UNIVERZA V NOVI GORICI FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

RAZISKOVANJE GENETSKE DIVERZITETE VELIKEGA KLOBUČNJAKA (Rhizostoma pulmo) Z

ORODJI MOLEKULARNE TAKSONOMIJE

DIPLOMSKO DELO

Kristina Turk

Mentorica: doc. dr. Andreja Ramšak

Nova Gorica, 2009

I

ZAHVALA

Zahvaljujem se prof. dr. Alenki Malej, Katji Stopar, Almi Hvala ter drugim zaposlenim na Morski biološki postaji v Piranu, ki so mi pomagali pri laboratorijskem in terenskem delu, ter mi omogočili dostop do potrebnih podatkov. Iskreno se zahvaljujem vsem prijateljem, zlasti Manici Kodrič, Svetlani Kodrič in Jasni Besednjak ter Lei Bric za njihovo pomoč in podporo pri pisanju diplomske naloge. Posebna zahvala gre moji družini, ki mi je omogočila študij in potrpežljivo čakala na ta trenutek. Posebej se zahvaljujem mentorici doc. dr. Andreji Ramšak za svetovanje in usmerjanje ter hitre odgovore, ko sem jih potrebovala.

II

III

POVZETEK Meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) se pojavljajo skozi vse leto, a v zelo majhnem številu. V zadnjih letih je bilo v Tržaškem zalivu zabeleženih več množičnih pojavljanj velikega klobučnjaka v zimskem obdobju. Poleg te vrste so se množično pojavljale še druge klobučnjaške meduze kot so uhati klobučnjak (Aurelia aurita), v poletnih mesecih pa mesečinka (Pelagia noctiluca). Poznamo več dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med katerimi so nekateri posledica človekove dejavnosti, nekatera nihanja v številčnosti pa so naravna nihanja. V diplomskem delu smo želeli raziskati filogenetsko povezanost meduz velikega klobučnjaka iz severnega Jadrana in Črnega morja. Filogenetsko povezanost smo raziskovali z analizo nukleotidnih zaporedij v genu za citokrom c oksidazo (COI), ki se nahaja na mitohondrijski DNA (mtDNA). Del tega gena (podenota I) smo pomnožili s PCR z univerzalnimi začetnimi oligonukleotidi za nevretenčarje. Iz pomnoženih fragmentov COI smo pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi analize le teh smo analizirali filogenetske odnose med vzorčenimi osebki. S filogenetsko primerjavo nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka v vzorcih iz Črnega morja in severnega Jadrana smo ugotovili, da je v nukleotidnih zaporedjih 80 odstotkov ohranjenih mest. Veliki klobučnjaki iz Črnega morja in severnega Jadrana tvorijo dve ločeni filogenetski skupini, kar je razvidno iz filogenetskega drevesa. COI se je izkazal kot primeren genetski marker za razlikovanje med vzorci iz Črnega morja in severnega Jadrana. To je prva tovrstna študija, saj zaenkrat še ni nobenih javno dostopnih nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka. Ključne besede: Scyphozoa, Rhizostoma pulmo, mitohondrijska DNA (mtDNA), citokrom c oksidaza, filogeografija, antropogeni vplivi, množično pojavljanje

SUMMARY Medusae of Rhizostoma pulmo are occurring throughout all year in small number. In recent years several mass appearances have been recorded in Trieste Bay during winter time. Except for this species other scyphozoan species have been appearing massively in Gulf of Trieste as well, such as moon jelly (Aurelia aurita), and also mauve stinger (Pelagia noctiluca) during summer. There are several factors affecting their mass occurrence due to anthropogenic activities and also natural origin. The aim of my diploma dissertation was to examine phylogenetic connections between medusae of Rhizostoma pulmo from the northern Adriatic Sea and of the Black Sea. The research of phylogenetic connection was carried out with an analysis of nucleotide sequences of the gene encoded cytochrome c oxidase subunit (COI) found in mitochondrial DNA (mtDNA). A part of this gene (subunit) has been amplified by PCR with universal oligonucleotide primers for invertebrates and sequenced with the same primer pair. On the basis of the nucleotide sequences analysis were performed phylogenetic relationships between sampled individuals were performed and estimation of gene flow and phylogenetic relationship were revealed. On the basis of phylogenetic comparison of COI nucleotide sequences of Rhizostoma pulmo in the samples from the Black Sea and the northern Adriatic Sea we determined that nucleotide sequences contain 80 % of conserved sites. Rhizostoma pulmo from the Black Sea and the Northern Adriatic Sea form two separated phylogenetic groups, as revealed by phylogenetic tree. COI proved to be a suitable genetic marker to distinguish between samples from the Black Sea and

IV

the northern Adriatic Sea. This is the first study of this kind, since there are no public accessible COI nucleotide sequences from Rhizostoma pulmo available yet. Key words: Scyphozoa, Rhizostoma pulmo, mitochondrial DNA (mtDNA), cytochrome c oxidase , phylogeography, anthropogenic factors, massive occurrences.

V

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

A..........................................adenin

ang.......................................angleško

bp.........................................bazni par

C..........................................citozin

CTAB..................................cetrilmetilamonijev bromid

DMSO…………………….dimetil sulfoksid

DNA....................................deoksiribonukleinska kislina

dNTP...................................2'-deoksinukleozid 5'-trifosfat

EDTA..................................etilen-diamino-tetraocetna kislina

EtBr…………………….....etidijev bromid

F..........................................»forward primer«, vodilni začetni oligonukleotid,

ki se prilega na matrično DNA v smeri 5`→3`

G.........................................gvanin

µ..........................................mikro

LSU……………………….velika ribosomalna podenota

Mg………………………...magnezij

ng........................................nano gram

PCR.....................................verižna reakcija s polimerazo

pH........................................negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov

pufer TAE............................raztopina Trisa, acetata in EDTA

R..........................................»reverse primer«, povratni začetni oligonukleotid,

ki se

prilega na matrično DNA v smeri 3`→5`

rRNA….................……….. ribosomalna ribonukleinska kislina

T...........................................timidin

Taq DNA-polimeraza..........DNA-polimeraza, izolirana iz Thermus aquaticus

tRNA……………………....prenašalna ribonukleinska kislina

SSU………………………..mala ribosomalna podenota

VI

RH........................................Rhizostoma pulmo

TRIS.....................................tris (hidroksimetil)aminometan

COI......................................citokrom c oksidaza

λ marker...............................Hind III λ marker

100bp marker....................... GeneRuler™ 100bp DNA Ladder(100bp do

1000bp, Fermentas)

EtBr......................................etidijev bromid

VII

KAZALO VSEBINE

ZAHVALA........................................................................................................ I

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ..........................................................................V

1. UVOD ........................................................................................................1

2. TEORETIČNE OSNOVE .......................................................................3

2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba ...................................................3

2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa)..........................................................................4

2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz..........................................4

2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo)................................................................................................................7

2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak...................................................................8

2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah........................9

2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih ................................9

2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov.........................................10

2.7. PCR reakcija............................................................................................11

2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje) .........12

2.9. Agarozna elektroforeza ..........................................................................12

3. EKSPERIMENTALNI DEL.................................................................14

3.1. Označevanje vzorcev...............................................................................14

3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije.......14

3.2.1. Puferske raztopine ...............................................................................14

3.2.2. Encimi: ..................................................................................................15

3.2.3. Velikostni standardi DNA:..................................................................16

3.2.4. Aparature..............................................................................................16

3.3. Vzorčenje na terenu ................................................................................16

3.4. Izolacija DNA ..........................................................................................17

VIII

3.4.1. Spektrofotometrične meritve.............................................................. 18

3.5. Agarozna elektroforeza.......................................................................... 18

3.5.1. Priprava agaroznega gela ................................................................... 18

3.5.2. Nanašanje vzorcev ............................................................................... 18

3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C ............. 19

3.6.1. Začetni oligonukleotidi........................................................................ 20

3.6.2. Priprava vzorcev za PCR.................................................................... 20

3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja...................................................... 20

3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij ....... 20

3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij ................................... 21

4. REZULTATI IN RAZPRAVA............................................................. 22

4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka....................... 23

4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju......................................................................................................................... 23

4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju ........................ 27

4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA ................ 29

4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR ......... 30

4.2.1. Reamplifikacija PCR........................................................................... 41

4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja ........................ 42

4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje)....................... 43

4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem Blast) ............................................................................................................... 43

4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal ............... 44

4.4. Filogeografska analiza............................................................................ 44

5. ZAKLJUČKI ......................................................................................... 47

6. VIRI ........................................................................................................ 48

IX

KAZALO SLIK Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa. (Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg)3 Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči 1. oktobra 2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov (Rhizostoma pulmo) ........................................................................................6 Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo).........8 Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo ........................12 Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju...........................................................................................................................17 Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV Tržaškega zaliva). Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca..........................................................24 Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 5 je sestavljena iz dveh slik. ........................................................................25 Slika 8: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................26 Slika 9: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................27 Slika 10: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................28 Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...33 Slika 12: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...34 Slika 13: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...35 Slika 14: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...36 Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega zaliva. ..........................................................................................37 Slika 16: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...38 Slika 17: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...39 Slika 18: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...40 Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega zaliva. ..........................................................................................41 Slika 20: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...42 Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega klobučnjaka iz Črnega morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja število substitucij v analiziranih nukleotidnih zaporedjih. ........................45

X

KAZALO TABEL Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. pulmo) in R. octopus (prirejeno po Mayer, 1910)............................................................. 8 Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo velikega klobučnjaka. ................................................................................... 22 Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu. ................................................. 30 Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter uspešnost pomnoževanja COI. .................................................................. 31 Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem ..... 43

1

1. UVOD Klobučnjaki (Scyphozoa) sodijo v evolucijsko zelo staro deblo ožigalkarjev (Cnidaria). Pri večini predstavnikov življenjski krog klobučnjakov zajema meduzo, ki se razmnožuje s spolno in nespolno generacijo, ki jo predstavlja pritrjen polip. Obe generaciji se lahko v določenih razmerah namnožita izjemno hitro in v velikem številu. Meduze klobučnjakov se pojavljajo sezonsko. Ko se pojavijo v izredno velikem številu, povzročajo gospodarsko škodo v ribištvu, na hladilnih sistemih jedrskih elektrarn, obratih za razsoljevanje, v turizmu (Purcell in sod., 2007). Opisanih je več dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med katerimi prednjačijo posledice človekovih dejavnosti, kot so onesnaževanje, evtrofikacija, spremenjen prehranjevalni splet, v katerem na vrhu prehranjevalne verige prevladujejo klobučnjaške meduze namesto velikih plenilcev (Mills, 1995). Spremembe v populacijski gostoti meduznih populacij med leti so povezane z oscilacijami v Zalivskem toku v severnem Atlantiku in z intenzivnostjo pojava El Niňo (Purcell, 2005). Nekatera nihanja v številčnosti klobučnjaških meduz so naravna nihanja, kot na primer množična pojavljanja mesečinke v Sredozemskem morju (Goy in sod., 1989). V zadnjih nekaj letih se v Jadranskem morju vse številčneje pojavlja veliki klobučnjak (Rhizostoma pulmo) in uhati klobučnjak (Aurelia aurita). Meduza velikega klobučnjaka je razmeroma velika in čvrsta in, kadar se namnoži v velikem številu, povzroča gospodarsko škodo predvsem v ribištvu. Zelo resne težave pa veliki klobučnjak povzroča že desetletje v španski laguni Mar Menor, ki je zaradi intenzivnega kmetijstva v zaledju in industrializacije postala evtrofična in kemijsko onesnažena. Občasno velike agregacije meduz velikega klobučnjaka opazijo tudi v Črnem morju. Veliki klobučnjak ni neobičajna vrsta v Sredozemskem in v Črnem morju, zaskrbljujoče je njeno množično pojavljanje in možna povezava z negativnimi učinki človekove dejavnosti na morsko okolje. V zadnjem desetletju vse pogosteje poročajo z različnih koncev sveta o množičnih pojavljanjih različnih vrst klobučnjaških meduz. Poleg množičnega pojavljanja običajnih vrst za dano okolje, pa so raziskovalci našli tudi dokaze za prenos tujerodnih vrst klobučnjakov v nova okolja. Eden takih primerov je množično pojavljanje meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) v Kaliforniji. Na osnovi sodobnih molekularno taksonomskih metod so ugotovili, da gre za neavtohtono populacijo (Dawson in sod., 2005), ki je bila najverjetneje prinešena z balastnimi vodami iz Japonske v Kalifornijo. Zaradi neobičajnega množičnega pojavljanja meduz velikega klobučnjaka v Sredozemskem in njemu sosednjih morjih (Črno morje in Atlantski ocean) ter gospodarske škode v ribištvu je naraslo zanimanje raziskovalcev in širše javnosti za omenjeno vrsto. Eden od osnovnih podatkov v biologiji je čimbolj natančen opis vrste in njena zanesljiva taksonomska uvrstitev. Opise vrst smo povzeli iz naslednjih monografij Medusae of the World (Mayer, 1910) in Synopsis of the medusae of the World (Kramp 1961). Velikemu klobučnjaku je morfološko zelo podobna vrsta Rhizostoma octopus, ki živi v Atlantiku, pri čemer se zastavlja vprašanje, kolikšna je sorodnost med opisanima vrstama in ali ju smemo zares smatrati kot dve vrsti (Mayer, 1910). Pri klasični determinaciji na osnovi morfoloških znakov naletimo pri klobučnjakih na velike težave pri razlikovanju zaradi razmeroma skromne makro-morfološke diferenciacije meduz in plastičnosti oziroma variabilnosti teh znakov pri isti vrsti. Razlikovanje med vrstama veliki klobučnjak in R. octopus temelji na obliki in številu robnih krp, na dolžini zgornjega dela ustnih ramen in na dolžini in obliki terminalnih priveskov. Zaradi tega je na voljo malo diagnostičnih znakov za nedvoumno taksonomsko uvrstitev. V takih primerih so nam v pomoč novi pristopi v taksonomiji, kot so uporaba genetskih markerjev na genomski in izven kromosomalni DNA (Hillis in sod., 1996).

2

Primerjava nukleotidnih zaporedij je eno od orodij, ki nam omogoča ugotavljanje geografskega izvora vrste (tujerodna ali avtohtona vrsta). Okoljski ukrepi se lahko razlikujejo glede na izvor osebka. Pri vnosu tujerodne vrste najprej skušamo ugotoviti njen geografski izvor in način vnosa v novo okolje. V primeru množičnega pojavljanja avtohtone vrste skušamo najprej prepoznati spremembe v okolju, ki vodijo do množičnega pojavljanja, in dokazati njihovo vzročno povezavo s pojavljanjem. Predvsem se moramo vprašati, kaj v okolju se je spremenilo, da je do tega prišlo (vnos hranil, sprememba habitata ...) Če gre za vnos tujerodne vrste, se moramo najprej vprašati, kako je prišla v novo okolje. Glede na potrjen izvor osebka se potem lahko odločimo, kakšne okoljske ukrepe bomo izvajali Odločili smo se, da bomo analizirali nukleotidno zaporedje gena za citokrom c oksidazo podenota I (COI) v osebkih velikega klobučnjaka nabranih na različnih geografskih območjih. COI je uveljavljen genetski marker v filogeografskih študijah in je genetsko marker, na katerem sloni eden od pristopov v molekularni taksonomiji, ki ga bolj popularno imenujemo z angleškim izrazom »DNA barcoding« (Ratnasingham in Hebert, 2007). Podatki pridobljeni iz COI bi nam lahko odkrili, kakšna je sorodnost med vzorčenimi osebki. V diplomskem delu smo iz vzorčenih osebkov ekstrahirali DNA in nato optimizirali pomnoževanje COI s PCR. Iz pomnoženih fragmentov COI smo nato pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi nukleotidnih zaporedij smo analizirali genetsko podobnost med vzorčenimi osebki in filogenetsko razdaljo med vzorčenima populacijama iz severnega Jadrana in Črnega morja.

3

2. TEORETIČNE OSNOVE

2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba

Ožigalkarji so skoraj izključno morske živali in le nekateri trdoživnjaki naseljujejo tudi celinske vode. Glavne značilnosti ožigalkarjev so preprosta telesna zgradba in ožigalke ali nematociste, ki vsebujejo strupene snovi. Glede na zgradbo telesa in življenjski krog (prisotnost polipne in meduzne generacije), razlike v gastrovaskularni votlini delimo ožigalkarje na tri razrede: koralnjaki (Anthozoa), klobučnjaki (Scyphozoa) in trdoživnjaki (Hydrozoa). Telo ožigalkarjev je sestavljeno iz dveh zarodnih plasti endoderma in ektoderma. Gastroderm (izvorna plast endoderm) je plast celic, ki obdajajo telesno votlino, epiderm (zarodna plast ektoderm) je vrhnji sloj, ki vsebuje ožigalke. Med epidermom in gastrodermom je mezoglea, ki je lahko zelo tanka ali zelo debela želatinasta tvorba kot na primer pri klobučnjaških meduzah. V notranjosti telesa leži prebavna votlina z eno samo odprtino, ki jo imenujemo usta. Ta so pri polipih na zgornji, pri meduzah na spodnji strani telesa. Usta obkrožajo lovke ali tentakli, pri meduzah ustna ramena, ki pomagajo pri lovu hrane. Polipna generacija je pritrjena na podlago (sesilna) in je malo gibljiva. Meduzna generacija je prosto plavajoča. Polipi so nespolna generacija, ki se razmnožuje z brstenjem, meduze so spolna generacija, ki proizvaja spolne celice. Za klobučnjake je značilno, da ima večina predstavnikov menjavo generacij: spolno generacijo (meduza) in nespolno generacijo (polip). Ena od vrst brez polipne generacije je mesečinka (Pelagia noctiluca). Danes je poznanih približno 9000 vrst ožigalkarjev. Približno 340 vrst je opisanih v Sredozemskem morju, ocenjujejo pa, da v njem živi okrog 200 vrst ožigalkarjev.

Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa. (Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg)

4

2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa) Klobučnjaki so razred morskih ožigalkarjev, pogosto z menjavo generacij med polipi (skifopolipi), ki se razmnožujejo nespolno, in prosto plavajočimi meduzami, ki se razmnožujejo spolno (skifomeduze). Meduze nekaterih vrst so lahko zelo velike s premerom klobuka enega do dva metra. V osnovni zgradbi so podobne meduzam trdoživnjakov (hidromeduze), razlikujejo se po odsotnosti krpastega naborka pod klobukom. Meduze in polipi imajo radialno simetrijo. Skifopolipi so zelo majhni (od 1 do 4 mm) in imajo različno število lovk. Polip velikega klobučnjaka ima do 24 lovk (Holst in Jarms, 2006). Klobuk meduz je poln želatinozne snovi (mezoglea), njegov rob je navadno razdeljen na režnje. Ustna ramena izhajajo izpod klobuka in so pri nekaterih vrstah precej velika. Gastrovaskularni sistem pri meduzah leži na spodnji strani klobuka (subumbrela) z manubrujem (ustni stožec), ki se nadaljuje v usta, posuta z ožigalkami. Gastrovaskularna votlina je predeljena na štiri prekate s pregradami iz gastroderma. Posamezni prekati so med seboj povezani z okroglimi odprtinami. Prosti robovi pregrad imajo močne septalne filamente, posute z ožigalkami in žleznimi celicami. Živčni sistem je slabo razvit in difuzen. Čutilne organe pri meduzah imenujemo ropaliji. Ropaliji imajo več različnih vlog, na posameznih delih meduze služijo za vid in kot čutilo za ravnotežje. Klobučnjaki so morske živali, do sedaj jih poznamo 200 vrst (Arai, 1997). Spolno in nespolno razmnoževanje omogočata klobučnjakom izjemno hitro namnoževanje. Klobučnjaki se razmnožujejo s posebnim načinom nespolne delitve, ki mu pravimo strobilacija, pri čemer nastanejo majhne meduze ali efire iz polipa, ki nato rastejo v spolno zrele meduze. Strobilacije ni pri skupini kubomeduze, ampak se polip preobrazi v meduzo. Meduze so spolna generacija in imajo dobro razvite spolne žleze ali gonade ter so večinoma enospolne (Mayer, 1910). Po oploditvi nastane plavajoča omigetalčena ličinka planula, ki se nato pritrdi, ko najde primerno podlago, in se iz nje razvije polip. V zmernih klimatih poteka strobilacija v toplejšem delu leta, medtem ko se v tropih odvija celo leto (Lucas, 2001).

2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz V novejšem času je vse več podatkov o množičnem pojavljanju meduz klobučnjakov, trdoživnjakov ter drugih skupin, kot so rebrače in plaščarji, ki jih glede na izgled imenujemo tudi želatinozni plankton. V našem opisovanju se bomo omejili na meduze klobučnjakov, ki jih bomo imenovali krajše meduze. Vse pogostejša dokumentirana opazovanja množičnih pojavljanj meduz klobučnjakov porajajo tudi ugibanja o možnih vzrokih. Raziskovalci najpogosteje omenjajo evtrofikacijo, prekomeren ribolov, invazije tujerodnih vrst in klimatske spremembe (Arai, 2001a). Medtem ko je ugibanj veliko, je zelo malo znanih čvrstih dokazov, ki bi trdno povezali množična pojavljanja z omenjenimi vzroki. Številne pojave, kot so evtrofikacija, hipoksija, motnost vodnega stolpca, spremembe slanosti, so stanja, ki jih meduze lažje prenašajo kakor ribe in druge morske živali. Spremembe v hidrološkem režimu zaradi jezov, nasipov in ostalih konstrukcij lahko spremenijo slanost in tako favorizirajo meduze. Porast številčnosti želationoznega planktona povezujejo tudi s klimatskimi spremembami. Študije, v katerih so analizirali okoljske

5

spremembe v daljšem časovnem obdobju, so pokazale, da nihanje številčnosti ožigalkarjev in rebrač, ki živijo v zmerno toplih vodah sovpada z okoljskimi spremembami (Purcell, 2005). Vremenske spremembe (topla voda, suho vreme), spremembe v slanosti predstavljajo ugodne razmere za klobučnjake in drug želatinozni plankton (Molinero in sod., 2005). Pogosto so množična pojavljanja opažena v evtrofnih območjih, pa tudi tudi v predelih, ki niso pod neposrednim vplivom človekove aktivnosti (Purcell in sod., 2007). Množična pojavljanja so se pojavila po obsežnem spreminjanju življenjskega prostora, kot se je zgodilo v laguni Mar Menor v Španiji, kjer so pesek zamenjali z blatom. Najprej se je zgodila invazija alge Caulerpa porifera, ki je nadomestila morsko travo. Nato so v laguno vnesli ostrige, ki predstavljajo dodaten substrat za polipe. Evtrofikacija (Howarth in sod., 2002) pomeni povečevanje koncentracije hranil. Povečanje hranil pogosto vodi k večji biomasi v vseh trofičnih nivojih (Daskalov in sod., 2007), pri čemer lahko več razpoložljive hrane omogoča preživetje in razmnoževanje večjemu številu polipov in meduz (Purcell in sod., 1999). Povečana raba umetnih dušikovih gnojil po letu 1970 je lahko vzrok nedavnih množičnih pojavljanj klobučnjakov (Gilbert in sod., 2005). Takšno stanje so povezali z množičnim pojavljanjem dveh vrst, in sicer morske cvetače (Cotylorhiza tuberculata) in velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) v laguni Mar Menor. Podatki kažejo, da visoka koncentracija dušika lahko privede do množičnega pojavljanja meduz. (Pérez in sod., 2002). Od leta 1990 je do množičnega pojavljanja meduz prišlo vzdolž sredozemske obale (Malej, 1982 ). Na drugi strani evtrofikacija vodi v zmanjševanje koncentracije kisika in v takem okolju imajo klobučnjaki selektivno prednost pred drugimi organizmi (Arai, 2001b). Ribe se hipoksiji izognejo, če pa je kisika manj kot 2 mg/L pa poginejo. Veliko meduz je sposobnih preživeti v okoljih z nizko koncentracijo kisika (do < 1mg O2/L) (Purcell in Arai, 2001). Tudi polipi imajo toleranco do nizke koncentracije raztopljenega kisika in lahko preživijo v takem okolju (Ishii, 2006). Številni dejavniki, ki so povezani z industrializacijo in razvojem obalnih območij zmanjšujejo prozornost vode ter prehajanje svetlobe. V takem spremenjenem okolju lažje preživijo klobučnjaki kakor ribe. Posredno meduze vplivajo na ribištvo, saj se prehranjujejo z zooplanktonom in ihtoplanktonom (jajčeca rib in ličinke). Nekateri avtorji pravijo, da so zaradi prelova rib, meduze, ki so nižje na prehranjevalni verigi zasedle prehrambeno nišo, ki so jo zasedale ribe. Ribištvo odstranjuje ribe, ki jedo zooplankton ter plenilce meduz, in tako ostane meduzam na razpolago več hrane. Na drugi strani ob množičnem pojavljanju klobučnjaki tekmujejo za razpoložljive vire hrane z ribami. Zaradi hranjenja z zooplanktonom lahko zmanjšajo ter spremenijo zooplanktonske populacije, kar posledično lahko zmanjša količino hrane, ki je razpoložljiva ribam (Jackson in sod., 2001, Daskalov in sod., 2007). Nekateri avtorji poudarjajo pomembnost selektivne pašnje majhnih kopepodnih rakcev (Sommer in sod., 2002). V različnih delih sveta povzročajo težave v ribištvu množična pojavljanja klobučnjaških meduz. V Vzhodno kitajskem morju in v Rumenem morju so zabeležili količinsko zmanjševanje ulova (Cheng in sod., 2005). Na Japonskem se je populacija meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) povečala po letu 1980 in se je v zadnjih dveh desetletjih številčno zelo povečala. Tako se je 65 odstotkov ribičev na Japonskem opredelilo, da je število meduz naraslo v zadnjih dvajsetih letih (Uye & Ueta, 2004). Tudi v Namibijskem morju so se po letu 1988 zmanjšali ulovi inčunov in sardel, glede na ulov od leta 1975 do 1988. V tem območju sedaj prevladujeta dve vrsti, klobučnjaška meduza Chrysaora hysoscella in trdoživnjaška meduza Aequorea forskalea (Lynam in sod., 2006). Zaradi velikega števila meduze zamašijo ribiške mreže in zmanjša se kvaliteta ulova. Tak problem so imeli predvsem na Japonskem od leta 1990 dalje, ko je populacija uhatega klobučnjaka narasla v Seto

6

Inland Sea. Od leta 2002 se v japonskih obalnih morjih vsakoletno pojavljajo meduze vrste Nemopilema nomurai. Veliko škode so povzročili uhati klobučnjaki v ribogojnicah ob škotski obali. Toksini, ki jih vsebujejo klobučnjaki, povzročijo pomore rib v kletkah, kadar se njihove meduze ob namnožitvi pojavijo tudi v kletkah (Johnston in sod., 2005).

Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči 1. oktobra 2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov (Rhizostoma pulmo) Foto: Bojan Marčeta, Zavod za ribištvo R Slovenije.

Gradnja struktur v morju kot so ribogojnice in ostale morske strukture predstavljajo ugodne življenjske prostore za polipe. Po eni strani jim ribogojnice omogočijo dodatno hrano, po drugi strani pa jim strukture v morju predstavljajo dodaten substrat, na katerem lahko polip živi (Johnston in sod., 2005). V obalnih morjih ob Arabskem polotoku je množično pojavljanje klobučnjaške meduze Crambionella orsini povzročilo težave v kroženju vode v elektrarnah in razsoljevalnicah (Daryanabard & Dawson, 2008).

Vnos tujerodnih vrst klobučnjakov v ekosistem lahko prav tako privede do množičnega pojavljanja z resnimi posledicami za okolje. Velikokrat je uspešna invazija tujerodne vrste povezana tudi z drugimi antropogenimi vplivi v okolju. Eden od takih vnosov tujerodne populacije klobučnjaške meduze je vnos uhatega klobučnjaka iz Japonske v Kalifornijo ter še na nekaj drugih območij po svetu. Tujerodna vrsta je v novem okolju našla primerno nišo in povzročila populacijsko eksplozijo. Ker je potovanje izključno s tokovi prepočasno za tolikšno razdaljo, sklepajo, da je do vnosa prišlo z balastnimi vodami transportnih ladij (Dawson in

7

sod., 2005). Na osnovi primerjalne analize nukleotidnih zaporedij v genu za COI so lahko ugotovili geografski izvor populacije uhatega klobučnjaka v Kaliforniji. Že prej so z analizo zapisa v genu za COI na mtDNA uhatega klobučnjaka ugotovili, da je vrsta uhati klobučnjak sestavljena iz več kriptičnih vrst (Dawson in Jacobs, 2001). Z najdenimi razlikami na nivoju mitohondrijske DNA sovpadajo tudi makro-morfološke razlike, ki so jih našli med analiziranimi populacijami kriptičnih vrst (Dawson, 2003)

Primer tujerodne vrste vnesene v nov ekosistem je tudi vrsta Rhopilema nomadica v Sredozemskem morju. R. nomadica (premer klobuka do 80 cm) je klobučnjaška meduza, ki je v zadnjih dveh desetletjih vse bolj številčna v vzhodnem Sredozemskem morju. Njena prisotnost povzroča tveganje tako za ribiče, kot za kopalce, saj ima neprijeten ožig in je lahko prisotna v velikem številu. Prvič je bila zabeležena leta 1976 v Sredozemskem morju ter je od leta 1986 vsako poletje množično prisotna ob obali Izraela (Lotan in sod., 1993). R. nomadica naj bi prišla skozi Sueški kanal in je zelo redka v Rdečem morju. Še dve drugi klobučnjaški meduzi Phyllorhiza punctata, ki izvira iz zahodnega Pacifika, ter Indo- Pacifiška vrsta Cassiopea andromeda sta se v zadnjem času naselili v Sredozemskem morju. Populacijska dinamika teh dveh meduz še ni znana.

Meduze klobučnjakov negativno vplivajo na turizem, saj povzročijo zelo neprijetne ožige (toksini nekaterih vrst, ki žive v toplejših morjih so lahko smrtno nevarni) kopalcem. Kadar je število meduz veliko, lahko povzročijo pravo epidemijo ožigov. Občasno se v Sredozemskem morju množično pojavlja mesečinka (Pelagia noctiluca) (Goy in sod., 1989, Molinero in sod., 2005), ki povzroča neprijetne ožige pri kopalcih. V nekaterih obmorskih krajih, kjer je veliko turistov in je število ožigov zelo veliko, so vpeljali redno spremljanje številčnosti meduz ter opozorilne sisteme za kopalce, ki vključujejo tudi napotke za prvo pomoč. Ožigi meduz predstavljajo prav tako nevarnost za ribiče (Purcell, 2005).

2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo)

Rod korenoustih klobučnjakov (Rhizostoma) spada v red Rhizostomea in v družino Rhizostomatidae. V rodu korenoustih klobučnjakov so do sedaj opisali tri vrste: veliki klobučnjak (R. pulmo Macri, 1778), R. octopus (Linnaeus, 1788) in R. luteum (Quoy in Gaimard, 1827). Poudariti moramo, da nekateri avtorji dvomijo v obstoj vrste R. luteum (Mayer, 1910). Veliki klobučnjak naseljuje Sredozemsko in Črno morje, R. octopus je razširjena v Atlantskem oceanu, ob severozahodni obali Evrope, ob obalah Skandinavije, v Irskem morju, ob južnih in zahodnih obalah britanskih otokov in v južnem delu Severnega morja. R. luteum naseljuje morje ob obalah Portugalske v ožini Gibraltar in zahodni obali Afrike (Russell, 1970). Mayer (1910) in Kramp (1961) smatrata vrsto R. octopus za varieteto vrste R. pulmo. Če privzamemo, da je R. luteum legitimna vrsta, potemtakem nastane vrzel v distribuciji med vrstama R. octopus in R. pulmo, ki jo zapolnjuje R. luteum. Mayer (1910) v svojem delu obravnava druge opisane vrste iz rodu korenoustih klobučnjakov kot varietete tipske vrste velikega klobučnjaka, ki je bila opisana na osnovi osebkov iz Sredozemskega morja. Tipsko vrsto R. pulmo je opisal Luis Agassiz leta 1862. Vrsta veliki klobučnjak je bila najprej opisana kot Potta marina, ki jo je opisal Aldrovandi leta 1642 (povzeto po Mayer, 1910).

8

Mayer v svojem delu Medusae of the World (1910) omenja varietete velikega klobučnjaka iz Sredozemskega morja, Rdečega morja, Atlantskega oceana vzdolž obale Evrope in Afrike. Opisane razlike med velikim klobučnjakom in R. octopus so v številu in obliki robnih krp, v dolžini zgornjega dela ustnih ramen, v dolžini in obliki terminalnih priveskov ter v razširjenosti. Opisane razlike so podrobneje opisane v Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. pulmo) in R. octopus (prirejeno po Mayer, 1910). R. PULMO R. OCTOPUS

Število robnih krp 80 96 do 112 Oblika robnih krp Kratke in zaobljene Kratke, zašiljene Dolžina zgornjega dela ustnih ramen

Daljša od spodnjega dela Krajša od spodnjega dela

Dolžina in oblika terminalnih priveskov

Krajši ali enaki kot zgornji del ustnih ramen, širši blizu na baze (proksimalno), zoženi na bazi, ni bazalnega peclja.

Daljši kot zgornji del ustnih ramen z neznatnim bazalnim pecljem in zadebeljenim kijasto oblikovanim zunanjim delom.

2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak Meduza velikega klobučnjaka je zvonaste oblike in čvrsta, brez tentaklov na robu klobuka, ustna ramena so zrasla med sabo in na njih je veliko majhnih sekundarnih ustnih odprtin. Na spodnji strani (subumbrela) je ustni stožec, na katerem so epolete, ki so videti kot trakasta nagubana struktura. Epolete s sekundarnimi ustnimi odprtinami so lahko obarvane oranžno rumeno do rjavkasto rdeče ali rjavo.Tako veliki klobučnjak kakor R. octopus imata premer klobuka od 15 do 60 centimetrov in drobno granulirano površino klobuka z nematocistami. Oblika robnih krp je pri velikem klobučnjaku polkrožne oblike, pri R.octopus pa ovalna. Razlika je tudi v številu robnih krp na osmino klobuka; pri velikem klobučnjaku jih je 8, medtem ko pri R. octopus to število variira okoli 10 robnih krp na osmino. Razlike med obema vrstama so še v dolžini in obliki končnih priveskov. Pri vrsti veliki klobučnjak so končni priveski krajši ali enako dolgi kot dolžina zgornjega dela ustnih ramen. Pri velikem klobučnjaku so končni priveski širši na proksimalnem delu (na stiku z ustnimi rameni), medtem ko so pri vrsti R. octopus ožji na proksimalnem delu, nabrekli in kijaste oblike. Barva klobuka je lahko pri obeh vrstah od mlečno rumene, do rdečkaste, medtem ko so robne krpe modrikaste do vijolične barve. Veliki klobučnjaki se hranijo s planktonom. Sekundarna usta obdajajo številne resice z nematocistami.

Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo). (Vir. M. Plantan diplomsko delo, 2008)

9

2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah Mitohondrijska DNA (mtDNA) je uporabna v raziskavah živalskih populacij zaradi relativno preproste izolacije, relativno visoke frekvence mutacij v nekaterih delih mitohondrijskega genoma in dedovanja po materini strani. Zaradi načina dedovanja lahko sledimo materini liniji z mitohondrijskimi haplotipi. Za filogenetske raziskave se najpogosteje uporabljajo nukleotidna zaporedja velike (16S) in male (12S) rRNA, citokrom c oksidaze podenota I (COI) in citokroma b. Ti odseki mtDNA so precej dobro proučeni in znotraj teh nukleotidnih zaporedij so poznane bolj ali manj variabilne regije, na osnovi katerih je možna primerjava nukleotidnih zaporedij in izpeljava filogenetskih odnosov. Nukleotidno zaporedje gena za COI je eden izmed najbolj pogosto uporabljenih genetskih markerjev v filogenetskih raziskavah živalih. Številne študije so potrdile, da je odsek na 5' koncu COI gena (t.i. 5' Folmer del) primeren za rekonstrukcijo nižjenivojskih odnosov pri višjih živalih (Erpenbeck in sod., 2005). Navkljub nekaterim pomislekom so novejše študije potrdile primernost tega gena tudi v filogenetskih raziskavah klobučnjakov. Ugotovili so, da je variabilnost COI pri klobučnjakih enako kot pri višjih živalih (Huang in sod., 2008). Eden od temeljev uporabe mtDNA v filogenetskih analizah populacij je koalescenčna teorija, ki jo podpira nevtralni model evolucije. Koalescenca je združitev razvojnih linij iz preteklosti. Bolj kot so si organizmi in geni med seboj podobni, krajši je čas koalescence, čas do skupnega prednika. Čas koalescence mtDNA je za vsaj štirikrat krajši kot za jedrne gene, ker ima mitohondrijski genom eno samo kopijo (haploiden). Na filogenetskem drevesu vrstni red vej sovpada z vrstnim redom dogodkov koalescence in predstavlja kladistične odnose med nukleotidnimi zaporedji. Medtem ko dolžine vej, ki povezujejo nukleotidna zaporedja v drevesu, sovpadajo s časom koalescence (povzeto po Gorički, 2004).

2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih Mitohondriji so zelo številčni celični organeli namenjeni celičnemu dihanju. V matriksu mitohondrija je običajno 5 do 10 identičnih krožnih molekul mtDNA. Mitohondrijski genomi večceličnih živali se razlikujejo po velikosti in razporeditvi nekaterih genov v njem. Mitohondrijska DNA (mtDNA) je običajno kratka in dvoverižna krožna molekula velikosti približno 16 kbp. Na njej so zapisani geni, ki kodirajo različne beljakovine, ki sodelujejo v dihalni verigi, ribosomalne RNA (rRNA) in transportne RNA (tRNA). V eni od verig je več gvanina in tisto verigo imenujemo težka veriga, medtem ko drugo verigo imenujemo lahka. Večina genov je zapisana na težki verigi. Med ožigalkarji najbolje poznamo zgradbo mtDNA iz predstavnikov razreda koralnjakov. Šele v letu 2006 je bil objavljen celoten zapis mtDNA uhatega klobučnjaka (Shao in sod, 2006). Mitohondrijska DNA uhatega klobučnjaka je dolga 16 937 bp in ni krožna molekula, kakor pri koralnjakih (Bridge in sod., 1995), ampak je linearna, kar je razmeroma redko med živalmi. Na mtDNA je zapis za 13 beljakovin, za veliko in malo podenoto rRNA in za 2 tRNA (za metionin in triptofan). Na mtDNA sta dva odprta bralna okvirja za gene, ki kodirajo encime dihalne verige. Geni so organizirani v dve skupini in vsaka skupina se prepisuje v svoji smeri, smer prepisovanja DNA se spremeni na mestu, kjer je 93. nukleotid. Poleg linearnosti ima mitohondrijski genom uhatega klobučnjaka še nekaj posebnosti. Gena za ribosomalni RNA sta 7 kbp narazen in imata vsak svojo smer prepisovanja. Taka

10

ureditev ribosomalnih genov je razmeroma redka v živalskih mitohondrijskih genomih. Običajno ribosomalni geni ležijo skupaj in imajo isto smer prepisovanja. Pri koralnjakih so opazili tudi razmeroma velike nekodirajoče regije, medtem ko so pri uhatem klobučnjaku nekodirajoča nukleotidna zaporedja med geni kratka. Nukleotidna zaporedja na obeh koncih linearne mtDNA so enaka, a obrnjena in ne tvorijo nobenih sekundarnih struktur ter ne vsebujejo nobenih telomeram podobnih ponovitev. Ožigalkarji pri translaciji bolj pogosto uporabljajo nekatere triplete (npr. triplet TGA za triptofan namesto TGG), zato imajo svoj značilen genetski kod. V vseh do sedaj znanih zaporedjih mtDNA ožigalkarjev sta samo dva gena za prenašalne RNA (tRNA), ki so potrebne za transkripcijo mitohondrijske DNA. Potrebne manjkajoče tRNA so zapisane v jedrnem genomu in se prenesejo iz jedra v mitohondrij. To pomeni, da se je z izgubo genov za tRNA na mtDNA v prednikih ožigalkarjev razvil prenašalni mehanizem za tRNA (Beaton in sod., 1998). Mitohondrijski genom klobučnjakov ima sposobnost vključitve in vgraditve tuje DNA v mitohondrijsko DNA ožigalkarjev. Takšen primer je homolog gena mut S, ki so ga našli v mtDNA v korali Sarcophyton glaucum in v morskem perescu Renilla kolikeri (Pont-Kingdon in sod., 1995, 1998), ter introni skupine I, ki so jih našli v morski anemoni Metridium senile (Beagley in sod., 1996). Prisotnost teh genov v mitohondrijskem genomu je redkost pri večceličnih živalih, kajti pri nobeni drugi skupini živali še niso našli tujih nemitohondrijskih genov. Na podlagi tega raziskovalci sklepajo na večjo izmenjavo med jedrnim in mitohondrijskim genomom ožigalkarjev v primerjavi z ostalimi skupinami živali. Za to obstajata dve razlagi:

� za vnos tuje DNA v mitohondrijski genom sta potrebni homologna in nehomologna rekombinacija. Zato je rekombinacija bolj pogosta v mitohondrijih ožigalkarjev kot v mitohondrijih ostalih živalih (Chevalier in Stoddard, 2001)

� obstoječi mehanizem za prenos tRNA pomaga tudi pri prenosu tuje DNA v mitohondrije (Shao in sod., 2006)

2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov Pri ožigalkarjih, zaradi skromne makro-morfološke diferenciacije (Mayer, 1910, Dawson, 2003) in velike pestrosti življenjskih ciklov, ostaja vprašanje, katera oblika je evolucijsko starejša (polip ali meduza). Prve filogenetske študije ožigalkarjev so bile narejene na osnovi ribosomalnih 16S rDNA in 18S rDNA (Bridge in sod. 1995). Skupine, ki imajo meduzno generacijo (trdoživnjaki, klobučnjaki in kubomeduze), tvorijo enotno monofiletsko skupino (izhajajo iz skupnega prednika) in jih imenujejo Medusozoa. Avtorji se nagibajo k teoriji, da je skupni prednik ožigalkarjev imel polipno fazo ter da je meduzna faza sinapomorfija klada Medusozoa. Collins in sodelavci (2006) so predlagali delitev ožigalkarjev na Anthozoa (koralnjaki) in Medusozoa. Predpostavljajo, da so se najprej razvili koralnjaki in nato še skupina, ki jo tvorijo kubomeduze ter klobučnjaki. Zadnji dve našteti skupini tvorita sestrski klad. Da bi poudarili, da ima razred pecljate meduze (Stauromedusae) ločeno evolucijsko zgodovino in da se razlikuje od ostalih razredov ožigalkarjev, sta Marques in Collins (2004) oblikovala nov razred Staurozoa. Molekularni in morfološki znaki kažejo, da so pecljate meduze sestrska skupina Medusozoa (Collins in sod., 2006). Strobilacija polipa in efire so sinapomorfni znaki za vse klobučnjake. V svoji študiji so Collins in sodelavci (2006) predpostavili, da red Rhizostomea izhaja iz prednikov reda Semaeostome zaradi podobnosti v sistemu radialnih kanalov, kar je v skladu s

11

starejšimi morfološkimi študijami (Mayer, 1910; Hyman, 1940; Thiel, 1966). To hipotezo potrjujejo tudi študije primerjav majhne ribosomalne podenote (SSU) (Collins, 2002), kot tudi na veliki ribosomski podenoti (LSU). Izmed treh družin redu Semeostomeae - Cyaneidae, Ulmaridae in Pelagiidae naj bi se zadnja družina najprej ločila. Znotraj skupine Rhizostomeae obstajata dve glavni skupini taksonov: Cepheida in Rhizostomida (Stiasny, 1922; Thiel, 1970), za katere je Thiel (1970) predpostavil, da so se razvile iz predstavnikov znotraj skupine Semaeostomeae. Družini Cepheidae z rodovoma Cassiopea in Cotylorhiza ter Rhizostomatidae z rodovoma Catostylus in Stomolophus tvorita monofiletsko skupino (Collins in sod., 2006). Filogenetska analiza je bila narejena na vrstah iz rodov, ki so omenjeni zgoraj.

2.7. PCR reakcija Verižna reakcija s polimerazo, znana tudi pod angleško kratico PCR (Polymerase Chain Reaction), je metoda, ki omogoča pomnoževanje odsekov DNA z encimom DNA polimeraza. Metoda posnema pomnoževanje DNA v celici. Za vsak fragment DNA, ki ga želimo pomnožiti s PCR, je potrebno poznavanje nukleotidnega zaporedja na obeh koncih tarčne verige DNA ter pripraviti ustrezen specifičen par začetnih oligonukleotidov. Temperaturni profil PCR je sestavljen iz ločitve obeh verig DNA (toplotna denaturacija), naleganja začetnih nukleotidov ter podaljševanja verig DNA. Pri optimizaciji protokola je potrebno upoštevati tudi druge dejavnike kot so koncentracije soli in nukleotidov, število kopij tarčne DNA, število ciklov ter čas trajanja posameznih ciklov (Suzuki in Giovannoni, 1996; Polz in Cavanaugh, 1998). Produkti pomnoževanja se v PCR eksponentno kopičijo. Ključnega pomena za PCR reakcijo je encim Taq polimeraza. Kratica Taq pomeni Thermus aquaticus, bakterijo, ki preživi in se razmnožuje v vročem okolju, ki je za druge organizme smrtno. V nasprotju z drugimi polimerazami je encim, ki izvira iz omenjene bakterije (in danes narejen iz genetsko spremenjene bakterije), stabilen pri visokih temperaturah zaradi česar lahko pomnoževanje poteka pri visokih temperaturah.

12

Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo (Vir: K. Drobnič.Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih informacij, metode verižne reakcije s polimerazo in računalniško podprte tehnologije).

2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje) Za pripravo sekvenčne reakcije uporabljamo metodo asimetrični PCR. Z njo pomnožimo tarčno DNA in produkt takega pomnoževanja so enoverižne DNA, ki jih nato ločimo na visokoločljivostnih gelih. V PCR uporabimo le en začetni oligonukleotid, s čimer dosežemo, da se pomnožuje le ena veriga. Nukleotidi, ki jih damo v PCR so mešanica nukleotidov, ki so fosforilirani in nefosforilirani in le ti so označeni z fluorescentnim barvilom. Pomnoževanje se ustavi tam, kjer Taq polimeraza doda nefosforiliran označen nukleotid. Tako nastanejo različno dolge verige, ki se med seboj ločijo za en nukleotid. Nastale verige DNA ločimo na visokoločljivem gelu, kjer lahko ločimo verige DNA na en nukleotid natačno. Poznamo več tehnik sekvenciranja s PCR, poleg omenjene, kjer v reakcijo PCR damo nefosforilirane nukleotide s fluorokromi ali je s fluorokromom označen začetni nukleotid.

2.9. Agarozna elektroforeza

Agarozna elektroforeza je metoda, s katero specifično ločujemo nukleinske kisline na podlagi velikosti, naboja in drugih lastnosti (Bodlaj, 2001). Pri tem vzorec

13

nanesemo na gel, ki je pripravljen iz agaroze v ustrezni koncentraciji v elektroforetskem pufru. Agarozni gel igra vlogo »molekularnega sita«, skozi katerega se prebijajo makromolekule. Nanešen vzorec izpostavimo električnemu polju določene napetosti in jakosti električnega toka. Nukleinske kisline zaradi različne molekulske mase ter oblike potujejo po gelu z različno hitrostjo. Nukleinske kisline obarvamo z fluorokromi, ki se vežejo na verigo ali med verigi (v primeru dvojnovijačne DNA). Pod svetlobo kratke valovne dolžine postanejo nukleinske kisline vidne zaradi flourescence vgrajenih barvil.

14

3. EKSPERIMENTALNI DEL Eksperimentalni del naloge smo razdelili na več delov: vzorčenje na terenu, postopek izolacije DNA, pomnoževanje COI s PCR, agarozna elektroforeza in določanje nukleotidnega zaporedja ter filogeografska obdelava podatkov.

3.1. Označevanje vzorcev

Vzorce smo označili tako, da je iz oznake razvidno leto in mesec vzorčenja, vrsta klobučnjaka (RH- Rhizostoma pulmo) ter zaporedna številka osebka. . Primer: 06/05/RH43 06- leto vzorčenja 05- mesec vzorčenja RH- Rhizostoma pulmo 43- zaporedna številka osebka

3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije

Raztopina za shranjevanje tkiv (20% DMSO nasičen z NaCl) DMSO 20 ml EDTA 50 ml 0,5M EDTA, pH 8,0 NaCl 5,06g H2O do volumna 100 ml 10 mM TRIS-Cl, pH 8,0l 121, 1 g TRIS baze Dodamo dvakrat destilirano vodo do 800 ml in umerimo pH s koncentrirano HCl, ter dodamo destilirano vodo do 1000 ml

3.2.1. Puferske raztopine

> Shranjevalni pufer za Taq DNA-polimerazo (Fermentas)

• 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)

• 0,1 mM EDTA

• 100 mM KCl

15

> 10-krat koncentrirani PCR-pufer (Fermentas)

• 100 mm Tris-HCl (pH 8,8 pri 25°C)

• 500 mM KCl

• 0,8-odstotni neionski detergent P40

> Sestava nalagalnega pufra za agarozni gel:

• 0,05-odstotni bromofenolmodro

• 0,05-odstotni ksilen cianid v formamidu

• 40-odstotna (wt/vol) saharoza v dH2O

> Sestava 1x TAE (tris acetatni pufer) za agarozno elektroforezo

• 0,04 M Tris-acetat

• 0,001 M EDTA

• pH 8,0

> Sestava TE pufra:

• 10 mM Tris-HCl, pH 8

• 1 mM EDTA, pH 8

> Sestava 5-kratne založne raztopine TBE pufra:

• 445 mM Tris

• 445 mM borova kislina

• 1 mM EDTA

� založna raztopina etidijevega bromida s koncentracijo 10 µg/ml

� kit za izolacijo DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)

3.2.2. Encimi:

• Taq DNA-polimeraza (5U/µl, Fermentas)

• Proteinaza K (Fermentas)

16

3.2.3. Velikostni standardi DNA:

• GeneRuler™ 100bp DNA Ladder (100-1000 bp, Fermentas)

• Lambda DNA/Hind III Marker, 2 (Fermentas); 23130 bp-125 bp

3.2.4. Aparature

- centrifuga (Sigma)

- ciklični termostat GeneAMP PCR system1400 (Perkin Elmer)

- vodna kopel

- napajalnik visoke napetosti za agarozno elektroforezo

- kadičke za agarozno gelsko elektroforezo

- modeli za agarozne gele

- spektrofotometer Bio Quest, CE 2501 (Cecil Instruments Limited, UK)

- detekcijski sistem za slikanje agaroznih gelov UVITEC (Cambridege, UK)

3.3. Vzorčenje na terenu Opravili smo tri vzorčenja v Tržaškem zalivu v zimskem času (decembra 2006 in februarja leta 2007). Za vzorčenje velikih klobučnjakov smo uporabljali povlečno kočo, ki sta jo vlekli ribiški plovili Riba I in Riba II. Vzorčenje smo opravili tudi s plovilom Sagita, ki je last Morske biološke postaje Nacionalnega inštituta za biologijo. Pri vzorčenju s plovila Sagita smo si pomagali z mrežo za lovljenje meduz na daljši palici. Na plovilu smo vsako meduzo velikega klobučnjaka stehtali in izmerili premer klobuka. Takoj, ko smo opravili meritve, smo meduzi odrezali košček tkiva z roba klobuka in košček gonad s čisto pinceto in škarjami. Pinceto in škarje smo po rezanju dobro sprali z morsko vodo, da smo preprečili kontaminacijo med vzorci. Vsak košček tkiva smo shranili posebej v epici z konzervansom (20% DMSO nasičen z NaCl ali v 96% alkoholu). Epico smo zaprli, ustrezno označili z imenom vrste, datumom in lokacijo vzorčenja. Epice smo imeli ves čas v posodi z ledom, dokler jih nismo shranili v tekočem dušiku. Za daljše obdobje smo epice nato shranili globoko zamrznjene pri -80ºC. Pri vzorčenju smo si zaščitili roke z rokavicami iz lateksa ali gume.

17

Black Sea

Mediterranean Sea

Adriatic Sea

Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju.

3.4. Izolacija DNA Izolacijo DNA smo opravili z DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). DNA smo izolirali samo iz roba klobuka. Za eno izolacijo DNA smo potrebovali: - 100 mg vzorčenega tkiva - 180 µl pufra ATL - 20 µl proteinaze K - 200 µl pufra AL (vsebuje gvanidin hidroklorid) - 200 µl 96% etanola - 500 µl pufra AW1 (vsebuje gvanidin hidroklorid) - 500 µl pufra AW2 - 100 ml pufra AE - 1,5 ml epice - 2 ml epice s silikatno membrano Tkiva smo do izolacije DNA hranili na -80°C. S pinceto smo prenesli tkivo iz epic s konzervansom in jih dali v sveže epice ter vsakemu vzorcu dodali 200µl pufra ATL in 20µl proteinaze K. Vsako epico smo dobro premešali, zavili v parafim in pustili v vodni kopeli čez noč na temperaturi pri 65°C. Naslednji dan smo vzeli vzorce iz vodne kopeli ter jih ponovno močno premešali, dodali 200 µl pufra AL in 200 µl etanola ter še enkrat dobro premešali. Iz vsake epice smo odpipetirali reakcijsko mešanico in jo dali v posebne epice s silikatno membrano na katero se absorbirajo nukleinske kisline, ter centrifugirali pri 8000 rpm eno minuto. Pod epico z membrano smo zbrali pufer za spiranje membrane in ga zavrgli. Dodali smo 500µl pufra AW1 in centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Absorbirano DNA na membrani smo spirali z 500 µl pufra AW2 in centrifugirali tri minute na 14000 rpm. Nato smo v epico z membrano dodali 100 µl pufra AE s katerim smo eluirali DNA z membrane. Pufer AE smo pustili na membrani eno minuto ter nato centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Postopek smo ponovili dvakrat, tako da smo dobili dve frakciji posameznega vzorca. Obeh frakcij nismo združevali,

18

ampak smo jih shranili ločeni. Vzorce smo hranili v zamrzovalniku na temperaturi -20°C do nadaljnjih analiz.

3.4.1. Spektrofotometrične meritve Koncentracijo izolirane DNA v vzorcih smo določili spektrofotometrično. Vzorce DNA smo redčili 1:100 v 10mM Tris pufru (pH 8,0) in nato izmerili absorbanco pri treh valovnih dolžinah (260 nm, 280nm in 320nm). Koncentracijo smo izračunali po formuli: koncentracija DNA (µg/mL) = A260 x 50 µg x faktor redčenja Za računanje koncentracije DNA smo uporabili spletno aplikacijo http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_03.html. Kontaminacijo izolirane DNA z beljakovinami smo ovrednotili iz razmerja absorbcije pri 260 nm in 280 nm. DNA, ki ima razmerje A260/A280 v razponu od 1,7 do 2,0 je primerna za nadaljnjo uporabo in smatramo, da ni kontaminirana z beljakovinami, fenolom ali drugimi snovmi, ki absorbirajo ultraviolično svetlobo pri tej valovni dolžini. Nekontaminirana dvoverižna DNA, ki ima OD 1 (en centimeter dolžina poti žarka; 260 nm) vsebuje 50 µg mL-1 dvoverižne DNA. Na osnovi absorbcije pri 320 nm lahko ugotovimo ali je DNA kontaminirana s sestavinami iz kita za izolacijo DNA.

3.5. Agarozna elektroforeza

3.5.1. Priprava agaroznega gela

Po izolaciji z DNeasy Blood & Tissue Kit smo preverili količino in kvaliteto oborjene DNA na agaroznih gelih. Za izolirane vzorce DNA smo pripravili 1,2% gel po naslednjem postopku: zatehtali smo želeno količino agaroze in jo dali v erlenmajerico. Dodali smo potrebno količino pufra 1xTAE. Agarozo smo segrevali po 1 minuto v mikrovalovni pečici na 750 W. Med segrevanjem smo jo večkrat premešali. Segrevali smo jo toliko časa, da se je agaroza popolnoma stopila (da ni bilo več videti zrnc agaroze). Ko se je agaroza ohladila na približno 50ºC, smo dodali etidijev bromid (koncentracija založne raztopine 10mg/mL). Agarozo smo ohladili in dodali 3µl EtBr. Pripravili smo banjico za gel z glavničkom, dodali agarozo z EtBr ter pustili, da se strdi. Ko se je gel strdil, smo odstranili glavničke in gel na podstavku vstavili v posodo za elektroforezo. Za ogled pomnoženih fragmentov COI smo pripravili 1,8% agarozo v TAE pufru po zgoraj opisanem postopku.

3.5.2. Nanašanje vzorcev Na parafilm smo nanesli 5µl nalagalnega pufra in mu dodali 5µl vzorca. Vzorec in pufer smo premešali in nanesli v žepke na gelu. Poleg vzorcev smo nanesli še ustrezen velikostni standard λ DNA/HindIII (Fermentas) za genomsko DNA ali 100 bp marker za PCR produkte (Fermentas). Na posodo za elektroforezo smo položili pokrov ter priključili enosmerni električni tok. Naravnali smo željeno napetost elektroforeze. Elektroforeza je potekala 60 minut pri 6V/cm. Po končani elektroforezi

19

smo si gel ogledali na transiluminatorju, kjer smo ga presvetlili z UV svetlobo (325nm) in gele fotografirali ter slike shranili v digitalnem zapisu.

3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C Osnovna PCR mešanica je bila sestavljena iz matrične DNA, začetnih oligonukleotidov LCO1490 in HCO2198 (Folmer in sod., 1994), MgCl2, Taq DNA polimeraze in dNTP-jev. V PCR reakcijo smo dali matrično DNA. Celoten volumen reakcijske mešanice za PCR je bil 50µl. Koncentracija vsakega posameznega dNTP-ja je znašala v PCR reakciji 0,2mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Kjer nismo uspeli pomnožiti COI pri pogojih, ki so opisani spodaj, smo spreminjali koncentracijo MgCl2 in temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov. Prvotna reakcijska mešanica za PCR s končnim volumnom 50 µl je vsebovala

naslednje sestavine v delovnih koncentracijah:

� 5 enot Taq-polimeraze

� 5 µl 10-krat koncentriranega pufra za PCR

� 2,5 mM MgCl2

� 0,8 mM dNTP

� 10 µl LCO1490

� 10 µl HCO2198

� DNA v razponu od 100 ng do 500ng

� deionizirana in sterilna voda do 50 µl

Temperaturni profil PCR

Izhajali smo iz začetnega temperaturnega profila:

� začetna denaturacija: 95 C 3 minuti

� denaturacija: 94 C 1 minuta

� naleganje: 40 C 90 sekund 35 ciklov

� podaljševanje: 72°C 1 minuta

� podaljšana polimerizacija: 72°C 7 minut

Izhajali smo iz zgoraj napisanega osnovnega temperaturnega profila. PCR je bil sestavljen iz 35 ciklov pomnoževanja. Pri denaturaciji se je reakcijska mešanica segrela nad 90°C, da smo dosegli prekinitve vodikovih vezi in s tem razklenitev dvojne vijačnice DNA. Tako je omogočeno začetnim oligonukleotidom, da najdejo komplementarna mesta prileganja na DNA. Prvi cikel denaturacije je bil daljši, do 5 min, da smo popolnoma ločili obe verigi genomske DNA. Naleganje začetnih oligonukleotidov je trajalo od 20 sekund do 1 min. Nato je sledilo podaljševanje verig s Taq polimerazo pri optimalni temperaturi delovanja encima, ki je 72ºC. Naslednja faza je podaljšana polimerizacija, ki omogoči Taq polimerazi, da dokonča podaljševanje. Ta stopnja je še posebej pomembna, kadar pomnožujemo dolge fragmente DNA.

20

3.6.1. Začetni oligonukleotidi

Za PCR, s katerim smo pomnoževali COI in v asimetričnem PCR za določanje nukleotidnega zaporedja v COI, smo uporabili enak par začetnih oligonukleotidov (Folmer in sod., 1994). Številki ob imenu začetnih oligonukleotidov pomenita mesto naleganja na mtDNA. HCO2198 5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3' LCO1490 5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC- 3'

3.6.2. Priprava vzorcev za PCR Vzorce za PCR smo pripravili v laminariju, zato da smo preprečili kontaminacije s pomnožki iz drugih PCR reakcij, ki so lahko v aerosolih. Delali smo na ledu, da smo preprečili nespecifično pomnoževanje v PCR. Vsakokrat smo si pripravili potrebno količino PCR mešanice brez matrične DNA v 1,5 ml epici in jo dobro premešali. Mešanico smo nato razdelili v epice za PCR v ustreznih količinah, nato smo dodali še matrično DNA v ustrezni koncentraciji (glej Tabelo 2). Vzorce za PCR smo dobro premešali ter jih postavili v ciklični termostat PCR.

3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja Nukleotidna zaporedja smo določili v 12 osebkih iz Črnega morja in v 4 osebkih iz Koprskega zaliva. Nukleotidna zaporedja vzorcev so bila narejena v podjetju Macrogen (Koreja). Za PCR reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij smo uporabili enake začetne oligonukleotide (LCO1490 in HCO2198) kot v prvem pomnoževanju s PCR. Za uspešno asimetrično reakcijo PCR smo potrebovali 500 do 700 ng PCR produkta v 15 µl s koncentracijo 50 ng/µl. Potrebna koncentracija začetnega oligonukleotida za en asimetričen PCR je bila 5 pmol v enem µl. Nukleotidna zaporedja smo dobili v obliki kromatografskih zapisov in jih ročno pregledali v programu ChromasPro 1,34 (Technelysium Pty Ltd). S pregledovanjem smo našli mesta z nukleotidi, ki so bili označeni kot dvomljivi (ang. ambigous). Če je bilo možno, smo določili pravi nukleotid, če to ni bilo možno, smo pustili originalen zapis. Nato smo nukleotidna zaporedja obeh matričnih verig združili v eno konsenzusno nukleotidno zaporedje, ki smo ga uporabili za nadaljne obdelave s programom BioEdit (Hall, 1999). .

3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij

Konsezusna nukleotidna zaporedja smo uredili v fasta format (glej priloga A) in nato poiskali najbolj podobna nukleotidna zaporedja, ki so v podatkovni zbirki

21

GenBank. Za iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij smo uporabili algoritem Blast, ki se nahaja na spletni strani podatkovne zbirke GenBank (Blast pognan 5.2.2008, glej priloga D). Vsa nukleotidna zaporedja velikega klobučnjaka in njemu podobna nukleotidna zaporedja, ki so bila rezultat iskanja v GenBank, smo nato poravnali s programom Clustal (Higgins in sod., 1988), ki je dostopen na spletu http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Nastavitev programa nismo spreminjali. Iz poravnanih nukleotidnih zaporedij smo izrezali vrzeli (ang. gaps). Rezultat so poravnana nukleotidna zaporedja, ki smo jih nato uporabili za nadaljno obdelavo in izračune. Poravnana nuklotidna zaporedja so prikazana v prilogi B.

3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij Filogeografsko analizo vzorcev velikega klobučnjaka iz Črnega morja (Modri zaliv) in severnega Jadranskega morja (Koprski zaliv) smo naredili v programu MEGA (Kumar in sod., 2004). Kot osnovo za izračune smo uporabili poravnana nukleotidna zaporedja narejena v programu Clustal (glej poglavje 3.7 in priloga B). Pri obdelavi podatkov iz nukleotidnih zaporedij in za izris filogenetskega drevesa smo uporabili dve metodi; metoda združevanja najbližjega soseda (ang. Neighbour-Joining (NJ)), ki sodi med nediskretne metode (metode razdalj) in za oblikovanje filogenetskega drevesa uporablja parna neskladja (med nukleotidi na istem mestu v DNA), ter Kimurino-2 parametersko metodo, s katero smo izračunali parne razdalje posameznih haplotipov (Kimura, 1980). Filogenetsko drevo smo narisali v programu MEGA. Za koreninjenje filogenetskega drevesa smo uporabili kot zunanjo skupino nukleotidno zaporedje iz vrste Nemopilema nomurai (AB243416).

22

4. REZULTATI IN RAZPRAVA V diplomskem delu smo uporabili 21 vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju (Koprski in Piranski zaliv) in 25 vzorcev iz Črnega morja, ki nam jih je poslala dr. Tamara Shiganova (Shirshov inštitut za oceanologijo iz Moskve). Vzorci meduz velikega klobučnjaka, ki so bili nabrani v Tržaškem zalivu, so bili nabrani v novembru in decembru 2006 ter še januarja in februarja 2007. V Jadranskem morju je množično pojavljanje velikega klobučnjaka dokumentirano le v hladnem delu leta. V to obdobje sodijo tudi opažanja ribičev in naključnih obiskovalcev ob obali. Zelo obsežno množično pojavljanje velikega klobučnjaka v Tržaškem zalivu je bilo zabeleženo leta 2005. Podrobnejši podatki o vzorcih iz katerih smo izolirali DNA so opisani v Tabeli 2.

Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo velikega klobučnjaka.

DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA 15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH1 15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH2 15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH3 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH1 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH2 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH3 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH4 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH5 28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH6 11.01.2007 Koprski zaliv 13/07/RH1 11.01.2007 Koprski zaliv 13/07/RH2 September, 2005 Črno morje 07/05/RH1 September, 2005 Črno morje 07/05/RH2 September, 2005 Črno morje 07/05/RH3 September, 2005 Črno morje 07/05/RH4 September, 2005 Črno morje 07/05/RH5 September, 2005 Črno morje 07/05/RH6 September, 2005 Črno morje 07/05/RH7 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH27 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH31 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH33 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH B Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH C Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH D Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH E Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH G Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH H Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH K Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH M Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH N Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH3 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH4 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH12 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH13 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH15 Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH16 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH1 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH2 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH3 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH4 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH5 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH6 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH7

23

DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH8 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH9 01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH10

4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka DNA smo izolirali iz roba klobuka meduze velikega klobučnjaka po navodilih proizvajalca s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Kvaliteto in količino DNA smo preverili na 1,2-dstotnem agaroznem gelu. Velikost izolirane DNA smo določili s primerjavo z velikostnim standardom Hind III λ marker (Fermentas). S primerjavo jakosti obarvanih fragmentov DNA smo približno določili njihovo koncentracijo. Rezultati izolacije DNA so prikazani na slikah: slika 6, slika 7, slika 8 in slika 9 .

4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju Slika 6 prikazuje rezultat izolacije DNA iz 9 vzorcev, ki so bili nabrani v Piranskem in Koprskem zalivu (glej Tabelo 2) v obdobju od decembra 2006 do februarja 2007. Izolacijo DNA smo opravili iz roba klobuka. Izolacija DNA (prikazana na sliki 6) je bila uspešna v 8 primerih (11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6, 11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3). Na stezi, kjer je nanešen vzorec 11/06/RH1, ni vidna DNA, a smo s spektrofotometričnim merjenjem ugotovili, da je v vzorcu vseeno DNA v zelo nizki koncentraciji 30ng/µl (Tabela 3). Agarozna elektroforeza nam omogoča, da lahko ocenimo kakšne velikosti je izolirana DNA in približno oceno koncentracije DNA v vzorcu. Na sliki vidimo, da smo uspeli izolirati visoko molekularno DNA, katere velikost smo ocenili na 23 000 bp. Izolirana DNA je tudi delno razgrajena, kar je videti kot razmaz na stezi pod visoko molekularno DNA. Količina vzorca, ki smo jo nanesli v luknjico v gelu, je 5 µl. Količina izolirane DNA med vzorci je različna in je odvisna predvsem od količine tkiva, ki je bila uporabljena za izolacijo.

24

Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV Tržaškega zaliva). Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca. V Koprskem zalivu smo nabrali 18 osebkov velikega klobučnjaka. Nato smo iz 10 meduz velikega klobučnjaka izolirali DNA. Iz vzorcev smo izolirali visokomolekularno DNA (14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 14/07/RH9) (glej Sliko 7). Koncentracija izolirane DNA je bila v razponu od 727 ng/µl do 237 ng/µl (Tabela 3). Iz vzorcev 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH10 smo izolirali razgrajeno DNA v zelo nizki koncentraciji. Na agaroznem gelu je razkosana DNA videti kot razmaz na stezi.

25

Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 5 je sestavljena iz dveh slik.

26

Slika 8: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 11/06RH7/1, 11/06RH7/2, 11/06RH1/1, 11/06RH1/2, 11/06RH2/1, 11/06RH2/2, 11/06RH3/1, 11/06RH3/2, 12/06/RH1/1, 12/06/RH1/2, 12/06/RH2/1, 12/06/RH2/2, 12/06/RH3/1, 12/06/RH3/2, 14/07/RH11/1, 14/07/RH11/2, 14/07/RH12/1, 14/07/RH12/2, 14/07/RH14/1, 14/07/RH14/2, 14/07/RH15/1, 14/07/RH15/2, 14/07/RH16/1, 14/07/RH16/2. Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca. Veliko količino DNA smo izolirali iz vzorcev 13/07/RH1 in 13/07/RH2, ki so bili nabrani v Tržaškem zalivu (glej Sliko 9). Izmerjena količina DNA je bila največja med vsemi vzorci in sicer 2000 ng/µl v vzorcu 13/07/RH1 in 2210 ng/µl v vzorcu 13/07/RH2. Izolirana DNA je bila delno razgrajena, a še vedno dovolj kvalitetna za nadaljnje manipulacije.

27

Slika 9: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl) sledijo vzorci (od leve proti desni): 07/05/RH1, 07/05/RH2, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 07/05/RH5, 07/05/RH6, 07/05/ RH7,vzorci iz Koprskega zaliva: 13/07/RH1, 13/07/RH2. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 9 je sestavljena iz dveh slik.

4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju Manj uspešna je bila izolacija DNA iz vzorcev, ki so bili nabrani v Črnem morju in so bili shranjeni dlje časa (nabrani v septembru 2005) v 20% DMSO nasičenem z NaCl. Za izolacijo DNA smo uporabili tkivo z roba klobuka. Kadar je tkivo shranjeno v tem konzervansu dlje časa, postane bolj tekoče (Dawson in sod., 1998), zato smo ga morali odpipetirati v epico, v kateri je potekala izolacija DNA. DNA zelo dobre kvalitete smo izolirali iz vzorcev 07/05/RH1 in 07/05/RH5 (Slika 9). Izolacija DNA ni uspela iz vzorcev 07/05/RH2 in 07/05/RH3, kar smo potrdili tudi z spektrofotometričnimi meritvami. Koncentracija DNA je bila v razponu 15 ng/µl do 55 ng/µl, kar so bile najnižje izmerjene vrednosti izolirane DNA.

28

Slika 10 prikazuje vzorce iz Črnega morja, iz katerih so že predhodno izolirali DNA na Morski biološki postaji v Piranu, in smo jih prav tako uporabili za pomnoževanje COI. DNA je bila izolirana z detergentom CTAB. Koncentracija izolirane DNA je bila v velikem velikostnem razponu. Najnižjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu 08/05/RH D in sicer 119 ng/µl, najvišjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu 08/05/RH H in sicer 4100ng/µl.

Slika 10: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH B, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH H, 08/05/RH K, 08/05/RH N, 08/05/RH M, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 08/05/RH12, 08/05/RH13, 08/05/RH15, 08/05/RH16. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 8 je sestavljena iz dveh slik. Kit DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) je primeren za izolacijo DNA iz meduz klobučnjakov. Tudi količina in kvaliteta izolirane DNA je bila zadovoljiva in je v glavnem odvisna od časa shranjevanja vzorcev v konzervansu. Primerjava izoliranih DNA pokaže, da je boljše kvalitete DNA, ki smo jo izolirali kmalu po vzorčenju (glej sliko 6). DNA, smo iz vseh vzorcev izolirali po enakem postopku s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), razen nekaj vzorcev iz Črnega morja, iz katerih je bila DNA izolirana že prej z detergentom CTAB. Daljši čas shranjevanja tkiva v konzervansu pomeni tudi večjo razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Najbolj zanesljivo je shranjevanje tkiv v tekočem dušiku takoj po odvzemu in nato na -80 C. Žal pa pri terenskem delu ni možno vedno zagotoviti takšnega načina shranjevanja. Raziskovalci so uporabili tudi klasične metode izolacije DNA in preverili, kolikšna je razgradnja DNA glede na čas shranjevanja. Ugotovili so, da mora biti tkivo shranjeno na čimbolj nizkih temperaturah in čim krajši čas. V študiji so primerjali različne pogoje shranjevanja in različne organizme. Največjo razgradnjo DNA so opazili pri uhatem klobučnjaku in manjšo pri drugih morskih nevretenčarjih, kot sta morski polž Astrea undosa in vetrnica Anthopleura xanthogrammica. Zaradi velike vsebnosti vode v tkivih morskih nevretenčarjev ni možno ohraniti DNA s hitrim sušenjem tkiva (Dawson in sod., 1998).

29

Priporočena količina tkiva za izolacijo s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN) je 25mg in se nanaša na vrsto tkiva. Vsa omenjena tkiva vsebujejo večje število celic in zaradi tega več DNA. Klobučnjaki imajo v telesu meduze v glavnem mezoglejo, ki pa vsebuje zelo majhno število celic. Prav tako imajo klobučnjaki veliko vsebnost vode v telesu. Pri izolaciji smo morali zagotoviti zadosti tkiva, da pridobimo zadovoljivo količino DNA za nadaljne manipulacije, kakor tudi paziti, da s preveliko količino tkiva ne onemogočimo adsorbcije DNA na silikatno kolono.

4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA

Koncentracijo DNA smo ovrednotili na podlagi meritve absorbcije pri 260 nm in 280 nm. Vzorce smo redčili v razmerju 1 proti 100 v pufru 10 mM Tris (pH 8,0). Iz vrednosti absorbcije pri 260 nm smo po opisani formuli izračunali koncentracijo DNA. Koncentracijo DNA smo podali v ng v enem mikrolitru. Izmerjene koncentracije so nizke. To smo nekako tudi pričakovali, saj je celotna meduza zgrajena v glavnem iz mezogleje, ki ne vsebuje veliko celic. Količina DNA v vzorcih je v razponu od najvišje vrednosti 4100ng/µl do 3,07 ng/µl. Izplen DNA iz roba klobuka meduze je mnogo manjši v primerjavi z izplenom iz drugih tkiv bolj bogatih s celicami, kadar uporabimo kit DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Z istim kitom lahko iz tkiv, ki so bogata s celicami, izoliramo do 40 µg DNA iz 25 mg repka podgane ali do 30 µg DNA iz možgan. Izplen DNA iz plavutke ribe (pribl. 20 mg) z istim kitom znaša 10 do 20 µg DNA. Majhna količina DNA pomeni tudi manj možnih manipulacij, zato priporočamo zaradi majhnega izplena DNA iz roba klobuka, da se pri vzorčenju odvzame več koščkov tkiva. Tako je kasneje možno izpeljati več izolacij iz DNA istega osebka in pridobiti zadosti DNA za nadaljne delo. Zgodi se, da se DNA ne raztopi, ampak ostane neraztopljena v topilu. Zato je tudi možno, da vzamemo alikvot, v katerem ni veliko raztopljene DNA. Razlog, da se DNA ne raztopi popolnoma v topilu je predvsem v nečistočah, ki so vezane na DNA in so povezane z vrsto tkiva, iz katerega jo izoliramo ali pa na okolje, v katerem je tkivo kot na primer izolacija DNA iz mikrobnih vzorcev sedimenta, vampa ali prsti (Roe in sod., 1996).

30

Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu. OZNAKA VZORCA RAZMERJE (A 260: A280) KONCENTRACIJA DNA

V VZORCU (ng/µL) 12/06/RH1 1,8 148 12/06/RH2 2,02 232 12/06/RH3 1,9 193 11/06/RH1 1,2 29 11/06/RH2 1,5 54 11/06/RH3 1,8 108 11/06/RH4 1,7 757 11/06/RH5 1,7 74 11/06/RH6 2,1 113 13/07/RH1 1,9 2000 13/07/RH2 1,7 2210 07/05/RH1 11 55 07/05/RH2 0 0 07/05/RH3 0 0 07/05/RH4 1,5 14 07/05/RH5 2 39 07/05/RH6 2 19 07/05/RH7 1 10 14/07/RH1 2 212 14/07/RH2 2,1 559 14/07/RH3 2,0 247 14/07/RH4 2,1 480 14/07/RH5 4,19 410 14/07/RH6 2,3 430 14/07/RH7 2 237 14/07/RH8 1,9 242 14/07/RH9 2,1 500 14/07/RH10 2,1 727 08/05/RH16 1,7 292 08/05/RH B 1,8 1 08/05/RH H 1,9 4100 08/05/RHN 1,9 970 08/05/RH3 1,8 3 08/05/RH4 1,8 3 08/05/RH27 1,8 787 08/05/RH31 2,2 153 08/05/RH33 2,2 188 08/05/RHC 1,9 613 08/05/RHD 1,8 118 08/05/RHE 1,9 153 08/05/RHG 2,0 999 08/05/RHK 1,9 371 08/05/RHM 1,7 108 08/05/RH12 1,8 732 08/05/RH13 1,9 920 08/05/RH15 1,9 970

4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR V reakciji PCR smo pomnoževali zapis za encim citokrom oksidazo C in sicer za podenoto I (COI) s parom začetnih oligonukleotidov LCO1490 in HCO2198 (Folmer in sod., 1994 ). Za PCR reakcijo smo uporabili temperaturni profil in reakcijsko mešanico, ki sta opisana v poglavju 3.5. in 3.5.2. Reakcijske mešanice so se razlikovale po količini dodane matrične DNA (glej Tabelo 3).

31

Najprej smo pripravili ustrezne redčine izoliranih DNA po naslednji shemi :5µl DNA + 45 µl sterilne vode (glej tabelo 3). Količine dodane matrične DNA v PCR reakciji so razvidne iz Tabele 4. Vzorcev, kjer smo izolirali malo DNA, nismo redčili. Pomnožili smo 700bp dolg fragment COI, ki smo ga uspeli pomnožiti v 16-ih vzorcih. Pomnoževanje je bilo uspešno v slabi tretjini vzorcev (27 odstotkih). Velikost pomnoženih produktov smo določili s primerjavo z velikostnim standardom GeneRuler™ 100bp DNA Ladder ((100–1000 bp) Fermentas na agaroznem gelu. Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter uspešnost pomnoževanja COI. OZNAKA VZORCA

REDČITEV MATRIČNE DNA

KONCENTRACIJA REDČENE DNA (ng/µl)

KOLIČINA MATRIČNE DNA (µL)

KONCENTRACIJA MATRIČNE DNA V PCR (ng)

USPEŠNOST POMNOŽEVANJA COI

06/05/RH43 1:10 Ni izmerjena 15 - +

06/05/RH46 1:10 Ni izmerjena 15 - +

08/05/RH16 292 10 2920 +

08/05/RH B 1 10 18 +

08/05/RH H 4100 10 41000 +

08/05/RH N 970 10 9702 +

07/05/RH3 0 3 0 +

06/05/RH43 10 - -

06/05/RH46 10 - -

07/05/RH3 1:10 0 5 0 -

07/05/RH4 1:10 1 5 7 -

08/05/RH4 1:10 0 5 1 -

08/05/RH27 1:10 78 10 787 +

08/05/RH31 1:10 15 5 76 +

08/05/RH33 1:10 18 5 94 +

08/05/RH D 1:10 11 10 118 +

08/05/RH E 1:10 15 5 76 +

08/05/RH G 1:10 99 5 499 +

08/05/RH K 1:10 37 5 185 -

08/05/RH M 1:10 10 5 54 -

08/05/RH12 732 7 5128 -

08/05/RH13 920 10 9207 -

08/05/RH15 970 10 9702 -

08/05/RH16 292 5 1460 -

07/05/RH6 19 5 99 +

12/06/RH1 148 1 148 -

12/06/RH2 232 1 232 +

12/06/RH3 193 1 193 +

11/06/RH1 29 1 29 -

11/06/RH2 54 1 54 -

11/06/RH3 108 1 108 +

11/06/RH4 757 1 757 -

11/06/RH5 74 1 74 -

11/06/RH6 113 1 113 -

11/06/RH5 redčina

1:10 7 5 37 -

11/06/RH6 redčina

1:10 11 5 56 -

32

OZNAKA VZORCA

REDČITEV MATRIČNE DNA

KONCENTRACIJA REDČENE DNA (NG/ΜL)

KOLIČINA MATRIČNE DNA (µL)

KONCENTRACIJA MATRIČNE DNA V PCR (NG)

USPEŠNOST POMNOŽEVANJA COI

07/05/RH3 1:10 0 5 0 -

08/05/RH16 292 5 1460 -

08/05/RH B 1 5 5 -

08/05/RH H 4100 5 20500 -

08/05/RH N 970 5 4851 -

08/05/RH27 1:10 78 10 787 -

08/05/RH31 1:10 15 10 153 -

08/05/RH33 1:10 18 10 188 -

08/05/RH C 1:10 61 10 613 -

08/05/RH D 1:10 11 5 59 -

08/05/RH E 1:10 15 5 76 -

08/05/RH G 1:10 99 5 499 -

11/06/RH7 10 - -

11/06/RH1 29 10 297 -

11/06/RH2 54 10 544 -

12/06/RH1 148 10 1485 -

12/06/RH2 232 10 2326 -

12/06/RH3 193 10 1930 +

14/07/RH1 212 1 212 +

14/07/RH3 247 1 247 +

14/07/RH7 237 1 237 -

14/07/RH8 242 1 242 +

14/07/RH11 7 - +

14/07/RH12 7 - +

14/07/RH14 7 - +

14/07/RH15 10 - +

14/07/RH16 10 - - Legenda : + uspešno pomnožen COI, - neuspešno pomnožen COI Rezultati pomnoževanja COI so prikazani na spodnjih slikah. Produkte pomnoževanja smo nanesli na 1,8 % agarozni gel, ki smo ga pripravili, kot je opisano v poglavju 3.4.1 in 3.4.2. COI smo uspeli pomnožiti v vzorcih (glej sliko 10): 06/05/RH43, 06/05/RH46, 07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N. Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna, učinkovitost pomnoževanja v PCR je bila verjetno odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. Vzorci 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 07/05/RH3 imajo na agaroznem gelu zelo močan signal, zato lahko sklepamo na visoko koncentracijo pomnoženega produkta. V vsak vzorec smo dodali 5µl matrične DNA. COI v vzorcih 06/05/RH43, 06/05/RH46 smo pomnožili v PCR pri naslednjih pogojih: temperaturi naleganja 40º C, koncentracija MgCl2 je bila 1,5 mM ter koncentracija obeh začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM.

33

Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 06/05/RH43, 06/05/RH46, 07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, velikostni standard 100bp DNA Vzorca (glej sliko 11) 06/05/RH43 in 06/05/RH46 smo ponovno namnožili (reamplificirali), kar pomeni da smo za matrično DNA uporabili neprečiščen PCR produkt iz predhodnega pomnoževanja s PCR. PCR reakcije, iz katerih smo uporabili PCR produkt so prikazane na sliki 11. V obeh vzorcih (06/05/RH43, 06/05/RH46) smo s ponovnim pomnoževanjem uspešno namnožili COI. Uspešno smo pomnožili COI tudi v vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH3 in 08/05/RH4. Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna. Poleg DNA so se v vseh vzorcih pomnožili še drugi nespecifični produkti, ki so vidni kot razmaz na stezi. Pomnoženi produkti COI niso specifični in tudi po velikosti (ker so manjši od 700bp) ne ustrezajo pravim velikostim COI. V vzorcu 07/05/RH4 se ni pomnožil COI, ampak je videti, kot da je v njem veliko visokomolekularne DNA. To je videti iz primerjave s sliko, na kateri je izolirana DNA tega vzorca. Velike količine DNA prav tako lahko inhibirajo pomnoževanje v PCR. Pogoji, pri katerih smo pomnožili COI, so bili: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl2 je bila 1,5 mM, ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM.

34

Slika 12: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami ( od leve proti desni): 06/05/RH43, 06/05/RH46, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 100bp DNA. Slika 12 je sestavljena iz dveh slik. COI smo uspešno pomnožili devetih vzorcih iz Črnega morja (08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH K, 08/05/RH M). Rezultati pomnoževanja so prikazani na sliki 12. Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. Pomnoževanje vzorcev 08/05/RH27, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G je bilo zelo učinkovito in na gelu smo videli močno obarvane pomnožke DNA. V vzorcih 08/05/RH K, 08/05/RH M smo namnožili produkte, ki po velikosti ne ustrezajo velikosti COI in smo jih zato ovrednotili kot nespecifične produkte. Pogoji pomnoževanja COI so bili temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl2 je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM.

35

Slika 13: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH K, 08/05/RH M , velikostni standard 100bp DNA. Slika 13 je sestavljena iz dveh slik

36

. COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 14) tudi v vzorcu 08/05/RH12. V vzorcih 07/05/RH6, 08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13,nam COI ni uspelo namnožiti.

Slika 14: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 07/05/RH6, 08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13, 08/05/RH12 ,velikostni standard 100bp DNA. Slika 14 je sestavljena iz več posameznih slik agaroznih gelov.

37

COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 15) v vseh vzorcih: 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5 (vzorci iz Koprskega zaliva). Na gelu smo videli, da je količina pomnožene DNA majhna. DNA, ki smo jo uporabili za matrično DNA, je bila slabe kvalitete in nizke koncentracije. Jakost pomnoženih fragmentov je nizka, količina in kvaliteta izolirane DNA slaba (glej Tabela 4). Pri vzorcih 12/06/RH1 ter 11/06/RH6 nam COI ni uspelo namnožiti.

Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega zaliva. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6, velikostni standard 100bp DNA.

38

Pomnoževanje COI v naslednjih vzorcih iz Koprskega zaliva (11/06/RH5, 11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10) in v vzorcih iz Črnega morja (08/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G) ni bilo uspešno. Rezultat pomnoževanja so nespecifični pomnožki, ki so na sliki vidni kot lise. Pogoji pomnoževanja so bili naslednji: temperatura naleganja 40º C, koncentraciji MgCl2 1,5 mM in koncentracija začetnih oligonukleotidov 0,5µM.

Slika 16: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 11/06/RH5, 11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10), 08/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, velikostni standard 100bp DNA. COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 17) vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH K. Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna in odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA (glej Tabela 3). V ostalih vzorcih nismo uspeli pomnožiti COI. V vzorcih smo pomnožili tudi nespecifične produkte. COI smo pomnožili pri pogojih: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl2 1,5 mM, koncentracija začetnih oligonukleotidov 0,5 µM.

39

Slika 17: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH K, 06/05/RH40, 06/05/RH43, 06/05/RH45, velikostni standard 100bp DNA.

40

Slika 18: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 11/06/RH7, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,14/07/RH11, 14/07/RH12, 14/07/RH14, 14/07/RH15, 14/07/RH16, 10/06/RH1/2, 10/06/RH2/1, 10/06/RH3/1, 10/06/RH4/2, 10/06/RH6/2, 10/06/RH7/1, 10/06/RH8/1, 10/06/RH9/2, velikostni standard 100bp DNA.

41

4.2.1. Reamplifikacija PCR Pri vzorcih pri katerih smo v prvem PCR pomnožili premalo količino DNA smo uporabili reamplifikacijo. To pomeni, da smo v PCR uporabili produkt prejšnjega PCR kot matrično DNA. V PCR smo dodali alikvot neprečiščenega PCR produkta 5µl. Reamplifikacijo smo izvedli v vzorcih, ki se niso pomnožili v PCR z naslednjimi pogoji: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl2 1,5 mM, koncentracija začetnih oligonukleotidov 0,5 µM, smo poskušali ponovno namnožiti v PCR, v katerem smo kot matrično DNA uporabili PCR produkt, ne pa izolirano DNA. Slika 19 prikazuje reamplifikacijo vzorcev iz PCR reakcije (glej sliko 15). Za reamplifikacijo smo uporabili naslednje vzorce: 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6. Z reamplifikacijo smo uspeli v vseh vzorcih pomnožiti COI, vendar so se poleg DNA namnožili še krajši nespecifični produkti.

Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega zaliva. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6, velikostni standard 100bpDNA. Zaradi kratkoverižnih nespecifičnih produktov (Slika 19) je za nadaljno uporabo potrebno iz gela izolirati specifičen produkt. Tega v okviru diplomske naloge nismo opravili.

42

4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja Ker smo iz nekaterih vzorcev pomnožili nespecifične produkte (temperatura naleganja začetnih oligonukleotidov je bila 40ºC), smo zvišali temperaturo naleganja začetnih oligonukleotidov na 50ºC, da bi zagotovili bolj specifično pomnoževanje. Spremenjen temperaturni profil za pomnoževanje COI s temperaturo naleganja začetnih oligonukleotidov 50ºC je bil : 95ºC 3min 94ºC 1min 50ºC 90 sek 35 ciklov 72ºC 1min 72ºC 7min 4ºC ∞ S spremembo temperature prileganja (glej sliko 20), smo uspeli pomnožiti specifičen produkt COI v naslednjih vzorcih: 14/07/RH1, 14/07/RH3, 14/07/RH7, 14/07/RH8. V PCR smo povečali še število enot Taq polimeraze z 1,25 U na 2,5 U. Za pozitivno kontrolo pomnoževanja smo uporabili DNA mesečinke (vzorec DNA 06/05/PN5). Negativna kontrola je bila PCR reakcijo, v kateri smo namesto matrične DNA dodali sterilno destilirano vodo, ki smo jo uporabljali za PCR.

Slika 20: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH3, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 08/05/RH16 (stara red., redčitev 10:1), 08/05/RH1 (nova red.redčitev 10:1), 11/06/RH6, pozitivna kotrola (mesečinka), negativna kontrola (H2O), velikostni standard 100bp DNA.

43

COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 20) v vzorcih: 11/06/RH7, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 14/07/RH12, 10/06/RH1/2. Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. V vzorcih 10/06/RH2/1, 10/06/RH3/1 in 10/06/RH4/2 smo poleg DNA pomnožili nespecifične produkte, ki so vidni kot razmaz na stezi. V ostalih desetih vzorcih nam COI ni uspelo namnožiti. COI smo pomnožili pri temperaturi naleganja 40º C, koncentracija in koncentracija MgCl2 je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5 µM.

4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) Nukleotidno zaporedje smo določili v desetih vzorcih (glej Tabelo 4). Za določevanje nukleotidnega zaporedja smo uporabili začetna oligonukleotida LCO1490 in HCO2198. Vzorce, ki smo jim določili nukleotidna zaporedja, smo preimenovali. Novo ime je sestavljeno iz številke vzorca in zaporedne številke osebka v tem vzorcu. Najprej smo naročili določitev nukleotidnega zaporedja ene verige in nato še določitev nukleotidnega zaporedja druge verige. Za določanje nukleotidnega zaporedja smo pripravili 16 vzorcev (glej Tabela 5). Nukleotidna zaporedja smo pridobili iz 7 vzorcev iz Črnega morja in iz dveh vzorcev iz Tržaškega zaliva. Iz 7 vzorcev nismo uspeli pridobiti nukleotidnega zaporedja zaradi premalo PCR produkta. Dolžina nukleotidnih zaporedij je bila od 660 bp do 680 bp in je ustrezala pričakovani velikosti COI. Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem MESTO VZORČENJA

OZNAKA VZORCA NOVA OZNAKA VZORCA

DOLŽINA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA (ŠT. BAZNIH PAROV)

Črno Morje 08/05/RH27 0801 - Črno Morje 08/05/RH31 0802 - Črno Morje 08/05/RH33 0803 - Črno Morje 08/05/RH C 0804 - Črno Morje 08/05/RH D 0805 670 Črno Morje 08/05/RH E 0806 - Črno Morje 08/05/RH G 0807 670 Črno Morje 07/05/RH33 0703 660 Črno Morje 08/05/RH16 0808 670 Črno Morje 08/05/RH B 0809 670 Črno Morje 08/05/RH H 0810 670 Črno Morje 08/05/RH N 0811 670 Koprski zaliv 14/07/RH4 1404 680 Koprski zaliv 14/07/RH3 1403 670 Koprski zaliv 14/07/RH2 1402 - Koprski zaliv 14/07/RH1 1401 - Legenda: - nukleotidnega zaporedja nismo uspeli določiti

4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem Blast) Z algoritmom Blast smo poiskali podobna nukleotidna zaporedja s tistimi v podatkovni banki GenBank. Ugotovili smo, da nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka ali iz rodu Rhizostoma ob času iskanja ni bilo v GenBank. Nukleotidna

44

zaporedja iz velikega klobučnjaka so bila najbolj podobna zaporedjem iz mtDNA A. aurita (DQ787873.1).

4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal Poravnavo nukleotidnih zaporedij smo naredili v programu Clustal (glej prilogo B) in vanjo vključili osem nukleotidnih zaporedij iz velikega klobučnjaka, ki smo jih pridobili v okviru diplomske naloge (RH805, RH811, RH807, RH808, RH703, RH810, RH809, RH801). Poleg smo vključili še nukleotidno zaporedje N. nomurai (AB243426). V poravnanih nukleotidnih zaporedjih smo našli nekaj vrzeli, najdaljša vrzel je bila dva nukleotida. Vrzeli smo izrezali pred nadaljno obdelavo in nato nukleotidna zaporedja ročno poravnali na obeh skrajnih koncih. Poravnana nukleotidna zaporedja smo vnesli v program MEGA, kjer smo dodali nukleotidno zaporedje N. nomurai (dolgo 529bp) in jih še enkrat ročno poravnali. Poravnana nukleotidna zaporedja so bila dolga 659 baz.

4.4. Filogeografska analiza Filogenetsko drevo smo narisali s programom MEGA (Kumar in sod., 2004). Za izris filogenetskega drevesa (slika 19) smo uporabili metodo združevanja najbližjega soseda (Neighbour-Joining (NJ)) in Kimurino-2 paramersko metodo, s katero smo izračunali parne razlike med posameznimi haplotipi. Našli smo 170 variabilnih mest, 487 ohranjenih mest, 123 filogenetsko informativnih mest, na katerih temelji filogenetska analiza. Ohranjena mesta so identična v vseh nukleotidnih zaporedjih, medtem ko informativna mesta vsebujejo substitucije. Substitucije so mutacije, ki so se ohranile skozi naravni izbor. Substitucije označujejo spremembo baznega para na tretjem mestu v kodonu. Merilo ob filogenetskem drevesu prikazuje število substitucij. Za koreninjenje drevesa smo uporabili nukleotidno zaporedje N. nomurai (AB243426), ker je najbližji sorodnik velikega klobučnjaka z določenim nukleotidnim zaporedjem. Za statistično ovrednotenje vejišč smo uporabili metodo vezanja (ang. Bootstrap) in sicer 1000 ponovitev.

45

Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega klobučnjaka iz Črnega morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja število substitucij v analiziranih nukleotidnih zaporedjih. Filogenetska analiza narejena na nukleotidnih zaporedjih COI je pokazala, da nukleotidna zaporedja velikih klobučnjakov iz Črnega morja tvorijo svojo filogenetsko skupino, ki je jasno ločena od velikih klobučnjakov nabranih v Tržaškem zalivu. Ločitev obeh skupin podpirajo tudi rezultati metode vezanja. Visoke vrednosti (98%) podpirajo združevanje vzorcev iz Črnega morja v enotno skupino. Enako visoke vrednosti (99%) podpirajo združevanje vzorcev iz Koprskega zaliva v enotno skupino. Med analiziranimi osebki velikih klobučnjakov iz Črnega morja smo našli pet različnih haplotipov med osmimi osebki. Trije osebki (RH807, RH703, RH805, RH810) imajo enak haplotip. Izračunane vrednosti genetske razdalje z Kimurino-2 paramersko metodo so enake 0 in pomenijo, da med nukleotidnimi zaporedji ni razlik. Kimurina-2-parameterska metoda pri izračunu upošteva obe možni vrsti substitucij (tranzicije in transverzije) in da v danem nukleotidnem zaporedju ni razlik v pogostosti substitucij. Majhno odstopanje smo opazili pri vzorcu RH811, ki pa ni statistično podprto z metodo vezanja (11%). Vse vrednosti metode vezanja, ki so pod mejo 50%, so statistično neznačilne. Izračunane genetske razdalje med vzorci nabranimi v Tržaškem zalivu in Črnem morju so večje in znašajo od 0,2279 do 0,2306. Ugotovitve pridobljene s filogenetsko analizo lahko verjetno navežemo na življenjski cikel in način razmnoževanja velikega klobučnjaka. Nespolno razmnoževanje velikega klobučnjaka poteka s strobilacijo polipa. Do sedaj je bila opazovana strobilacija samo pri vrsti R. octopus v laboratoriju (Holst in sod., 2007). Prav tako nimamo podatkov o sposobnosti razširjanja meduz velikega klobučnjaka. Glede na veliko geografsko oddaljenost med vzorčenima populacijama lahko sklepamo, da je genski pretok med njima omejen. Omejujejo ga pa tudi kratka življenjska doba meduze in geografske bariere, ki so med sevenim Jadranskim morjem in vzorčenim mestom v Črnem morju. Na osnovi nukleotidnih zaporedij iz COI je možno razlikovanje na nivoju vrst kakor tudi na nižjih nivojih zaradi zadostne variabilnosti v nukleotidnih zaporedjih COI (Hebert in Gregory, 2005). Uspešno uporabo takega pristopa pa predstavlja tudi podatkovna zbirka BOLD (Ratnasingham in Hebert,

RH805

RH811

RH807

RH808

RH703

RH810

RH809

RH801

Črno morje

Nemopilema nomurai(AB243426). RH1403

RH1404 Koprski zaliv 99

98

11

0.05 substitucij

46

2007). Do sedaj se je izkazalo, da je variabilnost znotraj COI majhna edinole pri koralnjakih (Anthozoa), medtem ko je variabilnost pri klobučnjakih primerljiva z drugimi skupinami večceličnih živali (Huang in sod., 2008). Pri uhatem klobučnjaku (ki je še vedno opredeljen kot kozmopolitska vrsta) je medvrstna divergenca v razponu od 13-odstotkov do 24-odstotkov (Dawson in Jacobs, 2001). Podoben razpon divergence so izračunali tudi med domnevnima vrstama Cyanea capillata (Dawson, 2005) in Cassiopea (Holland in sod., 2004). Divergenca, ki smo jo izračunali med nukleotidnimi zaporedji iz osebkov velikega klobučnjaka iz Jadranskega morja in Črnega morja, je v podobnem razponu in znaša 18,5 odstotkov. Glede na pridobljene rezultate menimo, da je možno uporabiti nukleotidna zaporedja iz COI velikega klobučnjaka za razlikovanje geografsko oddaljenih populacij.

47

5. ZAKLJUČKI Od leta 2003 so v Tržaškem zalivu zabeležili masovno pojavljanje nekaterih klobučnjaških meduz, kot so veliki klobučnjak (Rhizostoma pulmo), uhati klobučnjak (Aurelia aurita), medtem ko je masovno pojavljanje mesečinke (Pelagia noctiluca) že znan pojav. Razlogi za množično pojavljanje različnih vrst klobučnjaških meduz, ki so običajno prisotne v majhnem številu, še niso znani. Raziskovalci navajajo različne vzroke povezane z antropogenimi vplivi (evtrofikacija, hipoksija povezana z evtrofikacijo, klimatske spremembe, porušeno prehranjevalno verigo v morjih zaradi prelova nekaterih vrst rib), ki naj bi povzročili masovna pojavljanja. V teku diplomske naloge smo opravili vzorčenje s plovilom Sagita. Pri vzorčenju smo morali biti pozorni predvsem na to, da vzorca nismo kontaminirali ter da smo vzorce pravilno označili in shranili. Vzorce smo shranili v epicah s konzervansom, da smo tkivo zavarovali pred razgradnjo. Iz 36 osebkov smo izolirali DNA s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), ki se je izkazala kot zelo učinkovita in preprosta metoda. DNA nam je uspelo izolirati iz večine vzorcev. Količina in kvaliteta izolirane DNA je bila odvisna od časa shranjevanja vzorcev v konzervansu. Daljši čas shranjevanja je pomenil večjo razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Tkivo je potrebno shranjevati na zelo nizkih temperaturah čim krajši čas. Količina izolirane DNA v vzorcih je v razponu od 4100ng/µl do 3,07 ng/µl. Cilj diplomskega dela je bil proučiti genetsko diverziteto velikega klobučnjaka. Za raziskovanje diverzitete smo uporabili genetski marker citokrom oksidazo C podenoto I (COI). Najprej smo optimizirali pomnoževanje genetskih markerjev s PCR in nato pridobili njihova nukleotidna zaporedja. Z reakcijo PCR smo pomnoževali zapis za encim COI s parom začetnih oligonukleotidov LCO1490 in HCO2198 (Folmer in sod., 1994 ). Izkazalo se je, da univerzalni oligonukleotidi omogočajo pomnoževanje tudi na velikem klobučnjaku (Rhizostoma pulmo), saj nam je uspelo pomnožiti specifičen PCR produkt v zadostni količini za nadaljne postopke. PCR reakcija je bila uspešna v 27 odstotkih (16 osebkov). Nukleotidna zaporedja smo določili 8 osebkom iz Črnega morja, ki so si med seboj zelo podobna in 2 osebkoma iz Koprskega zaliva. Vzorci iz Črnega morja tvorijo svojo, ločeno filogenetsko skupino od vzorcev iz Tržaškega zaliva. Izračunane filogenetske razdalje med posameznimi nukleotidnimi zaporedji v vzorcih iz Črnega morja kažejo, da so si ti vzorci zelo podobni (izračunane vrednosti z Kimura -2 paramersko metodo so enake 0). Mnogo večje so izračunane genetske razdalje med nukleotidnimi zaporedji iz vzorcev iz Tržaškega zaliva v primerjavi z vzorci iz Črnega morja(od 0,2279 do 0,2306).

48

6. VIRI Arai, M. N. 1997. A Functional Biology of Scyphozoa. Chapman and Hall, London, 68-206. Arai M.N., 2001a. Pelagic coelenterates and eutrophication: a review, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 69-87. Arai M.N., 2001b. Predation on pelagic coelenterates: a review. J. Mar Biol. Assoc. UK 85: 523- 536. Beagley, C.T., Okada, N.A., Wolstenholme, D.R., 1996. Two mitochondrial group I introns in a metazoan, the sea anemone Metridium senile: one intron contains genes for subunits 1 and 3 of NADH dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 5619–5623. Beaton, M.J., Roger, A.J., Cavalier-Smith, T., 1998. Sequence analysis of the mitochondrial genome of Sarcophyton glaucum: conserved gene order among octocorals. J. Mol. Evol. 47, 697–708. Bodlaj, J. 2001. Metoda PCR/Polymerase Chain Reaction. Seminar. MF, Ljubljana. Bridge, D., Cunningham, C.W., DeSalle, R., Buss, L.W., 1995. Class-level relationships in the phylum Cnidaria: molecular and morphological evidence. Mol. Biol. Evol. 12, 679–689. Cheng J.H., Ding F.Y., Li S.F., Yan L.P., Ling J.Z., Li J.S., 2005. A study on the quantity distribution of macro-jellyfish and its relationship to seawater temperature and salinity in the East China Sea Region. Ecol Sin 25: 440- 455. Chevalier, B.S., Stoddard, B.L., 2001. Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res. 29, 3757–3774. Collins, A.G., 2002. Phylogeny of Medusozoa and the evolution of cnidarian life cycles. J. Evol. Biol. 15, 418–432. Collins A.G., Schuchert P., Marques A.C., Jankowski T., Medina M. and Schierwater B., 2006. Medusozoan Phylogeny and Character Evolution Clarified by New Large and Small Subunit rDNA Data and an Assessment of the Utility of Phylogenetic Mixture Models. Syst. Biol. 55(1):97–115, 2006. Daryanabard R., Dawson M.N. (in press). Jellyfish blooms: Crambionella orsini ( Scyphozoa, Rhizostomeae) in the Gulf of Oman, Iran 2008. J. Mar. Biol. Assoc UK. Daskalov G.M., Grishin A.N., Rodionov s., Mihneva V., 2007. Trophic cascades triggered by overfishing reveal possible mechanisms of ecosystem regime shift. Proc. Natl. Acad. Sci USA 104: 10518- 10523. Dawson, M.N, Jacobs D.K., 2001. Molecular evidence for cryptic species of Aurelia aurita (Cnidaria, Scyphozoa). Biol. Bull. 200: 92-96.

49

Dawson M.N., 2003. Macro-morphological variation among cryptic species of the moon jellyfish, Aurelia (Cnidaria: Scyphozoa),. Mar. Biol. 143:369-379. Erratum: Mar. Biol. 144:203.

Dawson M.N., Gupta A.S., England M.H., 2005. Coupled biophysical global ocean model and molecular genetic analyses identify multiple introductions of cryptogenic species, PNAS, Vol. 102, No 34: 11968–11973. Dawson M.N., 2005 . Cyanea capillata is not a cosmopolitan jellyfish: morphological and molecular evidence for C. annaskala and C. rosea (Scyphozoa:Semaeostomeae:Cyanidae) in south-eastern Australia. Invertbr Syst 19:361-370. Drobnič K., 2007. Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih informacij, metode verižne reakcije s polimerazo in računalniško podprte tehnologije. Erpenbeck D, Parra-Velandia FJ, Breeuwer JAJ, Van Soest R.W.M.,2005. Speculation with spiculation? – Three independent gene fragments and biochemical characters versus morphology in demosponge higher classification. Molecular Phylogenetics and Evolution , in press. doi: 10.1016/j.ympev.2005.11.001. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., and Vrijenhoek R.,1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates, Molecular Marine Biology and Biotechnology 3 (5): 294-299. Gilbert P.M., Seitzinger S., Heil C.A., Burkholder J.M., Parrow M.W., Codispoti L.A., Kelly V., 2005. The role of eutrophication in the global proliferation of harmful algal blooms: new perspectives and new approaches. Oceanography 18: 198- 209. Gorički Š., 2004. Ugotavljane genetske strukture diferenciacije močerila (Proteus anguinus) z analizo zaporedji mitohondrijske DNA. Magistrsko delo, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo. Goy J., Morand P.,Etienne M. 1989. Long term fluctuations of Pelagia noctiluca ( Cnidaria, Scyphomedusa) in the western Mediterranian Sea. Prediction by climatic variables. Deep-Sea Research, Vol. 36, No .2, 269-279. Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98. Hebert, P.N.D. and T.R.Gregory., 2005. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Systematic Biology;54 (5):852-859. Higgins D.G., Sharp P.M., 1988. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene, Vol. 73, Issue 1, 237-244. Hillis D.M., Moritz C.,1996. Maple Molecular Systematics, 2nd edition., Sinauer Press. Hillis D:M, Dixon M.T., 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic interference. Quarterly Review of Biology 66: 411-453.

50

Holland S., Dawson M.N., Crow G.L., Hofmann D.K. 2004. Global phylogeography of Cassiopea (Scyphozoa:Rhizostomeae): molecular evidence for cryptic species and multiple invasions of the Hawaiian Islands. Mar Biol 145:1119-1128. Holst S., Jarms G., 2006. Substrate choice and settlementpreferences of planula larvae of five Scyphozoa (Cnidaria)from German Bight, North Sea. Mar Biol. DOI: 10.1007/s00227-006-0530-y. Howarth R.W., Sharpley A., Walker D., 2002. Sources of nutrient pollution to coastal waters in the United States: implication for achieving coastal water quality goals. Estuaries 25: 656- 676. Hyman, L. H. 1940. The invertebrates. Volume 1. Protozoa through Ctenophora. McGraw-Hill, New York. Huang D., Meier R., Todd P.A., Chou L.M., 2008. Slow Mitochondrial COI Sequence Evolution at the Base of the Metazoan Tree and Its Implications for DNA Barcoding. J. Mol. Evol. 66:167-174. Ishii H., 2006. Adaptation to coastal environmental changes in the polyp stage in relation to jellyfish blooms in Tokyo Bay. PICES XV, Yokohama, Japan, 13 Oct. 2006, Abstract S2- 3117. Jackson J.B.C., Kirby M.X., Berger W.H., Bjorndal K.A., Botsford L.W., Bourque B.J., Bradbury R.H., Cooke R., Erlandson J., Estes J.A., Hughes T.P., Kidwell S., Lange C.B., Lenihan H.S., Pandolfi J.M., Peterson C.H., Steneck R.S., Tegner M.J., Warner R.R., 2001. Historical overfishing and the recent collapse of coastal ecosystems. Science 293: 629- 638. Johnston B.D., Irvine H., Sötje I., Pierce G.J., Secombes C.J., 2005. Ecological toxicology and effects of mass occurrences of gelatinous zooplankton on teleosts in enclosed coastal ecosystems. Am. Soc. Limnol. Oceanogr. Meet, June 2005, Abstract. Kimura, M, 1980 A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequencies. Journal of Molecular Evolution, 16: 111-120. Kramp P.L. 1961. Synopsis of the medusae of the World. J. Mar. Biol. Assoc. UK 40. Kumar S, Tamura K, Nei M., 2004. Mega 3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5 , 150–163. Lotan A., Ben- Hiller R., Loya Y., 1993. Aggregation and dispersal of Rhopilema nomadica, a tropical immigrant medusa in the Mediterranean Sea. Isr J. Zool. 39: 67-68. Lucas, C. H., 2001. Reproduction and life history strategies of the common jellyfish, Aurelia aurita, in relation to its ambient environment. Hydrobiologia 451 (Dev. Hydrobiol. 155): 229–246.

51

Lynam C.P., Gibbons M.J., Axelsen B.E., Sparks C.A.J., Coetzee J., Heywood B.G., Brierley A.S., 2006. Jellyfish overtake fish in heavily fished ecosystem. Curr. Biol. 16 (13): R492- R493. Malej A., 1982. Unusual occurance of Pelagia noctiluca in the Adriatic. Aota Adriat., let. 23, št1/2, str. 97- 102. Mayer A.G. 1910. Medusae of the World, III: the Scyphomedusae. Carnegie Institute, Washington. Marques, A. C., and. Collins A. G., 2004. Cladistic analysis of Medusozoa and cnidarian evolution. Invert. Biol. 123:23–42. Mianzan H. & Cornelius P.F.S., 1999. Cubomedusae and Scyphomedusae. In: South Atlantic Zooplankton (D. Boltovskoy ed.), BACKHUYS Publishers, Leiden (The Netherlands): 513-559. Mills, C. E., 1995. Medusae, siphonophores and ctenophores as planktivorous predators in changing global ecosystems. ICES J. mar. Sci. 52: 575–581. Mills C.E., 2001. Jellyfish blooms: are populations increasing globally in response to changing ocean conditions?, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 55-68. Molinero J.C., Ibanez F., Nival P., Buecher E., Sopissi S., 2005. North Atlantic climate and northwestern Mediterranean plankton variability. Limnol. Oceanogr. 50: 1213- 1220. Pérez- Ruzafa A., Gilabert J., Gutiérrez J.M., Fernández A.I., Marcos C., Sabah S., 2002. Evidence of a planktonic food web response to changes in nutrient input dynamics in the Mar Menor coastal lagoon, Spain. Hydrobiologia 475/476: 359- 369. Plantan M,.2008. Optimizacija mikrosatelitnih lokusov pri morskem klobuku (Rhizostoma pulmo) : diplomsko delo : univerzitetni študij . Optimization of microsatellite loci in barrel jellyfish (Rhizostoma pulmo). Graduation thesis : university studies. Ljubljana: [M. Plantan], 2008. X, 48 f., ilustr., graf. prikazi, pril. + CD. [COBISS.SI-ID 1878351]. Polz M.F. and Cavanaugh C.M., 1998. Bias in Template-to-Product Ratios in Multitemplate PCR. Applied and Environmental Microbiology, October 1998, , Vol. 64, No. 10, p. 3724-3730. Pont-Kingdon, G., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Watkins-Sims C:D., Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G., Wolstenholme R. , 1998. Mitochondrial DNA of the coral Sarcophyton glaucum contains a gene for a homologue of bacterial MutS: a possible case of gene transfer from the nucleus to the mitochondrion. J. Mol. Evol. 46, 419–431. Pont-Kingdon, G.A., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Wolstenholme R:D., Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G.B, 1995. A coral mitochondrial mutS gene. Nature 375, 109–111. Purcell J. E., White J. R., Nemazie D. A. & Wright D. A., 1999. Temperature, salinity and food effects on asexual reproduction and abundance of the scyphozoan Chrysaora quinquecirrha. Mar. Ecol. Prog. Ser. 180: 187–196.

52

Purcell J.E. & Arai M.N, 2001. Interactions of pelagic cnidarians and ctenophores with fish: a review, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 27-44. Purcell J.E. 2005. Climate effects on formation of jellyfish and ctenophore blooms: a review. Journal of the Marine Biological Association of United Kingdom 85:461-476. Purcell J.E., Decker M.B., 2005. Effects of climate on relative predation by scyphomedusae and ctenophores on copepods in Cheasapeake Bay during 1987- 2000. Limnol. Oceanogr. 50: 376- 387. Purcell J.E., Uye S.I, Lo W.T, 2007. Antropogenic causes of jellyfish blooms and their direct consequences of humans: a review, Marine ecology progress series, Vol.350: 153-174. Ratnasingham and P.D.N., Hebert. 2007. BOLD:The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org), Molecular Ecology Notes7,355-364. Roe B.A., Crabtree J.S., Khan, A., 1996. Methods for DNA Isolation. S. 42 do 72. V: DNA isolation and Sequencing. John Wiley & Sons. Russell F.S. ,1970. The medusae of the British Isles II. Pelagic Scyphozoa with a supplement to the first volume on hydromedusae. Cambridge University Press, Cambridge. Shao Z., Graf S., Chaga O.Y., Lavrov D.V., 2006. Mitochondrial genome of the moon jelly Aurelia aurita (Cindaria, Scyphozoa): A linear DNA molecule encoding a putative DNA- de. Sommer U., Stibor H., Katechakis A., Sommer F., Hansen T., 2002. Pelagic food web configurations at different levels of nutrient richness and their implications for the ratio fish production: primary production. Hydrobiologia 484: 11- 20. Stiasny D.G., 1922. Ein neues System der Rhizostomeen. Verhandlungen der Deutschen Zoologischen Gesellschaft E. V. 27:84–85. Suzuki, M., and S. J. Giovannoni. 1996. Bias caused by template annealing in the amplification of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62:625-630. Thiel, H. 1966. The evolution of the Scyphozoa, a review. Pages 77–117 in Cnidaria and their Evolution (W. J. Rees, ed.). Academic Press, London. Thiel M.E., 1970. U¨ ber den zweifachen stammesgeschichtlichen (‘‘biphyletischen’’) Ursprung der Rhizostomae (Scyphomedusae) und ihre Aufteilung in die zwei neuen Ordnungen Cepheida und Rhizostomida. Abh. Verh. naturwiss Ver. Hamburg NF 14:145–168. Uye S., Ueta Y., 2004. Recent increase of jellyfish populations and their nuisance to fisheries in the Inland Sea of Japan. Bull. Jpn. Soc. Fish Oceanogr. 68:9- 19 (in Japanese with English abstract). - http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.

53

PRILOGE

Priloga A: Nukleotidna zaporedja v fasta formatu >0703 Črno morje tttaaacttccagggtgaccaaaaaatcaaaaymratagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaaktatagtgttccaatatcttttgatttgggtgaaccaaaaaa >0805 Črno morje tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaamyrwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaaktatanngtgttccaatatctttatgaantgggtgaaccaaaa >0808 Črno morje tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaakgtataggwrkatgtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccacymkggcggaaaaagcaccaaatattaagttattagtgttccaatatctttatagttggnntggaaccaaaa >0810 Črno morje tttaaactttcagggtgaccaaaaaatcaaaataatatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtaakwawagtgttccaatatctttatagtgggngtgaaccaaannnaa >0801Črno morje

tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaatgttggtattrtrgatatttggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaaatawtatrgtatagtgttccaatatctttatgaatggggtgaccaaaa >0807 Črno morje tttaaacttttncaggtgaccaaaaaatcaaaaymwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtwagtawangtgttccaatatctttatgaatgggngtgaacaaaa >0809 Črno morje tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcarrmyawatgttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaagtattagtgttccaatatctttatgaatgggttgacccaaaanaa >0811 Črno morje tttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaarkawatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaatagtcagaaactgatattgttaagccttggaaaggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgggcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaagtaattwgtgttccaatatctttatgattggcgtgaaccaaannnaa >1404 Koprski zaliv ggagggatgagggggtaggagggaggggagggtgggagagaggataggggagagagagagttaaggggaggggggtagaaagtagggtgattaggtaaaaaggagggggggaggatggtaaagtggaatggaaggggg

gaggggggggggtggttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaaacaaatgytkaccamtgagaatactatggatstcctmctmccgctaggrtcgaagarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagccccagctaaaacaggtaaggacaataacaataatattgctgtgactagaacagaccatacaaacaaaggaattttatctatagtcataccgggagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgctaagtgtaaactgaagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaattgtccaacctgttcccgcaccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatcaaaaactaatattattcaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaacctcctatcaacactggcataacaaagaaaaatatcataatcaatgcgtgggckgtcactacaacattatatagttgatcatcacccaacatggatcctggaccagataattctaatcttataatcatwytgaaatgcagttcctaymatagcggaraaggctccatcatatatyataatatagtgttccaatatctttatgatgttgttgaccaaaa >1403 Koprski zaliv ggatttgagaaaggtgggagggaggtggggagtggtgaggtttagagagagagagtggaaggggaggggggagagaggggaagaaagagagttgggggataatagaggggggattaatgatcagttatgttgtgggcttataagtttttaaacttgggggtgaccaaaaaatcaaaacaaaggytkacccaatagagaaaatwggatstccymctcycgckrggrtcgrakarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagccccagctaaaacaggtaaggacaataacaataatatkgctgtgactagaacagrccatacaaacaaaggaattttatccatagtcataccgggagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgctaagtgtaaactgaagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaattgtccaacctgttcccgcmccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatcaaaaactaatattatttaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaacctcctatcaacackggcatamcaaagaaaaatatcataatcaatgsgtgggctgtcactacaacattatatagttgatcatcacccaacakggatcctggaccaagakratctctaatgcttataatcataytkaaattgcagytcstmtmakagsggaaaaggctccacaataywaaawactwgtgttccaatatctttatgattggttgaccaaa

Priloga B: Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal

Priloga C: Izračun genetskih razdalij med posameznimi nukleotidnimi zaporedji v programu MEGA

Priloga D: Podobnost med nukleotidnim zaporedjem COI iz velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) in COI iz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) Poizvedba narejena v GenBank dne 17. 6. 2008.

> gb|DQ787873.1| Aurelia aurita mitochondrion, complete genome

Length=16937

Score = 1205 bits (652), Expect = 0.0

Identities = 654/655 (99%), Gaps = 0/655 (0%)

Strand=Plus/Plus

Query 1

ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 11964

ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 12023

Query 61

AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12024

AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 12083

Query 121

AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12084

AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 12143

Query 181

ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12144

ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 12203

Query 241

TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12204

TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 12263

Query 301

TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12264

TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 12323

Query 361

TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12324

TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 12383

Query 421

TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12384

TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 12443

Query 481

CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12444

CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 12503

Query 541

GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12504

GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 12563

Query 601

ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGGGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 655

|||||||||||||||||||||

|||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 12564

ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGAGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 12618