Untersuchungen zu UV-protektiven Effekten · 2.2.3 Bestimmung von Carotinoiden in Serum-, Zellmedium- und ... BHT 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Car Carotinoid CD Konjugierte Diene

Untersuchungen zu UV-protektiven Effekten

von Nahrungscarotinoiden in vivo und in vitro

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

vorgelegt von

Olivier Aust

aus Mainz

Düsseldorf, Januar 2003

Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen

Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Referent: Prof. Dr. Wilhelm Stahl

Korreferent: Prof. Dr. Hans-Dieter Martin

Tage der mündlichen Prüfung: 04.02.2003 und 06.02.2003

meinen Eltern

„Die Wissenschaft fängt eigentlich erst an interessant zu werden, wo sie aufhört“

Justus von Liebig

Inhalt

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Die menschliche Haut 11.1.1 Aufbau der Haut 1

1.1.2 Funktionen der Haut 3

1.1.3 Schädigung der Haut durch UV-Exposition 3

1.1.4 Lichtschutz der Haut 8

1.2 Carotinoide 101.2.1 Carotinoide als Naturstoffe 10

1.2.2 Carotinoide als physiologische Antioxidantien 13

1.2.3 Carotinoide in der Photoprotektion 15

1.2.4 Carotinoidaufnahme 19

1.3 Ziel der Arbeit 20

2. Material und Methoden 21

2.1 Chemikalien 212.2 Analytische Verfahren zur Carotinoidbestimmung 212.2.1 Carotinoidarbeitslösungen 21

2.2.2 Geräte 23

2.2.3 Bestimmung von Carotinoiden in Serum-, Zellmedium- und

Zelllysatproben 23

2.2.4 Bestimmung von Carotinen in Serum- und Lebensmittelproben 24

2.3 Interventionsstudie 262.3.1 Studiendesign 26

2.3.2 Induktion des Erythems und Messung der Hautrötung 28

2.3.3 Bestimmung von Carotinoiden in der Haut und im Serum 28

Inhalt

2.4 Zellkultursystem 292.4.1 Fibroblasten und Keratinozytenkulturen 29

2.4.2 Inkubation mit Carotinoiden und UV-Bestrahlung der Kulturen 29

2.4.3 Bestimmung der Matrix-Metalloprotease-1-Expression (MMP-1) 30

2.4.4 Bestimmung der Interleukin-6-Expression (IL-6) 31

2.4.5 Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im Zelllysat 31

2.4.6 Bestimmung des Carotinoidgehaltes in Zellmedium und Zelllysat 31

2.5 Unilamellares Liposomensystem 322.5.1 Herstellung und Charakterisierung unilamellarer Liposomen (IUV) 32

2.5.2 Initiation der Lipidoxidation in unilamellaren Liposomen 32

2.5.3 Messung der Lipidoxidation in unilamelllaren Liposomen 33

2.5.4 Bestimmung der lag-Phase und des k-Wertes 33

2.6 Statistik 34

3. Ergebnisse 35

3.1 Analytik 353.1.1 Methode zur Bestimmung von Carotinoiden im Serum 35

3.1.2 Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von Carotinen im Serum

und in Lebensmitteln 37

3.2 Interventionsstudie 473.2.1 Studiendesign 47

3.2.2 Carotinoide im Serum 49

3.2.3 Bestimmung des Carotinoidgehaltes in der Haut 53

3.2.4 Induktion und Messung des Erythems 54

3.3 Carotinoidgehalt eines Lycopinkarottensaftes und anderer lycopin- und ß-carotinreicher Lebensmittel 57

Inhalt

3.4 Zellkultur 603.4.1 MMP-1-Expression in Fibroblasten nach UV-Bestrahlung 60

3.4.1.1 Inkubation mit Lycopin 61

3.4.1.2 Inkubation mit Phytoen/Phytofluen 64

3.4.2 IL-6-Expression in Keratinozyten nach UV-Bestrahlung 67

3.4.2.1 Voruntersuchungen mit HaCaT-Zellen 67

3.4.2.2 Untersuchungen mit Keratinozyten 68

3.4.3 Carotinoidgehalte in Fibroblasten und Kulturmedium 71

3.5 Unilamellare Liposomen 723.5.1 Charakterisierung der Liposomen 73

3.5.2 Bildung von konjugierten Dienen in unilamellaren Liposomen 74

3.5.3 Bestimmung der lag-Phasen und des k-Wertes 83

4. Diskussion 87

4.1 Interventionsstudie zur Photoprotektion durch Carotinoide 874.1.1 Carotinoidbestimmung im Serum und in Lebensmitteln mittels HPLC 87

4.1.2 Carotinoidgehalte im Serum 88

4.1.3 Carotinoidgehalte in der Haut 90

4.1.4 Photoprotektion durch lycopinreiche Supplemente 91

4.2 Untersuchungen zur Photoprotektion durch Carotinoide in Zellkultur 93

4.2.1 Einfluss auf den MMP-1-Signalweg 93

4.2.2 Einfluss auf den IL-6-Signalweg 95

4.3 Anti- und prooxidatives Verhalten von Carotinoiden in unilamellaren Liposomen 96

5. Zusammenfassung 100

6. Literatur 102

Inhalt

Abkürzungen

AAPH 2,2´-Azo-bis-(amidinopropan)-hydrochlorid

ABTS 2,2´-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonsäure) -

diammonium Salz

AIBN 2,2´-Azo-bis-isobutyronitril

AMD altersbedingte Macula-Degeneration

AMVN 2,2´-Azo-bis-(2,4-dimethylvalerionitril)

AP-1 Aktivatorprotein-1

BHT 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol

Car Carotinoid

CD Konjugierte Diene (conjugated dienes)

COX-2 Cyclooxygenase-2

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

DOPA 3,4-Dihydroxyphenylalanin

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (ethylenediaminetetraacetic acid)

ELISA Enzyme linked immune assay

EPP Erythropoetische Protoporphyrie

FCS Fötales Kälber Serum (fetal calf serum)

FF(DA) Spenderspezifische Hautfibroblasten

H Wasserstoffatom

HDL Lipoprotein hoher Dichte (high density lipoprotein)

HaCaT Immortalisierte Keratinozyten-Zelllinie

(Human adult low Calcium and high Temperature)

HO-1 Hämoxygenase-1

HPLC Hochleistungflüssigkeits-Chromatographie

(high performance liquid chromatography)

IL-6 Interleukin-6

IUV Unilamellare Liposomen mittlerer Größe(intermediate unilamellar liposomes)

KPi Kalium-Phosphatpuffer

LDL Lipoprotein niedriger Dichte (low density lipoprotein)

MDA Malondialdehyd

MeCN Acetonitril

MED Minimale Erythemdosis

Inhalt

MeOH Methanol

MMP-1 Matrix-Metalloproteinase-1 (Kollagenase)

mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger ribonucleic acid)

p A pro Analysi

PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PGE2 Prostaglandin E2

PP Polypropylen

ROS Reaktive Sauerstoff-Spezies (reactive oxygen species)

RP Umkehrphase (reversed phase)

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

SD Standardabweichung (standard deviation)

SDS Natrium-Dodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)

� lag-Phase in Min

THF Tetrahydrofuran

tr Retentionszeit

UV Ultraviolettstrahlung

v Volumen

vis sichtbarer Teil des Strahlungsspektrums (visible)

VLDL Lipoprotein sehr niedriger Dichte (very low density lipoprotein)

1. Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Die menschliche Haut

1.1.1 Aufbau der Haut

Die Haut stellt das größte Organ des Menschen dar. Als komplex aufgebautes

Organ macht es etwa 8-12 % des Körpergewichtes aus. Eine erste Einteilung der

Hautschichten ergibt sich entsprechend den histomorphologischen Kriterien wie in

Abb. 1.1 dargestellt (Möller und Matthies, 1995).

Die Oberhaut wird als Epidermis bezeichnet und besteht zu 90 % aus

Keratinozyten. Ihr Name leitet sich vom Keratin (Hornstoff, schwefelreiches

Skleroprotein) ab, das aus der extrazellulären Vorstufe Keratohyalin gebildet wird

(Pschyrembel, 1994). Von innen nach aussen ist eine kontinuierliche Differenzierung

der Keratinozyten festzustellen, so dass die außenliegenden Zellen (verhornte und

z.T. schon abgestorbene Zellen des Stratum corneum = Hornschicht) als die ältesten

anzusehen sind. Der Durchmesser der Epidermis schwankt zwischen 4 und 30 mm

je nach Hautgebiet abhängig von sich verändernden Umweltbedingungen. Starke

mechanische Beanspruchungen lassen so die Haut der Hohlhand, der Fußsohlen,

der Fingerbeere und der Zehenballen stark verhornen. Die Dicke der Hornhaut kann

bis zu 1,2 mm betragen. Diese Verhornungen werden durch die Hornschicht

verursacht. Tieferliegende Zellen, die meistens klein, dicht und regelmäßig

aneinandergefügt sind, bilden die Basalschicht und sind mit der Basalmembran

verbunden (Merk, 1994).

Neben den Keratinozyten kommen die Melanozyten und die Langer-

hans´schen Zellen in der Epidermis vor.

Die Basalmembran ist zapfenartig mit der Dermis (Lederhaut, Corium)

verbunden (Papillen), die von Fibroblasten gebildet wird. Zusammen mit der

extrazellulären Matrix bestehend aus Kollagen und anderen Biopolymeren wie

Elastin und Retikulin entsteht das faserige Netzwerk des Bindegewebes.

Subkutanes Fettgewebe folgt schließlich der Dermis als letzte der drei

Hautschichten.

Haare und follikuläre Gänge durchziehen sowohl die Dermis als auch die

Epidermis.

1. Einleitung

2

Die Epidermis besitzt keine Blutgefäße und kann daher nur durch Diffusion von

Nährstoffen aus dem kapillaren Netz, das durch die Dermis bis an die Basalmembran

heranreicht, versorgt werden (Bucher und Wartenberg, 1989).

Abb. 1.1: Aufbau der menschlichen Haut. Die Epidermis mit der Hornschicht (blau)und der Basalschicht (rot), die Dermis (Lederhaut, rosa) und das subkutaneFettgewebe sind zu erkennen. Epidermis und Dermis werden durch dieBasalmembran voneinander getrennt.

Dermis

Epidermis

SubkutanesFettgewebe

1. Einleitung

3

1.1.2 Funktionen der Haut

Aufgrund der großen Oberfläche von etwa 1,8 m2 ist die Haut ein wichtiges

Kontaktorgan zur Umwelt. Eine Aufgabe der Haut ist es, den Wasserhaushalt des

Gesamtorganismus zu regulieren; sie schützt vor Austrocknung. Eine erhöhte

Transpiration hat die Abgabe von Wärme zur Folge, so dass die Haut auch zur

Temperaturregulierung beiträgt. Als Barriere dient die Haut zum Schutz vor

mechanischen Beanspruchungen, aber auch vor Infektionen durch Bakterien und

Pilze. Diese schützende Eigenschaft wird durch immunologische Eigenschaften der

Haut verstärkt, so dass die Haut ein wichtiger Bestandteil des gesamten

Immunsystems ist. Bis zu 10 % der Zellen der Haut können dem Immunsystem

entstammen und mittels spezifischer oder unspezifischer Abwehrmechanismen

eindringende Fremdstoffe oder Erreger bekämpfen. Manche Erkrankungsbilder

manifestieren sich alleinig in der Haut und sind ein wichtiges diagnostisches

Kriterium von Allgemeinerkrankungen wie Masern, Scharlach und Gelbsucht (Bucher

und Wartenberg, 1989).

Daneben ist die Haut u.a. ultravioletter Strahlung ausgesetzt. Von

physiologischer Bedeutung ist die UV-abhängige Synthese des antirachitischen

Vitamins D3 aus 7-Dehydrocholesterin. Zugleich übt die Haut auch eine

Schutzwirkung gegenüber den schädigenden Wirkungen der UV-Strahlung aus.

1.1.3 Schädigung der Haut durch UV-Exposition

Die auf die Erdoberfläche auftreffende Sonnenstrahlung lässt sich in drei

Wellenlängenbereiche aufteilen. Es sind das sichtbare Sonnenlicht, das Infrarotlicht

und die UV-Strahlung, die in UV A (320 – 400 nm) und UV B (280 – 320 nm)

unterteilt wird. Tab. 1.1 gibt die prozentuale Verteilung der Strahlenbereiche an, die

sich aus den Bestrahlungsintensitäten (W/m2) ergeben.

1. Einleitung

4

Tab. 1.1: Prozentuale Verteilung der spektralen Bereiche des Sonnenlichtes auf derErdoberfläche (ca. 1100 W/m2 = 100 %, nach Finkel, 1995).

Spektraler Bereich

Anteil an der

Gesamtstrahlung (%)

Sichtbares Sonnenlicht 52,0

Infrarotlicht 42,0

UV 6,0(UV A) (5,6)

(UV B) (0,4)

UV-Licht dringt unterschiedlich tief in die Haut ein. Kurzwelliges UV B wird von

der Haut mehr als UV A reflektiert oder absorbiert. UV A durchstrahlt die Dermis,

während UV B nur bis zur Basalmembran der Epidermis gelangt (Bruls et al., 1984).

UV C-Licht wird in der Stratosphäre der Erde absorbiert und spielt für die biologische

Welt keine Rolle (Crutzen, 1992).

Physiologisch betrachtet lassen sich positive und negative Effekte der

Sonnenstrahlung auf den menschlichen Organismus beschreiben. Sonnenlicht

steigert das Wohlbefinden und damit auch die Leistungsbereitschaft. Eine gebräunte

Haut ist weitgehend ein begehrtes Erscheinungsbild und gilt als ein Zeichen des

Wohlstandes.

Eine Bräunung der Haut geht auf eine UV B-induzierte Pigmentierung durch

das in den Melanozyten gebildeten Melanin zurück. Die UV-Strahlung bewirkt eine

Steigerung der mitotischen Aktivität von Melanozyten, die mit einer Induktion des

Enzyms Tyrosinase verbunden ist. Tyrosin wird enzymatisch zu Dopa und schließlich

zu einem Dopa-Chinon oxidiert. Das polymere Melaninpigment entsteht in weiteren

Reaktionsschritten und wird schließlich zu den Keratinozyten transportiert. Die so

entstandene indirekte Bräunung bleibt über mehrere Wochen erhalten.

Eine direkte Bräunung, die jedoch nur von kurzer Dauer ist, wird durch UV A

erzielt. Farblose Vorstufen des Melanins werden photochemisch oxidiert, so dass

auch hier schließlich das polymere Melanin gebildet wird.

1. Einleitung

5

Eine übermäßige Exposition mit UV–Strahlung kann akute aber auch

chronische Schädigungen der Haut mit sich bringen. Akute übermäßige UV B-

Bestrahlung führt zu einem Sonnenbrand. Das Erythema solare zeigt sich durch die

auffällige Rötung der Haut nach 4 - 6 Stunden und ist ein Zeichen eines komplexen

Entzündungsgeschehens (UV-induzierte Dermatitis) (Kindl und Raab, 1998). Die

DNA wird geschädigt und kann in Abhängigkeit des Schweregrads der Schädigung

durch ein zelluläres „repair“-System repariert werden (Hemminki et al., 2002,

Schwarz et al., 2002). Eine typische Veränderung der DNA ist die Bildung von

Cyclobutan-Pyrimidindimeren (Chadwick et al., 1995, Clingen et al., 1995).

Oxidativer Stress in der Haut (Sies, 1991) ist die Folge einer übermäßigen UV

A-Bestrahlung und bedeutet eine vermehrte Bildung von intrazellulären reaktiven

Sauerstoff-Spezies (ROS) wie Singulettsauerstoff (1O2), Superoxidanionen (O2�-),

Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxylradikalen (HO�) und Stickstoffmonooxid (NO)

und deren Folgeprodukte (Black, 1987, Jurkiewicz und Buettner, 1994, Masaki et al.,

1995, Klotz et al., 2001, Suschek et al., 2001).

Oxidative Prozesse im Hautgewebe werden für eine Reihe chronischer

Veränderungen verantwortlich gemacht. Chronische Exposition mit UV A-Licht steht

im Zusammenhang mit dem Prozess der Photoalterung. Spröde, trockene und

faltenbildene Haut sind Kennzeichen der Hautalterung (Yaar und Gilchrest, 1990,

Scharffetter-Kochanek et al., 1997, Blattner et al., 1998). In dermalen Fibroblasten

wird durch UV A-Licht die Synthese der Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP-1) und

MMP-2 sowie MMP-3 stimuliert (Scharffetter et al., 1991, Herrmann et al., 1993). Als

Folge wird vermehrt Kollagen abgebaut und die Haut verliert ihre Zug- und

Dehnungsfähigkeit. Das Risiko einer Invasion von Tumorzellen in derart verändertes

Bindegewebe erhöht sich.

Die chronische UV-Exposition der Haut wird im Zusammenhang mit dem

Risiko für Hauttumore gesehen. Weltweit wird in den letzten Jahren eine steigende

Inzidenz der Melanombildung beobachtet (Langley und Sober, 1997, Serraino et al.,

1998, Dennis, 1999). Melanome entstehen in sonnenlichtgeschädigter Haut aus

einer Lentigo maligna (Leberfleck, ungleichmäßig pigmentierter, langsam größer

werdender Fleck in der Epidermis), werden aber nicht zwangsläufig durch UV-Licht

initiiert. Es liegen genetische Dispositionen vor, aber die Tumorpromotion wird mit

1. Einleitung

6

UV-Expositionen der Haut und einer verbundenen Immunsuppression in Verbindung

gebracht (Krutmann et al., 1996).

Die Inzidenz der Epitheliome (Basalzell- und Plattenepithelkarzinom der

Epidermis) der weissen Bevölkerung liegt bei 300 pro 100 000 Einwohner und ist

proportional zum Quadrat der durchschnittlichen, jährlichen Strahlenbelastung (Kindl

und Raab, 1998). Hier besteht eine direkte Korrelation zwischen dem Krebsrisiko und

der UV-Exposition.

Das allgemeine Risiko für Hautkrebs ist mit der Dauer der chronischen UV A-

Expositionen, aber auch mit der Häufigkeit einzelner akuter UV B-induzierter

Sonnenbrände korreliert (Berneburg et al., 1997). Selbst geringe Dosen an UV-

Strahlung führen nicht nur zu mutagenen Veränderungen an DNA–Molekülen

(Mutationen), sondern auch zu strukturellen Veränderungen des Chromosoms

(Chromosomenaberrationen) (Emri et al., 2000). Damit geht ein erhöhtes Risiko für

Hautkrebs einher (Armstrong und Kricker, 2001).

Beobachtet werden auch Differenzierungs- und Umbauvorgänge des

Hautgewebes und Veränderungen des Blutkapillarsystems, beispielsweise durch

Angiogenese. Zytoplasmatische Signalkaskaden, die in die Genexpression

eingreifen, steuern nach UV-Stimulation diese Prozesse (Devary et al., 1993,

Brenneisen et al., 1999). Deutlich wird dies durch die UV-induzierte Bildung von

sogenannten „sun-burn cells“, veränderte Keratinozyten mit aktiviertem

Zelltodprogramm (Apoptose). Geschädigte Zellen werden durch Apoptose aus dem

Gewebe entfernt, ohne dass weitere Schädigungen des umliegenden Gewebes

auftreten (Godar,1999, Kulms et al., 1999).

Es gibt eine Reihe von Zellsignalwegen, die auf eine UV-Exposition reagieren.

Lange schon ist bekannt, dass UV-Strahlung die Phospholipase A2 aktiviert, die aus

einem Phospholipid Arachidonsäure freisetzt. Über den Cyclooxygenase-2-Weg

(COX-2) werden in der Folge Signalmoleküle der Prostaglandingruppe gebildet

(Hawk et al., 1983). Dominierendes Prostaglandin im Hautgewebe ist PGE2 ( Ziboh

et al., 1978, Hammarström et al., 1979, Hanson und De Leo, 1989, 1990, Hruza und

Pentland, 1993). Prostaglandine sind mitverantwortlich für die Gefäßerweiterung in

entzündlichen Geweben wie bei einem Erythem (Williams und Peck, 1977, Pentland

1. Einleitung

7

et al., 1999). COX-2 wird durch Faktoren stimuliert, die mit Signalwegen des

Aktivatorproteins-1 (AP-1) und dem Nekrosefaktor �B (NF�B) in Verbindung stehen.

Die Aktivierung und vermehrte Expression dieser Faktoren gilt als tumorprogressiv

(Devary et al., 1993, Vile et al., 1995, Djavaheri-Mergny et al., 1996, Isoherranen et

al., 1998, 1999, Chen et al., 2001). Die UV-Bestrahlung von Hautzellen bewirkt eine

gesteigerte COX-2-Expression, die ROS-vermittelt ist (Feng et al., 1995, Buckmann

et al., 1998). Für die Induktion eines anderen „stress-response“ Proteins (Keyse und

Tyrrell, 1989), die Hämoxygenase-1 (HO-1), wurden oxidierte Lipidmetabolite als

Induktoren verantwortlich gemacht (Basu-Modak et al., 1996).

Fibroblasten und Keratinozyten reagieren nach UV-Stimulierung auch auf

immunologischem Weg mit einer parakrinen Signalvermittlung. Mediatoren wie

Zytokine werden bei entzündlichen Prozessen nach einer übermäßigen UV-

Bestrahlung extrazellulär an das umgebende Gewebe abgegeben (Kondo et al.,

1997). Interleukin-6 (IL-6) wirkt als systemischer Mediator und wird nach einer UV-

Bestrahlung der Haut in erhöhter Konzentration im Blutkreislauf gefunden (Urbanski

et al., 1990). Es regt in Fibroblasten (parakrin und autokrin) die MMP-1-Synthese an

(Brenneisen et al., 1999) und ist in der Lage, das Wachstum von Melanomen zu

stimulieren (McKenzie et al., 1994).

Die UV-Bestrahlung löst in der Haut eine Reihe physiologischer und

pathophysiologischer Reaktionen aus. Zudem sind komplexe immunologische

Prozesse involviert. Eine zentrale Rolle jedoch scheinen (photo) oxidative Vorgänge

zu spielen, welche sowohl durch UV A als auch durch UV B initiiert werden.

1. Einleitung

8

1.1.4 Lichtschutz der Haut

Der Lichtschutz der Haut bedeutet Schutz vor UV-Strahlung. Prinzipiell gibt es

folgende Schutzmöglichkeiten:

Primärer Schutz - Absorption

Streuung und Reflexion von

UV-Strahlung

Sekundärer Schutz - Verteidigung gegen photooxidative und

Oxidative Schädigungen der Haut und

Minderung der Folgereaktionen

Reparatur von Schädigungen

Der einfachste und effektivste Schutz ist die Absorption von UV-Strahlen

und/oder eine Verringerung der UV-Exposition. Die Haut verfügt dazu über einen

Selbstschutzmechanismus. Eine Verdickung der Hornhaut führt zu einer erhöhten

Absorption und Lichtstreuung. Die während der Bräunung gebildeten partikulären

Melaninpigmente sind zudem in der Lage, UV-Licht zu absorbieren, aber auch zu

reflektieren und zu streuen. Der kosmetische Einsatz von topisch aufgetragenen

Sonnenschutzmitteln soll ebenfalls einen primären Schutz durch UV-Filter bestehend

aus Zimtsäure- und Bornanderivaten sowie reflektierenden Partikeln wie Titandioxid-

Pigmenten gewährleisten.

Beim Eigenschutz der Haut ist die Bildung von Melanin als sekundärer

Sonnenschutzmechanismus anzusehen. Die während photooxidativer Reaktionen

gebildeten reaktiven Sauerstoff-Spezies können nicht nur durch Melanin, sondern

effektiver durch Antioxidantien wie Ascorbinsäure (Vitamin C) und �-Tocopherol

(Vitamin E) abgefangen werden. Die Kombination von �-Tocopherol und

Ascorbinsäure wird als Recycler-System verstanden, in dem oxidativ gebildete

Tocopheroxyl-Radikale durch Ascorbinsäure wieder zu Tocopherol reduziert werden

(Kagan et al., 1992). Der antioxidative Status charakterisiert die Fähigkeit des

1. Einleitung

9

Hautgewebes, sich gegen photooxidative Reaktionen zu verteidigen (Podda et al.,

1998).

Zu den enzymatischen Verteidigungsystemen gehören die Enzyme Katalase

und Superoxiddismutase. Wie Untersuchungen mit Fibroblasten ergaben, sind

ansteigende Gehalte an endogenem Glutathion ebenfalls als adaptive Reaktion auf

UV-Stress zu sehen (Jones et al., 1999). In vitro konnte durch Supplementierung mit

Vitamin E in einem Keratinozytenmodell der zelluläre Gehalt an Glutathion erhöht

werden (Masaki et al., 2002).

Die topische Applikation von Antioxidantien wie Vitamin E zeigte protektive

Effekte (McVean und Liebler, 1999, Sorg et al., 2001). Schutzeffekte wurden ferner

für das zu den Flavonoiden zählende Epigallocatechin und das sich davon ableitende

Gallat-Derivat berichtet (Soriani et al., 1998, Katiyar et al., 1999). Orale

Anwendungen von Vitamin E in Kombination mit Carotinoiden ergaben gegenüber

dem UV-induziertem Erythem einen Schutzeffekt, wie in Humanstudien

nachgewiesen wurde (Stahl et al., 2000).

Auch Carotinoide sind effektive Antioxidantien, die als endogene

Sonnenschutzmittel Verwendung finden (siehe 1.2).

1. Einleitung

10

1.2 Carotinoide

1.2.1 Carotinoide als Naturstoffe

Die Carotinoide zählen zu einer Gruppe von Pigmenten, die von höheren

Pflanzen und einigen Mikroorganismen synthetisiert werden. Bis jetzt sind mehr als

700 Carotinoide identifiziert worden. Ihre auffallende Farbigkeit zeigt sich in vielen

Obst- und Gemüsesorten (Karotte, Tomate, Mais, Zitrusfrüchte, Pfirsich, Melone).

Aber auch grüne Gemüse wie Spinat, Brokkoli oder Erbsen enthalten teils erhebliche

Mengen an Carotinoiden. Hier wird die Farbe aber durch das dominierende

Chlorophyll überdeckt.

Carotinoide weisen eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten auf. Sie sind in

höheren Pflanzen Bestandteil des „light-harvesting-Komplexes“ und tragen zur

Photoprotektion in Pflanzen und Mikroorganismen bei.

Natürlicherweise vorkommende Carotinoide besitzen einen Kette aus 40

Kohlenstoffatomen. Der zentrale Bereich der Kette stellt das eigentliche Chromophor

dar, das aus einem konjugierten Polyensystem besteht. Die Anzahl der konjugierten

Doppelbindungen beeinflusst die physikalischen Eigenschaften wie das

Lichtabsorptionsverhalten. Verbindungen wie beispielsweise Lycopin, Phytoen oder

Phytofluen sind acyclische Carotinoide, während Cyclisierungen zu 6-Ringsystemen

an den Enden der Kohlenstoffkette Carotinoide mit ß-Iononstruktur bilden können.

Das ß-Carotin oder andere provitamin A-aktive Verbindungen sind Beispiele hierfür.

Die Bildung anderer Ringsysteme (z.B. 5-Ring-Carotinoide) ist auch möglich.

Die Klasse der Carotinoide lässt sich in zwei Gruppen unterteilen. Carotine

sind Kohlenwasserstoffverbindungen ohne funktionelle Gruppen. Oxo-Carotinoide

(Xanthophylle) tragen mindestens eine Sauerstofffunktionalität in Form einer

Hydroxyl-, Carbonyl- oder Epoxygruppe. Xanthophylle mit Hydroxylgruppen liegen in

der Natur oftmals mit Fettsäuren verestert vor (Wingerath et al., 1998).

Die Strukturen der Hauptcarotinoide, die im Blut und Gewebe des Menschen

vorkommen, sind in Abb. 1.2 und in Abb. 1.3 dargestellt.

1. Einleitung

Abb. 1.2: Strukturen der Hauptcarotine im

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3 CH3CH3

CH3 CH3CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

ß-Carotin

�-Carotin

Lycopin

Phyto

Phyto

11

Blut und Gewebe des Menschen.

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

en

fluen

1. Einleitung

12

Abb. 1.3: Strukturen der Xanthophylle. Mit Ausnahme von Astaxanthin kommen alle anderenOxo-Carotinoide im Blut und Gewebe des Menschen vor.

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3

OH

OH

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3

OH

OH

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3OH

CH3CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3CH3

CH3 CH3OH

O

O

OH

Lutein

Zeaxanthin

ß-Cryptoxanthin

Astaxanthin

1. Einleitung

13

Die im Blut vorkommenden Hauptcarotinoide sind Lycopin, �-Carotin, ß-

Carotin, Lutein, ß-Cryptoxanthin und Zeaxanthin. Astaxanthin lässt sich im

menschlichen Blut nur nach dem Verzehr von astaxanthinreicher Nahrung wie dem

Seelachs nachweisen.

1.2.2 Carotinoide als Antioxidantien

Die Funktionen der Carotinoide als Bestandteil des Photosystems sind für die

Pflanzenwelt, einige Algen und Bakterien von Bedeutung (Martin, 1995). Protektiv

wirken sie vor allem aber durch ihre Fähigkeit Singulettsauerstoff zu desaktivieren

(„quenchen“), der in den photosynthetisch aktiven Chloroplasten entsteht (Frank und

Cogdell, 1996). Als Quencheffekt wird die Fähigkeit bezeichnet, Singulettsauerstoff

über eine Energietransferreaktion zu desaktivieren (Baltschun, et al., 1997, Junghans

et al., 2001a).

Lycopin und Singulettsauerstoff interagieren mit der höchsten

Desaktivierungsrate, so dass Lycopin unter den Carotinoiden der effektivste Quencher

für Singulettsauerstoff ist (Di Mascio et al., 1989, Beutner et al., 2000). Dieser Wert

liegt um den Faktor 100 höher als der für die Antioxidantien Vitamin E und Vitamin C

(Sies et al.,1992). Da Singulettsauerstoff in photooxidativen Prozessen auch in der

Haut gebildet werden kann, dürften Carotinoide auch zum Schutz der Haut vor

oxidativen Schäden beitragen (Stahl et al., 2001).

Carotinoide zeigen darüber hinaus auch noch andere antioxidativen

Eigenschaften (Ruck et al., 2001); sie sind sogenannte „chain breaking antioxidants“,

welche in pathobiochemischen Prozessen intermediär gebildete Lipidperoxylradikale

abfangen können. Da Lipidoxidationen autokatalytisch ablaufen, stellt die

Verminderung von Peroxylradikalen durch Carotinoide eine Unterbrechung dieser

Kettenreaktion dar (chain breaking). Hierbei wirken sie wie klassische Antioxidantien,

z.B. Tocopherole oder Flavonoide.

Basierend auf in vitro Untersuchungen wird postuliert, dass Carotinoide auch

prooxidativ in vivo wirken können (Mayne 1996, Mayne et al., 1996, Wang und

Russell, 1999). Solche prooxidativen Eigenschaften werden im Zusammenhang mit

1. Einleitung

14

den negativen Ergebnissen zweier Interventionsstudien mit ß-Carotin diskutiert. Nach

mehrjähriger Intervention mit 20 mg ß-Carotin pro Tag fand sich ein um 20 % erhöhtes

Risiko für Lungenkrebs bei Rauchern und Asbestarbeitern. Oxidativ gebildete apo-

Carotinale sollen durch Interaktion mit zellulären Signalwegen für die erhöhte

Tumorbildung verantwortlich sein (ATBC-Study Group, 1994, Omenn et al., 1996).

Carotinoide reagieren mit Peroxylradikalen, die im Verlaufe von

Lipidautoxidationsprozessen gebildet werden, u.a. zu Intermediaten, von denen

sowohl anti- als auch prooxidative Reaktionswege ausgehen können. Schematisch ist

dies in Abb. 1.4 (B) dargestellt.

A1Car + 1O2

3Car + 3O2 1Car + Wärme

B ROO-Car-OOR (a)

ROO� O2

Car + ROO� Car�- OOR �OO-Car-OOR (b)

O<Car + RO� (c)

Abb. 1.4: Schema zu anti- und prooxidativen Eigenschaften von Carotinoiden. (A)Desaktivierung von Singulettsauerstoff und (B) Reaktion mit Peroxylradikalen zu einemneutralen Addukt (a), radikalischen Addukt (b), oder Carotenoid-Epoxid und Alkoxyradikal (c)(Burton und Ingold, 1984, Kennedy und Liebler, 1992, Britton, 1995a).

1. Einleitung

15

Die Desaktivierung von energiereichem und reaktionsfähigem Singulett-

sauerstoff erfolgt durch Energietransfer auf ein Carotinoidmolekül im Singulett-

Zustand (Abb. 1.4 A). Das resultierende Carotinoid im Triplett-Zustand erreicht den

energetisch günstigeren Singulett-Zustand wieder durch Energieabgabe in Form von

Wärme an die Umgebung (Britton, 1995a).

Die Reaktion mit Lipidperoxylradikalen kann zu anti- oder prooxidativen

Folgereaktionen führen. Resonanzstabilisierte Carotinoid-Peroxyl-Addukte können

mit weiteren Peroxylradikalen zu nicht-radikalischen Produkten reagieren (Abb. 1.4 B

(a)). Die Kettenreaktion der Lipidautoxidation wird hierbei unterbrochen (antioxidativ).

Alternativ kann sich Sauerstoff an das radikalische Addukt anlagern. So entsteht ein

neues Radikal (prooxidativ). Da dieser Reaktionsweg reversibel ist, lässt sich gemäß

Massenwirkungsgesetz bei erhöhtem Sauerstoffpartialdruck das Gleichgewicht der

Reaktion zugunsten der Produktseite verschieben (b). Weiterhin ist auch eine

Spaltung der Peroxygruppe des Addukts möglich, die ein reaktives Alkoxyradikal

entstehen lässt. Alkoxyradikale sind reaktiver als Peroxyradikale, so dass dieser

Reaktionsweg ebenfalls alsprooxidativ anzusehen ist (Kennedy und Liebler, 1992).

Die resultierende Carotenoidverbindung kann ein Epoxid sein (Britton, 1995a, Martin,

et al., 1999). Aus den erhaltenen Peroxyverbindungen in (a) und (b) werden weitere

Abbauprodukte gebildet.

1.2.3 Carotinoide in der Photoprotektion

Oxidative Schädigungen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese

zahlreicher degenerativer Erkrankungen. Epidemiologische Studien zeigen, dass die

erhöhte Aufnahme von Antioxidantien mit einem verminderten Risiko für solche

Erkrankungen korreliert ist. So bestehen Korrelationen zwischen einer geringen

Carotinoidaufnahme oder niedrige Carotinoidwerte im menschlichen Serum und

einem erhöhten Risiko für eine Krebserkrankung, altersbedingte Macula-

Degeneration, einen Katarakt oder für eine kardiovaskuläre Erkrankung (Sies und

Krinsky, 1995, Stahl und Sies, 1996, Sies und Stahl, 1998, Mayne et al., 1998, Suter,

2000, Mecocci et al., 2002, Polidori et al., 2002).

1. Einleitung

16

Carotinoide sind vermutlich am Schutz lichtexponierter Gewebe beteiligt.

Auffällig ist das Vorkommen der polaren Carotinoide Lutein und Zeaxanthin in der

Macula lutea der menschlichen Retina (Wald, 1945, Bone et al., 1985, Handelman et

al., 1988). Das gelb erscheinende Pigment ist lokal beschränkt in der zentralen

Retina im Fokus der optischen Achse (Ort höchster Sehschärfe) zu finden. Es ist für

die Verminderung der chromatischen Aberration im Auge aber auch für die

Entstehung des psychophysikalischen Phänomens der Haidinger´schen Figur

verantwortlich (Reading und Weale, 1974, Bone und Landrum, 1984). Als Ursache

wird eine definierte, planare Anordnung der Carotinoide im retinalen Gewebe

angenommen, die eine optimale Wechselwirkung des einfallenden Lichtvektors mit

den Carotinoiden durch Absorption ermöglicht. Zugleich lassen sich dadurch

photoprotektive Wirkungen, z.B. durch Filtereffekte, erzielen.

Im Auge wird kurzwelliges UV B-Licht von der Hornhaut, längerwelliges UV A-

Licht hingegen von der Linse absorbiert. Intensive Einstrahlung des sichtbaren

Anteils der Sonnenstrahlung kann zu Schädigungen der Retina führen (Marshall,

1985, Young, 1988, Taylor et al., 1990, Young, 1994). Blaulicht im

Wellenlängenbereich von 400 – 450 nm wirkt besonders schädigend (Ham et al.,

1984). Insbesondere im Bereich der Macula weist die Retina im Vergleich zum

übrigen retinalen Gewebe einen geringeren Durchmesser auf, was mit einem

verminderten Absorptionsverhalten einhergeht (Schalch, 1992). Die für das

Farbsehen verantwortliche Zapfen werden durch Blaulicht eher geschädigt (Marshall,

1985), als die für das Schwarzweisssehen verantwortlichen Stäbchen. Das maculare

Pigment zeigt ein Absorptionsmaximum bei 460 nm und stellt somit einen idealen

Blaulichtfilter dar (Bone et al., 1992, Junghans et al., 2001a).

Eine der Hauptursachen für irreversible Blindheit in der westlichen Welt ist die

altersbedingte Maculadegeneration (AMD) (Vingerling et al., 1995). Es wird

angenommen, dass photooxidative Schädigungen von Zellbestandteilen der Macula

lutea eine Rolle spielen (Seddon, 1994, Sparrow, 2002). Es wird diskutiert, dass die

Maculapigmente Lutein und Zeaxanthin als Blaulichtfilter wirken und einen

protektiven Effekt aufweisen (Schalch und Weber 1994, Bone et al., 2001, Mares-

Perlman, 2002). Vergleichende Studien (Eye Disease Case-Control Study Group)

zeigten, dass ein erhöhter Verzehr von lutein- und zeaxanthinreicher Nahrung mit

1. Einleitung

17

einem vermindertem Risiko korreliert ist, an AMD zu erkranken (Seddon et al., 1994).

Diese Korrelation gilt besonders für den lutein- und zeaxanthinreichen Spinat (Müller,

1996). Weitere Studien zeigten auch, dass die Serumkonzentrationen der

Maculacarotinoide mit der Dichte des Maculapigments im Auge positiv korreliert sind

(Hammond et al., 1996). Durch den Verzehr von Spinat ließen sich sowohl die

Serumgehalte von Lutein und Zeaxanthin als auch die Dichte des Maculapigments

erhöhen (Hammond et al., 1997). Hingegen wurden in einer früheren Studie keine

positive Korrelation zwischen den Serumgehalten von Lutein und Zeaxanthin und der

Inzidenz für eine AMD festgestellt (Mares-Perlman, 1995).

Bisher sind nur wenige Untersuchungen zu photoprotektiven Effekten von

Carotinoidenin der Haut durchgeführt worden. Die meisten Untersuchungen waren

auf die Anwendung von ß-Carotin beschränkt. Zu unterscheiden sind hierbei

Untersuchungen mit topischen Anwendungen direkt auf der Haut und einer

systemischen, oralen Applikation.

Schon früh erwies sich ß-Carotin als geeignet für die Behandlung von

Lichtdermatosen wie der erythropoetischen Protoporphyrie (EPP) (Mathews-Roth et

al., 1977). Bei der EPP liegt eine Hypersensitivität gegenüber Sonnenlicht vor, die zu

sonnenbrandähnlichen Symptomatiken führt. Aufgrund eines genetischen Defektes

kommt es zu einer massiven Erhöhung des Protoporphyrins im Blut, das als

Photosensibilisator wirkt. Durch Energietransfer auf molekularen Sauerstoff im

Triplett-Zustand entsteht reaktiver Singulettsauerstoff bei gleichzeitiger

Regeneration von Protoporphyrin im Singulettgrundzustand. Eine ß-Carotin–

Supplementierung erniedrigt die Empfindlichkeit der Haut durch Desaktivierung des

Singulettsauerstoffs (Whitcombe et al., 1991).

Die Verwendung von Carotinoiden im systemischen Sonnenschutz findet erst

seit einigen Jahren Aufmerksamkeit, obwohl Interventionsstudien zufriedenstellende

Ergebnisse schon früh beschrieben hatten (Mathews-Roth et al., 1972, Fuller et al.

1992). Das Maß einer Protektion wird hierbei durch das Ausmaß des UV-induzierten

Erythems oder durch die Menge der dafür erforderlichen Strahlungsdosis bestimmt.

Mathews-Roth und Kollegen (1972) berichteten von einem protektiven Effekt

durch Gabe von 150 mg ß-Carotin pro Tag über 10 Wochen. Ähnliche Ergebnisse

1. Einleitung

18

wurden auch mit Carotinoidgemischen (Lee et al., 2000) und

Carotinoidapplikationenin Kombination mit topischen Sonnenschutzmitteln erzielt

(Gollnick et al., 1996).

Im Gegensatz dazu wurden in anderen Studien, die über einen kürzeren

Zeitraum (4 Wochen) durchgeführt worden waren, keine protektiven Effekte

beobachtet. Die tägliche Gabe von 90 mg ß-Carotin oder 150 mg Carotinoiden in

Form eines ß-Carotin-Canthaxanthin-Gemisches ergab keinen UV-Schutz (Wolf et

al., 1988, Garmyn et al., 1995).

Lycopin als endogene UV-Schutzsubstanz wurde nur in wenigen

Interventionsstudien untersucht. Die tägliche Gabe von 40 mg einer Tomatenpaste

erzeugte signifikant photoprotektive Effekte jedoch erst ab einer

Supplementierungsdauer von 4 Wochen. Verglichen mit den hohen Dosen an ß-

Carotin waren die täglichen Dosen von 16 mg Lycopin durch den Verzehr der

Tomatenpaste niedriger (Stahl et al., 2001).

In den genannten Studien wurden die Carotinoide ß-Carotin und Lycopin auf

ihre UV-protektive Wirkung hin untersucht. Insbesondere die Verwendung von

Carotinoidsupplementen aus Algenextrakten oder die Verwendung von

Lebensmitteln z.B. Tomatenmark macht es notwendig, das Carotinoidprofil der

eingesetzten Formulierungen zu prüfen, um eine Beziehung zwischen Exposition und

Wirkung beschreiben zu können. Weitere Carotinoide wie Phytoen sind in Tomaten

zu finden und können je nach Varietät bis zu 50 % des Lycopingehaltes ausmachen

(Belitz und Grosch, 1992). Phytoen ist ein neben dem chemisch verwandten

Phytofluen biosysnthetisches Vorläufermolekül der Carotinoide in Pflanzen (siehe

Abb. 1.2), welches schon früh von Mathews-Roth und Pathak (1975) im Tiermodell

des Frettchens untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass es ein UV-

protektives Agens der Haut ist, wenn es intraperitoneal (unter die Bauchdecke)

appliziert wird.

1. Einleitung

19

1.2.4 Carotinoidaufnahme

Voraussetzung für eine protektive Wirkung ist die Absorption der Substanz

und die anschließende Verteilung in das Zielgewebe. Daher sind Untersuchungen

zur Biokinetik von Carotinoiden notwendig, um Aussagen über protektive Effekte

treffen zu können.

Carotinoide sind stets mit lipophilen Kompartimenten assoziiert. Im

Verdauungstrakt des Menschen werden sie unspezifisch mit sezernierten

Gallensäuren und Nahrungsfetten zu Mizellen assoziiert, die über die Darmmucosa

aufgenommen werden. Im Lymphsystem erfolgt der Weitertransport über

Chylomikronen, die in das Blut abgegeben werden. Über den Blutkreislauf gelangen

die Carotinoide zu verschiedenen Zielgeweben (Goodman et al.,1966, Erdman et al.,

1993).

In der Leber erfolgt der Einbau in Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL),

welche anschließend im Blut enzymatisch zu Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL)

umgebaut werden. Wie in der Leber ist die Aufnahme von Carotinoiden in die

Zielzellen oftmals LDL-Rezeptor-vermittelt. Einen Großteil der polaren Xanthophylle

lassen sich hingegen in den Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) nachweisen (Olson,

1994). Eine weitere Metabolisierung ist bei Provitamin A-Carotinoiden zum Retinal

bzw. Retinol, bei allen übrigen Carotinoiden zu den ß-Apo-Carotenalen möglich

(Krinsky, 1993).

Der Transportweg der Carotinoide in das Blut und die Leber ist eingehend

untersucht. Die Anreicherung in bestimmten Zielgeweben lässt sich bislang jedoch

nicht hinreichend erklären. Hohe Carotinoidgehalte in der Nebeniere und in den

Testes lassen sich mit einer hohen Ausstattung an LDL-Rezeptoren erklären (Krinsky

et al., 1958, Kaplan et al., 1990, Johnson and Russel, 1992, Stahl et al., 1992).

1. Einleitung

20

1.3 Ziel der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einer Interventionsstudie am Menschen

photoprotektive Effekte von Carotinoiden gegenüber UV-induzierten Schädigungen in

der Haut nachzuweisen. Dazu sollten Probanden täglich mit lycopinreichen

Nahrungsergänzungsmitteln und mit einem lycopinreichen Lebensmittel für die Dauer

von 12 Wochen supplementiert werden. Der Carotinoidgehalt sollte im Blut und im

Zielgewebe der Haut nachgewiesen und quantifiziert werden, um Aussagen über die

Verfügbarkeit der Carotinoide aus den verschiedenen Supplementformulierungen zu

treffen.

Die Verminderung der UV-induzierten Erythemintensität der Haut nach einer

Solarsimulation sollte gemessen und das Ausmaß des photoprotektiven Effektes

bestimmt werden.

Weiterführend sollten in einem Zellkultursystem die UV-protektiven Effekte von

Carotinoiden untersucht werden. Als Modell dienten Kulturen von Hautfibroblasten

und Keratinozyten. Die UV-induzierte Expression des Enzyms Kollagenase (MMP-1)

und des Zytokins Interleukin-6 (IL-6) sollte in Anwesenheit von Lycopin, Phytoen

oder Phytofluen bestimmt werden, um den Einfluß dieser Carotinoide auf UV-

induzierte Signalwege in Hautzellen beschreiben zu können.

Schließlich sollten die antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden in einem

geeigneten Biomembranmodell untersucht werden, indem Carotinoide in ein

unilamellares Liposomensystem eingebaut werden. Zum Vergleich wurden weitere

Antioxidantien exemplarisch untersucht. Mit einer neuen methodischen Konzeption

sollten lipidprotektive Effekte der Carotinoide in den Liposomen aufgezeigt werden.

2. Material und Methoden

21


2.1 Chemikalien

Alle verwendeten Carotinoide waren synthetisch hergestellte Verbindungen,

die freundlicherweise von Dr. Ernst (BASF, Ludwigshafen, Deutschland) zur

Verfügung gestellt wurden. Die Reinheit betrug mindestens 90 % (HPLC); Lycopin

wies eine Reinheit von 86 % auf. Isomerenreines Phytoen wurde von Dr. Paust

(BASF) bezogen. Ein Gemisch aus Phytoen und Phytofluen wurde von LycoRed,

Natural Prod. Industr. Ltd. (Beer-Sheva, Israel) geliefert. Epicatechin,

Diphenylhexatrien und L-�-Di-lineoyl-phosphatidyl-cholin wurden von Sigma-Aldrich

bezogen (Deisenhofen, Deutschland). 2,2´-Azo-bis-(amidinopropan)-hydrochlorid

wurde von Polysciences (Warrington, PA, USA) geliefert. Alle übrigen Chemikalien

in p.A. und HPLC- Qualität waren von Merck (Darmstadt, Deutschland). Stickstoff der

Reinheit 5.0 war von Linde (Höllriegelskreuth, Deutschland). Wasser wurde

membranfiltriert (Millipore, Eschborn, Deutschland). ß-Apo-8-Carotinol wurde durch

Reduktion von ß-Apo-8´-Carotinal (Fluka, Deisenhofen, Deutschland) mit Natrium-

Borhydrid hergestellt (Khachik und Beecher, 1988).

2.2 Analytische Verfahren zur Carotinoidbestimmung

2.2.1 Carotinoidarbeitslösungen

Stammlösungen von Carotinoiden wurden durch Lösen der Festsubstanzen in

Hexan/Dichlormethan (4/1, v/v) hergestellt. Der Gehalt wurde jeweils photometrisch

unter Verwendung folgender Lösungsmittel zur Verdünnung der Stammlösung,

molarer Extinktionskoeffizienten (Britton, 1995b) und Wellenlängen bestimmt (Tab.

2.1):


22

Tab. 2.1: Extinktionskoeffizienten von Carotinoiden in organischen Lösungsmitteln

Verbindung � (l mol –1 cm – 1) ��(nm) Lösungsmittel

�-Carotin 145 300 445 Hexan

ß-Carotin 138 900 450 Hexan

Lycopin 184 000 470 Hexan

ß-Cryptoxanthin 138 900 450 Hexan

Lutein 144 000 445 Ethanol

Zeaxanthin 140 000 450 Ethanol

Phytoen 49 800 276 Hexan

Phytofluen 85 500 348 Hexan

Es wurden Arbeitslösungen im Bereich von 0,001 µM – 2,0 µM erstellt.


23

2.2.2 Geräte

Die chromatographische Trennung der Carotinoide erfolgte mit folgenden

Geräten:

Pumpe: La Chrom L7100 (Merck-Hitachi, Darmstadt, Deutschland)

Detektor: La Chrom UV-Vis Detektor L-7420 (Merck-Hitachi, Darmstadt)

Integrator: D-2500 Chromato-Integrator (Merck-Hitachi, Darmstadt)

Autosampler: Autosampler 655 A (Merck-Hitachi, Darmstadt)

Säulenofen: Column-Thermostat Jetstream 2 plus (Alltech, Associates,Deerfield, IL, USA)

Photometer: DU� 530 Life Science UV/Vis Spektrophotometer (Beckmann,München, Deutschland)

Zentrifuge: Hettich, Universal Zentrifuge 30 RF (Hettich, Tuttlingen,Deutschland)

Ultraschallbad: Sonorex Super Digital DK 255 (Bandelin, Berlin, Deutschland)

2.2.3 Bestimmung von Carotinoiden in Serum-, Zellmedium- und Zelllysatproben(Routineverfahren nach Gärtner, 1997)

In einem Polypropylen-Reaktionsgefäß (PP) wurden zu 1 ml KPi-Puffer (2 mM

KPi, pH 7,2 , 250 mg/l EDTA, 250 mg/l Ascorbinsäure) 200 µl einer Serum-,

Zellmedium- oder Zelllysatprobe gegeben. Als interner Standard (IS) wurden 20 µl

einer propanolischen Lösung von ß-Apo-8´-Carotinol zugegeben, die bei 450 nm

eine Extinktion von etwa 0,2 aufwies. Proteine wurden nach Zugabe von 1 ml

Ethanol durch intensives Schütteln gefällt. Nach Proteinfällung wurden 6 ml eines

Extraktionsmittels (n-Hexan/Dichlormethan, 5/1, v/v, 0,01 % BHT) zur Probe

gegeben. Es wurde 1 Minute vortex-geschüttelt, 10 Minuten ultraschallbehandelt,

wiederum geschüttelt und dann 3 Minuten zur Phasentrennung bei 3000 rpm

zentrifugiert. Ein Aliquot von 5 ml der organischen Phase wurde in ein weiteres

Reaktionsgefäß (PP) überführt und unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne


24

eingedampft. Das Reaktionsgefäß wurde mit Diethylether nachgespült und die

etherische Phase wiederum bis zur Trockne eingedampft.

Die Carotinoide waren bei 4 ° C und unter Stickstoff gelagert mindestens 1 Tag

stabil.

Die Carotinoide wurden nach Zugabe von 20 µl Dichlormethan mit 180 µl dermobilen Phase A siehe (s.u.) rekonstituiert.

Die Probenaufgabe erfolgte mit einem Autosampler durch Injektion von 50 µlder Analysenlösung. Die HPLC-Bedingungen waren (HPLC-System A):

Säule: Suplex pKb 100, 25 cm x 4,6 mm, 5 µm (Supelco, Bellefonte,Pennsylvania, USA)

Mobile Phase: A Methanol/Acetonitril/ 2-Propanol, 54/44/2, v/v/v,

B Methanol/Acetonitril/H2O/2-Propanol, 46/37/15/2, v/v/v/v

Gradient: 0 - 5 Min 64 % A, 36 % B

5 - 15 Min 64 % A 100 % A

15 - 27 Min 100 % A

27 - 32 Min 64 % A, 36 % B

Fluß: 1 ml/Min

Temperatur: Raumtemperatur

Detektion: 450 nm

2.2.4 Bestimmung von Carotinen in Serum- und Lebensmittelproben

Zu den in der vorliegenden Arbeit bestimmten Carotinen gehören ß-Carotin, �-

Carotin, Lycopin, Phytoen und Phytofluen. Im folgenden wird ein Trennsystem

beschrieben, welches entwickelt wurde, um ein dem Verfahren zur Carotinoidanalytik

(2.2.3) vergleichbares System zu erhalten. Die Eingliederung der Verfahren in einen

routinemäßigen Laborbetrieb sollte somit möglich sein.


25

Serumproben

In einem PP-Reaktionsgefäß wurden 500 µl Serum zu 1 ml KPi- Puffer (2 mM

KPi, pH 7,2 , 250 mg/l EDTA, 250 mg/l Ascorbinsäure) gegeben und mit 1ml Ethanol

die Proteine gefällt. Extrahiert wurden die Carotine mit n-Hexan/Dichlormethan (5/1,

v/v, 0,01 % BHT). Es wurde 1 Minute geschüttelt, 10 Minuten ultraschallbehandelt,

wiederum geschüttelt und dann für 3 Minuten zur Phasentrennung bei 3000 rpm

zentrifugiert. Ein Aliquot von 5 ml der organischen Phase wurde in ein weiteres

Reaktionsgefäß (PP) überführt und unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne

eingedampft. Das Reaktionsgefäß wurde mit Diethylether nachgespült und die

etherische Phase wiederum bis zur Trockne eingedampft. Die Rekonstitution erfolgte

mit 100 µl Dichlormethan und 100 µl Methanol.

Lebensmittelproben

Als Lebensmittelproben wurden trübe Säfte sowie pulpenähnliche und

pastöse Proben aus der Tomate und Karotte untersucht. Ferner wurde auch ein

Tomatenextrakt auf Oleoresin-Basis (Lyc-o-Mato�) untersucht. Die

Probenvorbereitung war an das Verfahren von Hart und Scott (1995) angelehnt.

Etwa 100 g des Lebensmittels wurden homogenisiert (Ultra-Turrax, IKA,

Staufen, Deutschland). 1 bis 5 g des Homogenats wurden in 50 ml H2O

aufgeschlämmt, für 10 Min im Ultraschallbad und für weitere 2 Min mit einem

Ultraschall-Sonifizierer behandelt (Sonifier 250, Branson, Danbury, CT). Feste

Bestandteile wurden über einen Filter (Schwarzband, Schleicher & Schüll, Einbeck,

Deutschland) abgenutscht und der Filterrückstand mit 100 ml Methanol/THF (1/1, v/v)

gewaschen. Die wässerige Phase wurde jeweils 3 x mit 400 ml Hexan im

Scheidetrichter ausgeschüttelt und ein Aliquot von 4 ml der vereinigten Hexan-

Phasen unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 µl

Dichlormethan aufgenommen und mit 900 µl Hexan vollständig rekonstituiert.

Kapsel-Supplemente (Lyc-o-Mato �) wurden in 30 ml Hexan/Dichlormethan

(5/1, v/v) mit einem Skalpell geöffnet und solange gerührt bis die Gelkapsel farblos

war. Die stark gefärbte Lösung wurde bis zu einem leichten Gelbton verdünnt.


26

Die so erhaltenen Analysenlösungen wurden direkt in das HPLC-System

gegeben.

Die HPLC-Trennung erfolgte mit (HPLC-System B):

Säule: Suplex pKb 100, 25 cm x 4,6 mm, 5 µm (Supelco, Bellefonte,Pennsylvania, USA)

Mobile Phase: Acetonitril/Methanol, 85/15, v/v

Gradient: isokratisch

Fluß: 1 ml/Min

Temperatur: 20 °C

UV/vis-Detektion: 276 nm (Phytoen)

348 nm (Phytofluen)

450 nm (ß-Carotin, Lycopin)

Fluoreszenz-Detektion: 348 nm (Anregung)

(in Reihe mit UV) 480 nm (Emission) (Phytofluen)

Die Fluoreszenz-Detektion wurde zum Nachweis von Phytofluen bei einer

Anregungswellenlänge von 348 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm

durchgeführt. Der Fluoreszenz- und der UV-Detektor waren dabei in Reihe

geschaltet.

2.3 Interventionsstudie

2.3.1 Studiendesign

An der Studie nahmen 48 Erwachsene teil. Sie wurden vom Institut für

Experimentelle Dermatologie der Universität Witten-Herdecke rekrutiert. An die

Probanden der Studie wurden folgende Kriterien gestellt: ein guter allgemeiner

Gesundheitszustand, keine Malabsorption, kein pathogener Lipidmetabolismus und

keine Lebererkrankungen. Die Teilnehmer waren Nichtraucher mit einem Body Mass

Index (BMI) von 18 – 25 kg/m2, sie waren nicht schwanger oder in einer


27

Laktationsphase. Ferner nahmen sie während der Studie keine Vitaminsupplemente

oder Medikamente ein. Photosensibilisierende Erkrankungen der Teilnehmer waren

nicht bekannt. Einen Monat vor Beginn der Studie wurden intensive

Sonnenbestrahlungen vermieden. Die Teilnehmer waren von Hauttyp II (weisse

Haut, blond oder hell-braunes Haar, blaue oder hellbraune Augen und leichte

Hautbräunung) (Pathak, 1982).

Die Studienteilnehmer wurden randomisiert in 4 Gruppen eingeteilt. Die erste

Gruppe erhielt pro Tag 2 Kapseln einer synthetischen Lycopin-Formulierung (Gruppe

Lycopin). Jede Kapsel enthielt 5,1 mg Lycopin mikroverkapselt als Beadlet.

Die zweite Gruppe nahm pro Tag zwei Kapseln eines Tomatenextraktes ein

(Lyc-o-Mato �), welcher als Oleoresin rekonstituiert war (Gruppe Lyc-o-Mato). Der

Gehalt an Carotinoiden betrug in jeder Kapsel (Herstellerangaben): Lycopin 4,9 mg,

Phytofluen 0,4 mg und Phytoen 0,5 mg.

Die dritte Gruppe trank täglich 2 x 250 ml eines als Drink (Lyc-o-Guard Drink �)

rekonstituierten Tomatenextraktes (Gruppe Lyc-o-Guard). Der Extrakt war in Form

von Beadlets wässerig mikrodispergiert. Die Gehalte an Carotinoiden waren dabei

folgende (Herstellerangaben): Lycopin 16,4 mg/l, Phytofluen 6,4 mg/l und Phytoen

8,0 mg/l.

Die vierte Gruppe nahm täglich 2 x 200 ml eines Saftes einer Lycopinkarotte

ein (Gruppe Lycopinkarotte). Die Gehalte der Carotinoide betrugen für Lycopin 25,1

mg/l, ß-Carotin 12,9 mg/l, Phytoen 4,8 mg/l und Phytofluen 1,0 mg/l (eigene

Untersuchungen).

Die Studie wurde über einen Zeitraum von 12 Wochen durchgeführt. Die

Verlässlichkeit der Probanden hinsichtlich einer carotinarmen Ernährung und der

Einnahme der Supplemente während der Studie wurde sowohl durch Befragung als

auch durch die Bestimmung der Carotinoide im Serum überprüft. Jeder Proband

stimmte der Teilnahme an dieser Studie schriftlich zu. Das Studiendesign wurde von

der Ethikkommission der Universität Witten-Herdecke genehmigt.


28

2.3.2 Induktion des Erythems und Messung der Hautrötung

Dorsale Hautbereiche in Höhe der Scapularegion wurden jeweils nur einmal

mit einem Solarsimulator (SOL 3, Hönle, München, Deutschland) bestrahlt. Die

spektrale Verteilung des Simulators entsprach der des Tageslichts. Im UV-Bereich

zwischen 310 und 350 nm wies der Simulator eine Zunahme der Strahlungsintensität

auf mit einem Maximum bei 330 nm. Ein Nebenmaximum lag bei 360 nm.

Für jeden Probanden wurde die minimale Erythemdosis (MED) vor Beginn

der Studie ermittelt. Am Tag 0 der Studie, nach 4 und 12 Wochen erfolgte dann eine

Bestrahlung mit der individuellen 1,25–fachen MED. Die Bildung eines Erythems

wurde durch den Hautrötungswert vor und 24 Stunden nach Bestrahlung mit einem

Chromatometer (Chromameter CR 200, Minolta, Ahrensburg, Deutschland) als

jeweiliger a-Wert gemessen und als differenzieller � a- Wert ausgedrückt (a-Wert 24

h nach Bestrahlung minus a-Wert vor Bestrahlung).

2.3.3 Bestimmung der Carotinoide in Haut und Serum

Carotinoidgehalte in der Haut der Probanden wurden nicht-invasiv

reflektionsspektrophotometrisch bestimmt (Stahl et al, 1998). Ein Spektrophotometer

(MultiscanOS 20, MBR Herdecke, Deutschland) registrierte Reflektionsspektren im

Bereich von 350 bis 850 nm. Licht dieser Wellenlängen erreicht eine Eindringtiefe in

die Haut von bis zu 0,8 mm, so dass eine Detektion der Carotinoide in der Dermis

möglich ist. Subkutane Carotinoide wurden nicht erfaßt. Als Referenz wurde

Titandioxid benutzt. Die Messungen wurden am Tag 0, nach 4 und 12 Wochen der

Studie am Institut für Experimentelle Dermatologie der Universität Witten-Herdecke

durchgeführt.

Carotinoidgehalte im Serum wurden mittels HPLC nach 2.1.3 bestimmt.


29

2.4 Zellkultursystem

2.4.1 Fibroblasten und Keratinozytenkulturen

Humane Hautfibroblasten mit der Bezeichnung FF(DA) eines männlichen

Spenders (Präputium-Biopsiematerial, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von

Dr. Brenneisen) wurden auf 6 cm Plastik-Kulturschalen (Greiner, Frickenhausen,

Deutschland) angezogen und in Dulbecco´s modified Eagle´s Medium (DMEM,

Sigma, Deisenhofen, Deutschland) kultiviert. Dem Medium wurde fötales

Kälberserum (FCS, Endkonzentration 10 %, Greiner) , L-Glutamin (2 mM, Sigma)

und Penicillin /Streptomycin (20 mg/ml, Sigma) zugesetzt. Die Zellen wurden in einer

wasserdampfgesättigten Atmosphäre bei 37 °C mit 5 % CO2 bis zur Konfluenz

inkubiert.

Keratinozyten der HaCaT-Linie wurden auf 3 cm Plastik-Kulturschalen

(Greiner) angezogen und unter denselben Bedingungen wie die Fibroblasten in

RPMI 1640 – Medium (Sigma) kultiviert.

Keratinozyten aus Biopsiematerial (zur Verfügung gestellt von Dr. Brenneisen)

wurden unter denselben Bedingungen wie die Fibroblasten in Epi-Life-Medium

(Sigma) mit einem Zusatz von Gentamycin (Endkonzentration 0,1 %) und einem

Keratinozyten-Supplement (Endkonzentration 10 %, Sigma) bis zu einer Konfluenz

von etwa 80 % kultiviert .

2.4.2 Inkubation mit Carotinoiden und UV-Bestrahlung der Kulturen

Die konfluenten Zellen wurden zunächst für 24 Stunden ohne FCS

konditioniert. Arbeitslösungen von Lycopin, Phytoen und Phytofluen in THF wurden

den Zellkulturen mit FCS-freiem Medium zugegeben. Der Anteil an organischem

Lösungsmittel im Medium betrug dabei maximal 0,2 %. Die Endkonzentrationen der

Carotinoide im Inkubationsmedium lagen zwischen 0,03 µM und 5,0 µM. Die Prä-

Inkubationszeit betrug zwischen 16 und 48 Stunden. Nach Entfernung des


30

Inkubationsmediums wurde zweimal mit Phosphatpuffer (PBS, 2 mM

Kaliumhydrogenphosphat, pH 7,2) gewaschen und die Zellen mit PBS überschichtet.

Bestrahlt wurde jeweils eine geöffnete Kulturschale bei Raumtemperatur mit

einem UV A-Strahler (UV-A 700 - Strahler, Waldmann, Villingen-Schwenningen,

Deutschland). Das Emissionsmaximum lag bei 365 nm. Die Intensität war auf etwa

40 mW/cm2 für 13 Minuten eingestellt. Die Dosis betrug 30 J/cm2. Nach Entfernung

des PBS wurden die Zellen mit FCS-freiem Medium überschichtet und für 20

Stunden bei 37° C post-inkubiert.

Mit THF prä-inkubierte bestrahlte bzw. unbestrahlte Zellkulturen dienten als

Positiv- bzw. als Negativkontrolle. Alle Untersuchungen wurden in einem dreifachen

Ansatz durchgeführt.

UV B-Bestrahlungen wurden mit einer UV B-Handlampe mit einem Maximum

bei 312 nm (Volber Lourmat, ltf- Labortechnik, Wasserburg, Deutschland)

durchgeführt. Die Intensität betrug 1 mW/cm2 und die Dosis 30 mJ/cm2. Um restliche

UV C-Strahlungen zu eliminieren, wurden die Kulturen während der Bestrahlungen

mit einem Quarzglas abgedeckt.

2.4.3 Bestimmung der Matrix-Metalloprotease-1-Expression (MMP-1)

Die quantitative Bestimmung der sezernierten MMP-1 aus Fibroblasten wurde

mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA Test- Kits 20 Stunden post-Inkubation

aus dem Zellmedium durchgeführt (MMP-1, human, Biotrak ELISA system,

Amersham-Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland). Die photometrische

Auswertung der in den 96-Well Platten gebildeten gelben Farbstoffe erfolgte in einem

automatischen Platten-Reader (Victor 1420 Multilabel counter, Wallac, Freiburg,

Deutschland).


31

2.4.4 Bestimmung der Interleukin-6-Expression (IL-6)

Interleukin-6 stellt ebenso wie MMP-1 ein extrazellulär sezerniertes Protein der

Keratinozyten (einschließlich HaCaT) dar, das quantitativ im Zellmedium nach 24

Stunden post-Inkubation mit einem ELISA–Ssytem bestimmt wurde (ChemiKine TM,

human interleukin-6 sandwich ELISA kit, Chemicon International, Inc., Temecula,

CA). Die photometrische Auswertung erfolgte im Plattenreader (Victor 1420, Wallac).

2.4.5 Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im Zelllysat

Die Zellkulturen wurden nach der Inkubation mit PBS gewaschen und mit

500 µl einer SDS-Lösung (0,1 %) lysiert. Das Lysat wurde bei –80 °C eingefroren

und nach dem Auftauen ultraschallbehandelt. Das so aufbereitete Lysat wurde direkt

für die Proteinbestimmung nach Lowry eingesetzt (DC–Protein Assay, Bio-Rad,

München Deutschland). Die photometrische Auswertung erfolgte im Plattenreader

(Victor 1420, Wallac).

2.4.6 Bestimmung des Carotinoidgehaltes in Zellmedium und Zelllysat

Carotinoide in Zellmedium (Zellkulturüberstand nach 24-stündiger Inkubation)

und in Zelllysatproben von Fibroblastenkulturen wurden mittels HPLC nach 2.1.3

bestimmt.


32

2.5 Unilamellares Liposomensystem

2.5.1 Herstellung und Charakterisierung unilamellarer Liposomen (IUV)

Es wurden Liposomen der IUV-Klasse hergestellt (intermediate unilamellar

liposomes). Dazu wurden 50 µl des in Dichlormethan gelösten Lipids (10 mg/ml) und

die Mengen einer Carotinoid-Stammlösung in ein Zentrifugenglas gegeben, welche

einem molaren Gehalt bis zu 0,5 mol % im Fall der Carotine und bis zu 5,0 mol % im

Fall aller übrigen Testsubstanzen entsprach. Die Lösemittel wurden unter einem

kontinuierlichem Stickstoffstrom entfernt. Zu dem trockenen Rückstand wurden 5 ml

eines Kalium-Phosphatpuffers (100 mM, pH 7,4) gegeben. Die Lösung wurde mit

Ultraschall behandelt (Ultraschall-Sonifizierer Sonifier 250, Branson, Danbury, CT)

und die entstandene klare Suspension direkt für die Messung der konjugierten Diene

(siehe 2.4.2) verwendet. Nicht mit Testsubstanzen beladene Liposomen dienten als

Kontrolle.

Die Liposomensuspensionen wurden elektronenmikroskopisch untersucht

(EM 9 S-2, Zeiss, Göttingen, Deutschland). Liposomen wurden dazu auf

Kupferdrahtnetzchen (mesh 400, Plano, Wetzlar, Deutschland) aufgezogen und der

Untergrund mit Phosphorwolframsäure markiert (Negativ-Färbung). Die Größe der

Vesikel wurde bestimmt und so die Liposomen nach Ostro (1983) klassifiziert.

2.5.2 Initiation der Lipidoxidation in unilamellaren Liposomen

1 ml der zuvor auf Eis gekühlten Liposomensuspension wurde für 10 Minuten

bei

37 ° C prä-inkubiert und anschließend mit 10 µl des wasserlöslichen Radikalstarters

AAPH (100 mM) versetzt und so die Oxidationsreaktion initiiert.


33

2.5.3 Messung der Lipidoxidation in unilamellaren Liposomen

Die Liposomensuspension wurde direkt zur Messung der Lipidoxidation

eingesetzt. Die Konzentrationen der Liposomen und die Art der Liposomen

bedingten, dass eine photometrische Erfassung der Lipidoxidation aufgrund der

primären Bildung von konjugierten Peroxyl-Dienen bei 234 nm möglich war. Der

zeitliche Verlauf der Bildung an konjugierten Dienen wurde photometrisch in einem

bei 37°C beheiztem Küvettenhalter verfolgt, indem die Extinktion mit einem zeitlichen

Abstand von 90 Sek registriert wurde (UV/vis-Spektrophotometer Lambda 2 mit 6-

fach Küvettenwechsler, Perkin-Elmer, Überlingen, Deutschland; ausgerüstet mit

Auswertungssoftware UV KinLab Vers. 2.85.00 Perkin Elmer).

2.5.4 Bestimmung der lag-Phase und des k-Wertes

Die Zunahme der konjugierten Diene (CD) wurde als Absorptions-Zeit-

Graphen dargestellt. Der anfänglichen zeitlichen Verzögerung der CD-Bildung (lag-

Phase) folgte die lineare Kettenwachstumsphase, deren graphische Extrapolation

die Bestimmung des Schnittpunktes mit der Abszisse ermöglichte

(Tangentenmethode). Der erhaltene Abszissenwert entsprach der lag-Phase und

wurde als �+ (Testsubstanz in das Lipid eingebaut) oder �- (Kontrolle; keine

Testsubstanz in das Lipid eingebaut) bezeichnet. Der Quotient aus �+ und �- wurde

berechnet und graphisch gegen die Konzentration der im Lipid eingebauten

Testsubstanzen (nmol/mg) abgebildet. Ein linearer funktionaler Zusammenhang

wurde gebildet und aus der Steigung der Funktion der k-Wert berechnet, der ein

Maß für die lipidprotektiven Eigenschaften der jeweiligen Testsubstanz ist.


34

2.6 Statistik

Statistische Analysen wurden mit dem Software-Programm Excel 5.0

(Microsoft Corp., Unterschleissheim, Germany) durchgeführt. Zur Varianzanalyse

wurde zuerst ein F-Test durchgeführt. Unabhängige Proben konnten mit dem Tukey-

Test überprüft werden; abhängige Proben eines Kollektivs wurden mit dem

zweiseitigen, gepaarten t-Test für abhängige Variablen getestet (Glantz, 1998).

Unterschiede wurden als signifikant bezeichnet, wenn das �-Niveau mindestens

P < 0,05 betrug. Alle Daten wurden als Mittelwerte � SD angegeben.

3. Ergebnisse

35

3. Ergebnisse

3.1 Analytik

3.1.1 Methode zur Bestimmung von Carotinoiden im Serum

Durch die Messung des Carotinoidgehaltes im Serum sollte die Verfügbarkeit

der Hauptcarotinoide aus den Supplementen und dem Saft der Lycopinkarotte

nachgewiesen werden. Desweiteren sollte das Ernährungsverhalten der Probanden

während der Interventionsstudie entsprechend den Vorgaben des Studiendesigns

kontrolliert werden.

Es wurden 6 Carotinoide im Serum mit einem Routineverfahren (Gärtner,

1997) für die Carotinoidanalytik bestimmt (HPLC-System A). Die Verwendung eines

Gradienten-Systems und eine gemeinsame Detektionswellenlänge von 450 nm

ermöglichte die Erfassung folgender Carotinoide in einem HPLC-Lauf:

Lutein, Zeaxanthin, interner Standard (IS), ß-Cryptoxanthin, Lycopin und

Isomere, �-Carotin sowie ß-Carotin und seine Isomere wurden detektiert. Die

Identifizierung der Carotinoide erfolgte mit Referenzverbindungen. Serumproben von

Probanden, die nicht an der Interventionsstudie teilnahmen, wurden in regelmäßigen

Abständen analysiert und dienten als Qualitätskontrollen der Carotinoidanalytik. Als

interner Standard wurde ß-Apo-8´-Carotinol verwendet, das durch Reduktion von ß-

Apo-8´-Carotinal mit Natrium-Borhydrid hergestellt wurde. Die Verwendung des IS

ermöglichte es u.a. auch, Aussagen über die Wiederfindung eines Carotinoids nach

Extraktion und Chromatographie zu treffen. Die Wiederfindung des IS war

reproduzierbar über die Dauer der Studie, und der Variationskoeffizient der

Signalhöhe des IS im Chromatogramm betrug 20 %. Quantifizierungen erfolgten

mittels des externen Standards mit internem Standard; es wurde das Verhältnis der

Signalhöhe des entsprechenden Carotinoids zur Signalhöhe des IS gebildet.

Kalibrierfunktionen wurden durch ungewichtete, lineare Regression erstellt. Zur

quantitativen Auswertung wurden nur die Kalibrierfunktionen herangezogen, deren

Korrelationskoeffizient r mindestens 0,999 betrug. Ein typisches Chromatogramm

einer Serumprobe (Qualitätskontrolle) ist in Abbildung 3.1 dargestellt.

3. Ergebnisse

36

Abb. 3.1: HPLC-Chromatogramm eines Serumextraktes (Qualitätskontrolle) zurCarotinoidanalytik (HPLC-System A); � = 450 nm, Raumtemperatur; 1 Lutein, 2Zeaxanthin, 3 interner Standard (IS), 4 ß-Cryptoxanthin, 5 all-trans-Lycopin, 6 cis-Isomere des Lycopin, 7 �-Carotin, 8 ß-Carotin, 9 13-cis-ß-Carotin, 10 15-cis-ß-Carotin

Die Xanthophylle Lutein und Zeaxanthin waren nahezu basisliniengetrennt.

Der interne Standard interferierte mit keinem Analyten. Lycopin in all-trans-

Konfiguration wurde von seinen 5-cis- und 13-cis- Isomeren getrennt. Die strukturell

verwandten Carotine �-Carotin sowie ß-Carotin und die Isomere 13-cis- und 15-cis-

ß-Carotin ließen sich ebenfalls chromatographisch trennen. Weitere Carotinoide

wurden nicht zugeordnet. Die Analysenzeit betrug weniger als 28 Min.

Zeit (Min)

Abso

rptio

n (4

50 n

m) 1

2

3

4 5

6

7

8

9 10

3. Ergebnisse

37

3.1.2 Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von Carotinen im Serum und in

Lebensmitteln

Die zu den Carotinen gehörenden Verbindungen Phytoen und Phytofluen

wurden sowohl im Serum als auch in den als Supplementen verabreichten

Tomatenextrakten analysiert, da beide Verbindungen in größeren Mengen in den

Produkten vorhanden sein sollten (Herstellerangaben). Im Tomatenextrakt auf

Oleoresin-Basis (Lyc-o-Mato �) betrug der prozentuale Anteil von Phytoen und

Phytofluen bezogen auf Lycopin etwa jeweils 10 %. Für den Tomatenextrakt, der als

trinkbare, wässerige Dispersion formuliert wurde (Lyc-o-Guard Drink �), ergab sich

sogar ein Phytoenanteil von 55 % und ein Phytofluenanteil von 39 % bezogen auf

Lycopin. Die Gehalte im Saft der Lycopinkarotte waren unbekannt. Zur Analyse

wurde eine HPLC-Methode entwickelt, die spezifisch und selektiv die Carotine

erfassen konnte. Zugleich war es mit dieser Methode möglich, zusätzlich die

Carotine Lycopin und ß-Carotin als Hauptcarotinoide der Supplemente und des

Saftes der Lycopinkarotte zu quantifizieren.

Voruntersuchungen hatten ungenügende Trennungen auf herkömmlichen

C18-Umkehrphasen (RP-18, LiChrospher Merck, Darmstadt) ergeben. Zudem war

stets ein Gradientensystem erforderlich, um Analysenzeiten unter 35 Min zu

gewährleisten.

Gute Trennungen wurden mit der modifizierten RP-Phase der pKb-100 Säule

unter Verwendung eines isokratischen Systems mit einem Acetonitril/Methanol-

Gemisch bei 20 °C erhalten (HPLC-System B). Alle Carotine ließen sich ausreichend

gut auftrennen. Die Analysenzeit lag unter 30 Min.

Die Methode wurde in Anlehnung an die Kriterien für die analytische

Beschreibung von Analysenverfahren überprüft. Grundlage waren die Anleitungen

zur Abfassung von Methoden im Bereich der Lebensmittelanalytik (Amtl. Sammlung

von Untersuchungsverfahren gem. § 35 LMBG). Die Spezifität der Methode wurde

durch die Verwendung von zwei verschiedenen Wellenlängen für jeweils Phytoen

(276 nm) und Phytofluen (348 nm) nachgewiesen. Phytofluen zeigte stets zwei

Signale, deren Zuordnung (cis/trans-Isomere) bislang nicht möglich ist (Khachik et

al., 1997). Die Genauigkeit wurde durch Überprüfung der Richtigkeit charakterisiert.

Eine externe Kalibrierung macht in der Regel eine Wiederfindungskorrektur

3. Ergebnisse

38

notwendig; jedoch wurden die externen Kalibrierstandards in das

Probenvorbereitungsschema mit eingebunden, so dass eine Bestimmung der

Wiederfindung nicht notwendig war.

Die Nachweisgrenze (NG) beschreibt die Konzentration, die sich durch das

höchste Signal einer analytfreien Probe über eine Kalibrierfunktion darstellen lässt

(DIN 32645). Für die Chromatographie ergibt das Rauschen der Basislinie den

gemittelten Blindwert und ein Signal/Rausch-Verhältnis von 3 definiert die NG

(Doerffel et al., 1986, Kunze, 1990). In der Chromatographie wird die NG auch als

Detektionsgrenze beschrieben, da sie nicht der Definition der DIN entspricht. Für

Phytofluen und Phytoen wurde eine Konzentration von 0,005 µM als

Detektionsgrenze festgelegt. Die Erfassungsgrenze (EG) ist doppelt so groß wie die

NG und lässt ein falsch-negatives Ergebnis mit nur 5 % zu, einen Analyten als

„nachgewiesen“ zu erkennen. Eine Quantifizierung ist jedoch nicht zulässig, da

immer noch eine Überlappung der statistischen Streubereiche von NG und EG

besteht. Erst die 3-fache Konzentration der NG ergibt eine Bestimmungsgrenze

(BG), oberhalb derer eine Bestimmung erlaubt ist (Hädrich und Vogelsang, 1996).

In Anlehnung daran wurde hier die Quantifizierungsgrenze als die 6-fache

Detektionsgrenze definiert. Phytoen und Phytofluen besitzen mit dem hier

verwendeten HPLC-System folglich eine Quantifizierungsgrenze von 0,03 µM.

Kalibrierfunktionen wurden durch ungewichtete, lineare Regression erstellt

und zur Auswertung verwendet, wenn der Korrelationskoeffizient r mindestens 0,99

betrug.

Die HPLC-Chromatogramme eines Phytoen-Standards sind in Abbildung 3.2,

die eines Phytofluen-Standards in Abbildung 3.3 gezeigt. Die Retentionszeit liegen

für Phytoen bei 29,4 Min und für Phytofluen bei 24,6 und 25,9 Min für die Isomere.

3. Ergebnisse

39

Abb. 3.2: HPLC-Chromatogramm nach Extraktion eines Phytoen-Standards (1) mit tr = 29,4Min bei � = 276 nm und T = 20 °C, mobile Phase: MeCN/MeOH (85/15, v/v).

Abb. 3.3: HPLC-Chromatogramm nach Extraktion eines Phytofluen-Standards (2) mit tr =24,6 und 25,9 Min bei � = 348 nm und T = 20 °C, mobile Phase: MeCN/MeOH (85/15, v/v).

Abso

rptio

n (3

48 n

m)

0 10 20 30

2

Zeit (Min)

Abso

rptio

n (2

76 n

m)

rrrrrrr

Zeit (Min)

0 10 20 30

1

3. Ergebnisse

40

Die Analyse der Carotine im Serum war an das Routineverfahren zur

Carotinoidanalytik angelehnt. Lediglich das Probevolumen wurde von 200 µl auf 500

µl erhöht, um auch im Serum von nicht-supplementierten Probanden eine

ausreichende Nachweisempfindlichkeit zu erhalten. Die Rekonstitution des

eingedampften Hexan/Dichlormethan-Extraktes erfolgte zunächst mit 100 µl anstatt

mit 20 µl Dichlormethan, da zu geringe Mengen an Dichlormethan zu einer

unvollständigen Lösung des trockenen Serum-Rückstandes geführt hatten.

Abb. 3.4: HPLC-Chromatogramm des Serum-Extraktes eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato vor Supplementierung bei � = 276 nm und T = 20 °C. Phytoen (1) kann identifiziertwerden (tr = 29,1 Min).

0 10 20 30

1

Zeit (Min)

Abso

rptio

n (2

76 n

m)

3. Ergebnisse

41

Beispielhaft ist in Abbildung 3.4 die Zuordnung des Phytoen über die

Retentionszeit von 29,1 Min im Serum eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato

gezeigt, welcher zu Beginn der Studie in Woche 0 nicht supplementiert war. Die

Zunahme des Phytoengehalts im Serum desselben Probanden nach 12-wöchiger

Supplementierung mit dem Oleoresin Lyc-o-Mato � ist in Abbildung 3.5 zu erkennen.

Abb. 3.5: HPLC-Chromatogramm des Serum-Extraktes eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato in Woche 12 nach Supplementierung bei � = 276 nm und T = 20 °C. Die Zunahme vonPhytoen (1) gegenüber der Woche 0 (Abb. 3.4) ist zu erkennen (tr = 29,1 Min).

Phytofluen ließ sich ebenso wie Phytoen eindeutig über die Retentionszeiten

bei 24 Minuten und 25 Minuten identifizieren. Die Signale des Phytofluen im Serum

Zeit (Min)

0 10 20 30

1

Abso

rptio

n (2

76 n

m)

3. Ergebnisse

42

des Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato zu Beginn der Studie und nach 12 Wochen

sind in Abbildung 3.6 und 3.7 dargestellt. Es fällt auf, dass das Isomerenmuster des

Standards mit dem Muster des Serums übereinstimmt. Das Phytofluensignal bei 25

Min dominiert über das Signal bei 24 Min. Dies gilt für nahezu alle untersuchten

Standards und Seren. Das Verhältnis Signalhöhe (tr = 25 Min) / Signalhöhe (tr = 24

Min) beträgt 2,3 � 0,8. Es zeigte sich dabei, dass ein Trend zur Zunahme des

zweiten Signals in den Seren nach Supplementierung besteht.

Abb. 3.6: HPLC-Chromatogramm des Serum-Extraktes eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato vor Supplementierung bei � = 348 nm und T = 20 °C. Es lassen sich die Phytofluen-Isomeren (2) nachweisen (tr = 24,0 und 25,4 Min).

Zeit (Min)

0 10 20 30

Abso

rptio

n (3

48 n

m)

2

3. Ergebnisse

43

Abb. 3.7: HPLC-Chromatogramm des Serum-Extraktes eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato nach 12 Wochen Supplementierung bei � = 348 nm und T = 20 °C. Eine starkeZunahme des Phytofluengehaltes (2) wird beobachtet (tr = 24,1 und 25,4 Min).

Sowohl bei einer Detektionswellenlänge von 276 nm als auch bei 348 nm zeigen die

Chromatogramme basisliniengetrennte Signale für Phytoen und Phytofluen. Eine

Zuordnung anderer Signale bei 276 nm und 348 nm war nicht möglich.

Phytofluen zeichnet sich durch eine ausgeprägte Fluoreszenz bei einer

Wellenlänge von 480 nm aus, wenn die Verbindung bei 348 nm angeregt wird.

Weitere Verbindungen der Carotin-Klasse wie Neurosporin und Tetrahydrolycopin

besitzen ebenso die Fähigkeit zu fluoreszieren. Daher wurde während der Analytik

der Seren mit dem HPLC-System B nach der UV-Detektion eine

Fluoreszenzdetektion in Reihe geschaltet (Abb. 3.8). Eine sehr stark ausgeprägte

Fluoreszenz zeigten Retinol bei einer Retentionszeit von 6 Min (überprüft durch

einen externen Standard) und Phytofluen bei 25 Min. Unter diesen Bedingungen

waren keine weiteren Signale mit entsprechend hoher Fluoreszenz zu beobachten.

0 10 20 30

Zeit (Min)

Abso

rptio

n (3

48 n

m)

2

3. Ergebnisse

44

Es ließen sich zwei Signale im Retentionszeitfenster des Phytofluen feststellen, die

dem Isomerenmuster des Phytofluen bei der UV-Detektion entsprachen. Jedoch

betrug das Verhältnis der Signalhöhe (tr = 25 Min) / Signalhöhe (tr = 24 Min) etwa 10

und ist somit um das 5-fache höher als bei der UV-Detektion.

Abb. 3.8: HPLC-Chromatogramm des Serum-Extraktes eines Probanden der Gruppe Lyc-o-Mato vor Supplementierung bei ��(Anregung) = 348 nm, � (Emission)�= 480 nm und T = 20 °C.Phytoen (2) und Retinol (3) lassen sich zuordnen.

Das entwickelte Trennsystem (HPLC-System B) eignete sich bei einer

Detektionswellenlänge von 450 nm auch für die Bestimmung der Carotine Lycopin,

�-Carotin und ß-Carotin.

In Abbildung 3.9 ist die Trennung des Lycopin und des ß-Carotin nach

Chromatographie eines Extraktes der Lycopinkarotte dargestellt.

Zeit (Min)

0 10 20

Fluo

resz

enz-

Emis

sion

(480

nm

)

2

3

3. Ergebnisse

45

Abb. 3.9: HPLC-Chromatogramm des Extraktes der Lycopinkarotte; � = 450 nm, T = 20 °C;Lycopin (1) mit tr = 12,6 Min und ß-Carotin (2) mit tr = 19,6 Min lassen sich detektieren.

Bei einer Wellenlänge von 450 nm wurden die Hauptcarotinoide Lycopin bei

einer Retentionszeit von 12,6 Min und ß-Carotin bei einer Retentionszeit von 19,6

Min detektiert. Andere Carotinoide wurden nicht nachgewiesen. Die Analysenzeit

betrug 25 Min.

Es wurde weiterhin überpüft, ob diese Methode auch für andere carotinreiche

Lebensmittel anzuwenden ist. Eine Probe einer karottenhaltigen Baby-Nahrung mit

Kartoffeln wurde dazu gleichermaßen extrahiert und mit HPLC-System B

chromatographiert (Abb. 3.10).

Lycopin wurde nicht detektiert. ß-Carotin sowie �-Carotin ließen sich bei einer

Retentionszeit von 19,5 Min und 18,0 Min nachweisen.

Abso

rptio

n (4

50 n

m)

0 10 20

Zeit (Min) a aa

1

2

3. Ergebnisse

46

Abb. 3.10: HPLC-Chromatogramm des Extraktes der karottenhaltigen Baby-Nahrung; � =450 nm, T = 20 °C; �-Carotin (1) mit tr = 18,0 Min und ß-Carotin (2) mit tr = 19,5 Minwurden bestimmt.

Hinsichtlich der Quantifizierung der Carotine bei 450 nm wurden die gleichen

Kriterien verwendet wie bei Gärtner (1997) beschrieben. Es wurden

Kalibrierfunktionen mit einem Korrelationskoeffizient von mindestens r = 0,999

verwendet.

0 10 20

Zeit (Min)

Abso

rptio

n (4

50 n

m)

1

2

3. Ergebnisse

47

3.2 Interventionsstudie

3.2.1 Studiendesign

In mehreren Interventionsstudien ist bereits gezeigt worden, dass eine erhöhte

Aufnahme von Carotinoiden – insbesondere von ß-Carotin und Lycopin – einen

Schutz vor dem UV-induzierten Erythem vermittelt. Der Verzehr von Tomatenpaste

als Quelle für Lycopin hatte so die Bildung eines Erythems nach Bestrahlung mit

einem Solarsimulator signifikant vermindert. Es sollte nun untersucht werden, ob die

tägliche Zufuhr verschiedener Lycopinquellen wie ein synthetisches Lycopinpräparat

(Kapselsupplement), ein Tomatenextrakt auf einer Oleoresin-Basis

(Kapselsupplement, Lyc-o-Mato �), ein Tomatenextrakt in einer wässerig

dispergierten Form (Getränk, Lyc-o-Guard �) und ein Saft hergestellt aus einer

Karotte, die neben ß-Carotin auch Lycopin enthielt (Lycopinkarotte), einen

vergleichbaren UV- protektiven Effekt bewirkt. Dazu sollten die Carotinoidgehalte in

der Haut und die Carotinoidgehalte im Serum während der Studien bestimmt werden.

Als Maß für die Schutzwirkung wurde der Rötungswert vor und 24 Stunden nach der

Bestrahlung ermittelt. Das Studiendesign ist in Abb. 3.11 wiedergeben.

Supplementierung 2 x täglich

Woche

0 4 12Blutabnahme

Reflexionsmessungder Haut

Solarbestrahlung

Erythemmessung (vor und 24 h nach Bestrahlung)

Abb. 3.11: Studiendesign der Interventionsstudie. Während der Studie mitlycopinhaltigen bzw. lycopin- und ß-carotinhaltigen Nahrungsergänzungen wurden zuausgesuchten Zeitpunkten Blutabnahmen für die Carotinoidanalytik,Reflexionsmessungen zur Carotinoidbestimmung in der Haut und die Bestrahlungenmit dem Solarsimulator durchgeführt. Die Bestimmung des Erythems erfolgte durchMessung des Rötungswertes vor und 24 h nach der Bestrahlung (�a-Wert).

3. Ergebnisse

48

Die täglichen Aufnahmemengen der einzelnen Carotinoide in den

Studiengruppen sind in Tabelle 3.1 dargestellt. Die Angaben errechnen sich aus den

Gehaltsangaben des Herstellers. Die Carotinoidgehalte im Saft der Lycopinkarotte

wurden in eigenen Untersuchungen bestimmt (3.1.2).

Tab. 3.1. Tägliche Aufnahmemengen von Carotinoiden in der Interventionsstudie

Carotinoid Gruppe Lycopin

Gruppe Lyc-o-Mato

Gruppe Lyc-o-Guard

GruppeLycopinkarotte #

(mg/Tag)

Lycopin 10,2 9,8 8,2 10,0

ß-Carotin 5,1

Phytofluen 0,8 3,2 0,4

Phytoen 1,0 4,6 1,9

# eigene Untersuchungen

Die aufgenommenen Mengen Lycopin lagen zwischen 8 und 10 mg pro Tag

und sind somit in den verschiedenen Gruppen vergleichbar. Alle natürlichen Quellen

für Lycopin (Tomatenextrakt und Lycopinkarotte) enthielten als weitere Carotinoide

Phytofluen und Phytoen. Ersteres wurde zwischen 0,4 und 3,2 mg pro Tag

aufgenommen und letzteres zwischen 1,0 und 4,6 mg pro Tag. Den höchsten Gehalt

an Phytoen und Phytofluen wies dabei das Tomatenextrakt-Getränk Lyc-o-Guard �

auf. Zusätzliches ß-Carotin wurde nur mit dem Saft der Lycopinkarotte in einer

Menge von 5,1 mg pro Tag aufgenommen.

3. Ergebnisse

49

3.2.2 Carotinoide im Serum

Die im Serum bestimmten Carotinoidgehalte sind in Tab. 3.2 bis 3.5

zusammengefasst.

In keiner der untersuchten Gruppen veränderten sich die Gehalte der

Xanthophylle Lutein, Zeaxanthin und ß-Cryptoxanthin im Serum signifikant während

der Studie. Die Gehalte waren zwischen den Gruppen vergleichbar für Lutein von

0,11 � 0,06 µM bis 0,18 � 0,05 µM, für Zeaxanthin von 0,02 � 0,01 bis 0,06 � 0,02

µM und für ß-Cryptoxanthin von 0,16 � 0,11 µM bis 0,21 � 0,17 µM.

�-Carotin im Serum war während der Studie nahezu konstant in der Gruppe

Lycopin und der Gruppe Lyc-o-Guard von 0,10 � 0,05 µM bis 0,15 � 0,08 µM. Ein

nicht signifikanter Anstieg wurde in der Gruppe Tomaten Oleoresin von 0,17 � 0,13

µM zu Beginn der Studie bis 0,29 � 0,47 µM nach Woche 12 festgestellt. Eine leichte,

aber statistisch signifikant Zunahme von 0,06 � 0,05 µM (Woche 0) auf 0,11 � 0,05

µM konnte hingegen für die Gruppe Lycopinkarotte beobachtet werden (P < 0,05).

ß-Carotin im Serum nahm in der Gruppe Lycopin von 0,39 � 0,20 µM auf 0,29

� 0,22 µM nach Woche 12 ab (P < 0,05). Eine nicht signifikante Zunahme wurde in

der Gruppe Lyc-o-Mato von 0,44 � 0,29 auf 0,72 � 0,89 µM nach 12 Wochen

beobachtet. Hingegen ist die Zunahme in der Gruppe Lyc-o-Guard von 0,30 � 0,13

µM auf 0,45 � 0,16 nach 12 Wochen statistisch signifikant (P < 0,05). Ebenfalls

signifikant war der Anstieg in der Gruppe Lycopinkarotte; hier nahm der Gehalt von

0,20 � 0,13 µM auf 0,34 � 0,19 µM zu (P < 0,001).

Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden zwischen den

Lycopingehalten im Serum der einzelnen Gruppen zu Beginn der Studie festgestellt.

Es wurde ein mittlerer Lycopingehalt mit 0,32 � 0,17 µM berechnet. Lycopin zeigte in

allen Gruppen schon nach 4 Wochen eine signifikante Zunahme gegenüber Woche 0

und eine im Mittel etwa 2-fache Steigerung des Basiswertes nach 12 Wochen.

Statistisch signifikant ist die Zunahme in jeder Gruppe.

In der Gruppe Lycopin ließ sich eine 2,2-fache Zunahme von 0,28 � 0,15 µM

auf 0,62 � 0,17 µM beobachten (P < 0,001). In der Gruppe Lyc-o-Mato nahm der

Lycopingehalt von 0,28 � 0,13 µM auf 0,55 � 0,19 µM um das 2-fache und in der

Gruppe Lyc-o-Guard von 0,37 � 0,0,17 µM auf 0,88 � 0,26 µM um das 2,4-fache zu

3. Ergebnisse

50

(P < 0,002). Gesteigert wurde der Lycopingehalt in der Gruppe Lycopinkarotte um

das 1,6-fache von 0,36 � 0,23 µM auf 0,58 � 0, 25 µM (P < 0,05). Die nach 12

Wochen Supplementierung erhaltenen Lycopingehalte im Serum unterschieden sich

nicht signifikant zwischen den Gruppen. Ausnahme war die Gruppe Lyc-o-Guard.

Hier wurde mit 0,88 µM ein höherer Gehalt an Lycopin als in den anderen Gruppen

gefunden (P < 0,05).

Der Phytofluengehalt im Serum lag im Vergleich aller Studiengruppen zu

Beginn zwischen 0,23 � 0,11 und 0,44 � 0,18 µM mit einem Mittelwert von 0,32 �

0,16 µM (n = 35). In der Gruppe Lycopin war kein Anstieg während der Studiendauer

zu beobachten. In allen anderen Gruppen nahm der Phytofluengehalt schon ab der

Woche 4 signifikant zu. Bezogen auf die Woche 0 wurden in der Gruppe Lyc-o-Mato

eine 2,1-fache Steigerung von 0,44 � 0,18 µM auf 0,94 � 0,52 nach Woche 12

beobachtet (P < 0,02), in der Gruppe Lyc-o-Guard eine 3,2-fache Steigerung von

0,27 � 0,16 µM auf 0,87 � 0,39 µM (P < 0,001) und in der Gruppe Lycopinkarotte

eine Steigerung um das 3,8-fache von 0,23 � 0,11 µM auf 0,87 � 0,53 µM (P < 0,05).

Der Vergleich der Phytofluengehalte in den einzelnen Gruppen untereinander

verdeutlicht, dass sich die Serumkonzentrationen in den Gruppen nach 12 Wochen

Supplementierung statistisch signifikant nur im Vergleich zur Gruppe Lycopin

unterscheiden (Gruppe Lyc-o-Mato mit P < 0,01, Gruppe Lyc-o-Guard mit P < 0,05

und Gruppe Lycopinkarotte mit P < 0,05).

Die Phytoengehalte im Serum waren zu Beginn der Studie niedriger als die

Phytofluenwerte und betrugen im Mittel 0,08 � 0,04 µM (n = 26). Eine signifikante

Zunahme des Phytoengehaltes während der Studie konnte nur in 2 Gruppen

beobachtet werden. In der Gruppe Lyc-o-Mato stieg der Gehalt um das 1,8-fache von

0,08 � 0,03 µM auf 0,14 � 0,10 µM nach 12 Wochen an (P < 0,05). Eine 2,3-fache

Steigerung wurde in der Gruppe Lyc-o-Guard von 0,08 � 0,06 µM auf 0,18 � 0,11

festgestellt (P < 0,02). In der Gruppe Lycopinkarotte nahm der Gehalt statistisch nicht

signifikant von 0,05 � 0,01 µM auf 0,17 � 0,12 µM zu. Kein Anstieg wurde in der

Gruppe Lycopin beobachtet.

3. Ergebnisse

51

Tab. 3.2: Carotinoidgehalte im Serum der Gruppe Lycopin (n = 12)

Carotinoidgehalt (µM)Woche

0 4 12

Lutein 0,11 � 0,06 0,13 � 0,08 0,12 � 0,04

Zeaxanthin 0,02 � 0,01 0,04 � 0,03 0,04 � 0,02

ß-Cryptoxanthin 0,17 � 0,11 0,21 � 0,17 0,18 � 0,17

Lycopin 0,28 � 0,15 0,61 � 0,29 * 0,62 � 0,17 *

�-Carotin 0,10 � 0,05 0,10 � 0,06 0,10 � 0,06

ß-Carotin 0,39 � 0,20 0,31 � 0,27 0,29 � 0,22

Phytofluen 0,33 � 0,15 0,32 � 0,20 0,31 � 0,15

Phytoen 0,08 � 0,03 0,07 � 0,04 0,07 � 0,03

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,001

Tab. 3.3: Carotinoidgehalte im Serum der Gruppe Lyc-o-Mato (n = 12)


0 4 12Lutein 0,17 � 0,05 0,14 � 0,08 0,14 � 0,04

Zeaxanthin 0,05 � 0,02 0,04 � 0,02 0,05 � 0,02

ß-Cryptoxanthin 0,20 � 0,13 0,23 � 0,13 0,17 � 0,10

Lycopin 0,28 � 0,13 0,55 � 0,19 **** 0,55 � 0,19 ****

�-Carotin 0,17 � 0,13 0,14 � 0,11 0,29 � 0,47

ß-Carotin 0,44 � 0,29 0,49 � 0,54 0,72 � 0,89

Phytofluen 0,44 � 0,18 0,73 � 0,25 ** 0,94 � 0,52 **

Phytoen 0,08 � 0,03 0,14 � 0,06 *** 0,14 � 0,10 *

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P > 0,05** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,02*** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,005**** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,001

3. Ergebnisse

52

Tab. 3.4: Carotinoidgehalte im Serum der Gruppe Lyc-o-Guard (n = 12)


0 4 12Lutein 0,14 � 0,06 0,14 � 0,08 0,13 � 0,07

Zeaxanthin 0,05 � 0,03 0,05 � 0,02 0,04 � 0,01

ß-Cryptoxanthin 0,20 � 0,13 0,16 � 0,11 0,17 � 0,11

Lycopin 0,37 � 0,17 0,84 � 0,26 *** 0,88 � 0,26 ****

�-Carotin 0,10 � 0,05 0,15 � 0,08 0,14 � 0,07

ß-Carotin 0,30 � 0,13 0,41 � 0,17 ** 0,45 � 0,16 *

Phytofluen 0,27 � 0,16 0,93 � 0,34 *** 0,87 � 0,39 ****

Phytoen 0,08 � 0,06 0,19 � 0,07 * 0,18 � 0,11*

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,02** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,005 *** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,002**** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,001

Tab. 3.5: Carotinoidgehalte im Serum der Gruppe Lycopinkarotte (n = 10)


0 4 12Lutein 0,18 � 0,05 0,17 � 0,05 0,17 � 0,04

Zeaxanthin 0,06 � 0,02 0,06 � 0,03 0,06 � 0,02

ß-Cryptoxanthin 0,19 � 0,08 0,19 � 0,09 0,16 � 0,06

Lycopin 0,36 � 0,23 0,58 � 0,17 ** 0,58 � 0,25 **

�-Carotin 0,06 � 0,05 0,09 � 0,03 0,11 � 0,05

ß-Carotin 0,20 � 0,13 0,38 � 0,19 *** 0,34 � 0,19

Phytofluen 0,23 � 0,11 1,01 � 0,56 * 0,87 � 0,53 *

Phytoen 0,05 � 0,01 0,27 � 0,18 0,17 � 0,12

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,05 ** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,005*** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,001

3. Ergebnisse

53

3.2.3 Bestimmung des Carotinoidgehaltes in der Haut

Es konnte gezeigt werden, dass sich unter Supplementierung mit

synthetischem Lycopin, Tomatenextrakten in Form eines Oleoresins oder eines

Getränkes oder mit dem Saft der Lycopinkarotte der Lycopingehalt im Serum der

Probanden ab der 4. Woche der Studie signifikant erhöhte. Mittels der

Reflektionsspektroskopie konnte die Zunahme der Carotinoidgehalte in dem

Zielgewebe Haut während der Studiendauer untersucht werden.

Die Gesamtcarotinoidgehalte der Haut wurden zu Beginn der Studie, nach 4

Wochen und 12 Wochen Supplementierung gemessen und sind in Tabelle 3.6

zusammengefasst.

Tab. 3.6: Gesamtcarotinoidgehalte der Haut während der Supplementierung

Carotinoidgehalt (nmol/g)Woche

0 4 12

Gruppe Lycopin 0,18 � 0,03 0,23 � 0,06 * 0,23 � 0,06 *

Gruppe Lyc-o-Mato

0,16 � 0,08 0,18 � 0,06 0,22 � 0,04 *

Gruppe Lyc-o-Guard

0,16 � 0,06 0,20 � 0,05 0,21 � 0,06

GruppeLycopinkarotte

0,16 � 0,06 0,20 � 0,05 0,21 � 0,06 **

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,005** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,002

3. Ergebnisse

54

Zu Beginn der Studie wies die Haut der Probanden in allen Gruppen einen

mittleren Carotinoidgehalt von 0,16 � 0,06 nmol/g auf, der sich im Mittel auf 0,22

nmol/g nach 12 Wochen Supplementierung erhöhte. Innerhalb der Gruppe Lyc-o-

Mato war der Anstieg nach 12 Wochen statistisch nicht signifikant.

3.2.4 Induktion und Messung des Erythems

Eine UV-Bestrahlung der Haut führt ab einer Schwellendosis zu einem

Erythem, die für jeden Probanden individuell verschieden ist und als minimale

Erythemdosis (MED) bezeichnet wird. Vor Beginn der Studie wurde für jeden

Studienteilnehmer die MED bestimmt. Während der Studie wurde das Erythem

anschließend durch die 1,25-fache MED induziert. Die individuelle Dosis wurde auch

nach 4 und 12 Wochen beibehalten und das Ausmaß der Rötung gemessen. Die zur

Erytheminduktion benötigten Dosen lagen zwischen 16 und 26 mJ/cm2 mit einer

gemittelten Dosis von etwa 20 mJ/cm2. Die Differenz des chromatometrisch

festgestellten Rötungswertes vor und 24 Stunden nach der Bestrahlung ergab den

�a-Wert als Indikator für das Ausmaß des Erythems.

Die für die einzelnen Studiengruppen bestimmten �a-Werte sind in Tabelle 3.7

aufgeführt. Der �a-Wert vor Beginn der Studie ist für alle Gruppen mit einem Wert

von etwa 5 ähnlich; ausgenommen in der Gruppe Lycopin mit einem Wert von 3,5.

Innerhalb jeder Gruppe zeigte sich eine Abnahme der �a-Werte in Woche 4 und 12

und weist somit auf einen UV-Schutz hin. Für die Gruppe Lycopin sank der �a-Wert

statistisch nicht signifikant von 3,5 � 1,7 auf 2,5 � 2,7 nach 12 Wochen. Statistisch

signifikant war die Abnahme in der Gruppe Lyc-o-Mato von 5,2 � 0,8 auf 3,2 � 1,4 (P

< 0,001), in der Gruppe Lyc-o-Guard von 4,9 � 1,6 (P < 0,001) auf 2,4 � 1,7 und in

der Gruppe Lycopinkarotte von 5,0 � 1,8 auf 2,7 � 1,7 (P < 0,005). Dies entsprach

einer Erythemminderung zwischen 29 und 46 % (Tab. 3.8).

Tabelle 3.7 gibt die �a-Werte während der Supplementierung über 12 Wochen

in den Gruppen bezogen auf die Woche 0 (100 %) wieder.

3. Ergebnisse

55

Tab. 3.7: Chromatometrisch ermittelte a-Werte der Haut (Rücken) in der Interventionsstudienach Supplementierung über 12 Wochen.

Woche

a- Wert 0 4 12

Gruppe Lycopin

vor Bestrahlung 8,2 � 1,7 8,2 � 1,7 8,1 � 2,024 h nach Bestrahlung 11,7 � 2,0 11,4 � 1,6 10,7 � 1,6

� a 3,5 � 1,7 3,2 � 2,0 2,5 � 2,3

Gruppe Lyc-o-Mato


� a 5,2 � 0,8 4,1 � 1,7 ** 3,2 � 1,4 ***

Gruppe Lyc-o-Guard


� a 4,9 � 1,6 4,4 � 2,7 2,4 � 1,7 ***

Gruppe Lycopinkarotte


� a 5,0 � 1,8 3,6 � 2,3 2,7 � 1,7 *

* signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,01** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,001*** signifikant unterschiedlich zur Woche 0; P < 0,005

3. Ergebnisse

56

Abb. 3.12: Erythemminderung nach Supplementierung über 12 Wochen in den einzelnenGruppen. Dargestellt ist die Abnahme der �a-Werte in (%) bezogen auf den �a-Wert inWoche 0 (100%). Schwarze Balken: Woche 0, graue Balken: Woche 4, offene Balken:Woche 12; * signifikant unterschiedlich zur Woche 0 (P < 0, 01), ** signifikant unterschiedlichzur Woche 0 (P < 0,005), *** signifikant unterschiedlich zur Woche 0 (P < 0,001).

Die Erythemminderung nach 12 Wochen Supplementierung lässt sich

ausgehend von den dargestellten Abnahmen der �a-Werte in Abb. 3.12 für die

einzelnen Gruppen in Tab. 3.8 zusammenfassen.

Tab. 3.8: Erythemminderung (%) in der Interventionsstudie nach 12 Wochen bezogen aufWoche 0 (100%).

Erythemminderung (% )

Gruppe Lycopin 29Gruppe Lyc-o-Mato 38Gruppe Lyc-o-Guard 51Gruppe Lycopinkarotte 46

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Gruppe Lycopin Gruppe Lyc-o-Mato Gruppe Lyc-o-Guard Gruppe Lycopinkarotte

� a

(%)

**

*** *** *

3. Ergebnisse

57

3.3 Carotinoidgehalt eines Lycopinkarotten-Safts und anderer lycopin- und ß-carotinreicher Lebensmitteln

Aus den Carotinoidgehalten der in der Studie verwendeten Supplemente und

des Lycopinkarotten-Saftes wurden die täglichen Carotinoiddosen errechnet. Dabei

wurden für die Supplemente die Angaben des Herstellers verwendet. Nur für die Lyc-

o-Mato � Kapseln und für den Lycopinkarotten-Saft war eine Bestimmung der

Carotinoide möglich. Die dabei ermittelten Gehalte entprachen den

Herstellerangaben (Tab. 3.1).

Die Datenlage für die Gehaltsangaben von Carotinoiden in Lebensmitteln ist

bislang auf die bekannten physiologisch relevanten Carotinoide Lutein, Zeaxanthin,

ß-Cryptoxanthin, Lycopin, �- und ß-Carotin beschränkt. Im Zusammenhang mit den

hier erhobenen Daten zur Bioverfügbarkeit von Phytoen und Phytofluen (s. 3.1.2)

stellte sich die Frage, ob auch andere kommerziell erhältliche Lebensmittel, die reich

an Lycopin und ß-Carotin sind, physiologisch relevante Mengen an diesen Carotinen

besitzen. Daher wurden ein herkömmlicher Tomaten-Saft (Pulpe), ein

Tomatenkonzentrat (Tomatenmark) und eine Baby-Nahrung aus Karotten und

Kartoffeln als Vertreter eines diätetischen Lebensmittels auf ihren Carotinoidgehalt

untersucht.

Für jedes dieser Lebensmittel sind die Carotinoidgehalte in den Tabellen 3.9

und 3.10 angegeben.

Der Gehalt an Carotinoiden im Saft der Lycopinkarotte änderte sich während

der Lagerung nicht, so dass der Saft für mindestens 12 Wochen im ungeöffneten,

kühlen und lichtgeschützten Zustand als haltbares Lebensmittel anzusehen war.

Lycopin wies im Saft der Lycopinkarotte den höchsten Gehalt auf. Bezieht

man die übrigen Gehalte prozentual auf Lycopin (100 %), so betrug der Anteil an ß-

Carotin 50,0 %, Phytoen 16,4 % und an Phytofluen 3,5 % (Tab. 3.9).

3. Ergebnisse

58

Tab. 3.9: Carotinoidgehalt des Lycopinkarotten-Saftes vor Beginn der Studie undnach 12 Wochen Lagerung (n = 3)

Carotinoidgehalt (mg/l)

vor der Studie nach der Studie

Lycopin 25,6 � 4,3 24,6 � 2,3

ß-Carotin 12,8 � 2,7 12,9 � 0,4

�-Carotin n.d. n.d.

Phytoen 4,2 � 1,1 4,3 � 0,8

Phytofluen 0,9 � 0,4 1,0 � 0,2

n.d. nicht detektierbar

Ein Vergleich mit anderen Lebensmitteln zeigte, dass Lycopin in den

Tomatenprodukten das dominierende Carotinoid ist (Tab. 3.10). Auch die Gehalte an

Phytoen, Phytofluen und ß-Carotin sind hoch. Die prozentualen Anteile bezogen auf

Lycopin (100 %) ließen sich für den Tomaten-Saft berechnen zu: Phytoen 10,8 %,

Phytofluen 6,8 % und ß-Carotin 2,7 %. Vergleichbare Anteile wurden für das

Tomatenkonzentrat bestimmt mit: Phytoen 11,1 %, Phytofluen 6,5 % und ß-Carotin

2,4 %. �-Carotin wurde nicht detektiert.

In der Baby-Nahrung, die nur Karotten als Carotinoidquelle aufwies, stellte ß-

Carotin das Hauptcarotinoid dar. Lycopin wurde nicht nachgewiesen. Einen sehr

hohen Anteil machte das �-Carotin mit 43 % des Hauptcarotinoids aus. Die relativen

Anteile an Phytoen und Phytofluen betrugen 10,8 % und 4,6 %.

3. Ergebnisse

59

Tab. 3.10: Carotinoidgehalt eines herkömmlichen, kommerziellen Tomaten-Saftes,eines Tomatenkonzentrats und einer Baby-Nahrung aus Kartoffeln und Karotten (n = 3)

Carotinoidgehalt (mg/kg)

Tomaten-Saft # Tomatenkonzentrat Baby-Nahrung

Lycopin 74,0 � 4,5 404,2 � 24,1 n.d.

ß-Carotin 1,9 � 0,4 9,8 � 2,0 92,7 � 9,0

�-Carotin n.d. n.d. 39,9 � 3,3

Phytoen 8,6 � 2,1 45,1 � 4,2 10,3 � 1,0

Phytofluen 5,0 � 0,1 26,3 � 0,7 4,3 � 0,9

# in (mg/l) n.d. nicht detektierbar

3. Ergebnisse

60

3.4 Zellkultur

Die Ergebnisse der Interventionsstudie zeigten, dass die Gabe von Lycopin

mit einem Anstieg des Carotinoids im Blut verbunden ist und damit eine Minderung

des UV-induzierten Erythems korreliert ist. Dieser protektive Effekt wurde auch nach

Gabe von Gemischen beobachtet, die aus Lycopin, Phytoen, Phytofluen und ß-

Carotin in verschiedenen Formulierungen bestanden.

Mit Hilfe eines Hautzellenmodells sollte untersucht werden, inwieweit die

photoprotektiven Effekte in Fibroblasten- und Keratinozytenkulturen mit den

Einzelsubstanzen Lycopin, Phytoen und Phytofluen in vitro nachvollzogen werden

können.

Die in der Interventionsstudie beobachtete Erythembildung in der Haut 24

Stunden nach der Bestrahlung stellt eine Reaktion auf UV B- aber auch auf UV A-

induzierten Stress des Zellgewebes dar.

Hautfibroblasten reagieren als Bindegewebszellen auf UV A-induzierten

Stress über komplexe Signalwege mit einer gesteigerten Expression des Enzyms

Kollagenase (MMP-1), welche extrazelluläres Kollagen abbaut und so in vivo

schließlich zur lichtinduzierten Hautalterung beiträgt.

Immunkompetente Keratinozyten geben nach UV-Stimulation Zytokine wie

das Interleukin-6 (IL-6) extrazellulär ab.

Der Einfluß von Lycopin, Phytoen und Phytofluen auf die beschriebenen UV-

induzierten Reaktionen sollte in den genannten Zellkulturen überprüft werden.

3.4.1 MMP-1- Expression in Fibroblasten nach UV-Bestrahlung

Konfluente Fibroblastenkulturen wurden mit UV A (30 J/cm2) bestrahlt und die

Menge an MMP-1 nach 24 Stunden im Zellüberstand mittels ELISA gemessen. Die

Zellen wurden zuvor mit den Carotinoiden im Konzentrationsbereich von 0,03 - 5,0

µM (Endkonzentration im Medium) für 16, 24 und 48 Stunden prä-inkubiert.

3. Ergebnisse

61

3.4.1.1 Inkubation mit Lycopin

Fibroblasten wurden mit Lycopin für 16, 24 und 48 Stunden inkubiert.

Unbehandelte und unbestrahlte Fibroblastenkulturen dienten als Negativkontrolle,

während unbehandelte und bestrahlte Kulturen als Positivkontrolle verwendet

wurden. Die gebildeten Mengen an MMP-1 24 Stunden nach der Bestrahlung sind in

Tabelle 3.11 aufgeführt. Die Angaben sind in (%) ausgedrückt und auf die

Negativkontrolle (100 %, n = 39) bezogen.

Tab. 3.11: MMP-1-Bildung in Fibroblasten nach 16, 24 und 48 h Prä-Inkubation mit Lycopinmit und ohne UV A –Bestrahlung. Für die Negativkontrolle wurden n = 39 und für die übrigenUntersuchungen n = 3-12 Experimente durchgeführt.

MMP-1-Bildung (% der Negativkontrolle)

16 h 24 h 48 h

Negativkontrolle(unbehandelt,unbestrahlt)

100,0 � 17,9 100,0 � 29,8 100,0 � 33,2

Positivkontrolle(unbehandelt, bestrahltmit UV A)

266,4 � 27,3 579,9 � 50,3 700,0 � 45,1

0,1 µM 146,5 � 17,9 n.b. n.b.

5,0 µM 144,2 � 17,1 n.b. n.b.

0,03 µM + UV A n.b. 536,1 � 75,7 734,3 � 131,7

0,1 µM + UV A 416,6 � 34,3 486,7 � 214,5 512,2 � 80,5

5,0 µM + UV A 405,5 � 86,7 467,1 � 39,2 242,5 � 23,3

n.b. nicht bestimmt

In den hier verwendeten Hautfibroblasten wurde durch die Bestrahlung mit UV

A (30 J/cm2) die MMP-1- Synthese im Vergleich zu unbehandelten und unbestrahlten

Kulturen stimuliert. In Abhängigkeit der Prä-Inkubationszeit betrug die Stimulation

3. Ergebnisse

62

nach 16 Stunden das 2,7- fache , nach 24 Stunden das 5,8-fache und nach 48

Stunden das 7,0-fache der Kontrolle. Die Supplementierung der Fibroblasten mit

Lycopin in einer Konzentration von 0,1 µM und 5,0 µM für 16 Stunden ohne

anschließende Bestrahlung führte zu einer leichten Steigerung der MMP-1-Bildung

um das 1,5- bzw. 1,4-fache der Kontrolle. Nach Zugabe von 0,1 µM bzw. 5,0 µM

Lycopin und anschließender UV A-Bestrahlung ließ sich hingegen eine Steigerung

der MMP-1-Expression um das 4,2- fache und um das 4,1-fache feststellen. Die

MMP-1-Bildung war demnach in den mit Lycopin prä-inkubierten und UV A-

bestrahlten Kulturen höher als in der Positivkontrolle (Abb. 3.13).

In weiteren Ansätzen wurden Fibroblasten für 24 Stunden mit 0,03 µM, 0,1 µM

und 5,0 µM Lycopin versetzt und mit UV A bestrahlt. Die MMP-Stimulation bei einer

Konzentration von 0,03 µM unterschied sich nicht signifikant von der Positivkontrolle.

Eine geringere Stimulation war bei den höheren Konzentrationen von 0,1 und 5,0 µM

Lycopin messbar (Abb. 3.14).

Eine deutliche Verminderung der MMP-1-Bildung ließ sich nach einer Prä-

Inkubationszeit von 48 Stunden bei Konzentrationen von 0,1 und 5,0 µM Lycopin

feststellen. Die Abnahme der Stimulation von dem 7,0-fachen (Positivkontrolle) auf

das 5,1- bzw. 2,4-fache der unbehandelten und unbestrahlten Negativkontrolle war

statistisch signifikant (Abb. 3.15).

Abb. 3.13: MMP-1–Bildung in Fibroblasten nach 16 h Inkubation mit Lycopin und UV A–Bestrahlung.

0100200300400500600700800

Kontrolle 0,1 µM 5,0 µM UVA 0,1 µM +UVA

5,0 µM +UVA

MM

P-1

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

63

Abb. 3.14: MMP-1–Bildung in Fibroblasten nach 24 h Inkubation mit Lycopin und UVA–Bestrahlung.

Abb. 3.15: MMP-1–Bildung in Fibroblasten nach 48 h Inkubation mit Lycopin und UVA–Bestrahlung.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Kontrolle UVA 0,03 µM +UVA

0,1 µM +UVA

5,0 µM +UVA

MM

P-1

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

0100200300400500600700800900

1000

Kontrolle UVA 0,03 µM +UVA

0,1 µM +UVA

5,0 µM +UVA

MM

P-1

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

64

3.4.1.2 Inkubation mit Phytoen/Phytofluen

Fibroblasten wurden mit einem Gemisch aus Phytoen und Phytofluen

(Massenverhältnis 10 : 1) für 2,5 und 16 Stunden prä-inkubiert und die Zellen

anschließend mit UV A bestrahlt. Phytofluen besitzt ein Absorbtionsspektrum mit

einem Maximum bei 320 nm, das dem Intensitätsmaximum des hier benutzten UV A-

Strahlers bei 316 nm entspricht. Um einen möglichen protektiven Effekt auf die MMP-

1-Bildung aufgrund eines UV-Filtereffekts zu untersuchen, wurde eine kurze Prä-

Inkubationszeit von 2,5 Stunden gewählt. Mit dieser kurzen Verweilzeit im

Zellkulturmedium sollte gewährleistet sein, dass Phytofluen nicht abgebaut wird.

Tabelle 3.12 gibt die Bildung des MMP-1 bezogen auf die Kontrolle (100 %)

nach 24 Stunden post Exposition wieder (n = 3). Positivkontrolle sind UV A–

bestrahlte Zellen. Eine 1,9-fache und 2,0-fache Steigerung der MMP-1-Bildung

wurde nach 2,5 und nach 16 Stunden gegenüber der Negativkontrolle beobachtet.

Die Stimulation der Positivkontrolle lag daher bei diesen Untersuchungen niedriger

als zuvor beschrieben wurde (s. 3.4.1.1). Nach einer Prä-Inkubationszeit von 2,5

Stunden (Abb. 3.16) wiesen Kulturen, die mit Phytoen/Phytofluen im

Konzentrationsbereich von 0,1 µM bis 2,0 µM inkubiert wurden, gegenüber der

Positivkontrolle keine gesteigerten MMP-1-Expressionen auf. Kulturen, die nach der

Inkubation mit Phytoen/Phytofluen bestrahlt wurden, bildeten die gleiche Menge an

MMP-1 wie die Positivkontrolle. Vergleichbare Ergebnisse wurden für Experimente

mit Prä-Inkubationszeiten von 16 Stunden erhalten (Abb. 3.17).

3. Ergebnisse

65

Tab. 3.12: MMP-1-Bildung in Fibroblasten nach 2,5 und 16 h Prä-Inkubation mitPhytoen/Phytofluen mit und ohne UV A–Bestrahlung; die Konzentrationsangaben sind aufPhytofluen bezogen.

MMP-1-Bildung(% der Negativkontrolle)

2,5 h 16 h

Negativkontrolle(unbehandelt,unbestrahlt)

100,0 � 17,2 100,0 � 7,4

Positivkontrolle(unbehandelt, UV A)

189,0 � 8,3 195,5 � 11,4

0,1 µM 130,7 � 17,2 68,2 � 6,2

1,0 µM 95,1 � 10,7 112,4 � 45,9

2,0 µM 85,5 � 1,6 131,5 � 26,1

0,1 µM + UV A 195,0 � 20,9 196,5

1,0 µM + UV A 181,6 � 13,2 200,7 � 27,7

2,0 µM + UV A 189,7 � 8,1 239,2 � 65,2

3. Ergebnisse

66

Abb. 3.16: MMP-1-Bildung in Fibroblasten nach 2,5 h Prä-Inkubation mit Phytoen/Phytofluen und UV A–Bestrahlung.

Abb. 3.17: MMP-1-Bildung in Fibroblasten nach 16 h Prä-Inkubation mit Phytoen/Phytofluen und UV A–Bestrahlung.

0

50

100

150

200

250

Kontrolle UVA 0,1 µM 1,0 µM 2,0 µM 0,1 µM +UVA

1,0 µM +UVA

2,0 µM +UVA

MM

P-1-

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

0

50

100

150

200

250

300

350

Kontrolle UVA 0,1 µM 1,0 µM 2,0 µM 0,1 µM +UVA

1,0 µM +UVA

2,0 µM +UVA

MM

P-1-

Bild

ung

(% d

er K

Ont

rolle

)

3. Ergebnisse

67

3.4.2 IL-6 Expression in Keratinozyten nach UV-Bestrahlung

Keratinozyten exprimieren sowohl nach UV B- als auch nach UV A-Exposition

das Zytokin IL-6. Zellkulturen wurden mit UV B (30 mJ/cm2) oder mit UV A (30 J/cm2)

bestrahlt. Der Einfluss von Lycopin und eines Gemischs aus Phytoen und Phytofluen

auf die IL-6-Expression nach einer UV-Bestrahlung sollte hier untersucht werden. Im

Zellüberstand wurde mittels ELISA der Gehalt an IL-6 ermittelt und vergleichbar mit

3.3.1 auf die unbehandelte und unbestrahlte Kontrolle normiert (100 %).

3.4.2.1 Voruntersuchungen mit HaCaT

In Kulturen der HaCaT-Zelllinie wurde zunächst der Einfluss von Lycopin

(1µM) und eines Gemisches aus Phytoen und Phytofluen (4 µM bezogen auf

Phytofluen) nach 24 Stunden Prä-Inkubation und anschließender UV A Bestrahlung

untersucht. Diese Keratinozyten lassen sich aufgrund ihres schnellen Wachstums

einfach kultivieren. Da HaCaT-Zellen sich im Differenzierungsverhalten von regulären

Keratinozyten unterscheiden, wurden die Versuche als Voruntersuchungen

angesehen.

Abb. 3.18: IL-6-Bildung in HaCaT-Zellen nach 24 h Inkubation mit Lycopin und UV A-Bestrahlung (n = 3).

0

50

100

150

200

250

300

Kontrolle 1,0 µM UVA UVA + 1,0 µM

IL-6

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

68

Abb. 3.19: IL-6-Bildung in HaCaT-Zellen nach 24 h Inkubation mit 4 µM Phytofluen und UVA-Bestrahlung (n = 2 - 5).

Die UV A-Bestrahlung in beiden Experimenten führte zu einer 1,7- und 1,5-

fachen Erhöhung der IL-6-Produktion im Vergleich zur Negativkontrolle. Die Prä-

Inkubation sowohl mit Lycopin (Abb. 3.18) als auch mit Phytoen/Phytofluen (Abb.

3.19) und folgender UV A-Bestrahlung verringerten die IL-6-Stimulation auf das 1,1-

fache bzw. auf das 0,9-fache der Negativkontrolle.

In unbestrahlten Kulturen beeinflusste die Inkubation der HaCaT-Zellen mit

Lycopin und Phytoen/Phytofluen die IL-6-Bildung statistisch nicht signifikant.

3.4.2.2 Untersuchungen mit Keratinozyten

Keratinozyten wurden mit 0,1 µM und 1,0 µM Lycopin für 24 Stunden prä-

inkubiert (n = 3). Der IL-6-Gehalt stieg in der Positivkontrolle nach einer UV B-

Bestrahlung von 30 mJ/cm2 um das 23-fache. Die Behandlung der Zellen mit 0,1 und

1,0 µM Lycopin bewirkte einen Anstieg des IL-6-Gehaltes um das 81- und 57-fache

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kontrolle 4 µM UVA UVA + 4 µM

IL-6

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

69

der Negativkontrolle. Hingegen zeigte in unbestrahlten Kulturen die Inkubation mit

1,0 µM Lycopin keinen Effekt (Abb. 3.20).

Abb. 3.20: IL-6 Bildung nach Prä-Inkubation mit 0,1 und 1,0 µM Lycopin und UV B-Bestrahlung (n = 3).

Die Prä-Inkubationen der Keratinozyten mit einem Gemisch aus Phytoen und

Phytofluen (1,0 und 2,0 µM bezogen auf Phytoen) hingegen führte nach einer UV B-

Bestrahlung zu einer 10-fachen Erhöhung des IL-6-Bildung im Vergleich zu einem

22-fachen Anstieg der IL-6-Produktion der Positivkontrolle. In unbestrahlten Kulturen

beeinflusste Phytoen/Phytofluen (2,0 µM) die IL-6-Expression im Vergleich zur

Negativkontrolle nicht (Abb. 3.21).

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

K ontrolle U V B 1,0 µM 0,1 µM +U V B 1,0 µM + U VB

IL-6

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

70

Abb. 3.21: IL-6 Bildung nach Prä-Inkubation mit 1,0 und 2,0 µM Phytoen/Phytofluen und UV-B-Bestrahlung.

0500

100015002000250030003500400045005000

Kontrolle UV B 2,0 µM 1,0 µM + UV B 2,0 µM + UV B

IL-6

Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

71

3.4.3 Carotinoidgehalte in Fibroblasten und Kulturmedium

Fibroblasten wurden mit Lycopin inkubiert wie in Kapitel 3.4.1 beschrieben.

Um die Wiederfindung des Lycopins im Zellkulturmedium und in den Fibroblasten zu

bestimmen, wurden Kulturen von Fibroblasten für 24 Stunden mit Lycopin in

Konzentrationen von 0,1 – 1,9 µM inkubiert. Sowohl im Zellkulturmedium als auch im

Zelllysat war nach 24 Stunden kein Lycopin nachweisbar (HPLC). Die

Wiederfindungen sind in Tab. 3.13 aufgeführt.

Zusätzlich wurden Dispersionen von Lycopin in Zellulturmedium mit

Konzentrationen von 0,12 – 11,0 µM hergestellt und anschließend der Gehalt mittels

HPLC überprüft. Aus den bestimmten Gehalten wurde die Wiederfindungen von

42 – 67 % berechnet.

Tab. 3.13: Wiederfindungen von Lycopin in Zellkultur

Lycopingehalt

Soll (µM) Ist (µM) Wiederfindung (%)

Medium 0,12 0,05 421,20 0,92 775,30 3,11 5911,00 7,38 67

FibroblastenkulturMedium, 24 h0,1 - 1,9 n.d.Zelllysat, 24 h0,1 - 1,9 n.d.n.d. nicht detektierbar

3. Ergebnisse

72

3.5 Unilamellare Liposomen

Carotinoide sind effektive Antioxidantien, die u.a. auch die Lipidperoxidation

hemmen. In unilamellaren Liposomen, die als Modellsystem einer Biomembran

gelten, sollten die antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden untersucht werden.

Die Lipidperoxidation wurde unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4 und 37 ° C)

durch Zusatz eines wasserlöslichen Radikalstarters 2,2´-Azo-bis-(amidinopropan)-hydrochlorid (AAPH) initiiert. Es wurde ein Meßverfahren etabliert, welches die

kontinuierliche Bildung der primären Oxidationsprodukte (Peroxylradikale) verfolgt.

Dazu wurde mittels einer photometrischen Methode die Zunahme der Absorption bei

einer Wellenlänge von 234 nm verfolgt, die ein Maß für die Bildung von konjugierten

Dienen (CD) ist. Die mit dem Phosphatidylcholin-Rest des verwendeten Lipids

veresterten Fettsäuren waren Linolsäuren (18:2); das Pentadien-System der

Linolsäure lässt sich leicht radikalisch unter H-Abstraktion angreifen, so dass ein

resonanzstabilisiertes Pentadienyl-Radikal resultiert. Das konjugierte Dien entsteht

schließlich durch Addition von Sauerstoff. Der Reaktionsweg zur Bildung des

konjugierten Diens aus der Linolsäure ist in Abbildung 3.21 wiedergegeben.

Abb. 3.21: Reaktionsschema zur Bildung des konjugierten Diens aus der Linolsäure (18:2)mit zwei isolierten Doppelbindungen.

R R R R• RR

OO•

´ ´ ´

O2

18:2 Pentadienyl-Radikal Konjugiertes Dien

mit R = -(CH2)7COO-

R´= -(CH)2-CH3

3. Ergebnisse

73

3.5.1 Charakterisierung der Liposomen

Die in dieser Studie verwendeten Liposomen wurden mittels einer Ultraschall-

technik hergestellt, um unilamellare Vesikel zu erhalten. Elektronenmikroskopische

Untersuchungen sollten klären, ob die hergestellten Liposomen aufgrund ihrer

Größe und ihrer Form unilamellare Liposomen sind und damit als Modell einer

Biomembran (Doppelmembran) angesehen werden können

Eine elektronenmikroskopische Aufnahme der Liposomen ist in Abbildung

3.22 dargestellt. Die Aufnahme zeigt bei einer Vergrößerung von etwa 21 000

gleichmäßig geformte Lipidvesikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von

180 nm (n = 6).

Abb. 3.22: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Liposomensuspension bei 21 000-facher Vergrößerung (Negativ-Färbung mit Phosphorwolframsäure). Die durchschnittlicheLiposomengröße beträgt 180 nm.

100 nm

3. Ergebnisse

74

3.5.2 Bildung der konjugierten Diene in unilamellaren Liposomen

Die Bildung der konjugierten Diene wurde kontinuierlich registriert. Die

erhaltenen Absorptions-Zeit-Kurven (Abb. 3.23) ließen sich in drei Bereiche

unterteilen. Dien- bzw. Peroxylradikal-Bildung fand zu Beginn der Reaktionen in

geringerem Maße statt (Initiationsphase I). Die Beschleunigung der Lipidperoxidation

war zeitlich verzögert (Kettenwachstumsphase II). Kettenabbruch bzw. Abnahme der

Dien-Bildung schließt an die lineare Kettenwachstumsphase an

(Kettenabbruchsphase III). Abbildung 3.23 gibt einen typischen Verlauf der

Lipidperoxidation wieder. Durch Extrapolation (lineare Phase II) wird der Schnittpunkt

mit der Abszisse bestimmt (�).� wird auch als lag-Phase bezeichnet und ist bei der

Anwesenheit von Antioxidantien verlängert und ist somit ein geeignetes Maß für die

antioxidative Wirkung von Substanzen (Cadenas und Sies, 1998).

Abb. 3.23: Bildung konjugierter Diene mit der Zeit: Initiationsphase I, KettenwachstumsphaseII und Kettenabbruchsphase III.

I II III

Zeit

Abs

orpt

ion

�

3. Ergebnisse

75

Die Ergebnisse der Bildung konjugierter Diene (CD) in den unilamellaren

Liposomen sind in Tabelle 3.14 dargestellt und sind bezogen auf die Kontrolle (ohne

Testsubstanz) in (%) � SD ausgedrückt. Ermittelt wurde die CD-Bildung aus den

Kurven zu den Zeitpunkten 30 Min, 60 Min und 120 Min nach Reaktionsstart durch

AAPH (10 mM) bei 37 °C. Neben den Carotinoiden ß-Carotin, Lycopin, Phytoen,

Lutein, Zeaxanthin und Astaxanthin wurden auch das natürlich vorkommende

Flavonoid Epicatechin und das Diphenylhexatrien in die Liposomen eingebaut.

Für die Kontrolle wurden n = 7 voneinander unabhängige Experimente und für

alle übrigen Testansätze mindestens n = 3 Experimente durchgeführt.

ß-Carotin mit einem Gehalt von 0,1 mol % in den Liposomen zeigte nach 30

Min eine Verringerung der CD-Bildung. Kein weiterer Unterschied zur Kontrolle

wurde zu anderen Zeitpunkten und mit einem höheren Gehalt von 0,5 mol %

beobachtet ( Abb. 3.24).

Lycopin bewirkte in allen getesteten Konzentrationen von 0,01 – 0,4 mol % im

Vergleich zur Kontrolle eine Zunahme der CD-Bildung. Mit ansteigender

Konzentration des Lycopins in den Liposomen erhöhte sich auch die Bildung der CD

(Abb. 3.25).

Phytoen führte zu einer deutlich verringerten Bildung an Dienen. Ein Gehalt

von 0,5 mol% bewirkte nach 120 Min eine Zunahme von 30 % der Kontrolle (Abb.

3.26).

Die Xanthophylle Zeaxanthin, Lutein und Astaxanthin wurden bis zu einem

Gehalt von 5,0 mol % untersucht.

Zeaxanthin verminderte ab einem Gehalt von 5,0 mol % die Bildung der CD

deutlich ab 30 Min (Abb. 3.27). Nach 120 Min betrug der Gehalt an Dienen12 % der

Kontrolle. Ähnliche Ergebnisse wurden für Lutein erhalten (Abb. 3.28). Ansteigende

Gehalte bis zu 5,0 mol % an Lutein in den Liposomen verringerten zu jedem

Zeitpunkt den Gehalt an Dienen verglichen mit der Kontrolle. Nach 120 Min betrug

der Anteil der gebildeten CD 41 % der Kontrolle.

3. Ergebnisse

76

Deutlich protektivere Eigenschaften zeigte Astaxanthin (Abb. 3.29). Hier

verringerte sich die Bildung der CD ab einem Gehalt von 0,1 mol % Astaxanthin in

den Liposomen. Nach dem Einbau von 5,0 mol % betrug der CD-Anteil nach 120 Min

bezogen auf die Kontrolle 5 %.

Zwei weitere Substanzen wurden zum Vergleich untersucht.

Epicatechin gilt als klassisches Antioxidans und verminderte die Bildung von

konjugierten Dienen bei einem Gehalt von 0,1 mol % nicht; erst der Einbau von 0,5

mol % bewirkte eine deutliche Verringerung bis zu 22 % der Kontrolle nach 30 Min

und der Einbau von 2,0 mol % bis zu 23 % der Kontrolle (Abb. 3.30).

Diphenylhexatrien (DPH) wurde getestet, da es ähnlich dem Phytoen ein

konjugiertes Trien-System aufweist, das jedoch mit zwei aromatischen

Phenylsystemen in Konjugation steht. DPH bewirkte schon nach 30 Min eine

Verringerung der Bildung an konjugierten Dienen mit 35 % bzw. 53 % der Kontrolle

bei einem Gehalt von 0,1 mol % bzw. 0,5 mol % (Abb. 3.31).

3.Ergebnisse

77

Tab. 3.14: Bildung konjugierter Diene inunilamellaren Liposomen nach Inititation durch 10M AAPH bei 37 ° C

Bildung konjugierter Diene bei 0,1 mol % Testsubstanz

(% der Kontrolle)

t (Min) Kontrolle ß- Carotin Lycopin Phytoen Zeaxanthin Lutein Astaxanthin Epicatechin DPH b

30 100,0 � 29,5 57,7 � 9,4 152,7 � 11,7 36,6 � 31,9 n. b. a 73,7 � 8,9 22,3 � 3,2 101,4 � 22,7 34,7 � 33,5

60 100,0 � 23,2 88,8 � 5,6 143,1 � 6,5 64,7 � 21,3 n. b. a 97,1 � 10,0 47,9 � 4,3 113,7 � 7,4 57,5 � 22,2

120 100,0 � 10,4 113,5 � 1,9 124,4 � 3,1 95,2 � 4,6 n. b. a 115,8 � 6,1 78,9 � 4,0 115,2 � 2,0 82,8 � 8,9


(% der Kontrolle)

t (Min) Kontrolle ß- Carotin Lycopin c Phytoen Zeaxanthin Lutein Astaxanthin Epicatechin DPH b

30 100,0 � 29,5 81,5 � 23,3 188,5� 13,7 0,0 � 0,6 73,8 � 6,8 43,7 � 2,0 27,7 � 14,9 21,9 � 1,7 53,3 � 30,0

60 100,0 � 23,2 97,3 � 13,5 172,4 � 5,0 3,1 � 1,5 86,0 � 7,3 71,9 � 1,9 41,5 � 8,2 35,2 � 5,3 64,1 � 21,6

120 100,0 � 10,4 109,0 � 3,8 150,2 � 6,7 29,7 � 19,3 85,9 � 3,7 101,7 � 0,7 72,5 � 7,6 103,9 � 7,6 82,6 � 14,1

3.Ergebnisse

78

Fortsetzung Tab. 3.14: Bildung konjugierter Diene in unilamellaren Liposomen nach Inititation durch 10 mM AAPH bei 37 ° C


(% der Kontrolle)

t (min) Kontrolle ß- Carotin Lycopin Phytoen Zeaxanthin Lutein Astaxanthin Epicatechin d DPH b

30 100,0 � 29,5 n.b. a n.b. a n.b. a 3,7 � 14,7 3,6� 2,4 0,0 � 5,5 23,0 � 0,3 n.b. a

60 100,0 � 23,2 n.b. a n.b. a n.b. a 5,5 � 7,2 10,4 � 2,6 0,3 � 2,1 27,3 � 0,9 n.b. a

120 100,0 � 10,4 n.b. a n.b. a n.b. a 11,5 � 6,3 40,7 � 6,4 4,7 � 1,1 36,8 � 1,8 n.b. a

a n.b. nicht bestimmtb Diphenylhexatrien (DPH)c 0,4 mol %d 2,0 mol %

3.Ergebnisse

79

Abb. 3.24: Bildung konjugierter Diene (CD) in unilamellaren Liposomen nach Initiation durch10 mM AAPH bei 37 ° C ohne Einbau (Kontrolle) und mit Einbau von ß- Carotin (0,1 mol %und 0,5 mol %) ; schwarze Balken: Inkubation nach 30 min, graue Balken: Inkubation nach60 min, offene Balken: Inkubation nach 120 min; Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte �SD aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

Abb. 3.25: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,01 mol %, 0,05 mol %, 0,1 mol %und 0,4 mol % Lycopin in Liposomen; siehe Abb. 3.24.

0

20

40

60

80

100

120

140

Kontrolle 0,1 mol % 0,5 mol %

CD

(% d

er K

ontro

lle)

0

50

100

150

200

250

Kontrolle 0,01 mol % 0,05 mol % 0,1 mol % 0,4 mol %

CD

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

80

Abb. 3.26: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,1 mol % und 0,5 mol % Phytoen in

Liposomen; siehe Abb. 3.24.

Abb. 3.27: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,5 mol % und 5,0 mol % Zeaxanthinin Liposomen; siehe Abb. 3.24.

0

20

40

60

80

100

120

140


CD

(% d

er K

ontro

lle)

0

20

40

60

80

100

120

140


CD

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

81

Abb. 3.28: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,1 mol %, 0,5 mol % und 5,0 mol %Lutein in Liposomen; siehe Abb. 3.24.

Abb. 3.29: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,1 mol %, 0,5 mol % und 5,0 mol %Astaxanthin in Liposomen; siehe Abb. 3.24.

0

20

40

60

80

100

120

140

Kontrolle 0,1 mol % 0,5 mol % 5,0 mol %

CD

(% d

er K

ontro

lle)

0

20

40

60

80

100

120

140


CD

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

82

Abb. 3.30: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,1 mol %, 0,5 mol % und 2,0 mol %Epicatechin in Liposomen; siehe Abb. 3.23

Abb. 3.31: Bildung konjugierter Diene nach Einbau von 0,1 mol % und 0,5 mol %Diphenylhexatrien; siehe Abb. 3.24

0

20

40

60

80

100

120

140


CD

- Bild

ung

(% d

er K

ontro

lle)

0

20

40

60

80

100

120

140


CD

(% d

er K

ontro

lle)

3. Ergebnisse

83

Für ß-Carotin wurde weder ein anti- noch ein prooxidativer Effekt gefunden;

Lycopin erwies sich als prooxidative Substanz in den Liposomen. Unter

Berücksichtigung der Ergebnisse in Abb. 3.24 – Abb. 3.29 läßt sich eine Reihenfolge

für die Lipidprotektion aufstellen:

Phytoen > Astaxanthin > Lutein = Zeaxanthin > ß- Carotin > Lycopin.

3.5.3 Bestimmung der lag-Phase und des k-Wertes

Die �- Werte wurden bestimmt wie in Kapitel 2.5.4 beschrieben und sind in

Tab. 3.15 aufgeführt. Der Quotient aus �+ und �- repräsentiert das zeitunabhängige

Maß für den lipidprotektiven Effekt. Ein linearer funktionaler Zusammenhang wurde

erstellt, indem der Quotient aus �+ und �- gegen die Konzentration der im Lipid

eingebauten Testsubstanz (nmol/mg) abgebildet wurde (Abb. 3.32 und Abb. 3.33).

Der k-Wert ist das zeit- und konzentrationsunabhängige Maß für den lipidprotektiven

Effekt und läßt sich durch Gleichung 1 darstellen.

Gl. 1 k = ((�+ / �-) – 1/ ([Testsubstanz])

mit [Testsubstanz] = Konzentration der in dem Lipid eingebauten Testsubstanz

in (nmol/mg).

Die graphische Auswertung erlaubt die Bestimmung des k-Wertes aus der

Steigung der linearen Funktionen in Abb. 3.32 und Abb. 3.33. Die Ergebnisse für die

Bestimmung der �- und k-Werte sind in Tab. 3.15 zusammengefasst.

Testsubstanzen, für die sich hohe k-Werte berechnen lassen, schützen das

Lipid besser als Substanzen mit kleinerem k-Wert.

3. Ergebnisse

Abb. 3.32: im Lipid (nmLiposomen

Abb. 3.33 Epicatechin

25

30

35�

+/� -

�+/�

-

84

Beziehung zwischen dem Verhältnis � + / � - und dem Gehalt an den Carotinoidenol/mg); Phytoen (� ), Astaxanthin (� ) und Zeaxanthin (� ) in

.

Beziehung zwischen dem Verhältnis � + / � - und dem Gehalt an Lutein (�) und (o) in Liposomen (nmol/mg).

0

5

10

15

20

0 1 2 3

Carotenoidkonzentration im Lipid (nmol/mg)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6

Lutein- und Epicatechinkonzentration im Lipid (nmol/mg)

3. Ergebnisse

85

Tab. 3.15 Bestimmung der �-Werte und der k-Werte in unilamellaren Liposomen

(nmol /mg Lipid) �- (Min) �+ (Min) �+/�- k ( 10 9 mg/nmol)

ß-Carotin 0,2 n. b. a

Lycopin 0,2 n. b. a

Phytoen

(0,1 mol %) 1,28 6 27,7 4,6

Phytoen

(0,5 mol %) 6,39 6 43,6 7,3 10,9

Zeaxanthin

(0,5 mol %) 6,39 6 17,6 2,9

Zeaxanthin

(1,0 mol %) 12,79 6 54,0 9,0

Zeaxanthin

(5,0 mol %) 63,93 6 > 135 22,5 8,0

Lutein

(0,5 mol %) 6,39 0,2 13,4 67,0

Lutein

(1,0 mol %) 12,79 0,2 16,7 83,5

Lutein

(5,0 mol %) 63,93 0,2 63,1 315,5 59,6

Astaxanthin

(0,1 mol %) 1,28 6 38,9 6,5

Astaxanthin

(0,5 mol %) 6,39 6 43,1 7,2

Astaxanthin

(5,0 mol %) 63,93 6 > 135 22,5 9,4

Epicatechin

(0,3 mol %) 3,83 0,2 26,4 132,0

Epicatechin

(0,5 mol %) 6,39 0,2 47,6 238,0 471,1

DPH

(0,5 mol %) 6,39 6 32,1 5,4 n. b. a

a nicht bestimmbar

3. Ergebnisse

86

Abbildung 3.32 zeigt die graphische Auswertung für Zeaxanthin, Astaxanthin

und Phytoen. In der genannten Reihenfolge der Carotinoide nimmt der k-Wert von

8,0 x 10 9 und 9,4 x 10 9 auf 10,9 x 10 9 (mg/nmol) zu.

Für Lutein und Epicatechin wurden k- Werte von 59,6 x 10 9 und 471,1 x 10 9

(mg/nmol) ermittelt, die sich aus der Auswertung in Abbildung 3.33 ergeben. Es fällt

auf, dass die k-Werte für Lutein und Epicatechin systematisch höher liegen als für die

anderen getesteten Substanzen. Dies lässt sich mit der verlängerten lag-Phase der

Kontrollen (�-) erklären. Ein Vergleich der k-Werte von Lutein mit den Werten von

Phytoen, Astaxanthin und Zeaxanthin ist deshalb nicht möglich. Die lipidprotektive

Reihenfolge für Phytoen > Astaxanthin > Zeaxanthin (s. 3.5.2) ist jedoch auch hier zu

erkennen.

4. Diskussion

87

4. Diskussion

4.1 Interventionsstudie zur Photoprotektion durch Carotinoide

4.1.1 Carotinoidbestimmung in Serum- und in Lebensmittelproben mittels HPLC

Die Carotinoide im Serum der Probanden wurden nach Extraktion mittels

HPLC bestimmt (Gärtner, 1997). Die verwendete Methode ermöglichte die Erfassung

der Hauptcarotinoide im Organismus des Menschen. Die Chromatogramme zeigten

bei einer gemeinsamen Detektionswellenlänge von 450 nm basisliniengetrennte

Signale aller Carotinoide. Die Trennung der strukturell verwandten Xanthophylle

Lutein und Zeaxanthin gelingt mit vielen HPLC-Methoden nicht, jedoch konnten diese

Carotinoide hier hinreichend getrennt und quantifiziert werden (Aust et al., 2001).

Darüberhinaus war eine Trennung der Lycopin- und ß-Carotin-Isomere möglich. Die

hier vorgestellte Methode kann routinemäßig zur Carotinoidanalytik im Serum

angewandt werden.

Ergänzend zu den erwähnten Carotinoiden wurden die UV-aktiven Carotine

Phytoen und Phytofluen chromatographisch erfasst. Deren Gehalt im Serum konnte

allerdings nicht mit der beschriebenen Methode bestimmt werden, da die Trennung

unzureichend war. Die bislang in der Literatur beschriebene HPLC-Methode zur

Bestimmung von Phytoen und Phytofluen im Serum (Khachik et al., 1997) erfordert

die Verwendung von stationären und mobilen Phasen, die sich von denen für die

routinemäßige Carotinoidanalytik (Gärtner, 1997) unterscheiden. Deshalb wurde eine

neue HPLC-Methode entwickelt, mit der Phytoen und Phytofluen innerhalb einer

Analysenzeit von 30 Min getrennt und quantifiziert werden konnten. Es wurde

dieselbe stationäre Phase eingesetzt, die auch im Rahmen der routinemäßigen

Carotinoidanalytik benutzt wurde. Die Zusammensetzung der mobilen Phase

unterschied sich nur geringfügig von dem Eluenten, den Gärtner (1997) verwendete,

so dass ein schneller HPLC-Systemwechsel möglich und die Methode im

Laborbetrieb praktikabel war.

Die Detektions- und Quantifizierungsgrenzen von 0,005 µM und 0,03 µM für

die Bestimmung von Phytoen und Phytofluen im Serum liegen höher als die Grenzen

anderer Carotinoide (Gärtner, 1997). Dafür werden die im Vergleich zu anderen

4. Diskussion

88

Carotinoiden kleineren Extinktionskoeffizienten von Phytoen und Phytofluen (Britton,

1995b) verantwortlich gemacht, die eine geringere Empfindlichkeit in der UV-

Detektion von Phytoen und Phytofluen bewirken. Die Quantifizierungsgrenzen

genügen aber einer statistisch hinreichend sicheren Bestimmung von Phytoen und

Phytofluen im Serum, da diese niedriger sind als der durchschnittliche Serumgehalt

beim Menschen von 0,3 µM für Phytofluen und 0,1 µM für Phytoen (Khachik et al.,

1997, Paetau et al., 1998).

Die entwickelte Methode wurde auch auf die Bestimmung von Phytoen und

Phytofluen in Lebensmitteln angewandt.

4.1.2 Carotinoidgehalte im Serum

Während der Studie veränderten sich die Gehalte an Lutein, Zeaxanthin und

ß-Cryptoxanthin in den Seren der Probanden nicht. Die Gehalte an Lycopin wurden

zu Beginn der Studie als Basiswert ermittelt und nach 4 und 12 Wochen

Supplementierung mit lycopinreichen Nahrungsergänzungs- und lycopinreichen

Lebensmitteln bestimmt. Der durchschnittliche Gehalt zu Beginn der Studie war in

allen Studiengruppen mit 0,3 µM vergleichbar mit in der Literatur beschriebenen

Werten (Sies et al., 1992, Khachik et al., 1997, Paetau et al., 1998). Eine signifikante

Zunahme des Gehaltes an Lycopin um das 2-fache nach 4 und 12 Wochen ließ sich

in allen Gruppen feststellen. Diese Erhöhung steht im Einklang mit Untersuchungen,

in denen Probanden täglich 12 und 16 mg Lycopin einnahmen (Bowen et al., 1993,

Stahl et al., 2001). Paetau und Kollegen (1998) verwendeten in ihren

Supplementierungsstudien mit vergleichbaren Lycopinpräparaten (synthetisches

Lycopin, Tomatenextrakt auf Oleoresin-Basis und in Wasser mikrodispers verteilter

Tomatenextrakt) um bis zu 7-fach höhere tägliche Dosen und beobachteten ebenfalls

eine 2-fache Erhöhung des Lycopingehaltes im Serum. Die Lycopinspiegel im Blut

sind gegen Ende beider Studien ähnlich hoch und unabhängig von der Art der

Lycopinformulierung in den Präparaten. Es scheint, dass bei der Supplementierung

mit Lycopin der Gehalt an Lycopin im Serum nicht über 1 µM erhöht werden kann. Im

Gegensatz dazu ist bei einer ß-Carotinsupplementierung die Erhöhung der ß-

Carotinkonzentration im Serum über 1 µM möglich (Stahl et al., 1998). Physiko-

4. Diskussion

89

chemische Eigenschaften wie die Neigung von Lycopin zur Aggregatbildung in

wässeriger Umgebung (Britton, 1995a) könnten den Einbau von Lycopin in

Lipoproteine des Blutes limitieren und so zu niedrigen oberen Grenzwerten für

Lycopinplasmaspiegel führen. Niedrige Werte in einem Fließgleichgewicht (steady

state) können auch durch kinetische Parameter wie eine schnelle Clearance oder

einen raschen Metabolismus von Lycopin erklärt werden.

Die Basisgehalte von Phytoen mit 0,1 µM und Phytofluen mit 0,3 µM im Serum

zu Beginn der Studie sind in Übereinstimmung mit Literaturdaten (Khachik et al.,

1997, Paetau et al., 1998). Während sich mit Supplementierung mit synthetischem

Lycopin die Phytofluen- und Phytoengehalte nicht veränderten, erhöhten sich die

Gehalte nach Gabe der Tomatenextrakte um das 2-fache. Auch diese

Beobachtungen sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Paetau und

Mitarbeitern (1998). Durch die Supplementierung mit dem Saft der Lycopinkarotte

stieg der Phytofluengehalt sogar um das 4-fache auf bis zu 1µM an und lag damit

höher als die höchsten Lycopingehalte, die in der Studie gemessen wurden.

Unabhängig von den unterschiedlichen täglichen Phytofluendosen scheint wie im

Falle des Lycopins ein oberer Grenzwert für den Phytofluenspiegel erreicht zu

werden. Hieraus wird gefolgert, dass die apparente Verfügbarkeit von Phytofluen

größer ist als die des Lycopins, obwohl die täglich aufgenommenen Dosen an

Phytofluen um den Faktor 10 niedriger lagen als die Lycopindosen.

Strukturelle Unterschiede zum Lycopin könnten für die hohen

Phytofluenplasmaspiegel verantwortlich sein. Da unter den in Pflanzen

vorkommenden cis/trans-Isomeren des Phytofluens das cis-konfigurierte Isomer

dominiert, könnte die gewinkelte Struktur des Moleküls eine geringere

Aggregationsneigung in wässeriger Umgebung bewirken und so einen vermehrten

Einbau in Mizellen oder Lipoproteine ermöglichen. Generell werden Carotinoide mit

cis-Konformation bevorzugt in Lipidkompartimente eingebaut (Britton, 1995a).

4. Diskussion

90

4.1.3 Carotinoidgehalte in der Haut

Die Untersuchung von photoprotektiven Effekten von Carotinoiden beim

Menschen wurde in dieser Studie an der Haut durchgeführt. Daher wurde auch der

Gehalt an Carotinoiden in der Haut bestimmt. Da Lycopin in den Supplementen das

Hauptcarotinoid war, wurde davon ausgegangen, dass die Steigerung der ermittelten

Gesamtcarotinoidgehalte hauptsächlich auf das Lycopin zurückzuführen waren.

Andere Carotinoide des Blutes wie Lutein, Zeaxanthin und deren Ester werden

ebenfalls in die Haut transportiert; sie lassen sich allerdings nur in geringen Mengen

nachweisen (Wingerath et al., 1998). Die angewandte Methode der

Reflektionsspektrophotometrie ermöglichte jedoch nur die Bestimmung der im

sichtbaren Bereich absorbierenden Carotinoide. Die UV-aktiven Verbindungen

Phytoen und Phytofluen wurden nicht detektiert.

Der Gesamtcarotinoidgehalt wurde in einem kleinen Hautareal des Rückens

bestimmt und stieg während der Supplementierung mit lycopinreichen

Nahrungsergänzungs- und Lebensmitteln von 0,1 auf 0,2 nmol/g an. Der Basiswert

zu Beginn der Studie ist vergleichbar mit den Gehalten, die Ribaya-Mercado et al.

(1995) und Stahl et al. (1998, 2001) beschrieben. Die Akkumulation von Lycopin in

der Haut scheint vergleichbar mit der Anreicherung im Serum begrenzt und

unabhängig von der Art der Präparate zu sein.

Einen vergleichbare Erhöhung des Gesamtcarotinoidgehalts durch

Supplementierung von 0,3 nmol/g erzielten Stahl et al. (2001) nach 12 Wochen,

wenn täglich mit 16 mg Lycopin (40 g Tomatenpaste) supplementiert wurde.

Hingegen war nach Supplementierung mit ß-Carotin in Form eines Algenextraktes

ein höherer Gesamtcarotinoidgehalt in der Haut mit 1 nmol/g festzustellen (Stahl et

al., 2000). Zugleich stieg in dieser Studie die ß-Carotinkonzentration im Serum über

1 µM (siehe 4.1.2). Die Erhöhung der Carotinoidgehalte von Lycopin oder ß-Carotin

in der Haut folgt somit dem Anstieg der Carotinoide im Blut. Darüberhinaus scheint

Lycopin in der Haut einem rascheren Metabolismus zu unterliegen als ß-Carotin, so

dass niedrigere Lycopinwerte in der Haut zu erwarten sind. Untersuchungen von

Ribaya-Mercado und Mitarbeiter zeigten, dass Lycopin in der Haut schneller als ß-

Carotin abgebaut wird (Ribaya-Mercado et al., 1995).

4. Diskussion

91

4.1.4 Photoprotektion durch lycopinreiche Supplemente

Die durch Supplementierung mit Carotinoiden erzielte Zunahme der

Carotinoidgehalte im Serum der Probanden korrelierte mit einem erhöhten

Gesamtcarotinoidgehalt in der Haut. Das Ausmaß eines photoprotektiven Effektes

wurde durch die Intensität der Sonnenbrand-Reaktion in der Haut ermittelt. Die

Sonnenbrand-Reaktion ist mit einem UV-induzierten Erythem (Rötung) verbunden,

dessen Bildung in einem kleinen Hautareal des Rückens durch Bestrahlung mit

einem Solarsimulator hervorgerufen wurde. Die Zunahme der Intensität des

Erythems 24 Stunden nach einer Bestrahlung war ein Maß für die Sonnenbrand-

Reaktion und wurde chromatometrisch als a-Wert bestimmt. Da die Haut auch im

unbestrahlten Zustand einen Eigenrotwert besitzt, wurde nicht der a-Wert sondern

die Rötungsdifferenz �a vor und 24 Stunden nach der Bestrahlung als Indikator für

die Erythemintensität verwendet.

Für die Studiengruppen, die mit den Tomatenextrakten und dem

Lycopinkarotten-Saft supplementiert wurden, ließ sich im Mittel ein Ausgangswert

von �a = 5 zu Beginn der Studie bestimmen. Der Variationskoeffizient für �a betrug

zwischen 15 und 36 %. Dieser Wert ist mit dem Basiswert in den Untersuchungen

von Stahl et al. (2001) vergleichbar. Für die Studiengruppe, die mit synthetischem

Lycopin supplementiert wurde, ließ sich die Rötungsdifferenz zu Beginn der Studie

mit �a = 3,5 berechnen. Der hier höhere Variationskoeffizient von 49 % könnte die

individuell unterschiedlichen Empfindlichkeiten gegenüber der UV-Stimulation bei

den Probanden wiederspiegeln und so den geringeren �a-Wert zu Beginn der Studie

erklären.

Eine Photoprotektion durch die verwendeten Supplemente war gegeben,

wenn während der Studie eine Abnahme von �a zu beobachten war. Diese

Photoprotektion wurde durch die Einnahme jedes der verwendeten

Supplementeerhalten, so dass eine Korrelation zwischen erhöhten Lycopingehalten

im Serum, erhöhten Gesamtcarotinoidgehalten in der Haut und der UV-Protektion

aufgestellt werden kann. Mit Ausnahme der Gruppe, die mit synthetischem Lycopin

supplementiert war, wurde für alle übrigen Studiengruppen eine statistisch

4. Diskussion

92

signifikante Abnahme von �a im Mittel von 5,0 (Woche 0) auf 3,2 (Woche 12)

beobachtet. Hier waren die photoprotektiven Effekte statistisch signifikant.

Die HPLC-Untersuchungen der Seren ergaben, dass auch die Blutspiegel an

Phytoen und Phytofluen bei den Probanden signifikant anstiegen, die mit Lycopin

aus natürlichen Quellen supplementiert wurden. Phytoen und Phytofluen sind

Vorläufermoleküle in der Biosynthese von Carotinoiden in höheren Pflanzen. Ihr

Vorkommen ist dabei nicht nur auf die in dieser Studie verwendeten Supplemente

beschränkt. Phytoen und Phytofluen wurden in lycopin- und ß-carotinreichen,

verarbeiteten Lebensmitteln (Tomatensaft, Tomatenkonzentrat und ein diätetisches

Lebensmittel für die Kleinkinderernährung) in größeren Mengen nachgewiesen, die

bis zu 12 % des Hauptcarotinoidgehaltes betrugen. Systematische Untersuchungen

zum Gehalt von Phytoen und Phytofluen in Lebensmitteln liegen bisher nicht vor

(Pelz et al., 1998).

Aufgrund ihrer UV-absorbierenden Eigenschaften im Bereich des UV A- und

UV B-Lichts (Andersson et al., 2001) könnten Phytoen und Phytofluen auch als UV-

Filter in der Haut wirken und so die erythemauslösenden Strahlungen mindern. In

vivo Untersuchungen am Frettchen zeigten, dass die intraperitoneale (unter die

Bauchdecke) Applikation von Phytoen das Ausmaß der Sonnenbrand-Reaktion

deutlich abschwächt (Mathews-Roth und Pathak, 1975). Untersuchungen zur

Verteilung und Bioverfügbarkeit der Substanzen imTiermodell liegen nicht vor.

Ähnliche Studien zu photoprotektiven Effekten durch lycopinreiche

Supplementierungen finden sich bei Stahl et al. (2001) (lycopinreiche Tomatenpaste)

und bei Heinrich et al. (2003) (Kapselsupplement eines Carotinoidgemisches). Die

signifikant protektiven Effekte ließen sich auch in diesen Studien erst ab einer

längeren Studiendauer von mindestens 10 Wochen aufzeigen. Ähnliche Ergebnisse

wurden in Studien mit einer ß-Carotin-Supplementierung erhalten. Untersuchungen,

in denen Carotenoid-Dosen von 30 mg oder 150 mg ß-Carotin über 10 Wochen

verabreicht wurden, ergaben schützende Effekte (Mathews-Roth et al., 1972, Lee et

al., 2000). Im Gegensatz dazu erzielten Wolf et al. (1988) durch Gabe von 150 mg

eines ß-Carotin-Canthaxanthin-Gemisches für eine Zeit von 4 Wochen keinen

protektiven Effekt. Auch Garmyn und Mitarbeiter (1995) konnten nach Gabe von 90

mg ß-Carotin für 3 Wochen keinen Sonnenschutzeffekt nachweisen.

4. Diskussion

93

Nicht nur die tägliche Höhe der Dosis von Carotinoiden scheint einen Einfluss

auf die UV-Protektion zu haben, sondern auch die Interventionsdauer. Zeitabhängige

Prozesse, in denen Carotinoide aus subkutanem Fettgewebe in die Dermis oder

Epidermis transportiert werden müssten, könnten so die verzögerten

Schutzwirkungen erklären.

Obwohl der endogene Sonnenschutz relativ gering ist und im Vergleich zu

topisch angewandten Sonnenschutzmitteln einen Lichtschutzfaktor von 3 aufweist

(persönliche Mitteilung PD Dr. Ulrike Heinrich, Universität Witten-Herdecke), hat die

systemische Anwendung von oralen Sonnenschutzmitteln auch Vorteile. Die

ständige Verfügbarkeit der protektiven Substanzen trägt zum permanenten Schutz

der Haut vor sonnenlicht-induzierten Schädigungen bei. Jedoch ersetzt der

endogene Sonnenschutz nicht die Anwendung von Sonnenschutzcremes bei

intensiver Sonnenbestrahlung der Haut wie im Hochgebirge oder am Meer.

4.2 Untersuchungen in Zellkultur zur Photoprotektion durch Carotinoide

4.2.1 Einfluss auf den MMP-1-Signalweg

UV-Bestrahlung der Haut führt u.a zu oxidativem Stress in der Haut, wobei

das zelluläre antioxidative Verteidigungssystem geschwächt wird (Podda et al., 1998,

Sorg et al., 2001). Die Folge kann eine Schädigung der Keratinozyten- und

Fibroblastenmembran durch intermediär gebildete reaktive Sauerstoff-Spezies sein

(Gaboriau et al., 1993). Das Ausmaß der Schädigung hängt dabei vom antioxidativen

Status der Zellen ab (Moysan et al., 1992). Für die in vitro-Untersuchung von

oxidativen Vorgängen in Hautzellen nach einer UV-Bestrahlung eignen sich

Zellkulturen von Fibroblasten (Morliere et al., 1991, 1995).

Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluß von Lycopin und einem

Gemisch aus Phytoen und Phytofluen auf die durch photooxidativen Stress

induzierte Bildung des Enzyms MMP-1 (Kollagenase) in Fibroblasten untersucht

(Scharffetter-Kochanek et al., 1993, Wlaschek et al., 1995). Die verwendeten

Konzentrationen des Lycopins im Zellkulturmedium von 0,03 – 0,5 µM entsprachen

den Gehalten im Blutplasma (physiologische Konzentrationen).

4. Diskussion

94

In den Fibroblasten betrug die UV A-induzierte MMP-Expression der Positiv-

Kontrolle im Mittel das 5,2-fache der unbestrahlten Kontrolle, was in

Übereinstimmung mit der 5-fachen Induktion ist, die Herrmann et al. (1993) in

Fibroblastenkulturen bei gleicher Strahlungsdosis von 30 J/cm2 erhielten.

Die Prä-Inkubation der Fibroblasten mit Lycopin für 48 Stunden verminderte

die UV A-induzierte MMP-1-Bildung gegenüber der Positiv-Kontrolle signifikant ab

einer Konzentration von 0,1 µM im Zellkulturmedium.

Ähnliche Untersuchungen zum Einfluss von Carotinoiden auf die UV-induzierte

MMP-1-Bildung wurden bislang nur von Offord und Mitarbeitern (2002) durchgeführt.

Die Ergebnisse dieser Studien können jedoch nicht mit den Ergebnissen der

vorliegenden Arbeit verglichen werden. Offord et al. verwendeten eine höhere UV A-

Dosis von 50 J/cm2, was die in dieser Studie beobachtete, starke Induktion der

MMP-1 in der Positiv-Kontrolle mit dem 15-fachen der unbestrahlten Kontrolle

erklären könnte. Die Prä-Inkubation der Fibroblasten mit Lycopin für 24 Stunden

verminderte die MMP-1-Expression nach der UV A-Bestrahlung nicht. Inkubationen

der Zellen mit Lycopin für 48 Stunden wurden von Offord et al. nicht durchgeführt.

Es wird vermutet, dass für die in der vorliegenden Studie beobachtete

Erniedrigung der UV-stimulierten Bildung der MMP-1 (oxidierte) Abbauprodukte des

Lycopins verantwortlich sein könnten. Lycopin war mit den hier verwendeten

Konzentrationen nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden weder im

Zellkulturmedium noch im Zelllysat der Fibroblasten nachzuweisen. Deshalb sind

genregulatorische Wirkungen von Carotinoidabbauprodukten auf die Expression von

MMP-1denkbar. Solche regulatorischen Effekte wurden bereitsfür Abbauprodukte

des ß-Carotins und Lycopins beschrieben (Siems et al., 2000, Ben-Dor et al., 2001,

Müller et al., 2002, Aust et al., 2002).

Die Untersuchungen zum Einfluss von Phytofluen und Phytoen auf die MMP-

1- Expression ergaben, dass die Supplementierung der Zellkulturen mit diesen

Carotinen die UV-induzierte MMP-1-Bildung nicht verminderte. Die in den Versuchen

eingesetzte Konzentration (2 µM bezogen auf Phytofluen) in dem Zellkulturmedium

könnte u.U. nicht ausreichend gewesen sein, genügend Subgstanz in die

Fibroblastenzellen einzubauen. Das Absorptionsmaximum von Phytofluen liegt bei

4. Diskussion

95

350 nm (in organischer Lösung) (Andersson et al., 2001) und zugleich in dem

Wellenlängenbereich des UV A-Lichtes. Eine UV-Filterwirkung, die eine MMP-1-

Induktion reduzieren könnte, war somit in den Fibroblastenkulturen nicht

nachweisbar. Auch scheinen Abbauprodukte des Phytoens keine regulatorische

Wirkungen zu haben.

4.2.2 Einfluss der Carotinoide auf den IL-6-Signalweg

Die Interaktion von UV-Licht mit den Keratinozyten der Epidermis kann zu

entzündlichen Prozessen führen, in deren Verlauf Zytokine wie das Interleukin-6 (IL-

6) als Signalmediatoren wirken (Petit-Frere et al., 1998). Keratinozyten werden durch

UV-Licht zur IL-6-Produktion stimuliert (Grundmann et al., 2001). IL-6 seinerseits

induziert über parakrine Mechanismen (Kondo et al., 1997) die MMP-1-Expression in

Fibroblasten (Brenneisen et al., 1999). Der Einfluss von Carotinoiden auf den IL-6-

Signalweg nach UV-Bestrahlung ist bislang nicht untersucht worden.

In dieser Arbeit wurden Keratinozyten mit einer UV B-Dosis von 30 mJ/cm

bestrahlt und somit die Bildung von IL-6 stimuliert. Die Supplementierung der

Keratinozyten mit Lycopin für 24 Stunden beeinflusste den IL-6-Signalweg nicht,

wohingegen die Prä-Inkubation der Keratinozyten mit Phytoen für 24 Stunden die IL-

6-Produktion um 55 % gegenüber der Positiv-Kontrolle verringerte. Das

Absorptionsmaximum des Phytoens (in organischer Lösung) liegt bei 280 nm

(Andersson et al., 2001) und zugleich im Wellenlängenbereich des UV B-Lichtes.

UV-Filtereffekte könnten für die Verminderung der UV-induzierten IL-6-Bildung in

Keratinozyten verantwortlich sein.

Ein Erythem ist ein Zeichen für eine Entzündungsreaktion. Die in der

Interventionsstudie am Menschen beobachtete verminderte Erythembildung (siehe

4.1.4 ) könnte auch mit einer schwächeren Immunantwort aufgrund einer

gedrosselten IL-6-Produktion assoziiert sein. Mathews-Roth und Pathak (1975)

zeigten einen UV-protektiven Effekt an der Haut des Frettchens, wenn Phytoen intra-

peritoneal (unter die Bauchdecke) verabreicht wurde. Zusätzlich berichtete Mathews-

Roth (1982), dass UV B-induzierte Hauttumore von Mäusen nach intra-peritonealer

4. Diskussion

96

Applikation von Phytoen verzögert auftraten. Antioxidative Effekte wurden für diese

Wirkungen verantwortlich gemacht.

4.3 Anti- und prooxidatives Verhalten von Carotinoiden in unilamellarenLiposomen

Die in dieser Arbeit in vivo und in vitro beobachteten UV-protektiven Effekte

können mit den antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden in Verbindung

gebracht werden. Der Einfluss von Carotinoiden auf die Lipidperoxidation wurde hier

in einem Biomembranmodell bestehend aus unilamellaren Liposomen (Ostro, 1983)

untersucht. Die Lipidperoxidation ist ein Indikator für oxidative, radikalische

Reaktionen, wie sie auch in Liposomen nach einer UV-Bestrahlung auftreten (Sujak

et al., 1999).

In der vorliegenden Studie wurde daher ein Verfahren etabliert, welches die

kontinuierliche Bildung der Peroxylradikale als sogenannte konjugierte Diene in

einem unilamellaren Liposomensystem direkt nach Radikalstart mit dem

wasserlöslichen Radikalstarter AAPH registrierte. Im Hinblick auf die lipidprotektiven

Eigenschaften in diesem Modell ließ sich eine Reaktivitätsreihenfolge für die

folgenden Carotinoide aufstellen:

Phytoen > Astaxanthin > Lutein = Zeaxanthin > ß- Carotin > Lycopin.

In dem vorliegenden Liposomensystem wirkte Phytoen als stärkstes

Antioxidans, während ß-Carotin keine antioxidativen Effekte zeigte. Lycopin

hingegen beschleunigte stets die Lipidoxidation und wurde daher als Prooxidans

eingestuft.

In vielen Untersuchungen zu den antioxidativen Eigenschaften von

Carotinoiden wurden sowohl anti- als auch prooxidative Effekte beobachtet, die von

den jeweiligen Versuchsanordnungen abhängen. Es sind Variablen wie der

Sauerstoffpartialdruck (Burton und Ingold, 1984), die Gegenwart von Metallionen

(Palozza, 1998, Lowe et al., 1999, Young and Lowe, 2001) oder weiterer

Antioxidantien (z.B. Tocopherol) (Junghans et al., 2001b), die eine entscheidende

Rolle spielen.

4. Diskussion

97

Die für Astaxanthin, Lutein, Zeaxanthin, ß-Carotin und Lycopin beobachteten

Ergebnisse entsprechen den Resultaten anderer Untersuchungen (Miki, 1991,

Palozza und Krinsky, 1992, Woodall et al., 1997a). Lim et al. (1992) beobachteten

allgemein einen besseren Lipidschutz vor Oxidation durch Xanthophylle als durch

Carotine. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Rengel et al. (2000). Chen und Djuric

(2001) beobachteten in einem vergleichbaren unilamellaren Liposomensystem keine

signifikanten anti- oder prooxidative Eigenschaften von Lycopin, ß-Carotin, Lutein

und Zeaxanthin. Stahl und Mitarbeiter (1998) und Junghans et al. (2001b) hingegen

beschrieben in einem unilamellaren Liposomensystem Lycopin als effektives

Antioxidans. Im Vergleich zur vorliegenden Arbeit ergeben sich allerdings

Unterschiede in der Methodik der Untersuchungen. Als Reaktionsstart verwendeten

Junghans et al. und Stahl et al. den lipophilen Radikalbildner AMVN und gaben das

Ausmaß der Lipidoxidation durch die Menge an gebildetem Malondialdehyd (MDA)-

Äquivalenten an. MDA entsteht als sekundäres Produkt gegen Ende einer

Oxidationskettenreaktion aus intermediär gebildetem endo-Peroxiden (Belitz und

Grosch, 1992), deren Bildung zudem von Faktoren wie Temperatur und der Menge

an Prooxidantien abhängig ist. Die Messungen unterschiedlicher (primärer und

sekundärer) Oxidationsprodukte zu unterschiedlichen Zeitpunkten der

Lipidperoxidation könnten zu unterschiedlichen Ergebnissen der beiden Studien

geführt haben.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützen die Hypothese, dass

Xanthophylle Liposomenmembranen vor Oxidation besser schützen als Carotine. In

diesem Zusammenhang scheinen die strukturellen Aspekte in der Membran eine

wichtige Rolle zu spielen. Reaktivitätseigenschaften der Carotinoidmoleküle (El Tinay

und Chicester, 1970, und Woodall et al., 1997a) haben eine nachrangige Bedeutung.

Xanthophylle weisen in Lipiddoppelmembran-Strukturen eine nahezu senkrechte

Orientierung auf, wobei die polaren Hydroxylgruppen der Xanthophylle einen Kontakt

zum wässerigen Aussenmedium der Doppelmembran ermöglichen (Gruszecki und

Sielewiesiuk, 1990). Mit dieser Orientierung geht schließlich auch eine Erhöhung der

Rigidität der Membran einher (Gabrielska und Gruszecki, 1996). Ein radikalischer

Angriff der Lipide wird anscheinend erschwert. ß-Carotin hingegen lagert sich derart

in die Lipiddoppelmembran ein; der Kontakt mit dem wässerigen Kompartiment ist

eingeschränkt. Beim Einbau von ß-Carotin und Lycopin in die Membran könnte die

4. Diskussion

98

Beweglichkeit der polaren Kopfgruppen der Phosphatidycholine erhöht werden, was

die Stabilität der Membran verringert (Jezowska et al., 1994) und ein Angriff von

Radikalen erleichtert.

Das Carotin Phytoen wies in dem in dieser Arbeit verwendeten Modell

lipidprotektive Eigenschaften auf. Aufgrund seiner Struktur mit lediglich 3

konjugierten Doppelbindungen gilt Phytoen nicht als Antioxidans (Martin et al., 1999),

da es kein ausgedehntes Elektronensystem besitzt. Radikalische Zwischenstufen

können nicht über Resonanzen, wie sie bei den übrigen Carotinoiden in der Regel

vorkommen, stabilisiert werden. Im Gegensatz zum ß-Carotin liegen bisher keine

Literaturdaten über die Orientierung von Phytoen in einer Lipidmembran vor.

Aufgrund der freien Drehbarkeiten des Phytoenmoleküls ist eine coplanare

Anordnung zu den Lipidmolekülen der Membran denkbar und damit ein

membranstraffender (protektiver) Effekt möglich. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit von

Phytoen (erleichterte H-Abstraktion durch freie Radikale bevorzugt an

Kohlenstoffatomen in allylischer Position) sollte mit einer verminderten

Elektronnegativität längs der Kohlenstoffkette des Phytoens verbunden sein.

Semiempirische Berechnungen der Elektronendichteverteilungen für Lycopin und

Phytoen zeigen diesen Unterschied zwischen den beiden Carotinen auf (Abb. 4.1

und 4.2).

Die Elektronenverteilung in der Kohlenstoffkette weist an den

Kohlenstoffatomen der Doppelbindungen, die nicht methylsubstituiert sind, die

höchste Elektronendichte auf. �- und ß-ständige Kohlenstoffatome sind daher

bevorzugte Positionen für eine H-Abstraktion.

Die Ergebnisse der Liposomenstudie lassen erkennen, dass auch Carotine

mit nicht ausgedehntem konjugierten Elektronensystem Membranlipide (im

Modellsystem von Liposomen) vor Oxidation schützen. Sie zeigen zugleich auf, dass

antioxidative Effekte des Phytoen in der UV-induzierten Erythembildung der Haut

eine Rolle spielen könnte.

4. Diskussion

99

Abb. 4.1: Elektronendichteverteilung des Lycopins. Dargestellt sind die Verteilungenlängs der Kohlenstoffatome in der Hauptkette.

Abb. 4.2: Elektronendichteverteilung des Phytoens. Dargestellt sind die Verteilungenlängs der Kohlenstoffatome in der Hauptkette.

Carbon atom

Cha

rge

(pos

itive

ele

ctro

nic

char

ge)

-0,20-0,19-0,18-0,17-0,16-0,15-0,14-0,13-0,12-0,11-0,10-0,09-0,08-0,07-0,06

Kohlenstoffatome längs des Chromophors

Rel

ativ

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Carbon atom

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Kohlenstoffatome längs des Chromophors

Rel

ativ

e El

ektro

nenl

dich

te

5. Zusammenfassung

100

5. Zusammenfassung

Carotinoide sind effektive Antioxidantien und dienen in höheren Pflanzen als

Lichtschutzfaktoren. Die Wirkung von Carotinoiden als Photoprotektoren beim

Menschen zur Verminderung von UV-induzierten Hautreaktionen (Sonnenbrand-

Erythem) ist nur wenig untersucht. Die bisherigen Studien hierzu wurden mit ß-

Carotin durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher Lichtschutzeffekte des

Tomatencarotinoids Lycopin untersucht. Hierzu wurden Probanden verschiedener

Gruppen über einen Zeitraum von 12 Wochen synthetisches Lycopin, lycopinreiche

Supplemente (Nahrungsergänzungsmittel) oder lycopinreicher Saft verabreicht. Zu

Beginn der Studie und nach 4 und 12 Wochen Supplementierung wurde mit einem

Sonnenlichtsimulator ein Erythem induziert. Zu den gleichen Zeitpunkten wurde der

Gehalt an Carotinoiden im Serum und in der Haut der Teilnehmer untersucht. In allen

Gruppen konnte ein Lichtschutzeffekt durch die Behandlung mit Lycopin

nachgewiesen werden. Die Intensität des mit gleicher Strahlungsdosis induzierten

Erythems war am Ende der Studie geringer als zu Beginn. Die Schutzwirkung war in

allen Gruppen, die Lycopin aus natürlichen Quellen zu sich nahmen, statistisch

signifikant. Weniger ausgeprägt und deshalb nicht statistisch signifikant war der

Effekt nach 12-wöchiger Gabe von synthetischem Lycopin. Die UV-protektive

Wirkung korrelierte mit dem Anstieg des Lycopins im Serum und der

Gesamtcarotinoide in der Haut.

In den Supplementen aus natürlichen Quellen waren zusätzlich zum Lycopin

insbesondere noch die im UV-Bereich absorbierenden Carotinoide Phytoen und

Phytofluen vorhanden. Untersuchungen des Serums zeigten, dass die

Konzentrationen dieser Carotinoide ebenfalls während der Studie anstiegen. Der

Anstieg war besonders ausgeprägt beim Photofluen; hier konnten Serumwerte

gemessen werden, die die der anderen Carotinoide (auch des Lycopins) übertrafen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass auch Phytoen und

Phytofluen UV-protektive Wirkung beim Menschen haben und zum UV-Schutz

beitragen können.

In vitro Untersuchungen zeigten auch, dass Lycopin, Phytoen und Phytofluen

UV-induzierte Signalkaskaden in Fibroblasten und Keratinozyten beeinflussen

5. Zusammenfassung

101

können. Die UV-induzierte Expression der Kollagenase (MMP-1) in Fibroblasten

wurde vermindert, wenn die Zellen mit Lycopin für 48 Stunden inkubiert wurden.

Die durch UV-Bestrahlung erhöhte Interleukin-6-Produktion in Keratinozyten

konnte durch die Inkubation der Zellen mit einem Phytoen/Phytofluen-Gemisch für

24 Stunden verringert werden.

Mithilfe eines Biomembranmodells wurden weiterhin die antioxidativen

Eigenschaften von Carotinoiden untersucht. Dazu wurde eine Methode zur

Bestimmung der Lipidperoxidation in unilamellaren Liposomen etabliert. Den besten

Schutz der Lipidmembranen vor Oxidation wurde durch die polaren Xanthophylle und

das apolare Phytoen erreicht. Keinen Effekt zeigte ß-Carotin, während Lycopin sich

als Prooxidans erwies.

Die vorliegende Arbeit zeigt auf, dass ein endogener Sonnenschutz durch

Nahrungscarotinoide erzielt werden kann. Lycopin oder Abbauprodukte des Lycopins

leisten einen Beitrag zur Photoprotektion der menschlichen Haut. Darüberhinaus

scheinen Phytoen und Phytofluen einen zusätzlichen Schutzeffekt auszuüben.

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Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von 1999 – 2002 im Institut für

Physiologische Chemie I der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf durchgeführt.

Mein besonderer Dank gilt daher Herrn Professor Dr. Wilhelm Stahl für die

Überlassung des überaus interessanten Themas dieser Arbeit sowie die

wissenschaftliche Betreuung im Verlauf der Durchführung.

Ebenso gilt mein Dank Herrn Professor Dr. Dr. Helmut Sies für vielfältige

Anregungen und für die Möglichkeit, diese Arbeit in seinem Institut durchführen zu

können.

Herrn Professor Dr. Hans-Dieter Martin (Institut für Organische und

Makromolekulare Chemie I, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf) danke ich sehr

für sein großes Interesse an dieser Arbeit und für die Übernahme des Korreferates.

Frau PD Dr. Ulrike Heinrich und Herrn Professor Dr. Hagen Tronnier (Institut

für Experimentelle Dermatologie, Universität Witten-Herdecke) danke ich für die

Kooperation. Darüber hinaus möchte ich mich sehr bei PD Dr. Peter Brenneisen, PD

Dr. Lars-Oliver Klotz und Professor Dr. Tankred Schewe, aber auch bei Dr. Holger

Steinbrenner, Cristy Ramos und Domink Stuhlmann für ihr stetes Bemühen um

fachliche Beratungen und konstruktive Gespräche bedanken. Ein besonderer Dank

gilt auch für Dr. Antonio Perez-Galvez für seine unermüdliche Hilfestellungen im

Fach der organischen Chemie. Andrea Borchardt und Ferdinand Grawe (Institut für

Genetik, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf) danke ich herzlich für die Aufnahme

und Entwicklung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen.

Ich danke weiterhin allen weiteren Mitarbeitern des Instituts für ein

ausgezeichnetes Arbeitsklima aber auch für zahlreiche Hilfestellungen, insbesondere

Dr. Darius Buchczk, Dr. Peet Schröder, PD Dr. Cristina Maria Polidori-Nelles,

Nilofaar Ale-Agha, Alejandro Betancor, Ira Melchheier, Sabrina de Almeida Marques

und Marlies Scholtes. Mein besonderer Dank gilt aber auch meinem Laborkollegen

Peter Graf für seine stetige Hilfsbereitschaft in technischen und inhaltlichen Fragen

und für die herausragend gute Arbeitsatmosphäre.

Nicht zuletzt möchte ich mich auch bei meinen Eltern, die mir diese

Ausbildung erst ermöglichten, meiner Großmutter und bei meiner Sandra Quinting

herzlichst bedanken, die mich während der Arbeit nach besten Kräften unterstützt

haben und so zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

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Untersuchungen zu UV-protektiven Effekten · 2.2.3 Bestimmung von Carotinoiden in Serum-, Zellmedium- und ... BHT 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Car Carotinoid CD Konjugierte Diene