Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 223, S. 369--374 (1954).

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit/it Mainz (Direktor: Profi Dr. G. KUSCHINSKY).

Untersuchungen fiber die Einwirkung yon verschiedenen Pharmaka auf die Spontanrhythmik

des isolierten Hfihneramnion* **.

Von (~USTAV KUSCHINSKY~ HEINZ L~LLMANN und ERICH MUSCHOLL.

Mit 3 Textabbildungen.

(Eingegangen am 20. Februar 1954.)

Die Entstehung yon koordinierten Bewegungen in isolierten Organen ist in neuerer Zeit wiederholt Gegenstand yon Untersuchungen gewesen.

So hat Bc~N mit B/)LBRING, VANE und KORDIK die Spontanrhythmik yon Herzen und die Bewegungen des Flimmerepithels in Beziehung zum Acetylcholin- stoffwechsel gesetzt. EVANS u. SC~LD (1953 a) und KLINGE bedienten sich erneut des ganglienzellfreien Katzendarm-Pr/~parates. Von KAWABATA wurden verschieden groBe Stiicke der KrStenharnblase benutzt, um die Schrittmacher der Bewegung zu lokalisieren. Ein sich spontan kontrahierendes Pr/~parat wurde yon MISLIN in Form des Flughautvenenherzens der Fledermaus angegeben. GINETSINSKII, SACHS, ITINA U. SOKOLOWA demonstrierten an explantierten Skeletmuskeln yon neugeborenen Kaninchen geordnete Bewegungen.

Da histologische Untersuchungen immer wieder das Fehlen nervaler Elemente in Vogelamnien ergeben haben (VERz~R, P]~TERFI, STOEHR, BACTZ~N) , w/~hlten wir i m AnschluB an BAUR und F~RGI:SON das Hiihneramnion als Versuchsobjekt, wie gleichzeitig mit uns EVANS u. SCHILn (1953b).

Das Hiihneramnion stellt also ein nervenfreies, glattmuskeliges Organ dar, das koordinierte Bewegungen ausfiihrt, wie unter anderem physiolo- gische Beobachtungen ergeben haben (V~RZ~R, PIeRCe). Uns scheint dieses Objekt besonders geeignet zu sein, verschiedenen physiologischen (Entstehung der ersten Erregung, deren Weiterleitung und Koordination) und pharmakologischen Fragen (Angriffspunkt und Wirkungsweise ein- zelner Pharmaka) n/~her zu kommen.

Methodik. ])as Hiihneramnion wurde nach dem Vorgehen yon BAUR isoliert und in 02-

durchperlter TyrodelSsung bei 38°C aufgeh/~ngt. Die Registrierung der Kontrak- tionen erfolgte in isometrischer Anordnung auf optischem Wege. Die Empfindlichkelt

* Frau Prof. Dr. med. HEDWIG LANGECKER zum 60. Geburtstag gewidmet. ** -~ber die Versuchsergebnisse wurde auf der 20. Tagung der dtsch. Pharmakolo-

gischen Gesellschaft in Bonn berichtet (Li~LLMANN).

370 G. KUSCHINSKY, H. LULLMANN und E. MUSCHOLL:

des Systems war variabel so eingestellt, dab die Spannungsentwicldung yon 50--300 mg jeweils zu maximalen Ausschl~gen fiihrte. In Abh~ngigkeit vom Be- brfitungsalter entwickelten die isolierten Amnien die genannten Spannungen.

Aus zwei Griinden erwiesen sieh die Amnien im Bebrfitungsalter yore 7. bis zum 9. Tage als giinstigste Versuchsobjekte: a) Es besteht eine ausgesprochene Neigung zu rhythmischen Reaktionen, die in den folgenden Bebrtitungstagen yon einem mehr tonischen Verhalten abgelSst wird. b) Mit zunehmendem Alter w~chst die gef~Bffihrende Allantois fiber immer grSBere Anteile des Amnions und l~gt sich praparativ nicht mehr yon diesen trennen.

Die Ableitung der Aktionspotentiale vom isolierten Amnion erfolgte durch eine Pinselelektrode fiber eine Silber-Silberchloridverbindung. Zur Registrierung der Potentiale diente ein Tectronix-Oszillograph (Typ 512), dem in den meisten F~llen zwei Philips-Vorverst~rker GM 4570 (gelegentlich genfigte ein Vorversti~rker) vorgeschaltet waren. Die ZeitauflSsung des Oszillogramms erfolgte durch ein Film- ger~t.

Die Messung der Cholinesteraseaktiviti~t im Amniongewebe wurde mit der mikromanometrischen Methode nach LINDERSTR()M-LANo U. HOLTER vorgenom- men. Der Fermentansatz, mit dem die ,,Taucher" besehiekt wurden, hatte folgende Zusammensetzung:

20 mg Amnion (Feuchtgewicht); 20 mm a Biearbonatpuffer (NaC1 0,72%, KC1 0,018%, CaC12 0,028%, NaHCOa 0,2%); 20 ram3 1°/o Substrat (Acetyleholinhydro- chlorid 1, Benzoyleholinhydroehlorid 1, Acetyl-fl-methyleholinhydroehlorid 1) in Bi- earbonatpuffer.

Yersuchsergebnisse.

1. Die Wirkung erregender Substanzen. Acetylcholin, Nicotin, Bariumchlorid und His tamin wurden untersucht . Wir beobachteten eine AuslSsung der R h y t h m i k bei ruhendem Amnion, eine Frequenzsteigerung der Spontanbewegungen oder eine Tonussteigerung bei folgenden Konzent ra t ionen: Acetylcholinhydrochlorid 1 :20000- -1 :500000 , Nico- t in ta r t ra t 1 : 20 000--1 : 200 000, Bariumchlorid 1 : 2000--1 : 200 000 und His taminhydrochlor id 1 : 20000--1 : 600000. Je nach Bebri i tungsalter reagierte das Organ mehr rhy thmisch (7.--9. Tag) oder tonisch 0 . - - 1 2 . Tag). Bei Vergleich tier Wirkungen der einzelnen erregenden Substanzen untereinander ergab sich der Eindruck, dab bei der Bar iumwirkung die Beeinflussung des Rhy thmus , bei dem Acetylcholineffekt die des Tonus fiberwog. W~hrend sich Acetylcholin, Nicotin und His tamin als leicht auswaschbar erwiesen, zeigten die Bariumionen eine nachhalt igere Wirkung. Erwi~hnt werden mag die Unwirksamkei t yon Hypophysen- h inter lappenhormon.

2. Die Beein/lu[3barlceit der Kontralctionen. Die Acetylcholinhemm- stoffe d-Tubocurar in ( 1 : 10 000--1 : 20 000), ] )ecamethoniumj odid (1 : 2000) und Atropinsulfat (1:20000) wurden auf ihre F~higkeit untersucht , am nicht spon¢an arbei tenden Amnion Effekte auszufiben. Eine Eigen- wirkung konnte bei den angegebenen Konzent ra t ionen nicht festgestellt

1 Wir danken den Firmen Hoffmann-La Roche, Grenzaeh, und E. Merck, Darmstadt, fiir die freundliehe ]~lberlassung der Versuchsmengen.

Einwirkung verschiedener Pharmaka auf Spontanrhythmik d. Hiihneramnion. 371

werden. Ebenso waren diese Verbindungen nicht in der Lage, die durch Acetylcholin oder Bariumionen ausgelSsten Kontraktionen zu unter- drficken oder abzuschw~chen (Abb. 1). Dasselbe Verhalten zeigten die beiden bevorzugt an Ganglien angreifenden Substanzen Pentamethonium- jodid (1:2000) und ttexamethoniumjodid (1:2000).

Dagegen erwiesen sich Papaverin und Chinin als starke Inhibitoren. Die satzsauren Salze konnten in Konzentrationen yon 1:10000 bis 1:200000 die durch Acetylcholin oder Barium angeregten rhythmischen

ACh t f

dTc ACh

Abb. 1. Isol iertes I t i ihneramnion , 12 Tage bebrfi tet , isometrische Regis t r ierung. A Ch = Acetylchol in 1 : 20 000; d Tc = d-Tubocura r in 1 : 20 000.

Abb. 2. Isol iertes Hf ihneramnion, 8 Tage bebrt i te t , isometrische Regis t r ie rung. Ba = Bar iumchlor id 1 : 20 000; Chin ~ Chininum hydrochloric. 1 : 20 000.

Kontraktionen hemmen (Abb. 2). Wurden zuerst Papaverin oder Chinin dem Organbad zugesetzt und darauf Barium, Histamin oder Acetyl- cholin, so war die Wirkung der erregenden Substanzen vSllig aufgehoben. Auffallend war dabei die flute Auswaschbarkeit der Alkaloide, schon nach einem einmaligen Badwechsel war die Ansprechbarkeit des Amnion gegenfiber Acetylcholfll oder Barium wieder hergestellt bzw. die Spontan- rhythmik setzte wieder ein.

3. Ableitung der Aktionspotentiale. Der Versuch, yore Amnionmuskel elektrische Erscheflmngen w~hrend de r T/itigkeit abzuleiten, ffihrte zu folgendem Ergebnis: Synchron zu den Kontraktionen konnten Aktions- potentiale aufgezeichnet werden, deren ])auer nut einen Bruchteil der Kontrak¢ionszei¢ ausmachte (Abb. 3). Zeitlich fiel das Auftreten vor oder in den Beginn der ~uskelverkfirzung in Abhi~ngigkeit yon der Lage der Elektrode. Wurde vonder Stelle abgegriffen, yon der die Kontraktionen

372 G. Kuscnz~sKr, H. LlJLLMANN und E. MUSCHOLL:

il~'en Anfang nahmen, so lag das Aktionspotential vor den meehanischen Xnderungen, beriihrte die Elektrode eine yon diesem ,,Schrittmacher" entfernte Muskelpartie, so setzte die Verkiirzung schon ein, ehe die Er- regung die Ableitstelle erreicht hatte. ~ber die Lokalisation des,,Schritt- raachers" kSrmen wir keine Angaben machen, da wir bisher lediglich an dem yon BAUR angegebenen Pr/~parat gearbeitet haben.

Bei Ableitung der Aktionspotentiale yon Amnien, die unter Wirkung yon Acetylcholin, Nicotin oder kleinen Dosen Bariumchlorid standen, zeigten die Potentiale eine groBe Regelmi~Bigkeit, die vSllig parallel zum

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Abb. 3. Isoliertes Hfihneraranion, 9 Tage bebrfitet, gleiehzeitige Registrierung der Aktionspotentiale und der Spannungsentwieklung. Zeitsehreibung 1 see. a Spontanrhythmik, obere Kurve: Oszillo- gramm, untere Kurve: Mechanogramm; b Rhythmische Kontraktionen, angeregt durch BaCI~

1 : 20 000, obere Kurve: Oszillogramm, untere Kurve: Mechanogramm; c Eichzacken des Oszillogramms entsprechen 0,1 inV.

l~echanogramm verlief. Nach Zusatz grSBerer Dosen Bariumchlorid (1:2000--1:21000) wurden sie unregelmi~l~ig, nahmen an zeitlicher Dauer zu und waren niche eindeutig dem mechanischen Geschehen zuzu- ordnen. Diese KoordinationsstSrung war ebenso wie dem elektrischen auch dem mechanisehen Bild zu entnehmen.

4. Messung der Cholinesterasea~ivitdt. Zur Kl~rung der Frage, ob das Amniongewebe eine Cholinesterase enth~lt, versetzten wir das lebend- frische Amnion in manometrischer Technik mit den Substraten Acetyl- eholin, Benzoylcholin und Acetyl-fl-methylcholin. W~hrend Acetylcholin und Acetyl-~-methylcholin etwa in gleichen Ausmal~en hydrolysiert wurden, konnte die im Amniongewebe vorhandene Esterase das Benzoyl- cholin nicht spalten. Definitionsgem~l~ (AuGusTINSSON nnd NACHMAN- SOH~) mug es sieh also um die Acetylcholinesterase (echte Esterase) handeln.

Einwirkung versehiedener Pharmaka auf Spontanrhythmik d. Hfihneramnion. 373

Besprechung der Versuchsergebnisse. Bei der Untersuchung der erregenden Substanzen fiel uns ein gewisser

qualitativer Untersehied zwisehen Aeetylcholin und Bariumionen in bezug auf Tonus und Rhythmus des Amnion aufi ])urch Auswertung der Aufnahmen der 1V[uskelaktionspotentiale konnte gezeigt werden, dab Barium die sonst immer vorhandene Koordination stSrt. Die Erregbar- keit der ~uskulatur seheint stark anzusteigen, und damit kommt es zum Auftreten neuer Reizentstehungsorte, yon denen aus dann ebenfalls Erregungswellen fiber die l~uskulatur laufen. ])ies wiirde durchaus mit den Befunden yon LORENTE DE N6 und lq'v,~G, die am Nerven erhoben wurden, in Einklang sbehen.

])ie Prfifung der Aeetylcholinhemmstoffe d-Tubocurarin, ])eca- methonium und Atropin ergab den bemerkenswerten Befund, dab weder d-Tubocurarin bzw. ])ecamethonium noeh Atropin in der Lage waren, den Acetylcholineffekt zu unterdrfieken. Wir sehen dies ale pharma- kologischen Hinweis fiir die Abwesenheit yon Bauelementen im Amuion an, die der ,,Nerv-~cIuskelverbindung" entsprechen. Auch die Unwirk- samkeit yon Pentamethonium und Hexamethonium sprieht ffir das •elffen zumindest komp]izierterer nervaler Elemente (intramurale Um- sehaltstellen).

])ie Alkaloide Chinin und Papaverin unterdriiekten die Wirkung aUer erregenden Substanzen. Als Angriffspunkt runs wolff die ~uskelzelle selbst angenommen werden. Hervorgehoben werden kann die leichte Auswaschbarkeit auch des Chinins; eine ,,irreversible Protoplasma. sehgdigung" ist also nicht zu beobachten. Ob zwischen der negativ dromotropen und bathmotropen Wirkung des Chinins bzw. Chinidins und dem Befund am rhythmiseh sich kontrahierenden Amnion Beziehungen bestehen, kann erwogen werden.

])a der Naehweis yon Aeetylcholinesterase im Amnion gelang, ist hiermit ein neues Beispiel ffir das Vorkommen dieser Esterase in einem Organ gegeben, das frei yon nervalen Elementen ist. Von Kol~niK, B~LBRING und BURN ko!3J2te dies bereits ffir clas Flimmerepithel gezeigt werden.

Zusammenfassung. 1. ])as isolierte Hfihneramnion nach BAuR eignet sich gut, um

~ragen nach der Entstehung der Erregung, deren Weiterleitung und Koordination, dem Angriffspunkt und der Wirkungsweise yon Pharmaka zu priifen, da es sich um ein nervenfreies, rhythmisehe Kontraktionen ausffihrendes Organ handelt, das prgparativ leicht zu handhaben ist.

2. Auf die erregende Wirkung yon Aeetyleholin, Nicotin und Barium- ionen sind d-Tubocurarin, ])eeamethonium, Atropin, Hexamethonium und Pentamethonium ohne EinfluB.

~74 K~scmu~sKY, LO.T.MAWN, MUSCHOLL: Spontanrhythmil~ des Hfihneram~on.

3. Papave r in u n d Chinin h e m m e n die g e n a n n t e n erregenden Ver- b indungen reversibel.

4. Bar iumionen fi ihren zu StSrungen in der Regelm~Bigkeit der rhy thmischen Kon t r ak t i onen . Die Deu tung dieses Effektes wird in der Steigerung der Er regbarke i t u n d d e m A u f t r e t e n neuer , ,Schr i t tmacher" gesehen,

5. I m Amniongewebe ist Acetylcholinesterase vorhanden .

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fiir die Unterstiitzung der Arbeit.

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Prof. Dr. G. KUSCHINSKY, Mainz, Pharmakologisches Institut der Universit~t.