. Begitu pula dengan hasil

    ekstraksi berupa supernatan yang bewarna kemerahan (Gambar 9).

    Gambar 9. Ekstrak kasar protein jaringan otot daging ayam potong bagian paha

    Proses Isolasi yang dilakukan terhadap jaringan otot daging ayam potong

    menggunakan buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,8 dan disentrifugasi pada 6000 rpm

    selama 20 menit dalam es. Menurut Janson et al., (1998) masalah utama dalam

    ekstraksi protein adalah dapat mengeluarkan protein dari dalam sel tanpa

    terdegradasi atau terdenaturasi dan kontaminasi sehingga hal tersebut dapat diatasi

    dengan pemilihan medium ekstraksi yang tepat, waktu persiapan cepat dan pada

    kondisi temperatur yang rendah.

    Tahap pertama dalam isolasi protein adalah proses perusakan atau

    penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan

    dari awal isolasi protein yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme et al.,

    1998). Menurut Wahniyathi et al. (2005), penghancuran jaringan otot daging

    ayam bertujuan untuk memecah membran sel serabut otot sehingga protein

  • 41

    jaringan otot dapat terekstraksi dengan larutan buffer. Pemilihan larutan buffer

    Tris-HCl 0,05 M dengan pH 8,8 dikarenakan buffer TrisHCl (Thromethamine

    HCl) berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfida dari protein. Selain itu

    pengunaan buffer untuk mengekstraks protein target, idealnya berada pada pH 7,0

    sampai dengan pH 8,8. Pemilihan pH tersebut bertujuan untuk membantu

    kestabilan protein target sehingga dapat menghalangi aktivitas protein yang tidak

    dikehendaki (Bonner, 2007). Selain itu penambahan PMSF dilakukan untuk

    menjamin agar sel protein yang diperoleh tidak dihidrolisis oleh enzim proteolitik,

    karena PMSF berfungsi sebagai inhibitor protease (Amiruddin et al., 2010).

    Tahap penghancuran sel atau jaringan otot daging ayam potong dalam

    penelitian ini menggunakan homogenizer. Penggunaan homogenizer termasuk

    cara fisik untuk membuat sel terekstrak, namun gesekan dengan alat penghalus

    tersebut dapat mengakibatkan terhambatnya ekstraksi protein dan menyebabkan

    koagulasi protein (Giacomazzi et al., 2005). Untuk itu proses lisis sel sebaiknya

    dilakukan dalam kondisi suhu yang rendah. Cara lain dalam tahap penghancuran

    sel adalah menggunakan bahan kimiawi berupa detergen triton X-100 sebagai

    senyawa yang dapat merusak struktur tiga dimensi protein. Menurut Rehm (2006),

    larutan deterjen triton X-100 dapat mendenaturasi protein serta dapat mencegah

    terjadinya interaksi antara protein dengan protein (pada struktur kuartener).

    Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat

    berperan dalam menghilangkan aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim

    pendegradasi DNA (Switzer, 1999).

  • 42

    Protein yang telah terekstraksi dari dalam sel selanjutnya dipisahkan dari

    komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan lipid melalui sentrifugasi

    (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007), menyebutkan bahwa

    sentrifugasi akan menghasilkan 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada

    lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas. Protein akan berada pada

    fase aqueous dan berada pada interfase setelah sentrifugasi, sedangkan lipid

    berada pada fase organik. Supernatan hasil ekstraksi ditampung dalam botol vial

    dan disimpan hingga pemakaian lebih lanjut.

    4.3 Kadar Protein Ekstrak Jaringan Otot Daging Ayam Potong

    Supernatan hasil isolasi protein dari jaringan otot daging ayam potong

    diukur konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visible melalui

    metode Lowry et al., (1959). Pengukuran kadar protein dengan metode Lowry,

    akan menghasilkan bentuk senyawa kompleks yang bewarna biru (Coligan et al.,

    2007). Metode Lowry Folin-Ciocalteu dapat menentukan protein rantai pendek

    (oligopeptida) dan asam amino. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+

    dari CuSO4 (Reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan dan sistein yang

    terdapat dalam protein. Selanjutnya ion Cu+ bersama dengan fosfomolibdat dan

    fosfotungstat yang terkandung dalam reagen Folin-Ciocalteu, akan bereaksi pada

    senyawa fenol lainnya yang ada pada sampel dan membentuk kompleks

    pewarnaan biru. Reaksi yang terjadi dituliskan melalui tahapan sebagai berikut:

  • 43

    Gambar 10. Reaksi pembentukan kompleks pewarnaan biru pada metode Lowry

    Warna yang diperoleh diukur absorbansinya dengan menggunakan

    spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 776,36 nm. Pembanding

    yang digunakan adalah BSA (bovine serume albumin) dengan seri konsentrasi 0,

    40, 80, 120, 160 dan 200 ppm yang diukur pula nilai serapan absorbansinya.

    Tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai seri konsentrasi adalah

    untuk menentukan kadar protein dalam sampel dengan menggunakan persamaan

    regresi linier garis lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar (Lampiran 5).

    Rantai polipeptida Ikatan polipeptida

    Ikatan kompleks bewarna ungu

    Pereaksi Folin-Ciocalteu Senyawa Fenol

    Kuinon

    Kompleks molybdenum-blue

  • 44

    Kadar protein setiap sampel yang dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 5

    berikut:

    Tabel 5. Kandungan protein jaringan otot daging ayam potong dengan metode Lowry

    Sampel

    Absorbansi

    (Y)

    Kandungan Protein

    (g/mL) dalam 100 g

    daging

    Rata-rata Kandungan

    Protein (g/mL) dalam

    100 g daging

    (Mean SD)

    A1

    A2

    0,027

    0,038

    28000

    39000

    33500 7778,17

    B1 0,028 29000 29500 707,10

    B2

    C1

    0,029

    0,03

    30000

    31000

    38000 9899,49

    C2

    A3

    0,044

    0,104

    45000

    105000

    92000 18384,77

    A4

    B3

    B4

    C3

    0,078

    0,085

    0,087

    0,066

    79000

    86000

    88000

    87000 1414,21

    67000 75000 11313,71

    C4 0,082 83000 Keterangan: Pengujian dilakukan secara duplo.

    FP = 200 kali

    1, 2 (Duplo Ayam Potong 4 minggu (1 kg)); 3, 4 (Duplo Ayam Potong 5 minggu (1,7 kg)); A

    (Perlakuan Stunning Halal); B (Perlakuan Stunning Haram); C (Perlakuan Non Stunning Halal).

    Merujuk pada hasil kadar protein daging ayam potong sebelumnya yang

    dilakukan oleh Moutney (1976), menyatakan bahwa kadar protein pada bagian

    paha daging ayam potong dalam 100 gram daging berkisar antara 21-24 gram

    protein. Mengenai hal tersebut, terdapat perbedaan pada hasil penelitian yang

    kadar proteinnya lebih rendah dibanding literatur tersebut. Hal ini didasari pada

    pengukuran kadar protein dengan metode Lowry adalah protein terlarutnya,

    sehingga kadar protein yang dihasilkan lebih rendah dari berat dagingnya.

    Hasil pada Tabel 5 menyatakan bahwa semakin bertambahnya usia ayam

    potong maka kadar proteinnya akan semakin meningkat seiring bertambahnya

    umur ternak, akibatnya akan meningkatkan jumlah jaringan ikat pada hewan

    ternak tersebut (Lawrie, 2003). Hal ini disebabkan pula dari adanya pengaruh

  • 45

    pemberian pakan pada fase tumbuh ayam. Pakan dengan kandungan protein

    rendah akan menyebabkan kandungan protein daging yang rendah pula

    (Kartikasari et al., 2001). Ayam potong usia 4 minggu (fase starter)

    membutuhkan tingkat protein pakan sebesar 23%, karena menurut Scott et al.,

    (1982) ayam potong usia muda yang sedang tumbuh mempergunakan protein

    yang tersedia untuk pertumbuhan jaringan sehingga terukur lebih rendah. Berbeda

    dengan Rasyaf (2004), ayam potong usia 5 minggu (fase finisher) dibutuhkan

    ransum pada tingkat protein 17,521% dan lebih banyak mengonsumsi jumlah

    bahan pakan tersebut. Kandungan protein dalam pakan serta banyaknya pakan

    yang dikonsumsi akan mempengaruhi jumlah protein dalam tubuh (Ramia, 2000).

    Sampel dengan penyembelihan electrical stunning halal maupun haram,

    rata-rata kadar proteinnya memiliki nilai tertinggi dibandingkan dengan perlakuan

    non electrical stunning. Hal ini disebabkan dari adanya prosedur pra-

    penyembelihan dengan perlakuan electrical stuning yang diduga mampu

    meningkatkan ekpresi protein tertentu di dalam sel akibat stress atau perlakuan

    arus listrik yang diberikan, sehingga proses tersebut dapat menyebabkan adanya

    aktifitas tertentu di dalam sel. Hasil ini didukung pula pada penelitian Zaman et

    al. (2012) yang menyatakan bahwa kadar protein daging ayam potong yang

    disembelih secara tidak halal melalui penyembelihan dengan memutus leher ayam

    potong hingga terpisah dari badannya serta tubuhnya diikat hingga ayam tersebut

    mati akan lebih tinggi dibanding sampel daging ayam potong yang disembelih

    secara konvensional dan halal.

  • 46

    4.4 Profil Protein Isolat Jaringan Otot Daging Ayam Potong hasil SDS-

    PAGE

    Pemisahan dan karakterisasi protein jaringan otot daging ayam potong

    dilakukan dengan teknik SDS-PAGE menggunakan separating gel 14% dan

    stacking gel 6% melalui pewarnaan gel menggunakan coomassie brilliant blue.

    Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul

    akibat adanya arus listrik yang diberikan. Penggunaan separating gel 14% ini,

    diharapkan protein akan terpisah pada kisaran berat molekul 10200 kDa.

    Merujuk pada penelitian Doherty et al. (2004), pita protein pada ekstrak jaringan

    otot daging ayam potong segar menggunakan separating gel 12,5% dapat

    menghasilkan profil protein dengan berat molekul pada kisaran 6-200 kDa.

    Proses elektroforesis pada penelitian ini menggunakan tegangan listrik 150

    V dengan arus sebesar 40 mA, pengaturan ini dapat dimodifikasi oleh

    penggunanya sesuai dengan keperluan dan pengalaman percobaan. Oleh karena

    itu, pengaturan pada penelitian ini dipilih karena telah memberikan hasil yang

    paling baik diantara beberapa percobaan yang telah dilakukan.

    Hasil elektroforesis (SDS-PAGE) jaringan otot daging ayam potong

    dengan perlakuan electrical stunning dan non electrical stunning, dapat dilihat

    pada Gambar 11 dan Gambar 12.

  • 47

    Gambar 11. Gel ke-1 Pemisahan Elektroforesis Jaringan Otot Daging Ayam Potong 1,

    2 (Duplo Ayam Potong 4 minggu (1 Kg)); A (Perlakuan Stunning Halal); B (Perlakuan

    Stunning Haram); C (Perlakuan Non Stunning Halal) dan Marker (M).

    Gambar 12. Gel ke-2 Pemisahan Elektroforesis Jaringan Otot Daging Ayam Potong 3, 4

    (Duplo Ayam Potong 5 minggu (1,7 Kg)); A (Perlakuan Stunning Halal); B (Perlakuan

    Stunning Haram); C (Perlakuan Non Stunning Halal) dan Marker (M).

    211,475

    118,579

    78,995

    53,054

    36,881

    28,643

    17,809

    8,4

    kDa M A1 B1 C1 A2 B2 C2

    kDa M A3 B3 C3 A4 B4 C4

    (a)

    (b)

    (c)

    (d)

    (e)

    (f)

    (g)

    (h)

    (i)

    211,475

    118,579

    78,995

    53,054

    36,881

    28,643

    17,809

    8,4

    (a)

    (b)

    (c)

    (d)

    (e)

    (f)

    (g)

    (h)

    (i)

  • 48

    Penentuan berat molekul tiap-tiap pita protein dilakukan dengan

    menggunakan persamaan garis lurus yang diperoleh dari kurva standar protein

    pembanding (marker) dari Bio-Rad. Kurva standar dibuat berdasarkan hubungan

    antara mobilitas relatif (Rf) dengan logaritma berat molekul (Log BM) (Lampiran

    7). Pita protein masing-masing sampel yang diperoleh dari hasil SDS-PAGE

    dihitung nilai Rf nya. Perhitungan Rf protein dilakukan dengan mengukur jarak

    pergerakan sampel kemudian dibandingkan dengan jarak tracking dye.

    Pengukuran nilai RF dilakukan dengan menggunakan software ImageJ 1.46

    sebagai nilai x yang kemudian dimasukkan pada persamaan regresi linear.

    Berdasarkan hasil perhitungan Rf dan log BM pada marker protein

    diperoleh persamaan regresi linear pada gel ke-1 dan gel ke-2 berturut turut yaitu

    Y = -0,001x + 2,222 dengan r= 0,943 dan Y = -0,001x + 2,212 dengan r=0,939.

    Gel hasil SDS-PAGE memperlihatkan adanya 25 pita (band) protein. Diantara 25

    pita protein yang terbentuk, terdapat 9 pita protein yang terlihat dengan intensitas

    ketebalan yang lebih tebal dibandingkan dengan pita protein sejenis yang terlihat

    lebih tipis (Gambar 11 dan Gambar 12). Tebal tipisnya pita protein yang terlihat

    merupakan gambaran banyaknya jumlah protein yang terkandung pada berat

    molekul tertentu. Semakin tinggi konsentrasi sampel semakin tebal pita yang

    terbentuk (Pasila, 2008). Oleh sebab itu, pada penelitian ini setiap sampel yang

    dimasukkan kedalam sumur gel elektroforesis dibuat sama dalam jumlah volume

    dan konsentrasi dari jumlah kadar protein yang dimiliki sampel.

    Selain itu dilakukan analisis lebih lanjut seperti melalui blotting dengan

    software ImageJ 1.46 untuk men