Wilhelm Roux' Archiv 178, 51--69 (1975) �9 by Springer-Verlag 1975

Ver/inderungen der Oenozyten und ihre Funktion w/ihrend der Metamorphose

bei Schw~irmern und Zahnspinnern

Christel Hintze-Podufal*

I. Zoologisches Institut der Universit~t GSttingen, Lehrstuhl Entwicklungsphysiologie

l~eceived January 1st, 1975

Accepted April 16, 1975

Changes of Oenocytes and their Func t i on during Metamorphosis of Sphingidae and Notodont idae

Summary. Oenocytes of the last larval instar and the pupa of Cerura vinula and Spinx ligustri have been examined, and their structure described. The activity phases of the oenoeytes at the time of both moultings, as well as during the last larval instar prior to an externally visible color change and prior to the pupal ecdysis i.e. during color change stage III) were clearly related to the process of metamorphosis, which was occurring in the larvae at this time 2--4 months after pupal ecdysis, diapausing pupae still show active larval oenocytes. Activity phases are characterized by many large and small vacuoles in addition to channel-like cyto- plasmatic structures, heavily branched nuclei and extensive cell processes and infoldings of the cell membrane. In the pharate pupal stage (eolour change stage IV) the imaginal oenoeytes originate from the hypodermis, becoming active just prior to the adult ecdysis.

Haemoeytes containing neurosecretory material attach themselves to the oenocytes and enter through infoldings of the cell membrane. Lipids, which are particularly abundant during active phases, could be demonstrated in the cytoplasm as well as passing from the fatty tissue closely surrounding the glands. Glycogen was also present in the oenoeytes. There was, however, no noticeable relation of these materials to the rhythm.

Physiological experiments demonstrated that oenocytes as well as prothoracic glands, when active, secrete the moulting and metamorphosis hormone. Both glands initiate the process of colour change. Brain tissue, containing active neurosecretory cells, or cholesterol, may stimulate the prothoracic glands and the oenoeytes to secrete their hormone.

Zusammenfassung. Von Cerura vinula und Sl)hinx ligustri wurden die Oenozyten im letzten Larvenstadium und in der Puppe untersueht und ihre Struktur beschrieben. Ihre Aktivitgts- phasen liegen zur Zcit der beiden H~utungen (Larven- und Puppenh~iutung) und im letzten Larveninstar vor der Umfgrbung, einem gul3erlieh sichtbaren Metamorphoseschritt, und vor der Puppenh~iutung im FS.rbungsstadium III. Sic stehen mit den Umwandlungsprozessen, die in den Raupen zu diesem Zeitpunkt stattfinden in deutliehem Zusammenhang. - - 2--4 Monate nach der Puppenh~utung sind in den diapausierenden Puppen noeh aktive larvale Oenozyten vo rhanden . - Aktivit~tsphasen sind charakterisiert durch viele groBe und kleine Vakuolen neben kanalartigen Strukturen im Zytoplasma, stark verzweigte Kerne und weitreichende Zellaus- und -einbuehtungen.

Im Vorpuppenstadium (Fgrbungsstadinm IV) entstehen die imaginalen Oenozyten aus der Epidermis, sic werden erst kurz vor der Adulthgutmlg aktiv.

Itaemozyten, neurosekrethaltig, legen sieh dieht an die 0enozyten an und dringen zwisehen Zelleinfaltungen ins Innere vor.

Lipide, besonders reichlieh in aktiven Phasen vorhanden, konnten sowohl im Zytoplasma nachgewiesen werden, ~ls auch ihr ~bertritt aus dem Fettgewebe, das den Driisen eng anliegt.

* Mit dankenswerter Unterstfitzung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.

52 Ch. Hintze-Podufal

Glykogen tritt ebenfalls in den Oenozyten auf, seine Menge steh~ aber in keinem merk- lichen Zusammenhang mit den Zellrhythmen. Physiologische Versuehe beweisen, dab die Oenozyten und aueh die Prothorakaldriisen in aktiven Phasen das H~utungs- und Metamor- phosehormon abgeben. Sie 15sen beide den UmfS, rbungsprozeB arts. Gehirne mit neurosekre- torischen Zellen in aktiver Phase oder Cholesterin k6nnen die Prothorakaldrfisen und z.T. auch die Oenozyten zur Abgabe ihres Hormons anregen.

Die postembryonale Entwicklung yon Insekten wird yon den beiden Hormo- hen, Juvenilhormon und Ecdyson, gesteuert. Abnahme des Juvenilhormontiters in spi~ten Larvenstadien und Zunahme des Steroidhormons, Ecdyson, fiihren zur Metamorphose. Generell finder w~hrend der ganzen Entwieklung keine Hi~utung ohne Ecdyson start. Untersuehungen yon Bodenstein (1938), Fukuda (1940, 1944) und Williams (1947) haben gezeigt, dab die Prothorakaldrtisen diejenigen Organe sind, die fiir die Metamorphoseprozesse verantwortlieh sind. Im Gegensatz hierzu standen lallge Zeit Ergebnisse aus Transplantationsexperimenten yon Piepho (1948) und yon Chadwick (1956). Bei ihnen traten nach Entfernen der Prothorakaldriisen aus den Larven der Waehsmotte, GaIleria mellonella, und der Schabe weitere H~utungen auf, z.T. sogar Imaginalh/~utungen. Gersch und Stiirze- beeher (1971) haben diese Befunde bestatigt. Das tI/~utungs- und Metamorphose- hormon muf~ noch yon anderen Organen gebi]det werden, die im Abdomen liegen kSnnten, wie die Befunde yon Gersch and Stiirzebecher (1971), Nakanishi u.a. (1972) und Weir (1970) belegen. Locke (1969) fand wohl als erster, sp~ter auch Gnatzy (1970), in den Oenozyten Strukturen, die fiir eine Steroidsynthese in Frage kommen.

In den vorliegenden Untersuchmlgen wurde zun~ehst die Struktur der Oeno- zyten eines Zahnspinners, Cerura vinula L., und eines Schws Sphinx ligustri, im Verlauf des letzten Larven- und Puppenstadiums histologisch ermittelt. AnschlieBend sell in physiologisehen Experimenten ihre Wirkungsweise im Ver- gleich mit den Prothoraxdriisen auf einen Metamorphoseprozeg, die sogen. Umf~irbung gekl~rt werden, deren Eintritt einen erhShten Ecdysonspiegel erfordert (Biickmann, 1965). In beiden Raupenarten treten im letzten Larvenstadium am Ende der FreBperiode Farbver~nderungen im Integument auf, die mit Auf- und Abbauprozessen an inneren Organen w/~hrend der Umwandlung der Larve in die Puppe korrelieren. Dieser Farbweehselproze6 eignet sich besonders gut ftir die L6sung der Fragestellung, ob aktive Oenozyten yon diesen beiden Raupenarten in der Lage sind, tats~chlich das Hi~utungs- und Metamorphosehormon abzugeben.

Material und Methoden

1. Tiermaterial Von erwachsenen Raupen, Puppen und Imagines des Grogen Gabelschwanzes, Cerura

vinula L. (Notodontidae), und Ligustersehw~rmers, Sphinx ligustri L. (Sphingidae), wurden die Oenozyten untersucht. Beide P~aupenarten werden j~ihrlieh unter konstanten Bedingun- gen, bei einem L: D-Wechsel yon 16 : 8 h, einer rH von 60: 80 % in 25 ~ C aufgezogen. Unter die- sen Bedingungen fressen die erwachsenen Raupen yon Cerura vinula dm'chschnRtlich 4 Tage, die yon Sphinx ligustri 5 Tage lang. Danach veri~ndert sich die Farbe durch Ommochrom- bildungen in der Epidermis bei C. vinula iiberwiegend im la~eralen Integument yon grfin nach rot, bei Sp. ligustri im dorsalen yon grfin nach braun. Dieser Prozeg ist ein morphologischer Farbwechsel, er wurde an C. vinula yon Bfickmann (1953) Um]Srbung genannt, und der Zeitabschnitt bis zur Verpuppung in sogen. F~rbungsstadien unterteilt. Der Abschnitt nach

0enozytenver~Lnderungen und Funktion wghrend der Metamorphose 53

L U P o ,o? o:1 ,,, ,v

Tage n.Htg. [ 1 2 5 6 7 8 9 10 12 1

Abb. 1. Die Einteilung des letzten Larvenstadiums von Cerura vinula in Stadien und Tags nach der letzten Larvenhgutung, L. Htg Hgutung. P Puppenh~Lutung. U Umf~rbung

der letzten Larvenhgutung bis zur Umfgrbung, in dem die P~aupen fressen, ist das sogen. O-Stadium. Aus der Abb. 1 geht die Einteilung des Ietzten Larvenstadiums in dis O- und Um/Sr- bungsstadien hervor, und aul3erdem ihre durchschnittliche Zeitdauer, am Beispiel yon C. vinula. Auch bei den t~aupen von Sp. Iigustri treten nach der Umfgrbung bis zur Puppen- h~utung geringe stufenweise Farbabweichungen auf, die sich sehr gut in dieses Schema einpas- sen lassen. In den vorliegenden Untersuchungen wurde stets einheit]iches Tiermaterial genommen, dessen Entwicklungszeiten genau diesen Daten entspraehen. Da auBerdem beide l~aupenarten nebeneinander aufgezogen werden konnten, waren immer gentigend gleichalte Stadien yon beiden Arten ffir die ph-ysiologischen Versuehe vorhanden.

2. Methodik Fflr die histologischen Untersuchungen wurden die Oenozyten fast immer aus den Raupen

herauspri~pariert. Sie lassen sich nach einer Fgrbung mit Neutralrot sehr gut yon dem in den erwachsenen l~aupen sehr reichlich ausgebildeten Fettgewebe unterseheiden, was die PrE- paration in lebenden Raupen erleichtert. Ftir die Anfertigung yon Paraffinschnitten babe ich sie in Bouin-LSsung oder Bouin-Allen bei 30--40~ fixiert, tiber Alkohol, Methylbenzoat entw~tssert, in Para:91ast eingebettet, 3--5 ~m dick geschnitten und mit Azan novum, Chrom- Hiimatoxylin-Phloxin nach Gomori (1952) oder Eisen-H~i.matoxylin nach Heidenhain gefgxbt. IVlit histochemischela Naehweisverf~hren sollte ermittelt werden, ob sie Lipide und Glykogen enthalten und sieh deren Menge w~Lhrend der Metamorphose ver~ndert.

Lipide konnten naeh Fixieren in Formol-Alkohol oder Formol-Calzium und F~rben mit Sudan-Schwarz B nach Chiffele und Putt, Sudan III, IV naeh Kay und Whiteheade oder Nilblausulfat erkannt werden. In Glycerin-Gelatine eingebettet sind diese Pr~parate haltba.r. Zum Lipoidnachweis in Paraffinschnitten wurden die Drtisen in einer LSsung yon 0,1%iger OsOa, gepuffert mit 0,1 m Natriumphosphat oder Veronalacetat nach Michaelis, fixiert.

Glykogen wurde nach Fixieren in Formol-Alkohol oder Bouin und Fgrben mit Karmin nach Best (s. Schulze-Graupner) ermittelt. Das Glykogen im Zytoplasma wird danach rot, die Kerne blau. Nach Vorbehandeln der Prgparate mit Diastase (ira Speichel), waren die Strukturen, die in unbehandelten Pri~paraten na.ch der Best-~{ethode gefi~rbt waren, nun farblos und damit d.as Glykogen her~usgel6st worden. Dieser zusgtzliche Negativtest half das Vorkommen yon Glykogeu eindeutig zu belegen.

Die physiologischen Versuehe werden in dem entsprechenden Abschnitt genau beschrieben. Zellmessungen: Von jedem Stadium wurde aus Sclmittserien der grSl3te L~ngsdurchmesser

von 100 Zellen ausgemessen, der Mittelwert erreehnet und, da die ZellgrSge erheblich variiert, in der Tabeile 1 aul~er dem Mittelwert auch die grOgte untere und obere Abweichung einge- tragen. Dfinne Zytoplasmafortsgtze wurden nicht in das MeBergebnis mit einbezogen.

Befunde

1. Die Oenozyten yon C. vinula und Sp. ligustri, ihre Lage und Form

I n den lebenden Raupen voI1 C. vinula und Sp. ligustri sind sie Oenozyten grog und hi~ufig gelb gef~rbt. Sie haben einen durchsctmit t l ichen Lgngsdurch- messer yon 161,59 ~m und kSnaen dadurch bereits mi t einer einfachen Lupe e rkann t werden. Aus der Tab. 1 k6nnen die Mittelwerte yon 100 Messullgen pro Larvens tadium, so wie ihre un te ren mid oberen Abweichungea abgelesen werden. Die enorme Schwankungsbrei te im Lgngsdurchmesser yon 100 bis fast 200 ~m in

54 Ch. Hintze-Podufal

Abb. 2. Raupe yon C. vinula vonder Seite. Die KSrperwand wurde tiber den Oenozyten entfernt. K Kopf, M Nuskul~tur, Oe Oenozyten

Tabelle 1. L~ngsdurehmesser der Oenozyten (fxm) im letzen Larvenstadium und der Puppe

Stadien- 01 02 03 04 I bezeiehnung

M 161,2 156,8 174,6 209,5 169,9 uA 120 110 110 130 120 oA 220 220 240 330 240

Stadien- II III IV fP spP bezeichnung

M 143,3 162,0 139,4 158,7 145,5 uA 110 120 80 70 70 oA 240 220 300 260 240

M Mittelwert. uA untere Abweiehung. oA obere Abweichung. Die Aktivit~tsphasen sind fettge- druekt.

einzelnen Stadien wird deutlieh. Die Oenozyten liegen in den Raupen beider untersuehter Arten aussehlieBlich im Abdomen und zwar in jedem stigmentragen- den Segment. Mehrere Zellen treten auf beiden KSrperseiten, losgelSst von der Epidermis, zu einer grSl~eren Ansammlung zus~mmen und erstreeken sieh in der KSrperh6hle etwa yon der HShe der Stigmen an Traeheen ent.lang abwgrts bis zur Ganglienkette auf der VentrMseite. In tieferen Bereiehen orientieren sie sieh an der segmentalen Dorsoventral- und Diagonalmuskulatur. An der Beinmuskulatur entlang kSnnen sie his in die Saugfiifie der Abdominalbeine verfolgt werden. Abb. 2 zeigt eine Seitenansieht von C. vinula. Die K6rperwand wurde mit einem Teil der Muskulatur entfernt und dadureh der Bliek auf die Oenozyten freigelegt. Die Abb. 3 a ist eine Aufsieht auf 2 Segmente einer sezernierten i~aupe, vonde r der tIauptanteil des Fettgewebes, der Darm, Spinndriisen und Gonaden entfernt wurden. Die Oenozytengruppen liegen beiderseits der Ganglienkette. Allgemein sind sie zwisehen den Fettzellen unregelm~l~ig verteilt (Abb. 3 b) und stehen mit ihnen sehr h~ufig in engem Kontakt. In den erw~ehsenen Raupen hat d~s Fett- gewebe den grSfiten Umfang erreieht and umhiiltt die Oenozyten nun vollst/~ndig. Augerdem haben beide Gewebetypen nun entweder eine weii3e oder im 2. Drittel

0enozytenver~nderungen und Funktion w~hrend der Metamorphose 55

a

Oe

G

Oe

M

b 0 , 2 m m

I I Abb. 3~ u. b. Die Anordmung der Oenozyten seitlich des Nervensys~ems, Aufsieht (a). G Gaag-

lion. M Muskulatnr. Oe Oenozyten. (b) Vergr/~fterung

des Stadiums gelbe Farbe. Dadureh werden Prgparationen und Beobaehtungen an den Oenozyten erheblieh ersehwert.

Die Gr6Be der Oenozytengruppen sehwa, nk~ in den aufe~anderfolgenden Abdominalsegmenten bei beiden Raupenarten in der gleiehen Weise. In den 4 beintragenden Segmenten bestehen die Gruppen auf beiden K6rperseiten aus jeweils 80--100 Einzelzellen, die in einer loekeren Traube hinter- und nebeneinan- der angeordnet sind. I-Iierzu wurden yon beiden Arten jeweils 20 l~aupen aus-

56 Ch. Hintze*PodufM

a ' ~ 50#m

b Abb. 4u u. b. Oenozyten mit Plasmaforts~tz. (a) TotMpr~pa.rat, (b) Schnitt

gez/~hlt. In den fibrigen stigmentragenden AbdominMsegmenten ohne Beine, liegen die Oenozyten auffMlend diehter gepaekt nebeneinander, ihre Zahl pro Gruppe schwankt zwischen 50 und 75.

Ebenso wie die Gr613e, schwankt auch die /~u/3ere Form der Oenozyten yon rund oder hexagonal fiber birnenf6rmig zu oval. Sie kSnnen auch spindelartig tlach und lang ausgezogen sein. Ihr gr613ter Durchmesser is~ ganz allgemcin dorsoventral orientiert. Faden~rtig dtinne Zytoplasmaforts~tze verbinden die Zellen oft untereinander (Abb. 4).

Von den segmentalen Ganglien gehen Nervcnfiste ab, die sieh sehr fein ver- zweigen und an einzelne 0enozyten her~ntreten, was nach Methylenblauf~rbungen beobaehtet werden kann. Die Nerven tragen ebenso wie die Plasmaforts/~tze der DrtisenzeIlen und vor Mlem die zahlreichert leinen Tracheenkapillarert (Abb.3 b), die die 0enozy~en reiehlieh umspinnen und mit Sauerstoff versorgen, zu einem loekeren Zusammenhalt dieser Zellpopulation bei.

Oenozytenvergnderungen und Funktion wghrend der Metamorphose 57

2. Histologisch er]cennbare VerSnderungen in den Oenozyten w~hrend des letzten Larvenstadiums und der Metamorphose

Rhythmisehe Strukturvergnderungen kennzeichnen einen Aktivit~itszyklus in den 0enozyten yon C. vinula und Sp. ligustri, der deutlich mit dem Ablauf yon Metamorphoseprozessen und ihrer Steuerung durch andere endokrine Driisen zusammenhgngt.

Wghrend und nach der 4. H~utung zum 5. Larvenstadium, solange die Ranpen- kutikula nicht sklerotisiert ist, sind die 0enozyten im Stadium O1 (Abb. 1) durch eine A]~tivitStsphase ausgezeichnet. Viele kleine Vakuolen liegen stemf6rmig oder konzentrisch um den Kern. Das Zytoplasma ist feingranulgr und wolkig, der Zellumril3 glatt oder leieht geschwungen, und eine bindegewebige Basalmembran, in Azan gefgrbten Prgparaten leuchtend blau, nmgibt jede einzelne Zelle (Abb. 5 a, 6a). Der Kern reicht mit stark verzweigten Asten weit in das Zytoplasma hinein. Sein Chromatin ist grobk6rnig nnd gleiehmggig verteilt, ein schmalerNnkleolus vorhanden. In Schnittpriiparaten wird er oft yon einem optiseh leeren Bereich umgeben, ebenso wie der Kern selbst.

6~12 Std spiiter im Stadium O1 haben die Oenozyten eine bizarre Form nnd weite Zellaus- und -einbuchtungen, die Selcretabgabephase ist erreieht (Abb. 5b). Die zahlreiehen kleinen Vakuolen des Vorstadiums sind an der Zellperipherie zu groften Lakunen zusammengetreten. Ihr Inhalt ist in fixierten und gefgrbten Sehnitten flockig und naeh Azanf~trbnng hellblau. Sehnittserien zeigen dentlieh, wie das Plasmalemm zerreiBt und der Vakuoleninhalt in die umgebende Hgmo- lymphe austritt. Kanalartige Strukturen dnrehziehen die Zellen vom Kern zur Peripherie. Das Zytoplasma ist in Kernnghe deutlieh basophiler. Aueh in diesem Stadium verdr/ingen im Kernraum ausgedehnte leere Vakuolen das feink6rnige Chromatin. Wenige knrze Kernauslgufer reiehen in das Zytoplasma hinein.

Am 2. Tag naeh der Hiiutung, im Stadium 02, sind die Oenozyten in einer funk- tionellen Ruhephase (Abb. 5 e). Ihre Zellgrenzen sind ann/thernd glatt und homo- genes Zytoplasma, in kernnahen Bereiehen basophiler, charakterisiert die Zellen ebenso wie ein heller 8aum an der Peripherie und ein groBer, beinahe unverzweigter Kern. Das Chromatin ist rein- bis grobk6rnig nnd hgufig zus~mmengeballt.

Ein neuer A~tivitiitszylclus beginnt am folgenden Tag mit dem Stadium 03. Das Zytoplasma ist nun feink6rnig aber wolkig aufgeloekert und das Chromatin flockig. Anffallend vide Blutzellen treten in engen Kontakt mit den Oenozyten (Abb. 5d, 6b). E)ltweder legen sie sieh dicht an die Zellen an, oder dringen dureh die Basalmembran weit in Zelleinbuehtungen vor. Ihr Zytoplasma ist mit gomori- positiven Substanzen angefiillt, die den Granula der neurosekretorisehen Zellen gleiehen.

Aueh im Stadium 04 bleibt der enge Kontakt zwisehea Blutzellen und Oeno- zyten bestehen. In Sehnittprgparaten wird deutlich, dab das Zytoplasma von den Driisenzellen im Bereieh einer anliegenden Haemozyte fast optisch leer oder vakuolenartig aufgeloekert ist. Es seheint ein enger Stoffaustauesh zwisehen beiden Zellarten stattzufinden. Der AlctivitiitshShepunlct vor der Umf~rbung, d.h. allgemeingesproehen vor dem Beginn der Verpuppungsprozesse i.w.S, ist erreieht. Eine Unzahl groBer und kleiner Vakuolen liegen wabenartig dieht aneinander und umgeben den Kerrt konzentriseh (Abb. 5e). Das Zytoplasma in Kernn~the wieder ausgesprochen basophil, wird von kanalartigen Strukturen durehzogen. Der Kern

58 Ch. Hingze-Podufal

i:l,

Ha~

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N K V

b e

V -

0,1mm I

Abb. 5a--I. Aktivitiitszyklus der Oenozyten im letzten Larvenstadium. (a) und (b) Stadium 01. (e) Ubergang 01 in 02. (d) Stadium 03. (e) und (f) 04. Hae Haemozyten. K Kern. N Nukleo-

lus. V Vakuolen

hat stets einen grogen Nnkleolus, gleiehm&Big verteiltes Chromatin und lange Ausl/~ufer. Gegen Ende des gleiehen Tages sind die Oenozyten bizarr verformt, kanalartige Strukturen dnrehziehen das Zytoplasma, und zisternenartig groge Vakuolen an der Peripherie kennzeiehnen die Sekretion.sphase (Abb. 5f).

0enozytenvergnderungen und Funktion wg~hrend der Metamorphose 59

a e

&

a 125'um I 150'uml b

, H a e

c , ~:~,~ ~ a e 150pm I

Abb. 6. (a) Oenozyten im Stadium 01. (b) Stadium 03 mit neurosela'etbeladenen Haemozyten Hae. (e) Um- f~irbungsstadium I, Haemozyten umlagern die Drtisenzellen und dringen ein. (d) Stadium III. (e) Stad. IV.

B Basalmembran. K Kern. V V~kuolen

60 Oh. Hintze-Podufal

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C J -I Abb. 7. (~) Oenozy ten im F g r b u n g s s t a d i u m I I m i t I{aemozyten a n und in der Zelle, Zyto- p lasmafor tsa tz . (b) F ~ r b u n g s s t a d i u m I I I m i t kang la r t igen S t r u k t u r e n K n und Vakuo len V.

(c) S t ad ium IV

Oeno~;ytenvergnderungen und Funktion wghrend der Metamorphose 61

a

V ~ ~ ~ ~ ~ : [I

C

d Abb. 8~--e. Oenozyten im Puppenstadium. (a) W~hrend der H~utung, (b) 14 Tage, (c) 4 Wochen,

(d) 2 Monate, (e) 4 ~fonate spEter. F Fettgewebe

62 Ch. Hintze-Podufal

Im folgenden Um/grbungsstadium I (Abb. 1), einem erneuten Ruhestadium, haben die Kerne z.T. noch verzweigte lange Ausl~ufer, aber das Chromatin ist. aufgelockert und flockig, das Zytoplasma homogen. Die Driisenzellen werden yon zahlreichen Haemozyten umgeben, die sich entweder dicht an sie anlegen oder in Zelleinbuchtungen weit vordringen.

Ab F~irbungsstadium II wird das Zytoplasma wieder in kernnahen Bereichen basophiler, die Zellen bilden lange, fadenfSrmig diinne Zellausls aus (Abb. 4, 7 a) und haben flockig znsammengeballtes Chromatin und einen grol3en Nukleolus. Kern und Zytoplasma heben sich deutlich voneinander ab. Die Kernstrukturen deuten eine zunehmende Aktivitiitsphase an. Sie erreieht im folgenden Fiirbungs- stadium HI ihren absoluten t t6hepunkt vor der Puppenh~utung. Die Zellen sind stark verformt, bilden viele weitreiehende Aus- und Einfaltungen aus, und groge wie kleine Vakuolen liegen im Plasma neben kanalartigen Strukturen, die an der Zellperipherie zu Zisternen mit floekigem Inhalt erweitert sind (Abb. 6 d, 7 b). Der Kern ist so stark verzweigt, dab er in Sehnittpr/~paraten manehmal sehwer erkannt werden kann. Die Oenozyten werden in diesem Stadium vom umgebenden Fettgewebe vollkommen eingesehlossen und nehmen engen Kontakt auf. Die Driisenzellen phagozytieren Granula, anseheinend Lipide, aus den Fettzellen. Am Ende des Fgrbungsstadinms I I I begirmt bereits die Selcretionsphase, die bis in das sp/~te Fiirbungsstaduim IV, das Vorpupl~enstadium, hineinreicht (Abb. 6e, 7). Homogenes Zytoplasma, gro6e lakunenartige Vakuolen an der Ze]lperipherie mit floekigem Inhalt, sowie ein groSer Kern mit grobem, gleichm/~Big verteiltem Chromatin charakterisieren diese Phase. Die Basalmembran hebt sich in den Sehnitten farblieh kontrastreich yon den Zellen ab und reieht in Zelleinfaltungen welt in das Innere vor. Unter ihr platzt das Plasmalemm und der Vakuoleninhalt wird frei.

Im Fiirbungsstadium IV, der Vorpuppe, wird yon der Epidermis eine neue 0enozytengeneration, die sogen, imaginale, abgespalten. Diese Zellen sind rund bis oval und lassen sich kaum anf/~rben. Mit einem durehsehnittliehen L~ngs- durehmesser yon 28,7 ~zm haben sie zu diesem Zeitpunkt ca. 1/5 yon dem Lgngs- durchmesser der larvalen Oenozyten erreieht.

W~hrend der Puppenh~iutung sind die larvalen Oenozy~en erneut, wie z. Zeit- punkt der letzten Larvenh/~utung, a~tiv (Abb. 8 a). Die zytoplasmatischen Vakuolen liegen der Kernmembran so dieht an, dab eine Beteiligung des Kernes an der Sekretbildung mSglieh erseheint. Die Oenozyten sind noeh lange naeh der Puppen- hs in der diapausierenden Puppe aktiv. Die Abb. 8 b zeigt eine typisehe Oeno- zyte 2 Tage, die Abb. 8e 14 Tage naeh der Puppenhgutung iiberwiegend in der Sekretionsphase. Selbst Haemozyten, mit Neurosekret beladen (Abb. 8 c), kSnnen bis 4 Wochen nach der Puppenh/~utung in engem Kontakt mit den Drtisenzellen beobachtet werden. 2 Monate naeh der Puppenh~utung deuten basophiles Zyto- plasma Kernnghe und Vakuole~ im Zytoplasma noeh eine schwaehe Zellaktivits an (Abb. 8d). 4 Monate spgter sind die larvalen Oenozyten noeh vorhanden, haben einen unregelm~tl3igen Zellumril3, homogenes Zytoplasma, verzweigte Kerne und diehten Kontakt mit dem Fettgewebe (Abb. 8 e). Degenerationserseheinungen mit histolytisehen Ver/~nderungen treten erst gegen Ende der Diapause in ihnen auf und zwar etwa zum Zeitpunkt, zu dem die imaginalen Oenozyten (LS~ngs- durehmesser 64,3 ~m) vor der Adulths aktiv werden. In den Imagines konnten keine Oenozyten gefunden werden.

Oenozytenver~nderungen und Funktion w~hrend der Metamorphose 63

L U P III IV

Stadien 0 1 1 0 : l O : l O t l l 5 6 7 8 9 10 Tage n.Htg.

h AAA �9 AAA �9 &AA AA& G nu �9 NN i l l I I I I

& & A

I I I �9

20-~,,,30~#g Ecdysteron/g Frischgewicht

I II III IV lip ~ p

Abb. 9. Aktivit~tsphasen der Oenozyten (Oe); Lipid-(L) und Glykogenvorkommen (G); zum Vergleich hierzu der Ecdysongehalt in den gaupen (aus vorli~ufigen Versuchsergebnissen,

Biickmann,, 1974)/P frische Puppe; sp sp~te Puppe

3. Histochemische Be/unde

Die angewendeten Nachweisverfahren gaben AufschluB fiber das Vorkommen yon Lipiden und Glykogen in den Oenozyten wghrend der Metamorphosestadien, dargestellt in Abb. 9. Oenozyten mit starker Zellaktivitgt haben anch einen hohen Gehalt an Lipiden, in der Abb. 9 mit 3 ansgefii]lten Dreiecken gekenn- zeichnet; das ist wghrend der Larven- und Puppenhgutung, vor der Umfgrbung im Stadium 04 und vor der Puppenhgutung im Stadium I I I und IV. Im Zyto- plasma iiberwiegen auf Grund der positiven Naehweise neutrale Lipide, an der Zellperipherie und an der BasMmembran zwisehen Zelleinfaltungen deuten osmiophile Grana auf ungesgttigte Lipide, die aus dem umgebenden Fettgewebe austreten. Glykogen, bei anderen Lepidopteren yon Beaulton (1968) nachgewiesen, ist im Zytoplasma der Oenozyten yon C. vinula und Sp. ligustri vorwiegend in kernnahen Bereiehen nachweisbar. Sein GehMt zeigt in den untersuchten Stadien keine bedeutsamen Vergnderungen (Abb. 9). Lediglieh im Stadium 03 vor der Umfgrbung und in der spiiten Diapause nahm der Glykogengehalt im Plasma deutlich ab.

4. Physiologische Experimente zur Funktion der Oenozyten

In den erwachsenen l~aupen yon C. vinula und Sp. ligustri beginnen die Meta- morphoseprozesse i.w.S, nach der Frel3periode. Eine deutiiche Farbver~nderung im Integument zeigt diese Phase an. Der Umfs ist abh/ingig yon einem bestimmten Hormonverhs der beiden Hormone Ecdyson und Juvenil- hormon (Hintze, 1969; Hintze-Podufal 1971, 1974, 1975; Hintze-Podufal u.a. 1971a). Ein hoher Ecdysonspiegel 16st die Umf&rbung aus (Biiekmann, 1965). Da die Strukturver&nderungen in den Oenozyten der beiden untersuchten Raupen- arten einen deutlichen Zusammenhang zu diesem ProzeB zeigen, sollte ihre

64 Ch. Hintze-PodufM

Bedeutung im physiologisehen Experiment im Vergleieh mit den Prothorakal- driisen gekl/~rt werden. Aus anderen Insektengruppen liegen deutliche tIinweise fiir die Abgabe des It/iutnngs- und Metamorphosehormons Eedyson aus diesen beiden Organen vor (z.B. Gnatzky 1970 und naeh Beendigung des Manuskriptes Romer 1974). Leider kSnnen die kl~ssisehen Aussehaltversuehe zur Deutung der Funktion eines Organs am gleiehen Tier mit den Oenozyten an diesen Raupen nieht durehgefiihrt werden, da diese Zellen wie besehrieben, in ausgedehnten Gruppen von 8 abdominalen Segmenten liegen.

In den folgenden Versuehsserien wurden jeweils 20 C. vinula und Sp. ligustri gleiehen Alters, zu Beginn des Stadiums 04, eine Ligatur zwisehen Thorax und Abdomen und eine weitere zwisehen Kopf und Thorax angelegt. Thorax mit Prothoraxdriise und Abdomen mit den Oenozyten waren voneinander isoliert, eine gegenseitige Beeinflussung und die dureh das iibergeordnete Zentrum des neuro- sekretorisehen Systems, das Gehirn, ausgesehaltet. Trat n~eh 1--2 T~gen kein Farbweehsel im Integument auf, konnten die Versuehe beginnen.

Serie 1. Jeder Raupe wurde in den Thorax und das Abdomen 3--5 aktive Gehirne aus Spendern des Umf/irbungsstadiums II, I I I ( = aktivstes Stadium der neurosekretorisehen Zellen, Itintze 1968) implantiert. Ergebnis: das thorakMe Integument verf~rhte sich bei beiden Raupenarten naeh 12--16 Std. Die wirts- eigenen Prothoraxdrtisen sind damit dureh das Neurosekret aktivierb worden, was den Umf/~rbungsprozeg ausl6ste. Das abdominale Integument blieb bei 12 yon 26 Raupen fast unvergndert, wS~hrend die restliehen eine eindeutige Farbver~n- derung (Umfs zeigten. Demnaeh wurden die Oenozygen nieht in allen Raupen yon den Gehirnen aktiviert.

Serie 2: Cholesterin, eine Vorstufe des Eedysons, wurde, in 10% Athanol/ Ringer gelSst, in Thorax und Abdomen injiziert. Ergebnis: im Thorax bei 16, im Abdomen bei 12 Raupen yon 20 positiv. Diese Zahlen sind Durehsehnittswerte von 5 Serien dieser Art an beiden I{aupenarten. Interessanterweise war das Ergebnis im Abdomen einer weiteren Serie eindeutig positiv, naehdem Cholesterin zusammen mit aktiven Gehirnen verabreicht wurde.

Serie 3 : Beiden KSrperahsehnitten wurden 5--8 Pa~r aktive Prothoraxdriisen, Spendern des Fgrbungsstadiums I I I entnommen, implantiert. Das Ergebnis fiel in beiden K6rperabsehnitten positiv aus, was zumindest die Aktivits der implan- tierten Prothoraxdriisen bests Inwieweit die wirtseigenen Oenozyten beein- flul3t worden sind, wird z.Z. noeh histologisch untersueht.

Serie 4: Der gleiehe Versueh wie in S. 3 wurde nun mit aktiven Oenozytei1 durehgefiihrt. Das Ergebnis war positiv in beiden K6rperabsehnitteu. Es beweist, dab die Oenozyten yon C. vinula und Sp. ligustri, wie die Prothoraxdriisen, H~utungshormon in aktiven Phasen abgeben.

Eriirterung der Befunde

Die strukturellen VerSmderungen in den Oenozyten yon C. vinula und Sp. ligustri, deuten auf eine Hormonbildung, die sowohl mit den H&utungsprozessen, als aueh mit physiologischen Vorg~tngen ws der Umwandlung der Raupen in die Puppen und sparer in die Imagines zusammenh~ngen, wie etwa Mitoseperioden in der Epidermis, Darm- und Fettk6rperver~nderungen u.a. Prozesse (Biickmann

Oenozytenver~nderungen und Funktion wa.hrend der }[et~morphose 65

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Abb. 10. Aktivitgtsphasen der neurosekretorischen Gehirnzellen N.z. und ProthorakaldrSsen (Pd) (aus Hintze, 1968) und der Oenozyten (Oe) zum Vergleich. Hae Haemozytenanlagerungen

an die Drtisen

1959). Verson (1900) beobachtete einen Zusammenhang zwischen Kernvergn- derungen in den 0enozyten yon der Seidenraupe Bombyx mori und den Hgutungs- prozessen. Die Oeaozyten der hier untersuchten gaupen yon C. vinula uad Sp. ligustri haben in aktiven Phasen stark verzweigte Kerne, sehr viele Vakuolen, kleinere im Zellinnern, gr6~ere, lakunenartig erweitert, and der Peripherie. D~s Zytoplasma, in kernnahen Bereichen basophi], wird yon kanMartigen Strukturen durchzogen, und weitreichende ZelleinfMtungen und -~usbnchtungen ftihren zu einer starken Oberfl~ichenvergrSl~erung in aktiven Phasen. ~hnliche Eigenschaften haben anch die Prothoraxdriisen yon C. vinula (Hintze, 1968, 1971a). In Abb. 10 sind beide Zelltypen einander gegeniibergestellt. Die zeitliche Ubereinstimmung der Aktivit~tsphasen in beiden Drtiser~typen, z.B. am 4. Tag nach der ietzten Larvenh~utnng, das ist vor dem Umfgrbungsprozeg, und im Fs III/IV vor der Puppenhs wird deutlich. Mehr noch, beide Drfisenorgane haben offensichtlich auch die gleiche Funktion, wie die physiologischen Versuche belegen. Sie sind in der Lage, den TeilprozeB der 1Y[etamorphose, die Umfgrbung, in abgeschniirten Abdomina oder ThorakMsegmenten yon C. vinula und Sp. ligustri, auszulSsen, Da in vivo ein hoher Ecdysongehalt ftir den Beginn dieser Prozesse verantwortlich ist (Biickmann 1965), wird aus den Transpl~nationen die Bedeutung der Oenozy~en deutlich. Sie geben wie die Prothoraxdrtisen d~s Hgutungshormon ~b. ImpI~ntierte aktive Gehime oder Chotesterininjektionen (Gersch und Sttirzebecher, 1971 Nakanishi u.~., 1972; Romer, 1971)stimulieren nicht nur die Prothoraxdr[isen zur Synthese und Abgabe des Hgutungshormons, sondern auch wei~gehend die Oenozyten. Die Funktionsfghigkeit dieser Driisen- zellen h~ngt nach Huber (1958), Day (1943) und Vogt (1949) yon der Anwesenheit des Juvenilhormons ans den Corpora allata ab. Es wgre durchaus denkbar, dM3 es in den vorliegenden Transplantationsversuchen yon Gehirnen, zusammen mit

5 W i l h e l m P~OtLX'S A r c h i v e s

66 Ch. Hintze-Podufal

ihnen injiziert, den positiven Ausfall des Ergebnisses erh6ht h~tte. Neurosekret- beladene Blutzellen nehmen gleiehermaBen Kontakt mit den Oenozyten auf, wie mit den Prothorakaldrfisen yon C. vinula (Hintze, 1968). AuBerdem treten feine segmentale Nervenverzweigungen an die Oenozyten heran. Es bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten zu kl~ren, ob bier ein/ihnlieher Steuerungsmechanis- mus vorliegt, wie er yon den Prothoraxdrfisen fiber den Blutweg und fiber neuro- sekrethaltige Axone bereits bekannt ist (Beaulaton 1968; Gerseh, 1970; Hintze, 1968; I-Iintze-Podufal, 1970; gomer, 1971). Die Aktivitatsphasen in den Gehirn- zellen liegen zeitlieh vor und z.T. w/ihrend derjenigen der ProthorakaldrtiselI (Hintze, 1968) und der Oenozyten (Abb. 10). Sie k6nnten an der Steuerung beteiligt sein.

Shaaya und Karlson haben 1965 in den Raupen yon C. vinula und Bombyx mori den Eedysongehalt bestimmt. In der Abb. 9 ist eine entspreehende Kurve zum Vergleieh mit der Zellaktivit&t der Oenozyten dargestellt, sie wurde vor- lgufigen Ergebnissen yon Bfickmann (1974) entnommen. Hieraus geht deutlieh hervor, dab Anstiege und Maxima des Eedysontiters mit den aktiven Phasen in den Drfisen zusammenfallan. Werte aus den Zellmessungen (Tabelle 1) k6nnten ebenso als Mal~ fiir die Aktivit/it der Drfisenzellen gewertet werden. Die Oenozyten sind, besonders in aktiven Phasen reich an Lipiden. Sie konnten sowohl im Zytoplasma, als aueh an der Peripherie naehgewiesen werden, an der der Austritt yon LipidtrSpfehen ans dem Fettgewebe, das den Drtisenzellen oft sehr dieht anliegt, und ihre Aufnahme in die Oenozyten beobachtet werden kann. Nach Gnatzy (1970) und l~omer (1971), steht das agranul/tre tubul~re endoplasmatisehe Retikulum der Oenozyten in engem Zusammenhang mit dem Lipidstoffweehsel. Lichtoptiseh erkennbare Vakuolen sollen den Elementen des ATEt~ entspreehen (Gnatzy), das bier ebenso stark ansgebildet ist, wie in steroidhormonproduzieren- den Zellen yon Insekten (Gerseh u.a., 1970; Hintze-Podufal 1971b; Romer, 1971), oder aueh in Wirbeltieren, z.B. den Interstitiellen Zellen des Hodens yon Meer- sehweinehen (Christensen, 1965) oder M/iusen (Christensen und Faweett, 1966). Locke (1969) vermutete wohl als erster, dag das Ater in den Oenozyten ftir die Steroidsynthese eine Bedeutung haben kSnnte. Die Prothoraxdrfisen yon Tenebrio molitor nehmen Lipide yon augen auf (Romer, 1971), die z.T. Cholesterin gelSst enthalten. In der Zelle wandem sie in Glykogenfelder ein, die dann mit dem EI~ und Mitoehondrien in Verbindung treten. Enzyme ans den Mitoehondrien k6nnten dann entweder an der Umwandlung yon Cholesterin (einer Vorstufe des Eedysons) in Eedyson beteiligt sein, oder aber die Fette in den LipidtrSpfchen zur Energie- gewinnung abbauen (Romer). Dieses w/ire demnaeh ein m6glieher Weg zur Bildung des Hormons Ecdyson.

Das Glykogen wird (Romer, 1971) z.T. in die Vakuolen des RVEt~ (rauhen vesikul/iren ER) eingelagert, bevor die Lipide yon den Glykogenfeldern aufgenom- men werden. Dieser Reservestoff kommt auch in den Oenozyten yon C. vinula und Sp. ligustri vor, seine naehweisbare Menge steht abet in keiner eindeutigen Abh~ngigkeit mit der Zellrhythmik. Philogene (1967) vermutet, dag das Glykogen am Phenolstoffweehsel beteiligt ist und evtl. zu den Chitinausgangsprodukten gehSren k6nnte.

Nach neuesten Untersuehungen (Romer 1974) geben die Prothoraxdrfisen c(-Eedyson, die Oenozyten fl-Ecdyson ab. Damit haben die Oenozyten teil an tier

Oenozytenver~nderungen und Funktion w~ihrend der Metamorphose 67

a l lgemeinen S t imul ie rung der D N S - S y n t h e s e w i h r e n d der l a rva len I t / iu tungs- zyklen, sowie der His togenese yon adu l ten Geweben, die yon mi to t i schen Tei lungen begle i te t ist, und der U m w a n d l u n g yon 0 r g a n e n wghrend der In sek tenme ta - morphose . Ebenso sind sie mi t ve raa twor t l i ch ftir die Ovar ienentwicklung und Vitel logenese bei einigen Lep idop te rana r t en , Coleopteren, Dip te ren und t t y m e n o p - t e ren (Laverdure , 1970; Sakura i u.a., 1969; Sp ie lman u.a., 1971; Wil l iams, 1968), u.a. Prozessen. Der (prims Angr i f f spunkt is t der K e r n (Clever, 1963, 1965; K~rlson, u.a., 1964). Die I~NS-Synthese wird n ieht erhSht, sondern es werden aueh spezifisehe I~ibonueleins/~urert geb i lde t (Wya t t , 1971), die dann z.B. fiir die Synthese besonderer E n z y m e veran twor t l i ch sind, wie es fiir den Tyros ins tofL wechsel in ep idermalen Zellen b e k a n n t is t (Karlson, 1965, 1966).

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Prof. Dr. Ch. Hintze-Podufal I. Zoolog. Institut Lehrstuhl Entwicklungspsyehologie D-3400 GSttingen Berliner StraBe 28 Bundesrepublik Deutschland