Versuche zur Isolierung des Schilddrüsenhormones

Versuche zur I so l i e rung des Schi lddr i i senhormones . 1. Tei l .

Von B, ROllleiS~ Miinchtm.

(Aus dem histologiseh-embryologischen Institut Miinehen, Vorst~nd: Prof. Mollier.)

Mi~ Tafel XI und XH, 4 Textabbildungcn und 30 Tabellen. (Eingegangen am 30. J,uIi 1921.)

Die Entdeckung G u d e r n a t s c h s , dab die Verffitterung frischer Schflddriisen an Froschlarven eine ganz spezifisehe, leieht zu erken- nende Reakt, ion (Entwicklungsbeschleunigung und Wachstumshemmung) hervorruft, erwies sieh auch fiir jenen Zweig der experimentellen For- schung, der die Isolierung des Schflddriisenhormones erstrebt, von groBer Bedeutung, da dureh den ~)Kaulquappenversueh(~ die MSglich- keit geboten wird, bei Fraktionierung von Organextrakten leichter und raseher als in fffiherer Zeit die Anwesenheit bzw. den Verlust tier wirksamen Substanz zu erkennen. Der Wert der Methodik wird dadureh, dab schon geringe Me~lgen in kurzer Zeit zu deutlichen Ver- i~nderungen fiihren, erhSht. Allerdings sind -- was manchmal ver- gessen wird - - zwei sehr wesentliche Punkte noch ungeklErt: Einer- seits, ob d i e Substanz, die bei Verfiitterung frischer Schilddriise an Kaulquappen die charakteristischen Wirkungen hervorruf$, dem physiologisehen Hormon der Drfise entspricht; andererseits, bis zu welehem Grade eine im Kaulquappenversuch typiseh wirkende Substanz auch die iibrigen dem X-Iormon der Schilddriise zurzeit zugesprochenen Wirkungen besitzt.

Eine LSsung dieser wichtigen Fragen wird aber erst dann mSg- lich sein, wenn die spezifisch wirkende Substanz yon den zahlreichen anderen, in der Driise und ihren Extrakten vorhandenen Stoffen ab- getrermt ist. :Die Fort se$zung meiner Versuche h~t da.her vorerst, das Ziel, die spezifisch wirkende Substanz zu isolieren, zur Kristallisation zu bringen und ihre chemische Konstitution zu ermitteln. Wenn auch diese Forderungen, wie gleich betont sei, noch nicht erfiillt sind, so veranlassen reich doeh VerSffentliehungen der letzten Zeit, vers'clfiedene Ergebnisse meiner sich fiber eine Reihe yon Jahren erstreckenden Versuche nieht mehr lgnger zuriiekzuhalten. Sp~tere Versuche werden sich dann mit der Frage z u befassen haben, wie wei~ sich mit der isolierten Substanz auch jene Erscheinungen hervorrufen lassen, die als eharakteristiseh ffir das Sehilddriisenhormon aufgefaBt werden.

Versuche zur Isolierung des Schilddriiscnhormoncs. I. 411

Die MSglichkeit einer allgemeinen Geltung der durch den Kaul- quappenversuch gewonnenen Ergebnisse besteht. So zeigte es sich, dab gerade jene Schilddrfisenpri~parate, die in der praktischen Medizin den besten Iguf geniet3en, auch auf Froschlarven die st~rkste Wirkung entfalten (Romeis 16), so dab infolgedessen bereits verschiedentlieh vorgesehlagen wurde, die Einwirkung auf Froschlarven oder vielleicht noch besser auf Axolotllarven in der pharmazeutischen Technik zur Wertung und Einstellung der Schilddi/isenpr~parate zu beniitzen. Ferner finden verschiedene Ergebnisse, die mit Hilfe des Kaulquappen- versuehes fiber die Natur der wirksamen Substanz gewonnen wurden, in gleichzeitigen Beobachtungen an h5heren Wirbeltieren eine kr~ftige Stfitze. So wiesen l~omeis (14--20), A b d e r h a l d e n (15, 20), K a h n (16), Herz fe ld und K l i n g e r (20) nach, dab die spezifisehe Wirkung der Sehilddrfise auf Froschlarven nicht an das Vorhandensein eines Eiweil3k5rpers gebunden ist, w~hrend Abelin (17), Eiger(17), Herz- fe ld und Klinger(18) zu fibereinstimmenden Feststellungen am S~ugetier kamen.

Die LSsung der gestellten Aufgabe wurde auf zwei verschiedenen Wegen versucht: durch tiefgehenden Abbau der Dr/ise mittels Hydro- lyse oder Autolyse und durch m6glichst sehonende 1%aktionierung frisch hergestellter I)rfisenextrakt-e. Wiihrend die erstgenannte Me- rhode anfechtbar ist, solange nicht der Nachweis erbracht ist, dab durch den Proze$ der Hydrolyse die ehemisehe Natur der wirksamen Substanz nicht ver~ndert wird, bietet die zweite diesem Einwand geringere Angriffspunkte. Sie geht aus yon der Uberlegung, dab in jeder normalen Schilddriise geringe Mengen des fertig gebildeten Hormones bereitgestellt sind, die sich bei Extraktion einer grSBeren A~lzahl yon Driisen in immerhin fagbarer Menge gewinnen und yon den iibrigen in L6sung gehenden Substanzen indiiferenter Natur abtrennen lassen mfissen. Allerdings mug man sich immer dessen bewuBt bleiben, dub aueh der geringfiigigste, an dem aus dem KSrper entfernten Organ vorgenommene Eingriff vital nicht vorhandene SpMtprodukte schaffen kann. Trotzdem diirften dem zweiten Wege ffir die Erkennung der Natur der wirksamen Substanz zuni~chst grSl3ere Bedeutung zukommen, als dem erstgenannten. In der vorliegenden Arbeit werde ich vorerst fiber die mit frischen Drfisenextrakten ausgefiihrten Versuche berichten, um in einer zweiten Arbeit die ~rirkung der dutch I:Iydrolyse gewonnenen Substanzen zu beschreiben.

Wie Oswald (99, 01, 16) gezeigt hat, wird aus einem w~Brigen, aus ffisehen Schilddriisen gewonnenen Extrakt dureh HalbsSttigung mit Ammonsulfat ein yon ibm als Jodthyreoglobulin bezeichneter EiweigkSrper ausgef~llt, den er auf Grund seiner Versuche als wirk- sames Prinzip der Schilddriise erkl~rt. Auch im Kaulquappenversuch

412 B. Romeis:

erwies sich das Jodthyreoglobulin als sehr wirksam (Romeis 18). Durch Ganzs~ttigung des abfiltrierten Extraktes wird ein zweiter Ei- weii~kSrper ausgef~llt, den Oswa ld Ms Nukleoproteid charakterisiert, das im Gegensatz zum Jodthyreoglobulin keine spezifische Wirkung auslSst. In ~bereinstimmung damit blieb auch im Kaulquappenver- such die Dissimilationssteigerung aus; die Tiere zeigten im Gegenteil gesteigertes Waehstum; in Zusammenhang damit dfirfte die beobach- fete leichto Beschleunigung der Metamorphose stehen ([Cornels I8). Die Wirkung des Nukleoproteids unterscheidet sich demnach vollkommen yon jener, die dutch Verffitterung frischer Driise zu erzielen ist. Seine Wirkung ist nicht organspezifisch, sondern l ~ t sich auch mit nukleoproteidreichen Fraktionen anderer Organe erzielen.

Das nach der zweiten Ausf~llung erhaltene ~iltrat ist eiwei~frei und nach Oswa ld ohne spezifische Wirkung. Oswald glaubt daher, daI~ die wirksame Substanz einzig und allein im Jodthyreoglobulin zu suchen ist. Auch im Kaulquappenversuch erwies sich das naeh dem Oswaldschen Vorgang enteiwei~te Filtrat als unwirksam (vgl. l~omeis 1918, Vers. 7, Pr~p. 9). Trotz allem hesteht aber die M6g- lichkeit, dab ein vorhandenes eiwei6freies Hormon entweder bei tier Extraktion des Drfisenbreies nicht mit extrahiert wurde, oder abet bei der Ausf~tllung mit Ammonsulfat bzw. mit Essigs~ture mit ausge- fallt wurde.

Der bei friiheren Versuchen erhobene Befund, da~ Extrakte naeh mehr oder weniger vollkommener Enteiweil]ung mit Alkohol noch spezifische Wirkung besal~en (vgl. R o m e i s 19), sowie die ]3eobach- tungen K a h n s (16) legten die V e r w e n d u n g des A l k o h o l s z u r E n t e i w e i B u n g nahe. ZunSchst wurde die F h l l u n g m i t wasse r - f r e i e m A l k o h o l be i n e u t r a l e r R e a k t i o n vorgenommen. Im einzelnen wurde bei der tterstellung der Extrakte (Nr. 62, 63 und 64) in folgender Weise verfahren:

50 Sehilddrfisen ffischgeschlachteter Rinder werden im Latapie- schen Apparat zerquetseht und in der Czokorschen Lymphmiihle mit etwas Quarzsand und neutralem destillierten Wasser unter Toluol- zusatz zermahlen. Der feine, emulsionsartige Brei wird zentrifugiert und der dadurch gewonnene dickflfissige, braunrote Extrakt bei neutraler Reaktion langsam in die zehnfache Menge abs01uten Alkohols getropft, wobei sofort grobflockige Gerinnsel in reichlicher Menge auftreten.

])er Bodensatz des zentrifugierten Extraktes wird noch einige Male mit neutralem 96%igem Alkohol ausgesehiittelt, zentrifugiert und die dadurch gewonnenen klaren Extrakte mit dem ']~iltrat vereinigt. Die Ausbeute bei diesen nachfolgenden Extraktionen ist nut gering.

Naeh 24stfindigem Stehen wird, der dunkclgoldgclb gefi~rbte Ge-

Versuche zur Isolierung des Schilddriisenhormones. I. 413

samtextrakt vom Niederschlag abfiltriert und das klare Fil trat im Vakuum bei 40 ° C zu einem triiben, ~elbbraun gefhrbten Sirup eingeengt.

Der durch die F~llung mit Alkohol erhaltene Niederschlag wird mit absolutem Alkohol bei neutraler Reaktion solange gewaschen, bis der Alkohol keine Substanz mehr aufnimmt, und dann getrocknet. Das hellbr~unliche Pulver kommt als P r i ~ p a r a t 62 in Gruppe e zur ~erwendung.

:Der eingeengte Sirup wird bei neutraler Reaktion mit der 20fachen Menge absoluten Alkohols versetzt. Es entsteht eine stark opake Trii- bung, clio sich auch nach 24 stfindigem Stehcn nicht ganz klhrt. Nach dieser Zeit wird yon der abgesetzten, am Glas des Kolbens ziih haf- tenden weiBlichen Sub.stanz abfiltriert und das nunmehr klare Fil trat im Vakuum bei 40 o C zu einer diekflfissigen, orangegelben Flfissigkeit konzentriert, die mit Petrol~ther nach Zusatz yon etwas 70%igcm Alkohol mehrmals im Schfitteltrichter ausgeschfittelt wird.

Der petrol~therl6sliehe Teil f~rbt sich dabei strohgelb. N~ch Ab- destillieren des LSsungsmittels im Vakuum wird der Rfickstand getrocknet, nochmals in Petrol~ther gel5st, abfiltriert und wiederum im Exsikkator zu einer z~hen, dunkelbraunen Substanz getrocknet (Pr~- p a r a t 64 fiir Gruppe e). Zur Ffitterung werden jeweils etwa 50 mg mit Wasser in der Reibschale zu einer triiben Emulsion verrieben, die in die Zuchtschale gespiilt wird.

DiG petrol~therunl6sliehe Fraktion, die rStlichgelb gefi~rbt ist, wird im Vakuum auf 30 ccm eingeengt und bei neutraler Reaktion noch- reals in 300 ccm absoluten Alkohol getropft. Die dabei auftretende Opaleszenz setzt sich naeh einiger Zcit in Form eines feinfloekigen Niederschlages ab. Von der davon abfiltrierten klaren LSsung wird im Vakuum. der Alkohol abdestilliert, der dicke, braungelbe Sirup mit etwas 60 %igem Alkohol verdfinnt, noehmals mit Petrol'Sther ausgeschiittelt und im Vakuumexsikkator fiber H_~SO~ und NaOH nach Zusatz vdn 5 cem Glyzerin vorsichtig konzentriert. Dabei schei- den sich kleine weiiJe Kugeln yon etwa 0,1 mm Durehmcsse r aus, die aus feinen, biisehelfSrmig angeordneten Kristallnadeln bestehen. Bei weiterem Einengen treten attch noch oktaederf6rmige Kristalle auf. Schliei~lich wird der Gesamtextrakt in 150 ccm dest. Wassers gelSst: P r K p a r a t Nr. 63. Im nachfolgenden Versuch werden bei jeder Extrakteinwirkung 5 ccm dieser L(isung verwendet.

l ~eak t i oncnen yon P r ~ p a r a t Nr. 63- EiwciBkochprobe:--; Hcllersche Probe: kein Niederschlag; nach einigen Minuten tritt ein olivgriincr l~.ing auf, der sich allmiihlich verbreitert und ticf kupfergriin wird; sodann entweichcn unter lebhaftem Brodeln Di~mpfe yon Stickoxyd, wohei an dcr Grenzschicht yon I-]~O a und Fliissigkeit ein fciner, weiBer Ring entsteht, der nach AufhSren der Gasentwicldung wieder verschwindct:. Iffach mehrercn Stunden verbleicht die griinliche F~irbung, die schlieI~licil die ganze LSsung angenommen hat.

414 B. Romeis :

:Biuretreaktion: - - ; Adamkiewicz-Itopkins: ganz schwach -p; Xanthoprotein- reaktion: - - ; Phosphorwoltrams/iure -~- H~SO~ : -~- -1- -t- -]-; Alm6nsches Reagens: -[-; Pikrins~iure und Esslgs~ure: -- , aueh bel, Erw~rmen. I)anach ist die Sub- stanz sicher frei yon Eiwei9, Albumosen und Peptonen.

Die Wi rkung der Pr~para te 62, 63 u n d 64 ergibt sich aus folgendem Versuch.

V e r s u e h I. M a t e r i a l : Rana temporaria-Larven aus einem am 31. IlI. 18 abgelegten Laieh. B e g i n n des V e r s u c h e s : 10. IV. 18. Alter der Tiere: 10 Tage. D u r e h s e h n i t t l i e h e GrSite: Gesamtl~nge 10,5 ram, Rumpfl~nge 3,5 mm,

Rumpfbreite 2,2 ram. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Xul3ero Kiemen seit einem Tag fiberwaehsen,

Kloakenmembran durehgebrochen. A n z a h l de r T i e r e : 6 Gruppen zu je 20 Larven. V e r s u c h s a n ~ ) r d n u n g :

Gruppe a: Kontrotle, >> b: frische Schilddriise,

c: :::it Alkohol gef~lltes Schilddriiseneiwciiil; Pr~parat 62, d: mit, Alkohol enteiweiBter Sehilddriisenextrakt; Pr:£parat 63,

~> e: pctrol~therlgslieher Toil des enteiweiBten Extraktes; Pr'g- parat 64.

Von den frischen Schilddriisen ~-erden bei ~eder ~iitterung 1 g, yon Prg~- parat 62 und 64 0,05 g verabreicht. PrSparat 63 siehe oben.

Versuch sp ro toko l l . 10. IV. 18 erste und ]2. IV. zweite Extrakteinwirkung. Am 14. IV. sind

die Larven der Gruppe e bereits deutlieh kleiner/ Die hinteren Extremitiiten- anlagen sind bei ihnen schon mi~ ffeiem Auge gut erkennbar.

15. IV. 18. 3. :Extrakteinwirkung. 16. IV. 18. Messung der Larven. Die DurehschnittsmaBe yon Gesamtlhnge,

Rumpfl/inge, Rumpfbreite betragen: G r u p p e a: 18,4:6,7 i 11,7; G r u p p e b.: 20,3:7,4:12,9; G r u p p e e: 15,9:5,7:10,2; G r a p p e d: 19,1:7,3:11,8; G r u p p e e: 17,7:6,8:10,9. Die Larven der Gruppe b sind also etwas grSBer, die der Gruppe e erheblieh kleiner als die der Kontrollgruppe; in beiden ist~ die Ent- wieklung besehleunigt, in c abet stiirker als in b. In Gruppe d ist das Wach~- turn etwas gesteigert., ohne da[l sich bis jetz~ Entwicklungsbeschleunigung feststellen liel3e. In Gruppe f i s t das Wachstum leieht gehemmt,

22. IV. 18. 4. Extrakteinwirkung; in Gruppe b und- c erhaltcn die Tiere yon jetzt ab keine Schilddriisensubstanz mehr. 26. IV. 18. 5. :Extrakteinwirkung.

29. 4. 18. Gruppe e: Bei 4 Tieren ist je eia linkes Vorderbein durchge- broehem Sehr starke Reduktionserseheinungen.

l. V. I8. Messung s~mtlicher Tiere (s. Tab. I). Die Kontrotltiere (Abb. 1 a) besitzen etwa 0,5 mm langc, vSllig undifferen-

zierte, unpigmentierte ExtremitStenanlagen. Gruppe b (Abb. 1 b) : Die Tiere sind erheblich kleiner, geigenfSrmig, frosehartige Pigmentierung. HornzS~hnehen, ttornkieler, Papillen resorbiert. Sch~delform troschartig, tlinterbeine ~n Ober- sehenkel, Untersehenkel und FuB differenziert., Zehen gut erkennbax. Streck- seite der Extremit~t gut piganentiert; am Schwanz starke Abbauerscheinungen. Vorderbeine noeh nicht durchgebroehen. Gruppe c (Abb. lc): Bei 4 Tieren steht je ein linkes stummela~iges, wenig difierenziertes Vorderbein vor. Hihter- beine etwas kleiner, diinner und weniger differenziert als in Gruppe b. tl~duk- tionserseheinungen dagegen in jeder Hinsieht stSrker. Gruppe d (Abb. l d ) :

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416 B. i~omeis:

Durchgehends larvaler Typus. Weder am Maul noch am Schwanz Reduktions- erscheinungen. DurchschnittsgrSl3e wie in Kontrollgruppc. :Die hinteren Ex- tremitgtenanlagen sind deutlich weiter entwickelt als bei der KontroUe. Sie lassen schon die Anlage der Fugplatte erkennen und sind mindestens doppelt so groB. Auf der Streckseite tritt auch schon Pigmentierung aaI, wghrend bei Gruppe a die Anlagen noch vSllig pigmentlos sind. Doch sind die Anlagen nicht nur wenlger weir entwickelt, sondern emch kleiner wie in Gruppe b und c, obwohl die Tiere dcr tetztgcnamlten Gruppen doch schr viel kleiner sind.

In Gruppe e (Abb. le) sind die Tiere im Wachstum zuriickgeblicbcn. An den Ext~remiti~tenanlagen ist~ ganz gerir~ge Ent.wicklungsbeschleunigung zu bemerken.

2. YL Gruppe b: 1 Tier metamorphosiert, bci 6 andcren Durchbruch eines Vordcrbeincs; cbens0 in Gruppe e bei einem wcitcrcn Tier; fiber die w/ihrend der niichsten Tage folgenden Metam0rphosen siehe Km~ve I. Weitere Extrakt- fiitterungen am 3. V., 10. V., 14. V., 20. V.

Am 23. V. (s. Tab. 2) stimmt das Wachstum der mit dem enteiweigten Schilddriisenextrakt gefiitterten Larven der Gn~ppe d (Abb. 2d) mit der Kontrolle (Abb. 2a) ziemlich iiberein, wghrend es in Grupt)e e (Abb. 2e) etwas gehemm~ ist. Die :Entwicklung ist in Gruppe d ~md e um geringes beschleunigt. Eine Reduktion der larvalen Organe ist aber noch nicht eingetreten.

T~belle 2.

Gruppe a: ii Kontrolle

26,0 26,5 28,5 29,6 29,4 30,3 31.5 3210 32,0 32,5 32,8 32,8 33,3 34,0 34,0 34,2

10,8 6,6 20.6 31,2

eiweil~ter Schilddriisene×trakt~

20,8 25,6 26,4 26,8 28,0 29,2 29,4 29,9 30,0 30,5 30,8 31,6 32,0 32,0 33,0 28,6

29~0

26,0 29,2 29,9 30,0 30,0 so,5 31,2 32,7 32,8 32,9 33,0 33,0 33,0 33,5 35,6

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10,0 10,5 10,5 10,2 10,3 11,0 10,8 11,3 11,2 11,0 10,5 11,0 11,0 10,6 12,4

5,5 16,9 6,2 18,7 6,5 19,4 6,2 19,8 5,5 19,7 612 19,5 6,5 20,4 7,1 21,4 7,0 21,6 7,4 21,9 6,8 22,5 7,5 22,0 7,0 22,0 6,0 22,9 7,6 23,2

Gruppe d: Gruppe e: Priip. 63. ) l i t Alkohol ent- i: Priip, 6~. Petro/StherlSsliche

Frakt ion

9,0 5,5 17,0 i 9,0 4,8 17,5 ! 9,4 5,8 18,6 i

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10,4 6,4 20,8

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10,0 11,0 10,0 9,7

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10,1

.~ ~

4,5 12,8 5,5 17,4 6,2 16,9 5,9 17,5 6,6 18,0 6,2 18,2 6,2 19,4 5,5 20,2 6,4 20,0 6,5 19,8 6,2 20,2 6,5 21,1 6,2 21,6 615 19,9 6,5 22,5 6,2 18,1

6,1 i8,9

Das Gcsamtwachstum in den einzelnen Gruppen und der Unterschied der Gruppe d gegeniiber b und c gcht am bcstcn aus Tabcllc 3 hervor.

Versuehe zur Isolierung des Schilddrfisenhormones. I. 417

T a b e l l e 3.

W a c h s t u m v o m i0. IV . - -22 . V.

C~ruppe a: Kontrolle . . . . Gruppe b: frische Schilddr. . Oruppe c: 1Jr~ipara$ 62 . . . Gruppe d: ] 'r~parat 63 @ruppe e: :Px~4parat 64

Weitere Extrakteinwirkungen erfolgcn am 23. V., 28. V., 5. VI., 9. VI., 13. VI., 19. VI., 23. VI., 27. VI., 5. VII., 9. VII . ; 2. VII. 20. Fiitterung.

Am 26. VL beendet ein Tier der Gruppe d die Metamorphose. Uber die yon nun an stattfindenden Metamorphosen vergleiehe Kurve 1.

Die unter dem Einflul] des enteiwei2ten Extraktes stehenden Larven der Gruppe d metamorphosieren demnaeh betrachtlich frfihzeitigcr als die Kontroltierc, wenn die Beschleunigung auch geringer ist als bei den Gruppen b u n d c . In Gruppe e ist der Ablaui der Metamorphose trotz der anf~nglich zu beobachtenden leiehten Entwicklungsbesehleuni- gung stark gehemmt. Im weiteren Verlauf setzt in der Gruppe eine ziemlieh starke 3lortalitgt ein. Die bei Gruppe d 'zu beobachtcnde Entwicklungsbeschleunigung unterseheidet sich yon der bei ]~'fit- terung mit irischer Sehilddriise eintretenden jedoeh in mehrfa- eher ttinsicht. Die bei letzterer stets zutage tretende Waehstums- hemmung und GrSBenabnahme, die auf abnorm gesteigerter Dis- similation beruht, fehlt durchgehends. Die Tiere gleichen vielmehr an GrSl]e wie Differenzie- rung vSllig normal ausgebildeten FrSsehehen. Dementspreehend fehlen auch alle bei Thyreoidea- fiitterang so hEufig zu bcobach- tenden Mil~gestaltungen, wie Verkriimmung des Unterkiefcrs,

Gesamt - R u m p f - l~nge ]fi.nge

-~- 20,9 -k- 7,3 q- 7,0 -t- 2,3 + 2,9 q-- 1,7 --b 20,7 + 6,9 + 18:5 + 6~6

• ° .

• . °

~ j

N:

1

I

l l u m p f - bre i te

4- 4,4 + 1,1 "4- 0,7 .+- 4,2 + 3,9

,4

418 B, Romeis :

zwergartige Extrcmit~ten, abnorra kleinc Leber und Bauchspeieheldrfise, vor- zeitige Schwanzresorption usw,

Ein durch mehrmMige ])~i~llung mit absolutem Alkohol bei neutraler Rc~ktion enteiweil3ter und gereinigter Schilddriisenextrakt ruft demnach im Kaulquappenversuch deutliche Entwlcklungsbeschleunigung hervor, wi~hrend die sonst bei Schilddriisenfiitterung zu beobachtende Dissimilationssteigerung fehlt. Im Zusammenhang damit erscheint es yon Interesse, da.t~ in einem nach der gleiehen Methode hergestellten Extrak~ kein Jod nachgewiesen werden konnte. Das steht in Uber- einstimmung mi?~ einer Angabe yon H e r z f e l d und K l i n g e r , die ihren durch Alkohotf:gllung enteiwei[~ten Schilddriisenextr~kt ebenfMls frei von Jod finden. MSgticherweise ist die im vorliegenden Versuch beobachtete Ent, wieklungsbeschleunigung aber gar nicht organspezifiseh, sondern durch ussimila*ionssteigernde Stoffe veranlaBt, die sich bei Anwendung der gleichen Extraktionsmethode nicht nut aus der Sehild- driise, sondern auch aus anderen 0rganen gewinnen lassen.

D~ nun ein durch zweimalige ]~gllung mit 96%igem Alkohol enteiweil~ter Extrakt, wig ein friiherer Versuch beweist (vgl. R o m e i s 19, Vers. 4, S. 471) neben Entwicklungsbeschlcunigung auch deutlic~te Wachstumshemmung zur Folge hatte, so ist es wahi'scheinlich, da~ dig eigcntliche, spezifisch wh'kende Substanz bei der F~llung mit wasserfreiem Alkohol bei neutrMer Reaktion wenigstens zum groBen Tell ausgef~llt wird. Sie w~re dann neben beigemengten EiweiBspuren in dem bei der zweiten und dritten AlkoholfMlung ausfMlenden Nieder- schlag zu suchen, eine Vermutung, die sich bei weiteren Vcrsuchen als richtig erwies. Um bei der Extr~ktion des frischen Drfisenbreies eine Reihe yon EiweiBstoffen ungelSst zurfiekzulassen, erschien es vorteilhaft, die erste Extraktion stat t mit Wasser mit, 50 -- 60 % igem Alkohol vorzunehmen. Die n~ehfolgende Enteiweil~ung mi~ Alkohol erfolgte nicht bei neutraler, sondern bei sehwach saurer Reaktion. Im einzelnen erfotgte die Fraktionierang schliel31ich in nachfolgender Weise:

:Die mit der Fleischha.ckmm~chine oder besser mit~ dem L a S a p i e - schen Apparat zerquet:schten und eventuell mit Quarzsand zu Brei verriebenen DriisGn werden bei Zimmertemperat.ur mehrmals mit reich- lichen Mengen 50 - -60%igen Alkohols bei neutrMer Reaktion auf der Schiittelmasehine erschSpfend extrahiert~ ). D i e Extrakte werden je- wells dutch eine diinne Lage Gaze koliert.. Die vereinigten Extr~kte werden durch vorsichtiges Ans~uern (auf 1000 ccm Ex~ak t et, wa 12 ccm 5%igc Essigsi~ure) v o n d e r Hauptmenge des Eiweii~es befreit.

~) Diese Extraktion soll mSglichst beschlcunigt vorgenommen werden, da bei l~ngerem Stehen als Zcichen autolytischer Prozesse alkoholliisliche Albu- mosen und Peptone auftreten.

Versuche zur tsolierung des Schilddrfisenhormones. L 419

])as in ~locken ausfallende EiweiB wird nach Absitzenlassen durch Papierfilter abgetrennt, was nach richtiger Ausf~llung ziemlich rasch vor sich geht. Ist dieselbe dagegen unvollst~ndig, so filtriert der Extrakt nut sehr langsam. Der abgetrennte Eiweil]niederschlag wird noch einige Male mit 50%igem Alkohol ausgeschiittclt und der dadurch gewonnene Ext.rakt nach Filtrieren mit dem Hauptextrakt vereinigt. Der extrahierte Riickstand wird getrockneb (F~llung 1).

Der vereinig~e, weingelb gef~rbte alkoholische Extrakt wird im Vakuum bei 35 ° C zu einem triiben Sirup eingeengt, der bei schwach essigsaurer Reaktion in die vierfache Menge 96%igen Alkohols eingetropft wird, wobei reichlicher, grobflockiger Niederschlag ausfallt. Der Sirup darf vor dem Eintropfen in den Alkohol nicht filtriert werden, da sonst die beim Abdestillieren des Alkohols zum Tell ausgef~llte wirksame Substanz verloren geht.

Nach 24stiindigem Stehen wird von dem abgesetzten Niederschlag (F~llung 2, P r ~ p a r a t 115) dekantiert und abfiltriert. Der gelb gef~rbte alkoholische Extrakt wird wieder im Vakuum konzentriert und nochmals bei schwach essigsaurer Reaktion in die 4fache Menge 96%igen Alkohols eingetropft,' wobei ein feinflockiger, zuerst weiB- licher, dann sich bald orangegelb i~rbender Niederschlag auftritt, der sich im Laufe einiger Stunden absetz~ (Fiillung 3, Pr~para~ 116). Das Filtrat wird im Vakuum eingeeng~, in wenig 50%igen Alkohol aufgenommen und bis zur vSlligen Klarung mit Petrolather ausgeschiittelt. Bei hartni~ckiger Emulgierung setzt man noch etwas Alkohol zu. Die petrol~t, herlSsliche Fraktion (P~parat 117) wird v o n d e r petrol~therunl5slichen Fraktion (== Pri~parat 118) abgetrennt.

Der erste, dutch Ansi~uern des alkoholischen Ausgangsextraktes erhaltene Niederschlag (Fhllung 1) gibt alte gebrguchlichen Eiweil~- reaktionen. Er enthi~l~ zum grSl]ten Tell das von Oswald zuerst dargestellte Jodthyreoglobulin, doch haben sich dutch die Extraktion mit 50%igem Alkohol (an Stelle des yon Oswald bcniitzten ~Vasscrs oder der physiologischen KochsalzlSsung) die LSslichkeitsverhSltnisse et, was ge~ndert. Insbesondere nach li~ngerer Einwirkung des schwach- prozentigen Alkohols ist der Eiweii~kSrper denaturier~, so da$ er sich selbst in alkalischem Wasser nur mehr unvollstiindig 15st, w~hrend das nach Oswald hergestellte Jodthyreoglobulin hierin leicht 15slich ist. Die ausgef~llte EiweiBsubstanz is~ jodhaltig. Im Kaulquappen- versuch gleicht sie in ihrer Wirksamkeit dem im vorigen Versuch angegebenen Pr~parat 61. Auch durch vielmalige Extraktion mit 50 %igem Alkohol gelingt es nicht, ihr diese Wirksamkeit zu nehmen. Die ira Jodthyreoglobulin wirkende Substanz ist also bei der Fiillung mit dem EiweiB nicht etwa nur niedergerissen worden, sondern anscheinend in das EiweiBmolekfil eingebaut. Auch durch Extraktion

Archly fiir Entwicklungsmcchanik Bd, 50, 28

420 B. Romeis:

mit S~iuren oder Alkalien in wiil3riger LSsung lal~t sich die Substanz nicht abtrennen. Es ist also anzunehmen, dab der bei der angewandten Methode erhaltene Niederschlag 1 nur die an Eiwei[t ge- bundene wirksame Substanz enth5tt, wahrend die dem frelen Hormon entsprechende ziemlieh vollstandig in den Alkoholextrakt iibergeht.

Die F ~ l l u n g 2 wird mit 96%igem Alkohol und )~ther gewaschen und getroeknet. N immt man das wefl~liche Pulver in 50 %igen Alkohol auf, so bleibt ein nicht unbetrachtlicher Tell der Substanz ungetSst zuriick. In Wasser getSst gibt diese~ Riickst~nd deutliche Eiweii3- reaktion; im Kaulquappenversuch ist derselbe gut wirksam. D e r von diesem Rfiekstand abfiltrierte Alkoholextrakt wird konzentxiert und in die 4fache Menge 96 %igen Alkohols getropft; man erhiilt, so wieder einen Niedersehlag, dessen Wirksamkeit im Vergleich zum Ausgangs- material aber erheblich zuriickgegangen ist. Der Niederschlag wird wieder abgetrennt, mit absolutem Alkohol und J~ther gewaschen und getrocknet. Nach noehmaliger LSsung in 50 %igem Alkohol wird abfiltriert, im Vakuum eingeengt und nochmals in die 4fache Menge 96 %igen Alkohols unter leiehtem Ans~uern mit Essigs~ure eingetropft. Der weil~e Niederschlag wird gesammelt, mit Alkohol und ~ ther gewaschen und getrocknet ( ~ - - l ~ r a p a r a t 115).

Die Substanz 15st sich bci neutraler Rcaktion vollkommen klar in Wasser. Die leicht gelblich gef~rbte L6sung gibt beim Schiittcln starken, lange best~n- digen Schaum. EiweiBkoehprobe : schwaeh -~- ; Heller: ~-; Spiegler: -t- ; Ferro- zyankalium und Essigs~iure: -}-; )3iuret: ganz schwach violett; Millon: -}--~-; Adamkiewicz-Hopkins : -}- ; Xanthoprotein: -~ ; Schwe~elblei : -}-; Pikrinsiiure : bei neutraler Reaktion: Opaleszenz; nach AnsEuern: ebenso; Alm~n: -{--{-; PhosphorwolframsSure q- tt~SO, : + -~- -}-; Sublimat neutral: Opaleszenz; sauer: -}-; Eisenchlorid: -!--}--~, 15slich im UberschuB; Bleiazetat: -~--{--{-, 15slich in NaOH beim ErwErmen.

:Die Substanz enth~lt also noch EiweiB (wahrscheinlich Albumosen). Im Kaulquappenversuch ist sie schwach wirksa.m (vgl. Vers. 2, Gruppe b). Mehrmalige subkutane oder intraperitonea.le Injektion in ansteigenden Dosen verursaeht beim Meerschweinchen neben anderen Erscheinungen Abmagerung, Haarausfall, Sterilita£. Die n~ch l~nger fortgesetzter In- jektion ab und zu auftretenden Kr~impfe lassen diese Erseheinungen Ms Anaphylaxiewirkung deuten. Die Untersuehungen fiber diese auch aus anderen Organen zu gewinnende ~lkohollSsliche Substanz sind noeh nieht abgeschlossen. Die Wirkung variiert je nach dem Organ.

Die F ~ l l u n g 3 =~ Prhparat 116 wird mit absolutem Alkohol und Ather sorgf~ltig ausgewaschen und getrocknet. Der getrocknete Nieder- schlag stellt ein orangegelb gef~rbtes Pulver dar, das sich bei neutraler Reaktion leicht und vSllig klar in dest,. Wasser 15s~. Im Kaul- quappenversuch beschleunigt die Substanz die Entwicklung nur in geringem Mal]e; das Wachstum w~rd zuerst gefSrdert; erst nach l~ngerer

Versuehe zur Isolierung des Sehilddriisenhormones. I. 421

Zei t tI~t~ eine le icht h e m m e n d e IVi rkung auf (vgl. 'Vers. 2, Gruppe c). W i e d ie nachfotgenden R e a k t i o n e n beweisen, is t d ie Subs t anz eiweil~- frei. Ih re W i r k u n g diirf te m i t dem Vorhandense in ger inger Spu ren e iner eiweii~freien wi rksamen Subs tanz zusammenhSngen , die sich wahrscheinlich durch mehrmaUge Umfhl lung aus anges~iuertem 9 6 % i g e m Alkohol h~t ten ent fernen lassen.

R e a k b i o n e n yon P r ~ p a r a t 116: Whl~rige L6sung gegen Laekmus: neutral; Eiweii~kochprobe: - - ; :Hellersche Probe : - - ; Spiegler: - - ; Ferrozyankalium -~ EssigsEure : - - ; :Biuret: - - ; Millon: - - ; Adamkiewiez-Hopkins : - - ; Xantho- protein : - - ; SehweIelblei : - - ; Kupferhydroxyd wird tiefblau gelSst; :Pikrins~ure bei neutraler und saurer Reaktion: - - ; AlmSn: sehwache Opalcszenz; Phosphor- wolframsEure -~- H2SO4: - i - - { : - ~ ; Subtimat neutral: Opateszenz, naeh An- s~uern geringe Zunahme dcrselben. Eisenchlorid: -~, leicht 15slich im ~?ber- sehul~; :Bleiazetat: ~--~, lbslieh beim Erwiirmen in NaOH.

W e d e r F~l lung 2 noch 3 i ibcn, wie gesagt,, nach E n t f e m u n g noch vo rhandene r Eiwei i ]k6rper im K a u l q u a p p e n v e r s u c h nennenswer te spezifische W i r k u n g aus. Die wl rksame Subs tanz geh t v ie lmehr in den A lkoho lex t r ak t fiber, aus dem in oben beschr iebener .Weise du tch Ausschf i t te ln mi t Pe t ro l~ ther die noch vo rhandenen Yet te a bge t r e nn t werden. Die in den Pe t ro l~ the rex t r ak t i ibergegangenen Stoffe rufen die schon in Vers. 1 bei PrS~parat 64 beobach te t e W i r k u n g hervor.

Die pet rol i i therunl6s l iche F r a k t i o n ( P r S p a r a t 118) wird im Vakuum von Petrol '~ therspuren befrei t und in dest. Wasse r aufgenommen (vgl. Vers. 2, Gruppe d). I m K a u l q u a p p e n v e r s u c h rufen schon ger inge Mengen der Subs tanz s t a rke spezifische ~Virkung hervor , t r o t z d e m dieselbe, wie nachfolgende Reak t ionen beweisen, vSltig eiweii~frei ist. Die Subs t anz is t jodhal t ig .

l ~ e a k t i o n e n y o n 1 ) r ~ p a r a t 118: Die brSunlich gefhvbte amorphc Substanz 15st sieh leicht, aber nieht ganz klar, in neutralem dest. Wasser; Eiweil~kochprobe: - - ; HelIer: - - ; Spiegler: - - ; Biuret: - - ; Millon: -~- ~ ; Adamkiewicz- Hopkins: -~- ~- -~ i Xanthoprotein : ~ -{-. PikrinsSure, neutral: - - ; P.- und Essig- s~u re : - - ; 1)hosphorwolframs~ure-~-HaSO~: -{--~-~-Q-; Sublimat neutral: 0pa- leszenz. Sublimat und Natriumazetat: -~--~--~-; S. und HCl: - - ; AlmSn: -t--~--~-. Auf dem Platinblech verbrennt die Substanz ohne Hinterlassung yon Asehe.

B e i l s t e i n s c h e Flammenprobc: GriinfSrbung der Flamme. Zusatz yon KNO~ und Ausschiitteln mit Chloroform: leiehte Violettiarbung des Chloroforms; aueh die Untersuchung nach dem B a u m a n n - R a b o u r d i n s c h e n Verfahren ergibt die Anwesenheit yon Jod.

Als Beleg ffir die W i r k u n g der Pri~parate 115, 116 und 118 diene folgender Versuch 2, dessen Ergebnis du t ch des f ibere ins t immende Resu l t a t mehre re r KonCrollversuche gest.iiCzt ist.

V e r s u c h 2. M a t e r i a l : Rana t emporar ia -Larven aus einem am 29. IIL 19 abgelegten Laich. B e g i n n des V e r s u c h e s : 9. 1V. 19. Alter der Tiere: 11 Tage. Durchschnittliche GrSi~e d e r L a r v e n : GesamtlSnge 12 ram; Rumpf-

li~nge: 4 mm; tCumpibreite: 2 mm.

28*

422 B. Romeis:

E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Beginnende Uberwachsung der ~iul~eren Kiemen. A n z a h l de r T i e r e : 4 Gruppen zu ]e 20 Larven. V e r s u c h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle.

b: Pri~para~ 115. 2. Alkoholfi~llung; enthSlt etwas Eiweii~. ,) c: ~> 116. 3. Alkoholi~llung; eiweil~frei. ~) d: ~ 118. AlkohollSsliche, petrol~itherunlSsliche, eiweiBfreie

Fraktion. Pr~parat 115 und 118 werden in 1%iger w~l~riger Li~sung, 116 in 0,5 %iger

w~Briger LSsung verwendet. Bei jeder Extrakfffitterung werden 5 ccm der LS- sungen zugesetzt,

V e r s u e h s p r o t o k o l L 9. IV. 19. 1. ExfirakLeinwirkung. ~. IV.: 2. Extr~kteinwirkung. 13. IV. In Gruppe d sind die I,arven deuflioh im Waehstum zuriiek-

geblieben; die Entwicklung der ]~xtremit~ten isb etwas weiter vorgesehritten. 14. IV. 3. Extrakteinwirkung. 16. IV. Messung (vgl. Tabelle 4)x).

Tabelle 4:

Gruppe a: Kont,rolle Gruppe b : Priip. l i5 Grupp¢ c: Pr~p. ~t6 Gruppe d: l>riip..1t8

14,9 17,0 15,0 17,5 15,0 18,o

15,0--17,5

16,2

17,0 17,8 17,2 17,9 17,3 18,0

16,8 18,0 17,0 18,0 17~2 1910

8,9 12,5 11.0 12,6 1112 13,2

17,1--17,9 17,0--18,3 10,3--12,9

17,5 17~6 11,6

In Gruppe d tritt die Thyreoidcawirkung schr deutlich hervor. Aul~er der starken, aus der Tabelte ersichtlichen Wachstumshcmmung 1~i8~ sich Beschleuni- gung der Extremit~tenentwicklung, Verlust der larvalen FreBwerkzeuge, Re- duktioa des Larvaldarmes, Einsehmelzen des Sehwanzes usw. teststellen. In Gruppe b u n d o ist das Wachstum etwas gesteigert; die Extremitiitenknospen sind um geringcs grSl~er als bei der Kontrolle.

Tabelle 5.

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b: t'riip. 115 Gruppe c: Pr~ip. i16

17,1 19,2 18,2 ! 21,0 18.0 21,4 17,5 19,8 19,5 / 21,5 1911 21,5 18,2 20,5 20,5 i 21,6 20,0 21,8

19,4--21,4 19,0--21,6 17,6--19,8

18,7 20,4 20,3

1) Hier und in den TabeUen wurden von jeder Gruppe die Gesamtl~nge der drei kleinsten und drei grS~ten Tiere gemessen und daraus die Dureh- schnittsmat]e berechnet..


19. IV. Bei der Mehzuahl der Tiere von Gruppe d ist ein vorderer Ex- tremit~tenstummel durchgebrochcn. Am Abend sind alle Tiere tot bis auf drci, die am folgenden Tag sterben.

21. IV. Messung. In Gruppe b u n d c ist das Wachstum noch immer be- giinstigt (vgl. Tabelle 5); die Entwicklung ist leicht beschleunigt.

:Extrakteinwirkungen am 27. IV., 7. V., 17. V. 18. V. Messung (Tabelle 6).

Tabelle 6.

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b: Priip. ii5 Gruppe c : l~r~ip, t l6

2] ,2 28,3 22,8 28,9 24,1 30,6

22,7--29~3

26,0

21,5 27,1 24,0 28,4 25,0 28,5

23,'.3 28,0 26,1 28,7 26,2 30,8

23,5--28,0 25,2--29,2

25,7 27:2

Die Waehstumszunahme ist also seit 21. IV. bei Gruppe b wie c geringer als in a. Die Entwicklung ist in Gruppe b etwas starker beschlcunigt als in e.

5. VI. 7. Extrakteinwirkung. Die durchschnittliche :L~nge der Hinter- beine betr~igt in Gruppe a: 3 ram, in b: 6 ram, in c: 4 ram.

5. VII. Messung (Tabelle 7). T~belle 7.

Gruppe a: Kontrolle i Gruppe b: t)r~il), il5 Gruppe c: Prltp. 116

26,2 27,0 30,3

33,4 ] 21,8 35,2 I 24,9 37,3 24,5

26,5 ] 27,6 31,5

27,8--35~3 ! 23,6--28,5

31,5 ! 26,1

23,2 31,0 23,6 31,8 25,2 36,0

240--32,8

28,4

])as ~Vachstum der Tiere bleibt in Gruppe b immer mehr hinter der Kontrollgruppe zlLriick. Geringer is~ die Hemmung in Gruppe e. Die Ent- wicklung ist in Gruppc b starker beschleunigt als in c; der Grad der Bc- sehleunigung 1E~t sich jedoch nicht vergleichen mit der Wirkung des Prilpa- rates 118. ])as Gesamtwaehstum b e t r ~ in Gruppe a: -}- 19,5 mm; Gruppe b: ~- 14,1 ram; Gruppe c: -}- 16,4 ram; Gruppe d: - - 0,4 mm.

Der Versueh wird abgebrochen.

Danach gelingt es also, aus der frischen Schilddriise ohne ein- greifende chemische Prozesse nach der angegebenen Methode eine vol lkommen eiweiBfreie Extraktfrakt ion zu erhalten, die im Kaul- quappenversuch starke typische Schilddriisenwirkung besitzt. Bei der Isolierung ist die Verwendung wasserhaltigen Alkohols und die saure Reakt ion von Bedeutung. Es is~ nicht unbedingt nStig, dab zur Ex- traktion, wie oben, gerade 5 0 - - 6 0 % i g e r Alkohol verwendet wird. Ver-

424 B. Romeis:

gleiehende Versuche zeigten, dab die Extraktion auch mit 80Toigem bis 90%igem Alkohol gelingt, wobei man zweckmSl~ig mit Essigs~ure schwach ans~uert. In diesen mit hSher prozentigem Alkohol gewonnenen Extr~kten ist die Menge der den ]~'511ungen 1 und 2 ent- sprechenden Substanzen stark vermindert, da sie grSfitenteils ungelSst im Extraktionsgut zuriickbleiben. Start dessen bekommt man aber mehr Fett- und Lipoidsubstanzen in den Extrakt, die dann dutch Aussch~itteln mit Petrol~t.her und ~ther wieder entfernt werden mfssen, wobei unter Umst~nden schwer t.rennbare Emulsionen auftreten. So- weit ich es bisher beurteilen kann, ist die Ausbeute an wirksamer Substanz bei Extraktion mit 60%igera AlkohoI am besten.

DaB alkoholische Extrakte der Sctfilddriise im Kaulquappenversuch spezifische Wirkung hervorzurufen vermSgen, wurde bereits von K a h n (16) und unabh~ngig davon von mir selbst (18) fesLgcstellt. Wie ich jedoeh darlegte ( R o m e i s 18 und 19), war damals die MSglichkeit, dad die Wirksamkeit dieser Extrakte mit vorhandenen Eiweil~spuren (besonders Albumosen) zusammenhangt, nicht ganz ausgeschlossen. Mit den vorliegenden Versuchen sind die damaligen Einw~nde wider- legtl). Danach beruht wohl auch die Wirkung des Pr~tparates B 2 in Versuch 2 meiner 6. Mitteilung (19) auf der Anwesenheit der eiweilt- freien wirksamen Substanz, die also auch aus der nach dem Er- 1 and sen schen Verfahren yon Fet ten und Lipoiden befreiten Trocken- substanz mit 80%igem Alkohol extrahiert werden kann. In der mir nachtr~glich bekannt gewordenen 3~[ethode yon H e r z f e l d und K l i n g e r (18) wird ebenfalls Alkohol zur Abtrennung der Eiwei~substanzen be- nfitzt. Doch lassen die nach dieser Methode bereiteten Extrakte wegen der dabei mehrere Tago lang bci alkalischer Reaktion stattfindenden Autolyse keine Schlfisse auf ein vital vorgebildetes Hormon zu.

Ein Vergteich der Wirkung der in Versuch 1 und 2 verwendeten, enteiwei~ten Extrakte und ihrer Herstethmg l ~ t die Ursache ver- muten, warum die yon O s w a l d (16) untersuchten, enteiwei~ten Schild- ddisenextrakte jede spezifische ~Tirksamkeit vermissen llet~en. O s w a l d befreite die betreffenden w~l~rigen Extrakte durch Kochen under Zu- satz yon Essigs~ure vom Eiwei~, engte auf dem Wasserba~l ein und tMlte in tier K~lte (Reaktion?) ~;mit starkem Alkohol, solange der ent- stehende wefl~flockige Niederschlag sich vermehrte(~. Mit diesem Nieder- schlag hat O s w a l d vermutlich auch die eiweil~freie wirksame Sub- stanz entfernt.

Die in der oben dargelegten Weise gewonnene Extraktfraktion

1) Selbst wenn man den negativen Ausiall der :Biuretreaktion als nicht beweisend ansehen wiirde, spricht das Ausbleibcn ]eglieher Triibung bei Pikrim s~iurezusatz (selbst bei ErwSrmen und Ans~uern) gegen die Anwesenheit yon Albumosen.

Vcrsuchc zur Isolierung des Sehilddrfisenhormones. I. 425

enth~lt neben der wirksamen Substanz noch eine Reihe von Bei- mengungen, die ffir die spezifische Wirkung belanglos sind. Ein Teil derselben l~l]t sich mit Hilfe yon Azeton entfernen. Auch etwa vorhandene Peptone (s. oben), die durch Alkohol zum Toi l nicht gefMlt werden, kSnnen auf diese Weise beseit4gt werden. Die im Vakuum stark konzentrierte Ex~raktfraktion wird dazu unter stetem Schiitteln in die 5fache Menge Azeton getropft. Dabei bildet sich ein ziemlich reichlicher, grobflockiger Niedersehlag, yon "dem nach 24 Stunden dekantiert wird. Der Bodensatz wird nochmals in reinem Azeton aufgeschiittelt, auf dem Fil ter gesammelt und im Exsikkator zu einer braunroten, weichen Masse getrocknet (Pr~parat 119).

Die azetonunlSsliche Fraktion (Pr'~parat 119) ist in dest. ~Vasser bei neutrater Reaktlon klar 15slich. Ebenso 15s~ sie sich in Eisessig. Heller: - - ; Biuret: - - ; Millon: - - ; Xanthoproteinreaktion: -[- -~- ~- ; Adamkiewicz-ttopkins: -~-{- ; Pikrins~ure: - - ; PhosphorwolframsSure -~ I:12S04: -{--~; Alm6n: - - ; Sublim~t neutral: Opaleszenz; ]~isen- chlorid: - - , starke Braunf~rbung; Bleiazetat: kein 5[iederschlag.

Im Kaulquappenversuch (s. Versueh 3) ruff die azetonunlSsliche ~raktion, wenn bei der ursprfinglichen Extraktion keine Autolyse stattfand, erst naeh li~ngerer Einwirkung Entwicklungsbeschleunigung nnd Wachstumshemmung hervor: Zum iiberwiegenden Teil geht die wirksame Substanz in den Azetonextrakt fiber. Die Trennung erfolgt jedoeh nicht qnantitativ.

V e r s u c h 3. Mater ia l : J~ana temporaria.Larven aus cinem am 29. III. 19 abgelegten

Laich. Beginn des Versuehes: 9. IV. 19. Alter der Tiere: 11 Tagc. D u r c h s c h n i t t l i c h e Gr59e der La rven : Gesamtl~inge: 12 ram; Rumpf-

l~tnge: 4 ram; l~umpfbreite: 21/~ mm. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Beginnende Uberwaehsung der ~uBeren Kiemen. Anz~hl der Tiere : 2 Gruppen zu je 20 Larven. Ve r suchsanordnung : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Pr~parat 119, azctonunlSslichcr Tell des enteiweii]ten Extraktes. Von Pr~parat 119 werden bei ~eder Extrakteinwirkung 5 ecru eincr 1%igcn

w~[~rigen LSsung verbraucht.

Tabelle 8.

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b: Priip. it9

15,1 17,2 17,2 18,2 15,2 17,4 17.3 18,6 15,3 17,9 1715 19,0

15~2--iI7~5 17,3--18,6

16,3 17:9

426 ]3. Romeis:

V e r s u c h s p r o t o k o l l . 9. IV. 19, 11. IV., 14. IV. Extrakteinwirkung. 16. IV. Messung (vgl. Tabelle 8). Das Wachstum ist in Gruppe b also deutlich gesteigert; dabei macht sich

gleichzeitig eine leichte Entwicklungsbcschleunigung an den ]~xtremit~tenanlagen bemorkbar.

Bei einer am 21. IV. vorgenommenen Messung sind die Larven der Gruppe b im DurchschnittsmaB noch um 1,4 mm grSBer als in der Kontroll- gruppe. Das Wachstum ist jedoch nicht mehr gesteigert; es stimmt mit jenem der Kontrolle iiberein.

Am 27. IV., 7. V. und 17. V. weitere Extrakteinwirkungen. 18. V. Messung '(s. Tabelle 9).

Tabet le 9.

Gruppe a : Kontrolle Gruppe b : Pr~i,p. 119

22,3 28,5 22,9 29,5 23,6 29~6

22,9--29,2

26,1

19,9 24,2 20.3 24~6 2112 24,7

20,5--24,5

22~5

Das Wachstum ist demnach in Gruppe b erheblich zuriickgegangen. Die Pigmentierung der Tiere ist froschfihnlich, die Extremit~ten s ind schon gut entwickelt. In Gruppe a noch reiner Larvaltypus.

1. VL In Gruppe b sind bei 2 Tieren die Vorderbeine durchgebrochen 5. VL 7. :Extrakteinwirkung. 7. VI. ]~Iessung (s. Tabellc 10).

Tabel le 10.

Gruppe a: Kontrotle

26,1 30,0 26~3 31,8 28,2 33,1

26,8--31,6

29,2

Danach ist in Gruppe b nicht nur

Gruppe b : Pr~tp. i t9

13,5 1 22,5 19,5 2470 21:6 24,1

18,2--23,5

20~8

eine I-Iemmung des Wachstums, sondern sogar ein Riickgang der Mal3e seit dcr lct~zten ~iessung Iestzustetlen. Die Ent~ wicklung ist deutlieh beschleunigt; bei 3 Tieren ist je ein liI~cs Vorderbein durchgebroehcn.

Die Tiere der Gruppe b metamorphosieren am 9, 12, 13., 14. und 16. VL In der Kontrollgruppe finder die erste Metamorphose erst am 7. VII. start.

Das P r ~ p a r a t 119 wi rk t also zuni~chst wachstumsfSrdernd. Nach einiger Zei t k o m m t aber eine wachs tumshemmende und entwicklungsbeschleunigende W i r k u n g zum Vorschein.

Versuche zur Isolierung des Schilddrfisenhormones. I. 427

Bei der Verarbeitung der a z e t o n l S s l i c h e n Fraktion wird zun~tchst das Azeton im Vakuum abdestilliert. Eine weitere Abtrennung spezifisch unwirksamer Substanzen erfolgt durch Ausschiitteln des in 50% igen Alkohol aufgenommenen Rfickstandes mit Benzol oder Trichloriithylen. Die in diese Liisungsmittel iibergehenden i~ettsubstanzen sind im Kaulquappenversueh in gereinigtem Zustande entweder ohne Wirkung oder rufen nur leicht, e Waehstumshemmung hervor.

Weitere Substanzen lassen sich durch A u s s c h i i t t e l n m i t J~ ther abtrennen. Man destilliert dazu zuniichst im Vakuum den noeh im Extrakt befindtiehen Alkohol vollst~ndig ab, nimmt den Riickstand in dest. Wasser auf und schiittelt mit alkoholfreiem Ather bei nen- traler Reaktion aus. Der abge t rennte ~therextrak~ wird mehrmals mit H20 gewasehen, der J~ther abdestilliert, und der braungelb gefarbte Riickstand nochmals in J~ther gelSst und abfiltriert. Nach Ver- dunsten des Athers bleibt eine gelbgefarbte Substanz zuriiek, die sich in absolutem Alkohol klar 15st. Aus der L5sung kristallisieren diinne, rhombische Cholesterinkristalle aus, zwischen denen noch eine gelb- gefi~rbte Zwisehensubstanz vorhanden ist, die anscheinend der yon W a c k e r (12) in J~therextrakten beschriebenen, chemisch noch nicht charakterisierten *)Begleitsubstanz(~ entspricht. Der positive Ausfall der Proben nach S a l k o w s k i und nach L i e b e r m a n n - B u r c k h a r d t spricht ebenfalls ffir die Anwesenheit yon Cholesterin. Im Kaulquappen- versueh ruft diese mit J~ther abgetrenn_te Extraktfraktion keine Ent- wicklungsbeschleunigung oder Dissimilationssteigerung hervor. Die wirksame Substanz bleibt also beim Ausschiitteln der wiil3rigen neutral reagierenden LSsung im wasserlSslichen Teil zuriiek.

Wird das Ausschiitteln mit ~ther nicht in wi~l~riger sondern in a l k o h o l i s e h e r L6sung (etwa 70--80%ig) vorgenommen, so scheidet sieh an der F!iissigkeitsgrenze eine weil31iche Substanz ab, die auf dem Filter gesammelt wird. Getrocknet stellt dieselbe ein weii]liehes, sich etwas fettig anfiihlendes Pulver dar, dab in neutralem dest. Wasser leieht ISsIich, in 96%igem Alkohol dagegen unlSslich ist. Auch in Chloroform, Benzol, Toluol 16st sich die Substanz nur wenig. Auf dem Platinblech verbrennt sie ohne Asehenriickstand. Beim Erhitzen im Reagenzglas tr i t t Akroleingerueh auf; die weil]en D/~mpfe konden- sieren sieh an der Wand des Glases. Wird zu einer mit Natronlauge versetzten wi~grigen LSsung Kalziumchlorid gegeben, so entsteht reichlicher weil3er Niedersehlag, der in kaltem wie kochendem Alkohol unliislich ist. Zusatz yon HC1 zur NaOH-LiJsung gibt keinen Nieder- schtag. Die ldare w~l]rige LSsung gibt mit Pikrins~ure oder Phosphor- wolframs~ure auch nach Ans~uern keinen Niedersehlag. Sublimat gibt nur bei neutraler Reaktion und gleichzeitigem Natriumazetatzusatz einen feinen, weiBlichgrauen Niedcrschlag. Millon: -- ; Biuret: -- ;

428 B. Romeis :

Trommer: ---; im Kaulquappenversuch ruft die Substanz ~keine Ent- wieklungsbesehleunigung hervor.

Beim Aussehlitteln des in 50--70%igen Alkohol aufgenommenen Extraktes mit ~ther gehen in den ~therextrakt auch verschiedene in reinem ~ t h e r unlSsliche Substanzen fiber, da sich dem J~ther natiirlieh auch Alkohol beimengt. Nimmt man dann dan im Vakuum getrockneten Atherextraktriickstand in reinen ~ther auf, so bleibt ziemlich viel Sub- stanz in Form eines gelblich weiBlichen Riickstandes ungelSst zur[ick. Die leieht gelb gef~rbte ~therlSsung enth~lt wie die oben beschriebene Cholesterin und eine gelbgef~rbte Zwisehensubstanz und ist im Kaul- quappenversueh unwirksam. Der ill reinem, alkoholfreien At.her un- 15sliche Rfickstand 15st sieh in dest. Wasser bei heutraler Reaktion sehr leicht his auf einen geringen, samischbraun gefarbten Niedersehlag, der auf ein kleines Filter abgesaugt wird.

Das Filtrat gibt folgende Reaktionen: Eiweil]koehprobe: -- ; Biuret: -- ; Millon: ~-~-q- ; Adamkiewicz:Hopkins: ~-d-d- ; Xanthoprotein: -t--}-d-; Ph0sphorwolframs~ure und H2SO.~: -+-q-d--~-; Sublimat neutral: -kd- ; Sublimat und Natriumazetat: -t- ~--k q-; Pikrinsaure: - - ; Pikrin- und EssigsSure:--; beim Ausschiitteln tier mit Salpetersaure versetzten LSsung mit Chloroform ganz schwache Rotf~rbung. Die Beilsteinsehe Flammenprobe gibt sehr deutliche Grfinf~rbung tier Flamme. Die Extraktfraktion ist demnaeh frei yon EiweiB, Albumosen und Peptonen, aber jodhaltig.

Im Kaulquappenversuch ruft diese Extraktfraktion in kiirzester Zeit sehr starke Dissimilationssteigerung, Wachstumshemmung und Entwieklungsbeschleunigung hervor. Wie in Abb. 3b abgebildete Kaul- quappen zeigen, genfigte die einmalige Einwirkung einer 0,00005Yoige n LSsung, um nach 4 Tagen die aus der Photographie ersiehtllchen Er- scheinungen hervorzurufen. (Abb. 3a: Kontrolle d~zu.) Die starke Wirkung kommt aueh im Durchsehnittsgewicht zum Ausdruck, das bei der Kontrollgruppe 200 rag, bei der Extraktgruppe 80 rug betr~gt.

Der br~unliehe, oben erwahnte Niedersehlag ist in Wasser bei neutraler Reaktion unlSslich; bei Zusatz vdn etwas verdfinnter Na0H erfolgt rasch LSsung in schwach gelblicher Farbe.

R e a k t i o n e n : Koehprobe: ~ ; Biuret: - - ; Millon: ~ ; Adamkie- wicz-Hopkins: - - ; Schwefelbleireaktion: - - ; Xanthoprotein: - - ; Phos- phorwolframs~ure -b H2SO~: Q--b-~ ; Sublimat und Natriumazetat: d - - k ~ ; Pikrinsaure: - - ; Pikrin- und Essigs~ure: - - ; Ausseh~itteln der mit Salpeters~ure versetzten Substanz mit Chloroform: keine Rot- farbung. Beilsteinsehe Flammenprobe:-- ; auf dem Flatinbleeh verbrennt die Substanz unter Hinterlassung yon Asehe.

Im Kaulquappenversueh ist der Niedersehlag schon in sehr starker Verdiinnung spezifisch wirksam. Die in Abb. 3c abgebildeten Froseh-


larven befanden sich 4 Tage vor der Aufnahme fiir 24 Stunden in einer 0,000 001%igen LSsung des Niederschlages. Schon nach 2 Tagen trab eine Verschm~lerung des Rumpfes ein, am 3. Tage deutliche Rc- duktion am Schwanz, die rasch fortschritt und am 4. Tage die Schwanz- l~nge auf weniger als die H~lfte verr inger t hatte. Hornkiefer usw. waren vSllig verschwunden, das Darmrohr stark verkiirzt. Die Ent- wicklung der Extrcmit~ten war deutlich beschleunigt, doch kam dieselbe infolge der st~rken Dissimilation nicht mchr rccht zur Geltung. (Unterschied im Durchschnittsgewicht gegeniiber Kontrolle: 96 rag: 200 mg).

In weiteren Versuchen wurde die alkoholische ExtraktlSsung mit H~SO~ bis zu 5 - -10% S~uregehalt anges~uert und nun nlehrmals mit -~ther extrahiert. Der ~berg~ng yon wirksamer Substanz in den alkoholischen Atherextrakt scheint hierbei noch starker zu sein. Als Beispiel tier Wirkung diene ein Vergieich yon Abb. 4a und b.

Bei den in Abb. 5b abgebildeten Larven, die im Vergleich zu den gloich alten, in Abb. 5a wiedergegebenen Kontrolltieren, sehr deutliche Entwlcklungsbeschleunigung zeigen, wurde die zur Einwirkung gelangte Substanz in folgender Weise gewonnen. Zun[Lchst wurdcn l0 ccm des enteiweil3ten Ausg~ngsextraktes (0,1%ige LSsung in 70%igem Alkohol) bei neutraler Reaktion mehrmals mit At.her ausgesch/ittelt. Dann wurde 1 ccm H2SO4 zugeftigt, nochmals mit 2 X 30 ccm J~ther extrahiert, der _~therextrakt filtriert und im Vakuum getroeknet.

R e a k t i o n e n eilleS aus d e m g l e i c h e n Ausgangsm~t te r i ,~ l a n M o g h e r g c s t e l l t e n E x t r a k t e s : K o c h p r o b e : - - ; Hellcr: - - ; Biuret: ~ ; Mitlon: - - ; Adamkiewicz-Hopldns: - - ; Phosphorwolfram- s~Lure und HeS04: -i--i--+--+-; Sublimat und Natriumazetat: - [ - ~ ; Pikrhls~ure: - - .

Der kaum sichtbare, minimale Riickstand (etwa 0,05 mg)wurdc in 20 ccm schwach alkalischen Wassers aufgenommen und davon in vier aufeinanderfolgenden Tagen je 5 ccm dem Wasser der betreffenden Kaulquappenschale (Inhalt 300 c0m H~O) zugegeben. 10 Tage nach ]3eginn des Versuches ist die aus Abb. 5a und b ersichtliche Wachstumshemmung und Entwicklungsbeschleunigung festzustellen, die in den folgendea 3 Tagcn sich noch verstiirkt. Am 13. Tage brechen bei der 3~ehrzahl der Tiere (6) bereits die Vorderbeine durch, w~hrend die Kontrollen noch ganz kleine uncntwickelte Beinanlagen besitzen. Die Wirkung hat in diesem Versuch durch das geringere Hervortreten der Dissimilationssteigerung und der dadurch starker in Erscheinung tretenden Entwicklungsbeschleunigung fibemus groi~e :~hn- lichkeit mit der Wirkung frischer Schilddrtise. Vermutlich beruht aber der Unterschied gegeniiber der Wirkung der Extraktc, die auf die in

430 B. Romels :

Abb. 3b u n d c sowie 4b abgebi!deten Tiere zur Einwirkung kamen, weniger in einer Verschiedenheit der Substanz, als vielmehr ira Unter- sehied der D.osierung. Allerdings wgren aueh Differenzen im Jodgehalt mSglich.

Aus den Versuehen geht hervor, dab das Ausschfitteln mit _~ther unter Umst~nden zu Verlusten yon wirksamer Substanz fiihren kann. Andererseits aber ergibt sieh aus ihnen ein Weg zur Isolierung der wirksamen Substanz, den ich noch welter zu verfolgen beabsichtige.

In den nachfolgenden Versuchen wurde zungchst die weitere Auf- teitung des enteiweiBten Grundextraktes durch ~ l l u n g versucht. Als Ausgangsmaterial dien~e dazu irdmer ein nach der vorangehend be- sohriebenen 5Iethode dutch Extraktion mit 50%igem Alkohol gewon- nener, durch Essigs~ure - - , zweimalige Alkohol- und einmalige Azeton- fhllung, dutch Aussehlitteln mit Petrol~ther und Trichlorgthylen gereinigter Extrakt , der zuletzt eingeengt, in 200 cem H-.O aufgenommen und bei neutraler Reaktlon mit alkoholfreiem ~ther ausgesch/ittelt wurde. I-Iierauf wird nochmals im Vakuum konzentriert und der Rfickstand mit H~O auf 100 ccm verdiinnt. Da die Menge der zur Extrakiion verwendeten Drtisen sehwankte, so lassen sich jedoch zwischen den einzelnen spgter abgetrennten Extraktffaktionen keine quantitativen Vergleich~ anstellen.

Die F g l l u n g m i t P h o s p h o r w o l f r a m s ~ u r e erfolgte in der Weise, dal3 der gereinigte Extrakt zun~chst langsam unter Kiihlung mit 5 ccm ttzS0~ angesSue~ wird, wobei der orangegelbe Farbton der LSsung rasch in Gelb umschlggL Dann wird sotange eine 5%ige w~13rige LSsung von Phosphorwolframs~ure (Merck) zugesetzt, bis an Stetle des zuerst auftretenden grobflockigen, hellbrhunliehen Nieder- schlages eine feinkSrnige, weil~liche ]~gllung erscheint. Man unter- brieht dann den Zusatz und l~t~t den Niederschlag absetzen, was bei genfigender Ausf~llung im Laufe von 1 - -2 Stunden erfolgt. Kl~rt sieh die dartiber stehende LSsung nicht, dann mul~ noch etwas Phosphor- wolframs~ure zugeffigt werden.

Nach einigen Stunden wird die klare, gelblich gef~rbte LSsung vom Niedersehlag abgesaugt. Zum Filtrat ffigt man zur Entfernung der HzS0¢ und der Phosphorwolframs~ure Baryumhydroxyd im Uber- schu6, filtriert ab und f~llt das in der Lgsung vorhandene Baryum- hydroxyd dureh Zusatz yon verdfinnter He_SOt bis zu ganz schwaeh sauerer Reaktion. Das klare Fil trat (Pr~iparat 133) wird im V~kuum bei 40~'C konzentriert und im Vakuumexsikkator fiber H~S04 und Na0 H getroeknet, wobei verschiedene Substanzen, die ieh noch nieht ngher untersueht habe, auskristallisieren.


:Reakt ionen yon Pr~iparat 133: die Trockcnsubstanz 15st sich leicht in dest. Wasser. Heller: -- ; Spiegler: -- ; Ferozyankalium-~-Essigs'~ure: - - ; Biuret: - - ; BIillon: -- ; Xanthoprotein : -b; Adamkiewicz-Hopkins : -~-; Pikrin- s~ure: -4-; Alm6n: ~--+- ; Sublimat-~- Natriumazetat: -+--b-b; Eiscnchlorid : -- ; Nesslers Reagens: reichlicher, orangegelb gef~rbter Niedersohlag.

Im Kaulquappenversuch (vgl. Vers. 4, Gruppe a, Pr~par,~t 133) tiben diese von Phosphorwolframs~ure nicht gef~llten Subst~nzen keinen entwicklungsbeschleunigenden Einflut~ aus. Dagegen wurde in einigen Versuchen, aber nieht, konstant,, eine wachstums- und entwicklungs- hemmende Wirkung sichtbar.

Der dureh Phosphorwolframs~ure ausgefallte Niederschlag wird auf der Nutsche mit 5%iger HeSO, und Wa~sser ausgewasehen. Dabei geht der erwahnte, bei tier F~ltung zuletzt auftretende weiBliehe Niederschlag in LSsung. Die Waschfliissigkeit wird dureh Zusatz yon Bariumhydroxyd von H.~S04 befreit, eingeengt und im Kaulquappen- versuch gepriift; die in ihr enthaltene Substanz hat auf Wachstum und Entwicklung keinen EinfluB.

Um die im Phosphorwolframs~ureniederschlag befindliehen KSrper in Freiheit zu setzen, wird der ausgewasehene, hellbr~unliche Nieder- schlag mit Barytwasser zersetzt. Er wird dazu in kleinen Mengen mit reichlicher, heit~ges~tt.igter, erkalteter Barytlauge sorgfSltig verrieben. Dabei farbt er sich zuerst rasch graugriinlich, sp~ter weil31ich br~iunlieh. Dus Zersetzen wird so lunge fortgesetzt, his kein hellbr~tunliehes KSrnehen mehr zu sehen ist. Hierauf wird nach kurzem Stehen ubgenutscht. Die Barytbehandlung des Niederschlages wird noeh 2 - - 3 m a l wiederholt.

Dureh das vereinigte hellgelb gefarbte Filtrat wird so lunge Kohlen- s~iure geleitet, his das Baryum als Karbonat ausgefitllt ist., worauf es naeh einigen Stunden durch Filtrieren abgetrennt wird; das neutral reagierende Filtrat wird ira Vakuum auf 50 ecru konzentriert und mit 50 eem 96%igen Alkohol versetzt. Werden beim AnsSuern einer kIeinen Probe mit H2SO~ noch Spuren yon Bariumsutfat ausgef511t, so wird alas Filtrat mit etwas verdiinnter H~.S04 sehwaeh angesauert und nochmals abfiltriert. Hierauf wird de1: Alkohoi im Vakuum abdes~illiert und der Rfiekstand fiber H2SO~ und NaOI-I im Exsikkator getroeknet, in 90%igem Alkohol aufgenommen, geschiittelt und die LSsung yon dem geringen Riickstand abfiltriert. Veto :Filtrat wird der Alkohol im Vakuum abdestiliert und der Riiekstand getrocknet (Pdtpara~ 134).

Reak t ionen yon Pr~para t 134: Die Trockensubstanz 15st sich leicht in dest. I-I20 bei schwach alkalischer Rcaktion. Auf dem Platinblcch verbrennt sie ohne Asche. tIeller: -- ; Spiegler: ~ ; Biuret: -- ; Millon: -- ; Xanthopro- tein: Gelbfiirbung, die sich auf Na0H-Ztisatz nicht verSndert; Schwefelblci- reaktion: - - ; Adamkiewicz-Hopkins: +q-q-; Tryptophan (Bromwasser): - - ;

432 B. Romeis :

Kupferhydroxyd wird tiefblau ge15st. Sublimat neutral: -~-; Sublimat und Natriumazetat: -~--t--~-; Sublimat und HCI:--; Pikrins~iure: --; Phosphorwolfram- s'~ure -~ HzSO l : -p-~--~--f-; Ahn~n: -]--~-~- ; Nesslers l~eagens : geringer, griinlich- gelber ~Niederschlag; Beilsteinsche :Flammenpr0bc mit etwas Trockensubstanz ausgefiihrt: keine Griinfiirbung der Flamme; auch nach der Baumann-Rabour- dinschen Methode l~l~t sich an eincm analog hergestellten :Pr~parat kein Jod nachweisen. Beim Schiitteln mit ttNO 3 und Chloroform kcine ViolettfSrbung, was ebenfalls fiir die Abwcsenheit yon Jod spricht.

Wenige Kubikzentimeter einer 0,1%igen w~!~rigen LSsung der braungelb gefhrbten Troekensubstanz rufen im Kaulquuppenversuch deutliche Entwieklungsbeschleunigung und Wachstumshemmung hervor (vgl. Vers. 4, Gruppe c, Fr~i.p~rat 134). Die wirks~me Substanz wird also durch Phosphorwolirams~ure ausgef~llt.

Der beim Zersetzen des Phosphorwolframs~ureniederschlags mit Ba.rytwasser zurfickbleibende Riickstand enthalt wie sehon seine briiun- liohe Farbung zeigt, aul3er schwer 15sliehem Bariumphosphorwolframat noch andere Subsmnzen. Um auch diese noch in ihrer Wirkung zu untersuchen, wurde zuniiehst die Extraktion mit warmer 10%iger H~SO~ (50 ° C) versueht, ohne daf5 die Substanzen in LSsung gegangen w~ren (vgl. auch Pri~parat 135 im Versuch 3, Gruppe d). I-Iier~uf wird der abgetrennte, mit H~0 ausgewaschene Niedersehlug mit 20 cem H20 verriihrt und nach Zusatz yon 5 ccm einer 40%igen Natronlauge auf dem Wasserbad kurze Zeit erw~rmt (50 ° C), wobei sieh die Fliissig- keit sehr rasch br~unt. Nach Abnutschen durch Asbest wird der l~iickstand so lunge mit warmer Natronlauge gewaschen, bis der Nieder- schlag vollkommen weil3 ist. ]Die vereinigten Filtrate werden zuerst mit 25%iger, dana mit 5%iger EssigsSure sorgfi~ltig neutmlisiert. Dabei fiillt ein feinflockiger, br~unlieher Niedersehlag aus, der nach 24 Stunden auf einem kleinen Tilter gesammelt wird. In sp~teren Versuchen wurde d{e Extraktion start mit NaOH mit verdiinntem NHa vorgenommen und derselbe im Vakuum aus dem Filtrat verjagt. Auch hier fallt nach Entfernung des lqHa und Ansauern mit Essigs~ure Niederschlag aus.

Die beim :Neutralisieren oder schwachen Ans~uern ausfallende Sub- stanz iibt im Kaulquappenversuch keine entwicklungsbeschleunigende, wohl aber ziemlieh betri~chtliche wachstumshemmende Wirkung aus (vgl. Versuch 3, Gruppe e, Pr~parat 136). ]:)as Filtrut (Pr~parat 137) wirkt schwach entwieklungsbesehleunigend (vgl. Versuch 4, Gruppe f).

t~eakbionen yon P r~pa ra t 136: Heller: ~ ; Spiegler: - - ; :Biuret: - - ; ~I i l lon:-- ; Xanthoprotein: _~2; Adamkiewicz-Hopkins- -]-; Kupferhydroxyd wird tiefblau gelSst; Sublimat neutral: -- ; Sublimat und Natriume~zetat :. - - ; Sublima, t u n d H C I : - - ; Pikrins~iurc:--: Ncssler;-- ; Alm6n:- - ; Phosphor- wolframs~ure -t- HzSOz: geringe Opaleszenz.

I~eakt ionen von P r £ p a r a t :137: Heller: ~ ; Spiegler: - - ; Biuret: - - ; Millon: - - ; Adamkiewicz-tIopkins : - - ; Xanthoprotein: - - ; Kupferhydroxyd wird


reichlieh und tiefblau gelSst; Sublimat, neutrah-q-; Sublimat und :Natrium- azetat: -t-; ~essler: - - ; Alm(~n: -bq-q--}-; gelb; Phosphorwolframs[iure q- H~SO4: Q--}--/--t-; weil~er, feinflockigcr Nicdersehlag.

Von 8 Versuehen, die zur Untersuehung der Wirkung der einZelnen Fraktionen mehrerer analog hergestellter Extrakte ausgeffihrt wurden und die zu iibereinstimmenden Ergebnissen fiihrten, sei der nachfolgende Versuch aus- flihrlicher wiedergegeben.

Versueh 4. M a t e r i a l : Rana temporaria-Larven aus einem am 29. IIL 20 abgelegten

Laich. B e g i n n des V e r s u o h e s : 3. V. 20. Alter der Tiere: 35 Tage. D u r e h s c h n i t t l i e h c GrSi~e de r L a r v e n : Ges~mtl;4nge: 20 ram; gumpf-

li~nge: 8 mm; l~umpfbreite: 5 ram. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Typisehe Larven mit 1 mm grot3en Extremi-

t4itenanlagem A n z a h l de r T i e r e : 6 Gruppen zu je 15 Larven.

V e r s u e h s a n o r d n u n g . Gruppe a: Kontrolle.

b: Pr~parat 133; enteiweil~ter Schilddriisenextr~kt; Phosphomvolf- reansgure-Filtrat.

~> c : ~ 134; desgl. PhosphorwolframsSureniederschlag; zersetzt mit Baryt; Filtrat.

~ d: ~> 135; desgl, desgl, desgl.; Riickstand; 16slich in H2SO~. ,> e: >> 136; desgl, desgl, desgl,; 15slich in NaOH, unlSslich

in verdiinnter EssigsSure. >> f: >> 137; desgl, desgl, desgl.; 15slich in :NaOH, 15slich in

verdiinnter EssigsMire. Pdiparat 133, 134, 136 und 137 kommen in 1% iger LSsung zur Verwendung.

]3ei jeder Extrakteinwirkung werden je 5 ecru diescr L5sungen verbraueht.

V e r s u c h s p r o t o k o l l . 3. V. 20: 1. Extrakteinwirkung. 5. V. Wasserwechsel. 6. V. 20: 2. Extrakteinwirkung. 7. V. Wasserweehsel. 8. V. Die Larven der Gruppe c sind deutlieh kleiner. Am Maul Reduk-

tionserscheinungen; Entwicklung der Extremit:~tenanlagen besehleunigt. 9. V. Messung (s. Tab. 11).

Tabel le 11.

G r u p p e ~:

Kontrolle

22,1 25,3 22,4 25,8 23,7 26,3

27,7--25,8

24,2

Gruppe b : Pr/tparat t33

21,8 24,9 22,2 26~1 22,8 26,4

22,3--25,8

24,0

Gruppe c : Praparat 131

17,6 19,8 18,3 20,6 18,7 22,3

18,2--20~9

19,5

Gruppe d : Pr~il)arat IJ5

22,5 25,1 23,2 26,3 24,1 26,8

24,6

Gruppe e: PrSparat i36

20,0 22,6 20,6 22,7 21,3 23,2

20,6--22,8

21,7

Gruppe f :

Pr~tparat t37

21,5 24,8 22,8 256 23,4 26,8

22,6--25,7

24,1 - - - -

In Gruppe c ist eine GrSf~enabnahme festzustellen, die sich ~us einsetzenden l~eduktionsvorg~ngen erkl~irt. Die Besehleunigung der ExtremitStenentwieklung hat sieh noeh verstiirkt. Hornz~hnchen, Hornkiefer und Papillen sind nur

434 B. I¢omeis:

mehr in geringen rudimenfiiren 1Resten vorhanden. Die iibrigen Gruppen zeigen keine typischen Thyreoideamerkmale; in Gruppe e ist das Wachstum zum Still- stand gekommen, ohne dab eine Beeinflussung der Entwicklnng zu beobachten ist..

11. V. 3. Extraktein~drkung. 12. V. in Gruppe c sehr starke Gewebsein- schmelzung.

12. V. Gruppe c: bei 3 Tieren ist der linke vordere Extremit~tenstummel durchgebrochen; Kopffiguration, Maulbildung froschartig. Augcn stark vor- springend. Larvaldarm reduzierk Schwanz zu zwei Drittel resorbiert.

15. V. Messung: (s. Tab. 12).

Tabelle 12. L

Gruppe a,; GruI~pe b ; Kontrolle P r ~ p a r a t i33

23,2 27,8 24,7 27,911 25,9 28, 1/

23,8 I 28,1 24,6 28,5 26,0 28,9

Gruppe c : P r ~ p a r a t 1 ~

13,2 16,5 14,7 17,2 14,9 19,3

Gruppe d : Pr~parat 185

23,7 27,4 4,6 28,0

25,2 28,2

Gruppe e: r r ~ p a r a t 136

19,2 21,8 20,0 22,9 21,9 23,5

G r u p p e f : P r ~ p a r a t t37

24,5 27,6 25,0 282 25,7 28,8

24,8--28,5 14,3--17,7 20,2--22,7 25,1--28,2

26,6 16,0 26 1 21,4 26,6

In Gruppc c sind die 5!aBe noch weiter zuriickgegangen. In Gruppe e ist das Wachstum seit der tctzten Messung nur mehr sehr gcring. Bei den iibrigen Gruppen keine wesenttichen Unterschiede.

16. V. 12 Tiere der Gruppe c liegen unter extremen Thyrcoidcacrschci- nungen mit beiderseits durchgebrochenen Vorderbeinstummeln tot in der Schale. :Die iiberlebenden drei sterben im Laufe der :Nacht auf den 17. V.

20. V. 4. Extrakteinwirkung. 21. V. Wasserwechsel. 24. V. 5. Extrakteinwirkung. 25. V. Wasserwechsel. 27. V. Messung (s. Tab. 13).

Tabelle 13.

Gruppe a :

Kontrol ie Gruppe b :

l ~ p a r a t i~ Gruppe d :

' ~ p a r a ¢ f35 Gruppe e :

P r g p a r a t f36 Gruppe f :

Pr~iparat 137

29,4 35,0 28,9 34,8 28,3 34,8 20,2 • 23,1 27,9 34,2 30,0 35,7 29,1 35,9 30,1 :~5,4 21,1 23,8 29,0 34,9 30,9 37,0 31,2 36,4 31,2 35,7 23,0 25,0 29,6 35,8

30,1--35,9 29,8--35,3 21,4--23,9 28,8--35,0

32,5

29,7--35,7

32,7 22,6 33,0 31,9

INach Ausscheiden der Gruppe c weist nunmehr Gruppe e das niedrigste DurchschnittsmM3 auf; das Wachstum ist hier stark gehemmt, ohne dai~ jedoch die ~Ent.wieklung beschlounigt ist: die larvalen Organe sind durchgehends noch in voller Ausbildung, die Extremit~tenentwicklung ist eher gehemmt als beschleunigt. Wachstum und Entwickhmg der Gruppen b und d ist unbeeinflui]t. In Gruppe f i s t die Entwicklung leicht beschleunigt, insofern die Extremitiiten vSllige Gliederung in Oberschenkel, Unterschenkel und FuB zcigen und die GrSl]e der Kontrollen um das Doppeltc iibertreffen.

Versuehe zur Isolierung des Sehilddrt[senhormones. I. 435

Der Versuch wird abgebroehen. Der EinfluB auf das Ges~mtwaehstum wfihrend der Versuchsdauer isi aus Tabelle 14 zu entnehmen.

Tabelle 14.

Waehstum yore Gruppe a; Gruppe b: I Gruppe e: Gruppe d; Gruppe e: Gruppe f: Kontrolle l ' rgp, t33 Pr/ip. 13~, Pr~p. t35 Prfi, p. 136 Pr~ip. 137

3. V.--9. V. -}- 4,2 -+ 4~0 - - 0~5 '. + 4,(~ A- 1,7 --{- 4,1 9. "V'.--15. V. + 2,1 + 2,6 -- 3,5 - - 1,5 - - 0,3 + 2,5 15. V.--27. V. ...... -+- 6,7 -{- 6,1 - - i -{- 6,4 ._-~-1,2 -{- 5.3

Gesamt~'acbstum -~- 13,0 -t- 12,7 - - 4,0 -b 1'2,5 ] -~- 2,6 ~- 11,9

Durch diesen Ve~uch, der in einer Reihe yon vorausgehenden wie nachfolgenden Kontrollversuchen voile Best htigung land, ist erwiesen, dab die spezifisch wirkende eiweiBfreie Subsbanz dureh Phosphor- wolframsgure ausgefgllt wird. Auffallend is~ die Feststellung, dab sich weder beim Ausschfitteln der salpetersauren L~sung mit Chloroform noeh n~ch der Baumann-R~bourdinschen Methode Jod feststellen lieB; nun k6nnten zwar nach dieser Methode geringe Jodspuren dem Nach- wels entgangen sein; das Resultat wird aber dadureh gestiitzt, dab auch die Beilsteinsche Flammenprobe ein negatives Resultat gab. In manehen Fallen, insbesondere dann, wenn die zur Extrakt ion beniitzten Driisen nicht frisch waren, so dab bereits Autolyse eingetreten war, l~f~t sieh nochet , was Jod nachweisen.

Zur weiteren t~einigung der wirksamen Extraktfrakt ion wurde sie mehrmals in 90%igem Alkohol gelSst, yon geringen ungeI6sten Riick- stgnden abfiltriert und wieder getrocknet. Nach 3maligem LSsen und Trocknen wurde die Trockensubsto, nz in 96%igem Alkohol aufgenommen, der Alkohol yon der filtrierten LSsung abdestilliert und der hellbrgunlich gefgrbte, kristallinische l~fickstand getroeknet (Pr~,p. 184).

Die Trockensubstanz verbrennt auf dem Platinbleeh ohne Asehen- riickstand. Die Befisteinsche Flammenprobe ist negativ. 0,01 g 15st sich klar in 100 ecru dest. Wasser. Die L6sung gibt deutlieh Adam- kiewicz-Hopkinsche Reaktion. Biuret: - - ; Xanthoprotein: Gelbf~rbung; Schwefelblei: - - ; Phosphorwolframsgure -[- H2S04: -~ -} - -k - -~ ; Subli- ma t neutral: Opaleszenz; Subl. und Natr iumazetat : -k--k-; Subl. und HCI:--; Millon: - - ; B l e i a z e t a t : - - ; Alm6n: -+-. Die Priifung auf Jod na~h den oben angegebenen Methoden ergab konstant ein negatives Resultat.

Uber die Wirkung im Kaulquappenversueh beriehtet naehfolgendes Protokolh

Versueh 5. ~Ia ter ia l : Rana temporaria.Larven aus einem am 27. HL 21 abgelegten

LaiehbaUen. Beginn des Versuches : 10. IV. 21. Alter der Tiere: 14Tage.

Archly fflr Entwicklungsmechanik Bd. 50. 29

436 B. Romeis:

D u r e h s e h n i t t l i c h e Gr51~e der L a r v e n : Gesamtl~inge: 13 mm; Rumpfl~nge: 5 mm; Rumpfbreite: 3,5 ram.

~ E n t w i e k l u n g s s t a d i u m : Kleine, typische Froschlarven; Extremit~tenanlagen nooh nicht sichtbar.

A n z a h l der T i e r e : 2 Gruppen zu je 20 Larven. V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Pr~parat 184 in

0,01%igor w~fl~riger LSsung.

V e r s u c h s p r o t o k o l l : 10. IV. 21. Erste Extrakteinwirkung: 10 ccm. 12. IV. Wasserwechsel. 13. IV. 10 ecru Extrakt. 14. IV. Wasserwechsel. In Gruppe b sind die Extremitiitenanlagen doppelt

so grol~ als in Gruppe a, in der sie mit der Lupc eben als kleine Knospen zu erkennen sind.

15. IV. und '20. IV. je 10 ccm Extrakt. 21. IV. Die Extremitiitenanlagen weisen in Gruppe b schon Gliederung in

Ober- und Un~erschenkel auf. Messung s. Tab. 15.

Tabelle 15.

Gruppe a : Gruppo b : Kontrol le Pr i iparat 18~

152 18.4 14,4 17,8 15,5 18,5 14,6 18,0 17,5 19,0 16:0 19~0

16,1--18,6 15,0--18,3

17,.~ 16,6

Das Waehstum ist also in Gruppe b sehw[[cher als in Gruppe a. 26. IV. und 1. V. je 10 ccm Extrakt. 12. V. Die Wachstumshemmung tritt in Gruppe b immer starker hervor

(vgl. Fig. 6a und b), desgleichen auch die Beeinflussung der Entwicklung. Der Kopf ist frosch~hnlich gestalget, die larv~len FreBwerkzeuge sind reduziert, an den kleinen, zwergartigcn Ex~remitiitcn sind die Zehen schon gut ausgebildet, wghrend die Anlagen der I(ontrolltiere noch vSllig ungegliedert sind. Die Flossensgume sind verschmalert, ohne dab jedoch die starken Einschmelzungs- vorg~nge zu be0baehten w~iren, die nach der Einwirkung jodreioher Schild- driisenprSparate auftreten. Die Intensitgt der Erscheinungen ist nicht bei allen Tieren der Gruppe gleich stark, bei einzelnen kommt die Wirkung etwas sehw~icher zum Vorsehein.

18. V. Messung s. Tab. 16.

Tabelle 16.

Gruppe a : Gruppe b : Kontro l le ~ P r~pa ra t 18¢

21,2 ] 26,0 22,0 ! 26,1 22,3 27,5

21,8--26,5

11,6 20,5 13.2 20,9 1318 23,4

12,9--21,6

24,2 17,2

Versu'che zur Isolierung des Schilddriisenhormones. I. 437 ,

Die Ticre der Gruppe b sind im Waehstnm hinter den Kontrolltierert stark zuriiekgeblieben. In der Entwieklung der Extremit~ten, des Darms usw. sind sie ihnen dagegen weir voraus.

~ o c h deutlicher als aus den L~ingenmaBen ist der dissimilationssteigernde Einflug aus den Gewiehtszahlen ersiehtlieh, die aus mehreren Einzelw/igungen mit I-Iilfe einer Torsionswage gewonnen werden und in den Durchsehnittswerten in Tab. 17 zusammengestellt sind.

Tabe l l e 17.

Gewicht am GruI)pe a: Kontrolle

16. IV. 21 20. IV.

28. IV. 4. V,

26. V, 8. VI,

41 mg 59 •

102 , 111 •

158 , 205 ,

Gruppe b: ~r~parat 184

39 mg

40 • 45 ,, 32 • (ether 17 nag!) 32

N o c h d e u t l i c h e r als be i j u n g e n L a r v e n t r i t t d ie en twick lungs -

b e s c h l e u n i g e n d e W i r k u n g des Pr~tparates 184 bet ~tlteren L a r v e n h e r v o r

(s. Ve r such 6).

V e r s u c h 6. ) [ a t e r i ~ l : 1{ana temporarla-Larven aus eincm am l7. LI_L 21 abgclcgten

Laichballen. B e g i n n des V e r s u c h e s : 17. IV. 21. Alter der Tiere: 31Tage. D u r c h s c h n i t t l i c h e G r S S e d e r L a r v e n : Gesamtlllnge: 20ram; Rumpf-

15nge: 8 ram; Rumpfbreite: 5 ram. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : KrMtige, typisehe Froschlarven mit 0,5 mm

langen undifferenzierten Extremitlltenanlagen. A n z a h l d e r T i e r e : 2 Gruppen zu je 10 Larven.

V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Konirolle. Gruppeb : Pr~tparat 184 in 0,01% iger wlil~riger

LSsung. V e r s u c h s p r o t o k o l l :

17. IV. 21. 10 ccm Extrakt. Ebenso am 21. und '95. IV. Am 27. IV. ist bet Gruppe b bereits deut]iehe :Entwicklungsbeschleunigung festzustellen. Der t{umpf ist verschm~lert.

1. und 5. V. je 10 ecru Extrakt. 10. V. Die Tiere der Gruppe b sind erheblich kleiner und wetter ent-

wiekel$ als die Kontrollt iere. Kopf froseh~hnlieh, Hornkiefer verschwunden, Darm reduziert, Extremit~£en gut ausgebildet.

18. V. 5{etamorphose yon 3 Tieren der Gruppe b (vgl. Abb. 7a und b). 19. V. In Gruppe b metamorptlosieren wieder 2 Tiere. 21. V. Bet 3 Tieren der Gruppe b ist je t in Vorderbein durehgebrochen.

:Die Kontroll t iere zeigen noch vollkommenen Larvaltypus. Die Waehstums- hemmung in Gruppe b ist recht erheblieh; sehr deutlieh ist sie auch aus Ta- belle 18, in der die aus cincr l~eihe yon W~igungen gewonnenen Durehschnitts- zahlen zusammengestellt sind, ersichtlich.

Die Larven der Kontrollgruppe habcn bis zum 15. VI. die Metamorphose noch nicht beendet.

29*

438 B. Romeis:

Tabelle 18.

Gewicht am Grul)pe a: Kontrolle Gruppe b : Pr~parat i8~

30. IV. 21 145 mg 126 mg 4. V. 160 , 128

21. V. 250 • 90 •

Auch in diesem Versuch ha t also die Substanz sehr deutliche W a c h s t u m s h e m m u n g und Entwicklungsbeschleunigung zur Folge gchabt.

U m eine weitere Reinigung der wirksamen Substanz zu erzielen, ~mrde ein in der oben besehriebenen Art und ~¥eise erhaltenes Pr~parat, wieder in 9 0 % i g e m Atkohol gelSst und nach schwa, chem Ans~uern mi t verdiinnter tt2SO~ im Exsikkator langsam konzentriert . Dabei setzten sioh in geringer Menge - - e twa 0,1 rag - - in kleinen Drusen feine nadelfSrmige Kristalle ab (Pr~parat 190), deren organische Na tu r dadurch, dab eine kleine Probe auf dem Plat inblech mit leuchtender Ylamme ohne Aschenrfickst:£nde verbrannte, sicher gestellt ist. Der Rest der Kristalle, yon denen die Mutterlauge abgesaugt wurde, wurde mi~ 4 ccm t t20 verrieben und zu folgendem Versuch verwendet.

Versuch 7. M a t e r i a l : Rana lemporaria-Larven aus einem am 27. IIL 2I abgelegten

Laichballcn. ]~eginn des Vcr suehes : 1. V. 21. Alter der Ticre: 35 TaRe. D u r c h s c h n i t t l i c h e Gr611e dc r L a r v e n : Gesamtl~inge: 21 mm; Rumpf-

liinge : 8,5 mm; gumi)fbreite: 5 ram. E n t w i e k l u n g s s t a d i u m : Typische t~roschlarven mit 0,5 mm langen un-

differenzierten Extrcmit~tenanlagen. A n z a h l de r T i e r e : 2 Gruppen zu je 5 Tiercn. V e r s u c h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrollc; Gruppe b: Pr~parat 190.

Ve rsue hspr ot o ko ll. 1. V. 21. 1. Pr~parateinwirkung. Etwa 0,05 rag. 4. V. Der Leib der Tiere in Gruppe b ist, seitlich eSwas eingczogen. 5. V. 2. Prgparateinwirkung. Etwa 0,05 mR. 9. V. Die Thyreoideawirkung ist deutlieh ausgepr~gt. Die Larven der

Gruppe b sind im Waehstum zuriiekgeblieben.

Tabetle 19.

Gruppe a : Kontrolle Gmll)pe b: Pr~iparat 190

Gesitmt- Schwanz- Gesamt- l~umpf- l~umpf- Schwanz* l~inge tiinge 1/inge l~inge breite ]~i~ge

23,8 24,0 24,3 24,5 24,8 24,3

Rumpf- Rumpf- liinge breite

9,7 5,0 9,0 5,0 9,8 5,3

10,0 5,5 10,1 5,5

9,7 5,2

14.1 15:0 14:5 14,5 14,7 14,6

16,0 16,5 1712 18.7 2010 17,7

6,5 3,9 6,7 4~0 6,3 4~0 6,6 4,1 6,5 4,0 6,5 4~0

9,5 10,8 10,9 12,1 13,5 11,2

Versuehe zur ]solierung des Schilddriisenhormones. I. 439

10. V. Weitere Zunahme der Erseheinungen. Kopf frosch~ihnlich. Larvale Fregwerkzeuge vel~ehwunden. Reduktionen an Darm und Sehwanz. Extremi- tiitenentwicklung besehleunigt. 3 Tiere tier Gruppe b sind tot. Mage vgl. Tabelle 19.

i2. V. Die beiden noeh iiberlebenden Tiere der Gruppe b sind sehr sehwaeh- lieh und werden {ixier~. Beide zeigen starke Thyreoideawirkung (vgl. Abb. 8a und b). Ihr Gewieht betrSgt 40 und 45 nag gegen ein Durehsehnittsgewicht yon t10 mg der Kontrolltiere, die noeh rein larvalen Typus zeigen.

Die Ms Priiparat 190 zur Verwendung gelangte kristallisierte Sub- stanz hat demnach im Kaulquappenversuch sowohl Wachstumshem- mende wie entwicklungsbesehleunigende Wirkung entfaltet. ~ b e r die Konsfitution der kristNlisierenden Substanz vermag ieh noch niehts auszusagen, da ieh his jetzt leider keine gr613ere Menge yon Kri- stallen gewinnen konnte. Da jedoeh das Ausgangsmaterial, soweit es die ausgef/~rten Methoden beurteilen lassen, jodfrei ist, so l~Bt sieh das gleiehe natiirlieh aueh ffir die daraus auskristMlisierte 8ubstanz folgern. D a d u r e h u n t e r s c h e i d e t s i ch d i e s e a u s d e r f r i s e h e n D r f i s e g e w o n n e n e S u b s t a n z y o n d e m K e n d a l l s c h e n T h y - r o x i n , d a s b e k a n n t t i e h s e h r s t a r k j o d h a l t i g ist . D i e W i r - k u n g d e r S u b s t a n z i m K a u l q u a p p e n v e r s u e h w i r d d e m n a c h n i e h t y o n d e m V o r h a n d e n s e i n o d e r l~eh len y o n J o d be - s t i m m t ; w i c h t i g e r a l s d i e s e s i s t d e r A u f b a u des u n t e r U m - st~Lnden d a s J o d e n t h a l t e n d e n G e s a m t m o l e k i i l s . J o d a l l e i n i s t n i e h t w i r k s a m ; d ie S u b s t a n z o h n e J o d i s t d a g e g e n w i r k - s a m ; e n t h ~ l t s ie a u B e r d e m n o e h J o d , so i s t i h r e W i r k u n g v e r s t i i rk t .

In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dab naeh den schSnen Untersuehungen von O s w a l d (1916) fiber die Wirkungen der Schilddriise auf den Blutkreislauf jodfreies Thyreoglobulin die gleiche f6rdernde Wirkung auf die Ansprechbarkeit der Herzvagusfasern des Depressors, sowie auf den h~modynamischen Adrenalineffekt besitzt, wie das jodhaltige, jedoch weit schw[teher.

In weiteren Versuchen kam an Stelle der Phosphorwolframs~ure als Fiillungsmittel Sublimat zur Anwendung. Als Ausgangsmaterial diente dazu wieder ein mit Alkohol und Azeton enteiweigter, mit Petroli~ther und ~ther ausgeschfittelter Extrakt . In einer gr6geren Anzahl vergleiehender Versuche zeigte sieh, dag die Ausfiillung am besten mit Sublimat-Natriumazetat gelingt,

Der nach S. 430 vorbereitete Ext rakt wird dazu, falls noch Essig- shurespuren vorhanden sein sollten, mit NaOt t neutralisiert. Dann werden abweehselnd so lange gleiche Mengen einer gesiittigten w~s- serigen QueeksilberehloridlSsung und einer gesitttigten wtisserigen Na-

440 ]3. R, omeis:

triumazetatlSsung zugefiigt, bis in einer abfiltrierten Probe bei weiterem Zusatz keine Triibung mehr auftritt. Der auf diese Weise erhaltene Niedersehlag wird naeh 24stiindigem Stehen auf der Nutsche gesammelt und mit Sublimat-NatriumazetatlSsung gewasehen. Waschwasser und Filtrat werden vereinigt.

Dutch das Filtrat wird It,,S geleitet, um das in LSsung befind- lithe Sublimat auszuf~llen. Nach Abtrennen des Quecksilbersulfids und Entfernung des I-I2S wird das ktare, gelblich gefgrbte Filtrat im Vakuum bei 35 ° G konzentriert ( ~ P r ' ~ p ~ r a t 138). Im Kaulquappen- versuch erweist sieh diese Fraktion als unwirksam (vgl. Versuch 8, Gruppe b).

Der durch die F~llung erhaltene Niederschlag wird in 5%iger Salzs~ure gut aufgeschiittelt und durch Einleiten yon HeS zersetzt. Nach vollst~ndiger Zersetzung und 24stiindigem Stehen wird abfiltriert und der Queeksflbersulfidniederschlag mehrmals ausgekocht. Die dabei erhaltenen Filtrate werden vereinigt, der H2S vertrieben, die S~ure mit NaOH neutralisiert und das G~nze im Vakuum bei 3 5 ° C konzentriert, bis die Aussci/eidung yon NaC1-Kristallen be- ginnt. I)er konzentrierte Extrakt (Pr~parat 139) erweist sich im Kaulquappenversuch als gut wirksam (vgl. Vers. 8, Gruppe c).

Die wirksame Substanz wird demnach durch Sublimat-Natrium- azetat bei neutraler Reaktion quantitatlv ausgef~llt. In gleicher Weise, aber nicht so voUst~ndig, erfolgt die F~llung durch alkoholische SublimatlSsung. Bei sauerer Reaktion tritt dagegen keine F~llung ein.

Reak t ionen yon Pr~para~ 138: Eiwei~koehprobe: - - ; ]teller: - - ; Spiegler: --; Biuret: - - ; Millon: -t-; Adamkiewicz-Hopkins: ganz sehwaeh -t-; Pikrins~ure:--; Pikrinsi~ure und Essigs~ure: - - ; Alto@n: -~-~-[-; Phosphor- wolframs~ure-[-t~SOa: -{--{--{-; Kupferhydroxyd wird ziemlieh reiehlich tiefblau gelSst; Sublimat neutral:--; Sublimat und HCI : - - ; Eisenehlorid: starke Rotf~rbung; Nessler: ~--t-~; Sonnenseheins Alkaloidrea~ens: -I--b-{--i-.

l~eakt ionen yon Pri~parat 139: Eiweii~kochprobe: - - ; Ho l l e r : - - ; Spiegler: - - ; Biuret: -- ; Millon: -- ; Adamkiewicz-]:[opkins: -[-; Pikrins~iure - - - ; Pikrins~ure und Essigs~ure: - - ; Alm6n: -- ; Phosphomvolframs~ure -{- I~S04: Q--I--i-H-; Kupferhydroxyd wird nieht sehr reichlich geI5st; Sublimat neutral: Sublima~ und ttCI: - - ; Eisenchlorid: -- ; Nessler: -[-; Sonnenscheins Alkaloid- reagens: -{--{--~--{-.

Versueh 8. ) l a t e r i a l : Ranatemporaria.Larven aus einem am 28. IlL 20 abgelegten

Laich. Beginn des Versuehes: 13. V. 20. Alter der Tiere 47 Tage. Durehschn i t t l i che GrSBe der Larven: Gesamtl~nge24mm; Rumpf-

l~nge: 9,5 mm; Rumpfbreite: 5 mm. En twick lungss t ad ium: Grol~e, kr~ftige Larven mit 1--1,5 mm langen,

im Beginn der Differenzierung stehenden Extremit~tenanlagen. Anzahl der Tiere : 3 Gruppen zu je 10 Larven.

Versuehe zur Isolierupg des Sehilddrfisenhormones. L 441

V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Pri~parat 138: Mit Alkohol enteiweiBter Sehilddriisenextrakt, fraktio-

niert mit Queeksilberehlorid-Natriumazetat: Filtrat. Gruppe e: Prttparat 139: desgl.; F~llung.

V e r s u e h s p r o t o k o l l . 13. V. 20. 1. Extrakteinwirkung. 17. V. 2. Extrakteinwirkung. 19. V. Messung (s. Tab. 20).

Tabel le 20.

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b : Pr~tparat 138 Gruppe c : PrJ~parat i39

25~0 27,1 23~5 26,2 19~10 23,5 25,0 27,2 24,2 26,5 21,6 24,8 25,5 29,0 24,8 26,8 23,0 27,2

25~2--27,7 24,2--26,5

26,4 25,3 . . . . . . . . . . . . ?!~2-2~,2

23,2 In Gruppe c kommt danach eine etwas sttirkere Wachstumshemmung zum

Vorschei~. Auch Abmagerung und beschleunigte Entwieklung der Extremi- ttitenanlagen sind zu verzeichnen.

21. ¥. 3. Extrakteinwirkung. Die Wachstumshemmung und Entwicklungs- beschleunlgung verstiirkt sich in Gruppe e. Gruppe b wie Kontrolle.

1. VI. In Gruppe b ist gegeniiber der Kontrollgruppe, abgesehen yon einer geringen Waehstumshemmung ~ui~erlieh kein Untersehied zu bemerken. Dagegen treten bei den Tieren der Gruppe e sehr intensive Thyreoideaerseheinungen hervor. Die Tiere sind sehr klein und zeigen an den Ruderschw~nzen zum Teil starke Reduktionsvorg~nge. Die Kopfform ist eekig, frosehartig. Die lax- valen Fre[~werkzeuge sind vorhanden. Bei einem Tier sind beide Vorderbeine durchgebroehen; die Extremit~ten sind bei ihm diinn und zart, aber gut aus- bildet.

3. VI. In Gruppe e sind 2 weitere Tiere metamorphosiert. 5. VI. 4. Extrakteinwirkung. 8. VI. $Iessung (s. Tab. 21).

T~belle 21.

Grupe a*: Kontrolle

30,1 34,2 32,8 34,8 32~9 34~9

31,9--34,6 i 14,7--19,6

Gruppe b: Pr~iparat f38

i 31,2 34~3 32,0 35,6 32,2 36,0

i 31,8--35.3

Gruppe c: Priiparat i39

14,0 18,8 14,8 18,9 15,3 19,0 P

33:2 33,5 ii 14,6

Die Tiere in Gruppe c sind weitaus am kleinsten, wtihrend die Entwiok- lung bei ihnen am weitesten vorgesehritten ist. Gruppe b zeigt keine wesentliche Beeinflussung.

Am 7. VL verwandeln sich in Gruppe c noch weitere 3 Larven zu Zwerg- trtischchen. Bei 4 Larven ist je ein linkes Vorderbein durehgebrochen. In Gruppe b und a setzt die 5Ietamorphose erst am 20. VI. ein.

442 B. Romeis:

Die wirksame Substanz wird demnach durch Sublimat vSllig gef~llt. In gleicher Weise wird sie, wie diesbezfigliehe Versuche zeigten,

aus dem enteiweiBten Extrakt durch ~][erkurisulfat nach der Methode ftir Tryptophandarstel lung von Cole und H o p k i n s ausgef~llt. Aueh hier ist das Fi l t rat spezifiseh unwirksam, w~hrend der Niederschlag die wirksame Substanz enth~lt.

WEb_rend bei den genannten Methoden, wie bereits mehrfach er- wahnt, die EnteiweiBung mit Hilfe yon Atkohol erfolgte, ~urde in einer zweiten Gruppe yon Versuchen die Entfernung der EiweiBsub- stanzen mi~ Aluminiumsilikat. (Kaolin) versucht. Die Ausffihrung erfolgte zun~chs~ in folgender Weise:

400 g Rinderschilddrfsen werden im Latapiesehen Appoint zer- quetscht und mit Quarzsand und etwas dest. Wasser unter Toluol- zusatz aufs feinste zermahlen. Der Brei wird mehrere Stunden lang mit immer neuen Port ionen dest. Wassers bei neutraler Reaktion ausgeschiittelt, wobei die Extrakte durch ein feines Drahtsieb notdiirftig abgetrennt werden. Diese Extraktion wird so lange fortgesetzt, bis die Extrakte substanzarm werden. Die vereinigten Extrakte werden mi t Essigs~ure schwach anges~uert, durch feines Leinen von dem ent- standenen Niedersehlag und noch vorhandenen Gewebsteilchen abgetrennt und dann nochmals filtrier~. Das klare Fi l t rat wird mit H20 auf 1000 ccm verdiinnt und unter stetem Schiitteln mit kleinen Mengen yon Aluminiumsilikat versetzt. Nach Eintragen yon 200 g Aluminiumsilikat wird filtriert. Das schwaeh gelblieh gef~rbte ~i l t rat wird in gleicher Weise nochm~ls mit Aluminiumsilikat ausgesehiittelt, wiederum abgetrennt und im Vakuum bei 4 0 ° C auf 150 ccm eingeengt. Der Extrakt wird mehrmals mit Petrolather ausgeschiittelt, der petrolatllerunlSsliehe Tell abgetrennt , im Vakuum auf wenige Kubikzent imeter konzentriert und sehlieBlieh mi t H20 auf 150 ccm verdfinnt (Pr~parat 65).

R e a k t i o n e n y o n PrKpara t 65: Kochprobe: - - ; Heller: - - ; Spiegler: - - ; Biuret: - - ; Millon: -~-~-; absol. Alkohol: -[--~-; Xanthoprotein: -~-~-~; Phos- phorswolframsEure -[- H~SO~: -[--[--~--[-; Alm~n: -~-~--t-; PikrinsEure neutral: - - ; Pikrins~ure und Essigs~ure:--; Sublimat und Natriumazetat: -~-~-~-; Sublimat und HCI: --.

I m Kaulquappenversuch (s. Vers. 9) ruff ein in der angegebenen Weise enteiweiBter Schilddrfisenextrakt deutliehe Wachstumssteigerung hervor; gleichzeitig ist d~mR eine m~Bige Entwiektungsbeschleunigung verknfipft, die ungef~hr der bei Pr~parat 63 (vgl. S. 414,Vers. 1, Gruppe d) beobachteten entspricht. Wie dort unterseheidet sich die Wirkung des enteiweiBten Extraktes von jener, die auf die Verfiitterung frischer Schilddriise hin eintri~t, dureh den verh~ltnism~Big langsamen und


dabe i vSllig geregel ten Verlauf und das F e h l e n einer dissimikrtions- s te igernden W i r k u n g : D ie me t amorphos i e r t en FrSschchen f ibertreffen die Kon t ro l l t i e r e sogar an KSrpergrSBe. W i e bei Pri~parat 63 wurde auch b ier die eiwei$freie wi rksame Subs tanz be i de r En~fernung der E iweiBkf rper m i t ausgefi~llk

V e r s u c h : M a t e r i a l : Rana temporaria-Larven aus einem am 31. III. 18 abgelegten

Laichballen. B e g i n n des V c r s u e t l e s : 10. IV. 18. Alter der Tiere: 10 Tage. D u r e h s e h n i t t l i e h e GrSBe: Gesamtliinge 10,5 mm; ~umpilSnge 3,5 ram,

Rumpfbreite 2,2 ram. E n t w i e k l u n g s s t a d i u m : J~ul~cre Kiemen seit einem Tage iiberwachsen.

Extremitg~tenanlagen noch nicht sichtbar. Kloakenmembran durehgebrochen. A n z a h l d e r T i e r e : 2 Gruppen zu je 20 Larven. V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: ~PrSparat 65.

Wiisseriger Sehildriisenextrakt, enteiweil3t mit Aluminiumsilikat.

V e r s u e h s p r o t o k o l l . I0. IV. Extrakteinwirkung. Desgl. am 10. IV., 15. IV. 16. ]iV. 5Iessung (s. Tab. 22).

Tabel le 22.

Gruppe a: Kontrolle _ Gruppe b: :Pr~parat 65

16,7 19,4 19,9 21,5 17,0 19,9 20,0 21,5 17,1 20,0 20,1 21:9

16,9 - 19~8 ] 20,0--21:6

18~3 i[ 20,8 In Gruppe b ist das Waehstum etwas gesteigert; Entwicklungsbeschleuni-

gung ist nieht zu beobaehten. 22. IV. und 26. IV. Extraktcinwirkung. I .V . ~Iessung (s. Tab. 23).

Tabe l le 23.

G~uppe a : Kontrolle Gruppe b : rr / ipar~t 65

21:4 29,0 24,2 30,0 25,5 30~3

23,7--29:8

20,0 26,7 20,8 26,9 21,9 27,3

20~9- 27,0 . ~ _

23,9 26,7

Die Tiere der Gruppe b zeigen also noeh immer deutliohe Waohstumsstei- gerung. Auch die Mal~c der l~umpfgrSBe liegen hSher als bei den Kontroll- tiercn. Die Entwicklung ist nur wenig beeinflul3t. Die Tiere zeigen noch vSUig larvales Aussehen (vgl. Abb. 9a und b). Keine Reduktionserscheinungen. 3. V., 10. V., 14. V, 20. V. Extrakteinwirkung. 22. V. )Iessung.

444 B. Romeis:

Tabel le 24.

Gruppe a: KontroiIe tll Gruppe b: Praparat 65

"11" Gesamt- Rumpf- :Rumpf- Schwanz- l i Gesamt- Rumpf- Rumpf- Schwanz- lSnge l~inge breite Hinge tl l~nge l~inge breite l/inge

27,2 28,4 28,6 29,2 30,0 80,1 30,3 31,8 32,9 33,0 33,2 33,5 34,4 36,0

10,0 10,6 10,5 10,4 10,3 10,9 11,2 11,2 10~9 11,0 10,5 11,0 10,8 12,5

5,8 6,0 6,2 6,5 6,0 7,0 6,2 7,0 7~4 6,8 7,3 7,0 6,5 7,5

17,2 17,8 18,1 18,8 19,7 19,2 19,1 20.6 2210 22,0 22,7 22,5 23,6 23,5

31,5 32,0 32,6 33,0 33,5 33,7 34,0 34,0 34,1 34,3 35,0 35,1 35,4 35,5

11,0 12,0 10,8 10,7 11,4 11,2 11,4 11,6 11,7 11,5 11,5 11,5 13,0 11,5

7,4 7,5 7,0 6,8 6,5 6,0 7,5 7,0 6,5 6,8 7,8 7,5 7,0 8,5

31,3 10,8 6,6 20;5 33,8 11,5 7,1 Die Larven der Gruppe b sind den :Kontrolltieren an GrSBe

20,5 20,0 21,8 22,3 22,1 29,5 22~6 22,4 22,4 22,8 23,5 23,6 22,4 24,0 22,3

noeh immer iiberlegen, doch ist ihr Wachstum seit der letzten Messung etwas geringer als bei der Kontrolle. Ein Vergleich yon Abb. 10a und b lehrt, dab die Tiere der Gruppe b deutlich welter entwickelt sind. Die Tiere besitzen jedoeh noch alle larvalen ~Ierkmale, wie ttornz~ihnehen, Spiraldarm, Rudersehwanz usw.

23. V., 28. V., 5. VL, 9. VL, 13. VI., 19. VL, 23. VI., 27. VI., 5. VH., 9. VII. und I1. VrL weitere Extrakteinwirkungen. Am 25. VI. beendet ein Tier der Gruppe b als vSllig normal entwiekeltes, kr~iftiges Fr5sehehen die )Ietamor- phoee. Der Rudersehwanz ist zur Zeit des Durehbruchs der Vorderbeine noeh gut erhalten und verschwindet erst im Laufe der n~chsten Tage.

Die yon jetzt an stattfindenden Netamorphosen sind in Kurve 2 zusammengestellt.

Ma/ Juzl JM/

I l l I i ~ r t I I [ 1111 I I I I l l ~1 I I I I I I I l i ~ ...... ~ ~ ~ ~ F i I J I I I I I ~ I I I I I J [ I I 1

Kurve 2,

Es geht daraus hervor, dab der Eintrltt der Metamorphose ia Gruppe b m~Big besehleunigt ist; alle metamorphosierenden Tiere gleichen in ihrem ~ul3ern den oben besehriebenen.

Das Pri~para~ 64 unterscheide~ sich also in seiner Wi rkung auI Kau lquappen sowohl durch das ;Fehlen der Dissimilafionssteigerung und Wachs tumshemmung , wie durch die anders gear te te Entwicklungs- beschteunigung deuflich yon der Wi rkung Irischer Schilddriise.

Versuehe zur Isotierung des Sehilddriisenhormones. I. 445

In einem weiteren Versuche wurde ein wie in vorbeschriebener Weise mi~ Aluminiumsilikat enteiweil~ter Schilddriisenextrakt eingeengt und bei neutraler Reaktion in die zehnfache Menge absol. Alkohols getropft. Es entsteht ein weil~lieher, flockiger Niederschlag, der auf dem Filter gerammelt und getrocknet wird. Seine LSsung in 100 ecru I-I20 dient als Pri~para$ 70. Das Filtrat wird im Vakuum yore Alkohol befrei~ und mit ~Vasser auf t00 ccm verdiinnt ( ~ Pri~parat 71). Beide Pri~parate sind eiweit~frei. (Reaktionen des Ausgangsextraktes wie bei Praparat 64.) Im Kaulqu~ppenversuch machte sich bei beiden Pri~- paraten wieder eine leicht wachstumssteigernde Wirkung bemerkbar. Die Ent~icklungsbeschleunigung tritt aber bei Praparat 70 etwas sti~rker hervor als bci Priiparat 71 (vgl. Vers. 10).

Bei Fttllung mit Phosphorwolframs~ure in schwefelsaurer L'6sung geht die entwieklungsbesehleunigende Wirkung gr61~tenteils auf den Niedersehlag fiber. WachslbumsfSrdernd wirken dagegen sowohl Nieder- sehlag wie Filtrat.

Versuch 10. M at e ri al : l~ana temporaria.Larven yon einem am 11. IV. 18 abgelegten Laich. Beginn des Versuches: 26. IV. 18. Alter der Tiere: 15 Tage. D u r c h s c h n i t t l i c h e Gr61~e der Larven : GesamtlSngc 17.5 ram; Rumpf-

liinge 6,3 ram; Rumpfbreite 3,8 mm. En tw iek lungs s t ad ium : Kleine typisehc Kaulquappen mit eben sicht-

baren Extremiti~tenknospen. An~ahl der Tiere : 3 Gruppen zu je 20 Larven. Versuehsanordnung:

Gruppe a: Kontrolle. Gmlppe b: Pr~parat 70. Mit Aluminiumsilikat enteiweil~ter Sehilddriisenextrakt;

F~llung mit Alkohol; ~qiederschlag. Gruppc c: Prhparat 71. Desgl.; Filtrat.

Versuchspro toko l l : 24. IV. 18, 29. IV., 3. V., 10. V., 14. V., 20. V. Extrakteinwirkung. 23. V. Messung (s. Tab. 25).

Juni JuF

. . . . . A ^ ..................

i I

! Kurve 3.

In Gruppe b und e ist das Wachstum der Tiere giins~ig becinfhfl~t. Die Entwicklung ist leicht besehleunigt (vgl. Abb. l la, llb, llc). Weitere Extrakt- einwirkung am 9_8. V., 5. VI., 13. VI., 20. VI. und 0-7. VI.

446 B. Romeis:

Tabelle 25.

31,1 10,1

Gruppe a : Kontro l le Gruppe b : l~r~parat 70 Gruppe c : Pr / tpara t 71

m r~

9,3 9~2 9:9 9,4 9,2 9,4

10~0 10,0 10,1 10,4 10.0 10'6 1017 11,3 12,0

29,0 29,3 29,5 29,6 30,0 30,0 30,5 30,5' 30,6 31,5 32,4 32,5 32,5 33,4 35:2

5,4 19,7 5,5 2011 6,0 19,6 6,0 20,2 5,0i 20,8 5,5 i 20,6 5,4 t 20,5 5,9 20,5 5,5 20,5 6.2 21,1 515 22,4 6,0 I 21,9 6,4 / 21,8

23,2

5,8 I 21,0

27,5 28,5 30,6 31,0 32,0 32,2 33,0 33,0 34,0 34,1 34,5 35A 35,8 36,0 I 36:5 ] 36,8I 3321

8,8 9,2

10,0 11,0 10,2 1178 11,5

11,8 11,8 11,4 11:6 12,0 12,0 12:1 12:2 11:5 11~l

5,4 5,3 5,6 6:8 6,0 6,8 6,6 6,8 70 7,5 6,6 7,8 8,0 618 7,5 615 6:6

18.7 30,2 1913 3013 20,6 30.5 2o:o 31:o 21:8 32: 20,4 32.7 21,5 3311 21,2 t 34'.0 22:8 ii 34'.5 22.7 !l 34;7 2219 1 23,1! 23,8 23,9 24,3 25,3

1.22:1 33,3

9,8 5fi 1010 5,6 10,6 6,5 1012 6,1 1017 6,1 10.2 6,5 10,4 6,4 1110 6,9 1116 6,5 1111 6,5

7,o 7,1

35,0 12,1 35,2 12,0 3512 11,6 6,1 3516 12,3 7,0 36.5 12,0 6:9

20,4 20,3 19,9 20,8 21,8 22,5 22,7 23,0 22,9 23,6 22.9 23,2 23,6 23,3 24,5

11:0 6,4 22,3

Der Ablauf der Metamorphosen (vgl. Kurve 3) ist bei beiden Gruppen gegenfiber der Kontrollgruppe leicht beschleunigt, und zwar bei b etwas mehr als bei e. Die met~morphosierten Tiere gleichen in ihrem •uBeren und ihren Aus- mai3en krMtigen, normal entwickelten Tieren.

Auch hier wurde also die spezifisch wirkende Substanz zum mindesten zum iiberwiegenden Tell bei der EnteiweiBung enffernt. Die Methode is~ d~her in dieser Anwendungsweise zur Isolierung nicht brauchbar. Sehr vorteilh~ft erwies sie sich dagegen bei Extrakten, die vorher mit Alkohol in der S. 430 beschriebenen Weise enteiweil~t und gereinigt worden waren. Es zeigte sich, dab dabei die wirksame Substanz dutch Aluminiumsilikat, absorbiert wird und aus diesem durch Ammoniak wieder herausgelSst werden kann.

Im einzelnen wurde dabei in folgender Weise vorgegangen. Ein mit 50%igem Alkohol aus 1000 g frischen Schilddriisen ge-

wonnener Extrakt wird nach der auf S. 430 angegebenen Methode mit Alkohol enteiweil~t, und mit Petrol~ther und Ather ausgeschiittelt. Nach der Fiillung mit Azeton wird der Extrakt ira Vakuum konzen- trierS, mit dest. Wasser auf 500 ecru verdfinnt und mit 20 ccm 5%iger Essigsi~ure anges~uert. Dann werden unter stetem kr~ftigem Schiitteln 100 g gereinigtes Aluminiumsilikat in kleinen Mengen nach und nach

Versuehe zur Isolierung des Sehilddr[isenhormones. L 447

zugesetzg. SchHeBlich wird auf de r Nu t sche scharf abgesaugt . D~s dabe i e rha l t ene F i l t r ag wird im Vakuum bei 4 0 ° C e ingeeng t (Pr~- p a r a t 144). Die in ihm en tha t t enen Subs tanzen rufen im K a u lqua ppe n - versuch nur schwache En twick lungsbesch leun igung hervor . Auch die W a c h s t u m s h e m m u n g is t ger ing (vgl. Vers. 11, Gruppe b). Die schwache W i r k u n g hSngt mi t der Anwesenhe i t ger inger Mengen wirksamer Sub- s t anz zusammen, die sich durch ein zweites Ausschi i t te ln m i t Alumi- niumsfl ik~t en t fe rnen l~13t.

U m die an das Alumin iums i l ika t g e b u n d e n e wi rksame Subs tanz zu 15sen, wurde der ~ i ede r sch l ag mi t ve rsch iedenen LSsungsmi t t e ln behandel t . Sehr vol ls t~ndige LSsung wurdo du tch E x t r a k t i o n mi t 1/1 n- N a O H un te r l e ich tem Erw~rmen crreicht . Der gelbl ich gef~rbte Ex- t r a k t wird durch Asbes t abgenu t sch t und mi t HC1 neutra l i s ier t . Dabe i fall~ etw~s in LSsung gegangenes Alumin iums i l ikg t aus, das a, bf i l t r ier t wird. Das :Fi l t ra t wi rd im Vakuum etwas konzen t r i e r t ( P r t p a r a t 145). I m K a u l q u a p p e n v e r s u c h ruft diese Subs tanz s t a rke Diss imi la t ions- s t e i ge rung ,Wachs tumshemmung u n d En twick lungsbesch leun igung he rvor (vgl. Vers. 11, Gruppe c).

l ~ e a k t i o n e n von Pr /~par~ t 144: Biuret: - - ; Hellcr: - - ; Spiegler: - - ; Ferrozyankalium + Essigs~ure: - - ; Million: + ; Adamkiewiez-Hopkins: + ; Sublimat neutral: Opaleszenz: Sublima~ und Natriumazetat: + + ; Sublimat und HCI: - - ; Pikrins/iure: - - ; Pikrins~ure + Essigs~ure: - - ; Phosphorwolf- ramsgure + HoSO 4 : + + + + ; Xanthoprotein: + -4- ; Bleiazetat: - - ; Schwefel- blei : "4- -~-.

R e a k t i o n e n y o n P r ~ p a r a t 145: Biuret: - - ; Hcller: - - ; Spieglcr: - - ; Ferrozyankalium -4- Essigs~ure: - - ; Millon: - - ; Adamkiewiez-Hopkins: - - ; Sublimat neutral: Op. ; Sublimat und Natriumazetat: -f- -t- -~; Sublimat -4- HCI: - - ; P ikr ins / iu re : - - ; P ikr ins~ure-~-] ]ss igs~ure : - - ; Phosphorwolframs/~ure q- I-I~SO~: -+--~-; Xanthoprotein: -~; Bleiazetat: -~A--~ lcicht 15slich in NaOF[; Sehwefelblei: sehwach A-.

V c r s u c h 11. M a t e r i a l : Rana temporarla.Larven von einem am 29. III. 20 abgelegten

Laich. B e g i n n des V e r s u e h e s : 12. V. 20. Alter der Tiere: 44 Tage. D u r e h s c h n i t t H e h e GrSi~e d e r T i e r e : Gesamtl~nge: 22ram; Rumpf-

l~nge: 8,5 ram; Rumpfbreite: 5 ram. E n t w i e k l u n g s s t a d i u m : Typisehe Froschlarven mit 0,7 mm langen un-

differenzierten Extremit~tenanlagem A n z a h l d e r T i e r e : 3 Gruppen zu je 12 Larven. V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Pr/iparat 144. Mit Alkohol enteiwei$ter Sehilddr~isenextrakt;

dutch Aluminiumsilikat nicht adsorbierte Substanzen. Gruppe e: Pr~parat 145. Desgl. ; adsorbiert dureh Aluminiumsilikat, gelSst

mit HaOH. V e r s u e h s p r o t o k o l l . '

12. V. 20, 14. V. und 16. V. Extrakteinwirkung. 17. V. In Gruppe c macht sich deutliehe Entwieklungsbeschleunigung und

Waehstumshemmung bemerkbar.

448 ]3. Romcis :

19. V. wcsentlicher Untcrschied gegeniiber a.

22. V. Messung (s. Tab. 26).

Tabelle 26.

Tiere der Gruppe c erheblich kleiner, geigenfSrmig. Gruppe b kein

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b: i)r~p, i ~ II Gruppe c: ]Pr~p. 145

24,5 26,0 24,6 26,4 25,0 26,8

22,4 25,4 22,7 25,9 23,4 26,1 .

14,6 16,9 14,8 17,3 15 3 18,4

Dic Mat3e dcr Tiere yon Gruppe c sind unter den Anfangswert zuriickgegangen. Die Schwanzfiossensgume sind verschm/ilert,, an den Spitzen zum Tell Einschmelzungsprozesse bemerkbar. Die larvalen :Fretappaxate sind verschwunden, der .Kopf ist frosch~hnlich; die hinteren Extremitgten zeigen Differenzie- rung in Oberschenkel, Unterschenkel und Ful3, w'~hrend die Anlage bei den ]Kontrolltieren noch ganz undifferenziert ist. Spiraldarm stark reduziert.

24. V. Bei 4 Tieren der Gruppe c ist das linke Vorderbein durchgebrochen; bei 7 weiteren beide; typische Thyreoideaerscheinungen (vgl. Abb. 12a und b). In Gruppe b ist keine Ver~nderung eingetreten.

25. V. In Gruppe c sind 9 metamorphosierte Tiere tot. 5. VL In Gruppe b 1Kilt sich weder nennenswerte Wachstumshemmung

noch :Ent~wicldungsbeschleunigung feststellen. Dcr Versuch wird abgebrochen.

Die wirksame Substanz wird demnach beim Ausschfitteln des mit Alkohol enteiweil3ten Extraktes durch Aluminiumsilikat adsorbiert nnd liiBt, sich daraus mit Natrontange wieder extrahieren. Um nun aus der LSsung das v o n d e r Neutralisa:~ion der NaOH vorhandene Koch- salz zu entfernen, wird weiterhin die wgt3rige L6sung durch einen Kollodiumsabk gegen dest. Wasser mehrere Tage lang dialysiert. Dialysat und Rfickstand werden im Vakuum eingeengt nnd auf ihre Wirksamkeit im Kaulquappenversuch gepriift. Dabei iibt das Dialysgt fast keine spezifische Wirkung aus, wghrend die Einwirkung des Riick- standes wieder starke VCachstumshemmung und Entwicklungsbeschleu- nigung zur ~Folge hat. Die wirksgme Substanz dialysiert also durch eine Kollodiummembran nicht oder nur in Spuren. Meine friiheren, bei der Dialyse ungereinigter Schilddriisenextr~kte erhobenen Befunde (1918) werden xlurch diese Feststellungen an gereinigten Extrakten best~$igt. Durch weitporige, tierische Membranen, wie Schafblinddarm oder Fischblase, dfirfte die Substanz vermutlich dialysieren.

Bei sp~teren Versuchen wurde, um die Verwendung der NaOH bei der L6sung der adsorbierten wirksamen Substanz aus dem Alu- miniumsilikatniederschlag zu umgehen, an ihrer Stelle eine verdiinnte wi~$rige AmmoniaklSsung (30 : 100 H~O) verwendet. Der Niederschlag wird damit erschSpfend extrahiert - - zuletzt unter leichtem Erwarmen.

24;7-26,4 25,5

22,8--25,8 14~9--17,5

24,3 16,2

Versuehe zur Isolierung des Seifilddriisenhormones I. ~49

Vom k la ren abf i l t r ie r ten E x t r a k t wird das L6sungsmi t t e l im V a k u u m bei 40 ° C abdest, i l t ier t und der d~bei sich t r i ibende, hel tbr~unl ich gef•rbte Ri icks tand in dest . Wasse r au fgenommen (Prgparab 192). Ein ige K u b i k z e n t i m e t e r des E x t r a k t e s werden nach li~ngerem Schiit- t e ln mi t der gleichen Menge halogenfre ier Salpeters~ure mi t Chloro- form ausgesch/ i t te l t . D a b e i f~rbt sich das Chloroform schwach rosa. Die Subs t anz ist, also jodhMtig. Uber die W i r k u n g des E x t r a k t e s auf K a u l q u a p p e n ber ich te t nachfolgender Versuch 12.

V e r s u c h 12. M a t e r i a l : Rana temporaria.Larven yon einem am 2. IV. 21 abgelegten

Laiehballen. B e g i n n des V e r s u c h e s : 1. V. 21. Alter der Tiere: 29 Tage. D u r e h s e h n i t t l i c h e GrSBe d e r L a r v e n : Gesamtl~nge: 22ram; Rumpf-

lgnge: 9 ram; Rumpfbreite: 5 ram. A n z a h l d e r T i e r e : 2 Gruppen zu je 15 Larven. V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Prgparat 192. )I i t Alkohol enteiweiBter Schitddriisenextrakt,

adsorbiert dureh Aluminiumsilikat, gelSst mit NH3.

V e r s u e h s p r o t o k o l l . 1. V. 21 und 3. V. Extrakteinwirkung. 5. V. In Gruppe b ist an den Extremit~itenanlagen deutliehe Entwieklungs-

besehleunigung zu erkennem 7. V. Zunehmende Thyreoideawirkung in Gruppe b. Hornkie~er abge-

woffen, :Papillen in Resorption. Reduktion yon Spiraldarm. Waehstum stark gehemmt.

11. V. Messung (s. Tab. 27).

Tabel le 27.

Gruppe a: Kontrolle Gruppe b: Prap. 192

23,7 I 27,2 13,9 17,1 24,0 [ 28,0 15,6 17,3 24,9 28,2 15,8 19,0

24,2--27,8 15,1--17,8

26,0 16,4

Die GrSBe der Tiere ist in Gruppe b u n t e r die Anfangswertc bctr'achtlieh zuriickgegangen. Noch deutlieher als in den Lgngenmaflen ikommt diese Ab- nahme in den Gewiehtszahlen zum Ausdruek, insofern das Durchschnittsgewieht bei Gruppe b auf 34 mg gesunken ist, w~hread cs bei der Kontrollgrulape 150 mg betriigt. Bei 4 Tieren der Gruppe b sind beide Vorderbeine durehgebrochen, bei 3 Tieren je ein linkes. Der Kopf ist frosehghnlieh umgebildct, dcr Spiral- darm stark verkiirzt, der Sehwanz verschm~lert und zum Teil reduziert. Dis tIinterbeine sind in Obersehenkel, Untersehenkel und Fug gegliedert und halb gebeugt. Der Einflug ist aueh aus Abb. 13a und b sehr deutlich erkennbar. Die Kontrolltiere zeigen dagegen noeh v611ig larvalen Typus.

12. V. In Gruppe b sind 7 metamorphosierte Tiere tot; bei 4 weiteren ist je ein Vorderbein durehgebroehen. Bis zum 19. V. getlt das Durchschnitts-

450 B. Romeis:

gewich$ der noch iiberlebenden Tiere dieser Gruppe bis auf 22 mg zurilck (h[inimalwert 18 rag!), wghrend es bei der KontrolIe auf 170--200 mg ange- stiegen ist.

] )as Ergebnis des Versuches 12 s t i m m t de mna c h mi t dem des vorausgehenden i iberein. Auch bier wurde die spezifisch wi rkende Subs tanz aus dem mi t Alkohol enteiweii3ten E x t r a k t durch Alumin ium- s i l ikat adsorbier t . Zur LSsung derse lben aus dem Niedersch lag 15~t sich an Stel le von Na t ron lauge auch verdf inn te r NHa verwenden,

W i e erw~ihn~, t r i t t be im Abdes~il l ieren des NIta im w~13rigen Rfick- s t a n d eine Tr i ibung auf, d ie sich bei le ich tem Ansauern der eingeeng ten Fl i i ss igkei t noch e twas ve r s t~ rk t und als feiner Niedersch lag absetz t . Derse lbe soll te ebenso wie das d a v o n abge t r enn te :Fi l t rat in e i n e m wei te ren Versuch auf seine W i r k s a m k e i t gepri i f t werden.

Der Niederschl~g wi rd auf e inem klc inen F i l t e r ges~mmel t u n d im Exs ikka to r ge t rocknet . Es resul t ie r t e ine ger inge graubr~unl iche Subs tanz yon amorphe r Beschaffenhei t (Pr~para t 194), die in Vers. 13, Gruppe b, auf ihre W i r k s a m k e i t un te r such t wird.

R e a k t i o n e n y o n P r S p a r a t 194: Die Substanz verbrennt auf dem Platin- blech ohne Hinterlassung yon Asche. In dest. Wasser ist sie bei neutraler Reaktion unlSslieh, nach Zusatz von etwas Na0H tritt L6sung ein. Biuret: - - ; l~Iillon: ganz sehwache RStlichf~rbung der :Flfissigkeit; Xanthoprotein: ganz schwaeh ~-; Adamkiewicz-Hopkins: - - ; Bromwasserreaktion: - - ; Erhitzen der Troekensubstanz mit etwas KOH: kein Skatolgeruch; Phosphorwolframs~ure -}- H:SO~: -]--~--i-; Sublimat neutral: - - ; Sublimat und Natriumazetat: -~--~; Sublimat und HC1: - - ; Pikrins£ure: - - ; Schwefelblei: - - ; b e i m Aussehfitteln tier mit H~NOa versetzten LSsung mit Chloroform ganz sehwache r5tliehe F~r- bung (vielteieht nicht ganz sieher); Beilsteinsche Flammenprobe: negativ.

] )as vom :Niederschlag 194 abge t r enn t e goldgelb gefi irbte F i l t r a t k o m m t als P r~pa ra t 195 in Versuch 13, Gruppe c, zur biologischen Unte rsuchung , in Gruppe d wi rd nochmals die W i r k u n g de r durch Alumin iums i l ika t n ich t adso rb ie r t en Subs tanzen (p r~para t 196) gepriift .

R e a k t i o n e n y o n P r £ p a r a t 195: Biuret: - - ; I t e l l e r : - - ; ~Iillon: -{-; Xanthoprotein: ~ -~- ; Adamkiewiez- Hopkins : ~- ~- ~-; Phosphorwolframs~iure ~- tt2S04: -]--~-~--~; Sublimat neutral: -~-~-; Sublimat und :Natriumazetat: -l--~--~-; Sublimat-~-HCl: - - ; Pikrinsfiure: - - ; auch beim Kochen kein Nie- dersehlag.

R e a k t i o n e n v o n P r £ p a r a t 196: Biuret: - - ; Millon: -]--~-; Xanthopro- tein: --}---]-; Adamkiewiez-Hopkins: -~ -~- -{-; Phosphorwolffams~ure --~ HeSO4: -{- -~- --~ -~; Sublimat neutral: -~ -~- -{-; Sublimat und Natriumazetat: -~- -~- -{- -{-; Sublimat und t tCI: - - ; Pikrins~ure: - - , aueh beim Koehen keine Triibung.

V e r s u e h 13. M a t e r i a l : Rana temporaria-Kautquappen yon einem am 27. III. 91 abge-

legten Laich. B e g i n n des V e r s u e h e s : 2. V. 21. Alter der Tiere: 36 Tage. D u r e h s e h n i t t l i e h e G r S ~ e d e r L a r v e n : Gesamtliinge 22ram; R umpf-

l~nge 9 ram; Rumpfbreite 5 mm.


E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Typisehe Kaulquappen mit 0,5 mm langen undifferenzierten Extremit~tenanlagen.

A n z a h l d e r T i e r e : 4 Gruppen zu je 10 Larven. V e r s u c h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Pr'~parat 194. :Mi~ Alkohol enteiweiBter Schilddriisenextrakt;

adsorbiert dutch Aluminiumsilikat; gelSst in Ntta, gefgllt dureh Ansguern; 0,1 mg geli~st in 6 corn H20.

Gruppe c: Pr~parat 195. Desgl.; desgl.; beim Ans~iuern in LSsung bleibende Substanzen; 0,1%ige w~flrige LSsung.

Gruppe d: Pr~parat 196: Dcsgl.; dutch Aluminiumsilikat nieht adsorbierto Substanzen; 0,1% ige w~13rige LSsung.

V e r s u c h s p r o t o k o l l . 2. V. 21. Extrakteinwirkung. In jeder Schale der Gruppen b, e und d

kommen 2 ecru Extrakt. 4. V. 2. Extrakteinwirkung (je 2 ecru). 6. V. 3. Extrakteinwirkung (je 2 ccm). In Gruppe b ist deutliche Thy-

reoidegwirkung erkennbar. 7, V. Gruppe b: Die ~Iornklefer sind abgeworfen, Papillen resorbiert, Um-

bildungen am Kopf; leichte Besehleunigung der Extremit~tenentwieklung. 8. V. Weitere Zunahme der Thyreoideawirkung in Gruppe b und Ein-

schmelzungsvorg~nge am Ruderschwanz. 9. V. 8 Tiere der Gruppe b sind unter starken Reduktionserseheinungen.

zugrunde gegangen, dvr Rest stirbt bis gegen Abend. :Die ~Extremit~iten sind smmmelfSrmig, grSBer ats in Gruppe m Die Vorderbeinanlagen sind nieht durehgebrochen. In Gruppe e is~ die iEntwieklung e~was welter als in Gruppe b, die Tiere zeigen aber noeh alle larvalen Merkmale. Reduktionsprozesse sind noeh nieht bemerkbar. Das Waehstum ist gehemmt. Gruppe d gleieht der ltontrollgruppe.

12. V. Die Thyreoideaerseheinungen nehmen in Gruppe c zu. Reduktion des larvalen FreBapparates. Waehstumshemmung.

14. V. Messung (s. Tab. 28; d i e MaBe d e r G r u p p e b s i n d ve to 9.V. 21),

T~bel le 28.

Gruppe a: Kontro]lo Gruppe b: Pr~lp. i9~. Gruppe c: Priip. 195 Gruppe d: Prtfp. t96

24,8 26,1 25,0 26,5 25,3 27,0

25,0--26,5

25,7

15,0 16,8 15,3 17,0 16,1 17,4

22,0 22,7 i 22,1 23,0

22,3 23,5

15,4 .--17, l 22,1--23,1

16,2 • 22,6 .............

23,8 25,0 24,2 26,0 24,3 26,4

24,1- 25,8

~,9

In Gruppe c ist deutliche~Waehstumshemmung fes~ustellen. Die hinteron Extremi~ten sind klein aber bis zu den Zehen herab v5tlig geglieder~, w~ihrend die Kontrolltiere noch immer ganz undifferenzierte Anlagen besitzen. Der Kopf ist frosehghnlich, die KSrperform geigenfSrmig. Gruppe d unters0hoidet sich nieht wesentlioh yon der Kontrolle.

16, V. 4. Extrakteinwirkung: 2 cem. 18. V . In Gruppe e ist bei 4 Lateen eine vordere Extremitgt durehge-

broehen. Vorder- wie Hinterbeine sind klein und diinn, aber his zu den Zehenspit~en ausdifferenziert. Die ttinterbeine stehen in Beugestellung. Das

Arehiv fllr Entwicklungsmechanik Bd. r~. 30

452 B. Romeis:

~Iaul ist frosch~hnlich, ohne Itornkiefer usw. Der Schwartz ist verschm~lert, ohne jedoch die starken ~Einschmelzungsprozesse aufzuweisen, die bei Gruppe b hervorgetreten sind. Die GrSBe ist seit 14. V. noch weiter zuriickgegangen. Zwischen Gruppe d und a, die noch reinen Larvattypus aufweisen, besteht kein wesentlieher Unterschied (vgl. auch Abb. 14a, b, c und d). Der Versueh wird abgebrochen.

Auch hier wurde also die wirksame Substanz durch Aluminium- silikat adsorbiert. Sie l~Bt sich aus dem Adsorptionsmittel mit NtIa wieder 16sen. Beim Abdestillieren des NHa und Ans~uern des Riick- standes mit Essigs~ure fiillt ein Niederschlag aus, der bereits in geringen Mengen (0, L rag) starke I)issimilationssteigerung zur Folge hat, wi~hrend die entwicklungsbeschleunigende Wirkung an den Extremi- ti~ten ~hnlich wie beim Jodothyrin weniger stark hervortritt . Die eiweil3freie Substanz ist anseheinend jodhaltig, gibt keine Adamkiewicz- Hopkinssche Reaktion. ]:)as klare anges~tuerte, vom Nicdersct~lag abgetrennte Fi l t rat wirkt dagegen langsamer und nicht so stark dissimilationssteigernd; daffir t r i t t aber die entwicklungsbeschleunigende Wirkung sti~rker in den Vordergrund.

In gleicher Weise wie dureh Aluminiumsilikat wird die wirksame Substanz aus dem enteiweil~ten Extrakt durch Tierkohle adsorbiert. Der v o n d e r Kohle naeh leichtem Erw~rmen abfiltrierte, beinahe farblose Ext rakt , in dem Phosphorwolframsiiure nach H2SO4-Zusatz noeh starken Niederschlag ausfiillt, ruft keine Entwicklungsbeschleu- nigung hervor, besonders wenn der Extrakt noch ein zweites Mal ausgesehiittelt wird.

Eine weitere Rcihe von Versuchen diente der Fortsetzung meiner Untersuehungen fiber den Einflut] von anorganischen und organischen Jodverbindungen. Bei den ersten, 1913 an schon ziemlich welt entwickelten.Rana esculenta-Larven ausgeffihrten Versuehen (vgl. R o m e is 1914/15, S. 632 ff.) hat te der Zusatz yon Lugolscher L6sung im Vergleich :Lu der intensiven Wirkung, die die Verabreichung von ffischer Schilddriise zur Folge hat, keinen nennenswerten Einflul3. Gegenfiber Tieren, die nur mit Muskel gefiittert wurden, schien eine ganz geringe Entwicklungs- besehleunigung zu bestehen. Doch konnte keine endgfiltige Entschei- dung darfiber getroffen werden, da die Versuchstiere schliel31ich schw~chlich wurden und vor Beendigung der Metamorphose zugrunde gingen. Aul3erdem blieb bei diesen ersten Versuchen ein Punkt un- beachtet, dessen Bedeutung mich erst sp~tere Versuche erkennen lie~en: n~mlich die Forderung zu derartigen Versuehen nur selbstgezfichtete Tiere ein und desselben Laichballens zu verwenden. Bei Versuchen mit frischeingefangenen [i~lteren Larven hat man fiir die Erfiillung dieser wichtigen Bedingung keine Gew~ihr.


In der Wiedergabe der Protokolle beschr&nke ich mich bei den i ibereinst immenden Ergebnissen der Raumersparnis halber auf das Protokol l eines gr6Beren mit mehreren anorganischen Jodsalzen ausgefiihrten Versuches (vgl. Vers. 14).

Versueh 14. Ma te r i a l : Rana temporaria-Larven aus einem am 1.IV. 19 abgelegten Laieh. B e g i n n des V e r s u c h e s : 25. IV. Alter der Tiere: 25 Tage. D u r c h s e h n i t t l i e h e Gr68e der L a r v e n : Gesamtl~nge: 20ram; Rumpf-

1/inge: 7,2 ram; Rumpfbreite: 4,2 mra. E n t w i e k l u n g s s t a d i u m : Typisehe Kaulquappen mi~ eben siohtbaren,

0,3 mm langen, undifferenzierten Extremit~tenanlagen. Anzah l de r T i e r s : 6 Gruppen zu je 10 Larven. V e r s u c h s a n o r d n u n g : Gruppe a: :Kontrolle. Gruppe b: Katiumjodat (KJOz) 0,1%ige w/i$rige LSsung. Gruppe e: Kaliumjodat (0,01%ige w~i.Brige L6sung. Gruppe d: Kaliumjodid (KJ) 0,1%ige w~l~rige LSsung. Gruppe e: Natriumjodat (NaJOa) 0,01 °/oige w&Brige LSsung. Gruppe f: Natriumjodid (NaJ) 0,01%ige whBrige LSsung. Von den betreffenden LSsungen werden jeweils 2 ecru in die Versuohs-

sehale gegeben. V e r s u e h s p r o t o k o l l .

25. IV. 19. Erste Jodsalzeinwirkung; ebenso am 27. IV., 29. IV., 1. V., 3. V., 8. V. 10. V. Messung (s. Tab. 29).

Tabelle 29.

Gruppe u :

Kont ro l l e

23,4 25,8 23,8 25,9 24,3 26,3

23,8--26,0

24,9

Gruppe b : Gruppe c : Gruppe d :

KJOa KJO~ K J

2 ,0 22,9 2 ,9 23,2 I 6,0 24,0 26,0 23,2 II 23,4t 26,0 24,1 26~1 23,9 I 26,0

23,4--26,1.24;7 -[[[I 23,7--26,024,8 t - 23'5-26'024,7

6rllppe e :

22,8 25,7 23,7 25,9 23,9 26,4

24,7

Grtlppe f :

N a J

23,1 25,9 23,1 26,0 23,9 26~1

23,3--26,0

24,6

Trotz der siebenmaligen Jod- einwirkung besteht demnaoh im Wachstum der einzelnen Gruppen kein Untersehied. Ebensowenig zeig~ der Stand der Entwicklung zwisehen den einzelnen Gruppen nennenswerte Abweichungen.

16. V., 18. V., 20. V., 2~. V., 24. V., 26. V., 28. V. je 2 eem JodsalzlSsung. In Gruppe b geht am 21. V., 26. V. und 30. V. je eine kteiae schw~ehliche Larve zugrunde; der Leib dieser Tiere ist eingefallen, die tarvalcn ~¢[erk- male sind aber yell erhalten; keine Entwicklungsbeschlcunigung.

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30"

454 .B Romeis:

10. VI. )1essung (s. Tabelle 30).

Tabelle 30.

Gruppe a : Gruppe b : Gruppe c : Gruppe d : Gruppe e : Gruppe f : Kontro l le KJOa KJO.~ ILl NaJO~ :NaJ

31,3 36,5 32,6 36,6 33,4 36,9

32,4--36,7

34,5

32,8 36,0 32,9 36,4 33,5 37,0

33,0--36,5

34,7

31,0 36,3 31,9 36,4 33,6 37~1

32,1--36,6

34,3

31,2 35,8 31,9 36,5 33,0 37,0

32,0--36,4

34,2

32,0 36,3 33,0 36,4 33,2 36,5

32,7--36,4 Ii

34~5

I I 30,1 36,7 32,2 36,8 33,5 36,8

31,9-

34,3

Auch jetzt sind noch keine Unterschiede in Entwicklung und Wachstum festzustellen.

Am 18. VI. erfolgt die erste Metamorphose in Gruppe d; der Ablauf der weiteren Metamorphosen ist aus Kurve 4 zu entnehmen.

Es geht daraus hervor, dai~ in keiner Gruppe die Entwicklung beschleunigt ist. Die kleinen zu beobachtenden Schwankungen zwischen den einzelnen Gruppen kann man aueh bei vSllig jodfreier, normaler Ern~ihrung antreffen.

KJ03, KJ , NaJO8 und NaJ rufen demnach in der angegebenen Konzentration weder Entwicklungsbeschleunigung noch Wachstums- hemmung hervor. Bei st~rkerer Konzentration und gesSeigerter Ein- wirkung sterben die Tiere h~ufig ab. Der Leib dieser Larven verschm~lert sigh gewShnlich, wodurch sich die Seitenkontur nach hinten zuspitzt (keine Geigenform). In manchen Fallen rollt sich auch die Schwanzspitze etwas ein. Dabei bleiben jedoch die larvalen Merk- male erhalten. Die Erscheinungen, die wohl mit VGrgiftung zusammen- hi~ngen, diirfen night mi~ den typischen Reduktionsprozessen ver- weGhselt werden, wie sie naGh Schilddrfisenfiitterung auftreten. 0fters f~llt bei Einwirkung yon Jodsalzen das Auftreten grSl~erer, dunkel- brauner Pigmentflecken in den Flossensaumen des RudersGhwanzes auf. Das gleiche Ergebnis wie der obige Versuch hatte die 5- -15- malige Einwirkung yon Lugolscher L(isung in der Verdiinnung yon 1 : 50000- -1 : 500000.

Seit meiner ersten VerSffentlichung sind eine Reihe yon Arbeiten erschienen, die sich ebenfalls mi~ dem Einflul3 yon Jod und anorganischen Jodverbindungen auf Froschlarven befassen (Morse, M., 15; L e n h a r t , C. H., 15; S w i n g l e 19; A b e l i n 20 und 21). Leider waren mir davon bis jetzt nu t die Arbeiten A b e l i n s zugi~nglich. Ul~erein- stimmend mit obigen Versuchen vermiBte A b e l i n bei Einwirkung yon Kalium-, Natrium-, Ammoniumjodid sowie Kalium]odat jeglichen spezifischen Einflu~ auf die Entwicklung. Auffallend ist die hohe Sterblichkeit der Tiere, insbesondere bei Kaliumjodat. Bei Behand- lung mit Lugo l sche r LSsung glaubt A b e l i n Zeichen einer Wirkung beobachtet zu haben; doch ist die Versuchsdauer infolge des friihen


Absterbens der Tiere so kurz, da0 zumal bei der geringen Anzahl der Kaulquappen m. E. keine bindenden Schlul]folgerungen gezogen werden k6nnen. Auch verwendete Abelin sehr h~ufig keine aufge- zfiehteten, sondern frisch eingefangene Tiere.

Diesen negativen Ergebnissen stehen die Angaben Swingles gegenfiber, wonach schon geringe Mengen yon Jod und Jodalkalien die Meta- morphose beschleunigen. Nach Abel in I) benfitzte Swingle sehr stark verdiinnte LSsungen (1 :mehreren 3~lliohen). Uhlenhu~h ver- danke ich die briefliche Mitteilung, dab Swingle Jod mit Getreide- mehl zu einem Teig knotete und daraus kleine Tabletten buk, die er an Kaulquappen verfiitterte; vielleicht wird sich die Differenz in den Versuchsergebnissen aus der verschiedenen Anwendung erkl~ren lassen.

Zu anderen Ergebnissen fiihrten die Versuche mit organisehen Jod- verbindungen. Naeh M. Morse (1915) tuft die Verfiitterung von ]odiertem Bluteiweil~ (Jodalbin) Entwicklungsbesehleunigung hervor, eine Angabe, die C. M. L e n h a r t (I915) nicht vSllig best~tigen konnte. Ubereinstimmend damit konnten auch l~ogoff und Marine (1916) nut bei Verabreichung sehr groBer Dosen eine schwache Wirkung erzielen. Meine eigenen 1916 mit jodiertem Serumalbumin ausgefiihrten Versuche (Romeis 1918, S. 159, 194 und 204) ergaben kein ganz einheitliches Reslfitat: In zwei Versuehen rief die Verfiitterung auBer verst~rkter Pigmentierung keine wesentliehen Erseheinungen hervor in einem dritten Versueh (Versuch 11) wurde die Entwicklung yon KrStenlarven deutlich beschleunigt, das Wachstum ~ber gehemmt. Die Wirkung aber war jedoch schw~eher als sie nach ~iitterung mit friseher Sehilddriise oder Schilddriisentrockensubstanz eintritt. Da sieh nun naeh den Untersuchungen Oswalds (1911) das Jod im kfinstlich jodierten EiweiB groBenteils an das Tyrosin lagert, so lag es nahe, die Wirkung des Dijodtyrosins im Kaulquappenversuch zu prfifen. Die Ergebnisse der 1917 ausgefiihrten Versuche waxen zun~ichst nicht ganz eindeutig (Romeis 1918, Anmerkung S. 254), was sowohl mit dem Alter der Tiere wie anscheinend mit der Gewinnung des Dijod- tyrosins zusammenhing. Weitere 1918 ~1920 durehgeffihrte Versuche ergaben dann, dab Dijodtyrosin im KauIquappenversuch einen der Schilddrfisenwirkung vergleichbaren EinfluI3 auszufiben vermag (vgl. Versueh 15).

Versuch 15. Material: Rana temporarla-Larven yon einem am 29. IlL 19 abgclcgter~

Laieh. Beginn des Versuches: 5. V. 19. Alter der Tiere 37 Tagc. Durchschnit t l iche GriiBe der Tiere: Gesamtl~nge 23,5 ram; Rumpf-

l~nge 9 ram; Rumpfbreite: 6 ram.

1) Die Originalarbeiten S wingles konnte ich leider bis jetzt nicht erhalten.

456 B. Romeis:

E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Kr~ftige, typisch entwiekelte Frosehlarven mit 0,7 mm langen undifferenzierten ExtremitKtenanlagen.

A n z a h l de r T i e r e : 3 Gruppen zu je 15 Larven. V e r s u e h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Dijodtyrosin in 0,1~oiger w~l~riger, sehwach alkaliseher LSsung. Gruppe e: Kaliumjodat in 0,1%iger w~Briger LSsung.

V e r s u c h s p r o t o k o l l . 5. V. 19. Gruppc b: 10 ecru Dijodtyrosin; ebenso am 6. V. und 7. V.

Gruppe e: 10 ecru Kaliumjodat. 9. rg. Gralppe b: leichte Versehm~lerung des Rumples; Auftreten vort

:Pigmentflecken in Sehwanzflossens~umen. Gruppe c: wie Kontrolle. 11. V. Die En~wieklung der Extremit~ten ist in Gruppe b leieht besehleu-

nigt. Die Versehm~ilerung des Rumples hat welter zugenommen. Reduktions- erseheinungen sind nieht wahtalehrabar; jedoeh Waehstumsstillstand.

12. V. Aultreten von Reduktionen am larvalen Prel3apparat, Darm und Schwanz in Gruppe b.

14. 5. Weitere Verst~rkung der Erseheinungen in Gruppe b. ttornkiefer abgeworfen. Papillen, Lippenleisten usw. beinahe vSllig resorbiert. Sehiidel Irosehf5rmig, Spiraldarm stark verkiirzt. .An den Extremitatenanlagen ist An- l~ge yon Oberschenkel, Unterschenkel, Ful3 und Zehen erkennbar. An der Sehwanzspitze ziemlieh starke Gewebseinschmelzung.

15. V. Bei 7 Tieren der Gruppe b sind beide Vorderbeine durchgebroehen, bei 4 je eines. Die Tiere lassen sieh s~imtlich nicht yon Tieren unterseheiden, die mit Jodothyrin oder Schilddriisentrockensubstanz geffittert wurden. In Gruppe e zeigte sich weder Entwicklungsbeschleunigung noeh Waehstumshem- mung (vgl. Abb. 15a, b undc).

16. V. Messung (s. Tabelle 31).

Tabelle 31.

Gruppe a: Kontrollc

24~0 28~3 25,1 28.5 26,0 29:5

Gruppe b : Dijodtyrin

~6,9

15~6 17~0 15,8 1774 16,0 ] 9,0

Gruppe e: Kal iumjodat

26,2 24,0 26~8 29,2 27,2 30,0

25,9--28,8 15~8--17,8 26,7--29,1

16~8 27,9

Die Gruppe b zeigt einen erhebliehen Riiekgang der Grill]e, die sieh sowohl aus der Waehstumshemmung wie den Abbauprozessene,'kl~rt. Am Abend sind:8 Tiere der Gruppe b tot. Der Rest. stirb~ am folgenden Tage. In Gruppe e ist nieht die geringste Entwicklungsbesehleunigung festzustellen.

Der Versuch beweist, d~13 schon geringe Mengen (30 mg) yon Dijod- tyrosin im Kaulquappenversuch Wirkungen hervorzurufen vermSgen, die weitgehende Ahnlichkeit mit der Wi rkung yon Schilddriisentrocken- substanz oder von Jodo thyr in besitzen. Von der Wirkung frischer Schilddriise unterseheidet sich die des Dijodtyrosins, i~hnlich wie es bei Jodothyr in der Fall ist, dutch st~rkeres Uberwiegen der Dissi- milationssteigerung. Vermutl ich hangt dies mi t quantita%iven Unter-


schieden im Jodgehal t usw. zusammen, worfiber ich die Versuche noch fortzusetzen beabsichtige.

Das Ergebnis des Versuches 15 ist dutch die i ibere ins t immenden Resul ta te einer Reihe weiterer Versuche ges~iitz~. Bei E inwi rkung auf sehr junge Entwick lungss tad ien t r i t t die Wirkung, besonders bei Rana esculenta, etwas langsamer her~'or, wofiir n~chfolgender Versuch 16, der auch wegen des .Vergleiches mi t Jodo thy r in yon Interesse ist, e inen Beleg bietet.

V e r s u c h 16. M a t c r i a l : Rana esculenta-Kaulquappen aus einem am 25. V. 20 abgelegten

Laichballen. B e g i n n des V c r s u c h e s : 10. VI. 20. Alter der Tiere: 16 Tage. I ) u r c h s e h n i t t l i c h e G r S B e d e r L a r v e n : Gesamtli~nge: 10mm; Rumpf-

l~inge: 4,8 ram; Rumpfbreite: 2,8 ram. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : AuBere Kiemen vSllig iiberwachsen; Kloaken-

membran durchgebrochen, ExtremitStenanlagen auch mit Lupe noch nicht sichtbar.

A n z a h l der T i e r e : 3 Gruppen zu je 10 Larven. V e r s u c h s a n o r d n u n g : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Dijodtyrosin 0,1%igc whBrige, schwach alkalische LSsung. Gruppe c: Jodothyrin. 0,1 ~oige wSl~rige, schwach alkalische LSsung.

V e r s u c h s p r o t o k o l l . 10. VL 20. Gruppe b: 20 ccm der DijodtyrosinlSsung. 11. VI. Gruppe b: wiederum 10 ccm Dijodtyrosin. 13. VI. Gruppe b: 10 ccm Dijodtyrosin. 14. VL Gruppe c: einmalige Verabreichung von 10 ccm JodothyrinlSsung. 16. VL Gruppc b: 10 ccm Dijodtyrosin. Die einzelnen Gruppen zeigen

noch keinen Unterschied. 17. VI. Wachstumshemmung in Gruppe c. Die Hornh~ikchen am Maul

sind unregelm~iBig, zum Teil ausgefallen. 19. VI. Die Extremit~itenanlagcn sind bei Gruppe b deutliSh sichtbar ,

keine Wachstumshemmung. In Gruppe c sind die Tiere dagegen klciner als die Kontrollticre.

20. VL Die Jodothyrintiere der Gruppe c sind sehr schwiichlich und werden daher teilweise fixiert. Hornkicfer, ]:[ornh~kchen, Papillcn, Lippenleisten sind vSllig verschwunden, dcr Sch~del ist vcrkiirzt, aber noch nicht frosch- ~hnlich. Die Pigmentzellen sind ausgebreitet, wodurch das Farbkleid der Tiere dunkler erscheiat. Die Sehwanzflossens~iume sind verschm~lcrt, die Spitze etwas eingeschmolzen, aber nicht in dem Male, als es bei Jodothyrinfiitterung an ~iltere Ticre oder auch an jungc l~ana temporaria-Larven dcr Fall zu sein pflegt. Die Extremitfitcnanlagen sind als kleine Kniipfe deutlich sichtbar, w~ihrend sie bei den Kontrollen auch mit tier Lupe noch nicht nachweisbar sind. Der Spiraldarm ist bei einem Tell der Tiere auI ein kurzes, gerades Rohr zusammengeschrumpft, bei einem andern Teil ist noch ein kleiner KnSuel sichtbar.

Die mit Dijodtyrosin beeinflul~ten Larven der Gruppe b zeigea dagegen keine Wachstumshemmung. Die Hornkiefer sind noch gut erhaltcn, nur die Hornh~kchen sind spiirlicher als bei den :Kontrolltieren. Am Schwanz sind keine Einschmelzungen zu bcobachtcn; die hinteren Extrcmit~tenanlagen sind

458 B. Romeis:

dagegen dreimal so groB als bei den Jodothyrintieren. Das Darmrohr ist noch in ~ypiseher Spiralform aufgerollt, doch ist das Lumen des Rohres gegenliber denen der Kontrolltiere verengt. ]:)as Durchschnittsgewieht der Tiere in Gruppe a und b betr~igt fibereinstimmend 50 rag, das der Jodothyrintiere dagegen nur 20 rag.

21. VI. Die Jodothyrintiere liegen tot in der Schale. 23. VI. Die Mehrzahl der mit Dijodtyrosin gefiitterten Tiere ist reeht

sehw~chlich. Sie zeigen Verkriimmungen an der Sehwanzwurzel, an der Sehwanz- spitze aber keine wesentliehe Reduktion. Die Hornkiefer sind zum Teil abgeworfen.

25. VI. 4 Tiere der Gruppe b sind tot, die fibrlgen sehr sehw~ichlieh. 26. VI. Der Rest der Tiere in Gruppe b ist im Absterben. Die Reduktions-

erseheinungen am Schwanz sind gering. Die Extremit~tenanlagen lassen beginnende Differenzierung erkennen, w~hrend sie bei der Kontrollgruppe noeh gar nieht siehtbar sind; yon den vorderen Extremit~tenanlagen ist jedoeh keine durchgebroehen. Am ~Iaul ist weitgehende I~eduktion der larv~len FreBwerk- zeuge festzustellen; der Darm ist verkiirzt. Das durchschnittliehe KSrper- gewicht ist etwas niedriger als bei den Kontrolltieren.

Bei Einwirkung auf ganz junge Esculenla-Kaulquappen t r i t t ~lso die wachstumshemmende, dissimilationssteigernde Wirkung des Dijodtyro- sins erst allm~hlich hervor; um so deutlicher kommb im vorausgehenden Zeitabsehnitt der entwicklungsbesehleunigende, aufbauende Einflu~ auf die Extremit~ten zur Geltung; beim Jodothyrin tr i t t dagegen viel rascher der abbauende in Erscheinung, trotzdem dieses den Tieren nur einmal, Dijodtyrosin dagegen vierm~l verabreieht wurde.

I m ganzen genommen hat die Wirkung des Dijodtyrosins aber so grebe ~hnliehkeit mit jener, wie sie aueh bei Jodothyrin oder einem dureh Alkalihydrolyse gewonnenen analogen Prapara t hervortritt , dal~ die Frage Berechtigung hat, ob nieht die Wirkung jener Substanzen mi t dem Vorhandensein von Dijodtyrosin in Zusammenhang steht. Ieh werde darauf im zweiten Teil meiner Arbeit, der sich mit don dutch Hydrolyse gewonnenen Extrakten befassen wird, noeh n~her zuriickkommen.

])as Resul~at der vorliegenden Versuche s t immt mi t den jiingst yon A b e l i n verSffentlichten Beobaehtungen iiberein. A b e l i n konnte ebenfalls dureh Dijodtyrosin sowie dureh ein Dijodtyrosin enthaltendes EiweiBpr~parat, (Jodalbazid) die Metamorphose yon ttana esculenta- Kaulquappen in ahnlicher Weise beeinflussen, wie dutch Schilddriisen- stoffe. Aueh M. M o r s e hat, wie ich einer Angabe A b e l i n s entnehme, im Kaulquappenversuch eine ~hnliche Wirkung des Dijodtyrosins be- obaehtet.

Dutch die Feststellung, dal] Dijodtyrosin im Kaulquappenversuch sehilddriisen~hnliehe Wirkung hervorruft, ist nagfirlieh noch nicht gesagt, dal3 nun aueh die bei Schilddrfisenffitterung wirkende Substanz oder etwa gar das Hormon der Sehilddriise Dijodtyrosin ist. Gegen letzteres spricht schon die Feststellung 0 s w a l d s (1916), dab Jod-

Versuche zur Isolierung des Schilddriisenhormoncs. I. 459

tyrosin auf die Adrenalinempfindlichkei$ unwirksam ist. Auch die Beobachtung, dab ich Tyrosin allein, das ich aus hydrolysierten Schild- driisenextrakten isolierte, im Kaulquappenversuch unwirksam land - - auch A b e l i n konnte mi~ Tyrosin weder Dissimilationssteigerung noch Entwicklungsbeschleunigung hervorrufen - - spricht, dagegen. Denn die aus Schilddrfsenextrakten isolierte Substanz wirkt auch noch bei Abwesenheit yon Jod. Jedenfalls lassen es aber die Ergebnisse als notwendig erseheinen, mi t Dijodtyrosin weitere Untersuchungen an thyreopriven S~ugetieren vorzunehmen.

In eiJaer vorausgehenden Arbeit teilt A b e l i n (20) ferner mit, auch in Dijodtyramin eine Substanz gefunden zu haben, ~)die selbst in geringen Mengen die normale Entwieklung der Kaulquappen in ganz charakteristischer Weise beeinfluBt und besehleunigt(~. Die entwieklungsbesehleunigende Wirkung tr i t t allerdings nur bei Einwirkung auf altere, kurz vor der Metamorphose stehende Kaulquappen hervor, wi~hrend bei jungen Tieren nach A b e l i n )~eher elne Entwicklungshemmung hervorgerufen wird~. Da reich der Umstand, dab die durch Dijod- tyramin hervorgerufenen Unterschiede aueh bei Einwirkung auf ~lSere Larven nach A b e l i n s Versuchsprotokollen zu sehlieBen nur verhi~ltnis- m~Big gering sind, gegeniiber der oben angef/ihrten SchluBfolgerung etwas skeptiseh stimmte, h a b e ich die Wirkung des Dijodtyramins in einer Reihe von Versuchen nachgepriift. Dabei blieb bei Verwendung junger, etwa. 20 Tage alter Rana temporaria-Larven aueh naeh zehn- maliger Einwirktmg yon je 6 ccm einer 0,1%igen L6sung die Entwiek- lung ganz unbeeinfluBt. Zur Veransehaulichung der Wirkung auf mitt- lere und ~iltere Larven diene das Protokoll der Versuche 17 und 18.

Versueh 17. ]~Iaterial: Rana temporaria.Larvcn aus einem am 27. IV. 21 abgelegten

Laich. Beginn des Versuches: 6. V. 21. Alter der Tierc: 40 Tage. D u r c h s c h n i t t l i c h e GrSi]e der La rven : Gesamtli~nge: 22 ram; Rumpf-

l~nge: 9 ram; RumI)fbreitc: 5 mm. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : kr~ftig entwickclte Froschlarven mit 0,5 mm

langen, undifferenzierten Extremit~tenanlagen. Anzahl dcr Ticre : 2 Gruppen zu je 10 Larven. Ve r suchsano rdnung : Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b: Dijodtyramin

in 0,1%iger whBriger Suspension. Ve r suehsp ro t oko l l : Gruppe b erh~lt am 6, V., 7. V., 9. V., 12. V., 14. V.

]e 4 cem Di~odtyramin. Die Tiere zeigen keinerlei Unterschiedo gegeniiber der Kontrolle.

Am 17. V., 21. V., 24. V., 26, V. werden je 6 ecru verabreicht. Die ~Ies- sung am 27. V. (vgl. Tabclle 32) ergibt, da~ die mit Dijodtyramin gefiittcrten Tiere nur unwesentlich kleiner sind als die Kontrollarven. Die Entwicklung stimmt in beiden Gruppen iiberein. Die larvalen Organe sind noeh in roller Ausbildung erhalten (vgl. auch Abb. 14a und b).

29. V., I. VI., 3. VL ]e 6 cem Dijodtyramin.

460 B. Romeis:

Tabe l le 32.

Gruppe a: Kontrolle Gruppeb: Dijodtyramin

23,1 28,0 23,0 27,5 25,3 28,2 25,0 28,0 26~0 29~5 26~5 28,2

24,8--28,5 24,5--27,9

26,6 26,2 Am 5. VI. zeigt Wachstum und Entwicklung der Gruppe b frotz zwSlf-

maliger Fiitterung mit Dijodtyramin noch keine wesentliehe Beeinflussung.

In nachfo lgendem Versuch 18 wurde die W i r k u n g des Dijod- t}~ramins noch an kurz vor de r Metamorphose s t ehenden La rven gepriift .

M a t e r i a l : Rana temporaria-Kaulquappen aus einem am 27. III. 21 abgelegten Laich.

B e g i n n des V e r s u c h e s : 10. VI. 21. Alter der Tiere: 75 Tage. D u r c h s e h n i t t l i c h e GrSfie d e r L a r v e n : Gesamtl~inge: 36 mm; Rumpf-

l~nge: 13,5 mm; :Rumpfbreite: 9,0 mm. E n t w i c k l u n g s s t a d i u m : Grol]e, kurz vor der Metamorphose stehende

Larven mit gut differenzierten, reehtwinklig vom l~umpf abgebeugten, 5 mm langen Hinterbeinen.

A n z a h l d e r Tiere-" 2 Gruppen zu je 10 Larven. V e r s u c h s a n o r d n u n g " Gruppe a: Kontrolle. Gruppe b.: Dijodtyramin

in 0,1%iger Suspension. V e r s u c h s p r o t o k o l l :

10. VI. 21. 10 ecru Dijodtyramin; ebenso am 11. VI., 12. VI. und 14. VI. 16. VL In Gruppe a brechen bei einem Tier die Vorderbeine durch. 17. VI. Gruppe a: 2 Tiere metamorphosieren, in Gruppe b 4. 18. VI. Gruppe a: 3 Tiere; Gruppe b: 2 Tiere. 19. VI. Gruppe b: 1 Tier metamorphosiert. 20. VI. Gruppe a: 3 Tiere metamorphosieren; Gruppe b: 1 Tier. 22. VI. Gruppe b: 2 Tiere metamorphosicren. Die Mehrzahl der metamorphosierten Tiere der beiden Gruppen unter-

seheidcn sieh voneinander in keiner Weise: l~ur bei 3 Tieren der Gruppe b sind sie Extremit~ten um 1--2 mm kfirzer und der Schwanz zur Zeit des Dureh- bruehes tier Vorderbeine um 2--3 mm s6irker eingesehmolzen.

Das Ergebn i s f inder Bes ta t igung in zwei wei teren Versuchen, in denen ebenfal ls kurz vor de r Metamorphose s tehende Rana temporaria- Larven an vier aufe inander fo lgenden Tagen je 6 ccm e iner 0 , 1 % i g e n Di jod ty raminsuspens ion erhiel ten, m i t d e m Erfolge, dab Versuchst iere u n d Kon t ro l l t i e r e zu gleicher Zei t o h n e sicht l iche Differenzen meta- morphosier ten .

Auch auI a l te Tiere wi rk t also D i j o d t y r a m i n nur schwach. Der Untersch ied in seiner W i r k u n g gegeni iber Di jod tyros in is t sehr s tark. Die dissimilat ioDsteigernde, w a c h s t u m s h e m m e n d e und entwicklungs-


besehleunigende Wirkung ist hier demnach an das Vorhandensein der Karboxylgruppe gebunden. Wird dieselbe dutch die Aminogruppe ersetzt, so wird die erw~thnte Wirktmg aufgehoben oder zum mindesten stark abgeschwi~cht.

Worauf der Unterschied meiner Versuehe mit I)ijodtyramin gegenfiber den Ergebnissen A b e l i n s beruht, ist mir zurzeit noch unklar. A b e l i n benutzte zu den Versuchen mit Dijodtyramin hauptsi~ehlieh Esculenta-Kaulquappen, bekam aber auch in zwei mit Temporaria- ~Larven ausgefiihrten Versuehen (Versueh 79 und 36) gleiehlautende Ergebnisse. An der Tierart k a n n e s also nicht liegen. MSglicher- weise islb d i e HerkunI~ des Dijodtyramlns die UrsacheZ). Im iibrigen ist zu beriieksichtigen, dal3 aueh bei A b e l i n die entwicklungsbeschleunigende und dissimflatorische Wirkung nicht sehr stark ist. Vielleicht w~ren die yon A b e l i n besehriebenen Differenzen gegeniiber der Kon- trolle bei Beobaehtung einer grSl3eren Zahl yon Tieren gleichm~iger Herkunft noch geringer.

Ergebnisse.

1. Ein durch mehrmalige Fallung mit absolutem Alkohol bei neutraler Reaktion enteiweiI3ter und gereinigter Schilddriisenextrakt tuft im Kaulquappenversuch zwar deutliche Entwicklungsbeschleunigung hervor, nicht abet die bei Ffitterung mit frischer Schilddriise stets zu beobaehtende Dissimilati0nssteigerung. Es ist daher fragtich, ob die genannte Entwicklungsbeschleunigung als organspezifisch zu be- trachten ist. Der (lurch die erste Alkoholfitllung abgetrennte eiweii3- reiche Niederschlag wirkt sehr stark dissimilationssteigernd, wachstums- hemmend und entwicklungsbeschleunigend. Die petrol~therlSslichen Substanzen des Alkoholextraktes rufen in gereini~tem Zustand keine nennenswerte Entwicklungsbesehleunigung hervor.

2. Dutch Extraktion mit 50%igem Alkohol, Ans~uern mit Essig- s~ure und zweimalige Ausf~llung mit anges~uertem 96%igem Alkohol gelingt es aus der ffischen Schilddriise eine alkoholl6sliche, eiwei[~freie Extraktfraktion zu erhalten, die dissimilationssteigernd, wachstums- hemmend und entwicldungsbeschleunigend wirkt. :Ebenso wirken die durch Essigs~ure ausgef~llten Eiwei~substanzen. Die bei der ersten und zweiten Atkoholfi~llung entstehenden Niederschl~ge sind nur schwach wirksam (der erste mehr Ms der zweite). Die alkohollSsliehe eiweii~- fl-eie spezifisch wlrkende Extraktfraktion ist in Petrol~ther nicht 15slieh. Sie ist jodhaltig. Sie l~i~t sich aus der frischen Driise auch mit 80 -- 90 % igem Alkohol extrahieren.

x) "l'ch bekam das PrSparat in liebenswiirdigster Weise yon den Farbwerken Bayer, Leverkusen, zur Vcrfiigung gestellt.

462 B. I~omeis:

3. Die im ~lkoholl5slichen Extraktteil enthaltene wirksame Substanz geht bei Fraktionierung mit Azeton zum grSl~ten Tell in den Azeton- extrakt fiber. Die Trennung ist jedoch nicht quantitutiv. Bei oft- maliger Einwirkung ruft auch die azetonunlSsliehe Fraktion Wachs- tumshemmung und En~wicklungsbeschleunigung hervor.

4. Bei Aussehiitteln des azetonlSsliehen Extraktteiles mit Benzol, Toluol und Triehlor~thylen geht die wirksame Substanz nicht oder nur in Spuren in das Extraktionsmittel fiber.

5. Auch die mit ~ther aus dem Extrakt abgetrennten Substanzen sind nicht spezifisch wirksam, wenn das Ausschfitteln in w~itriger LSsung bei neutraler Reaktion vor sich geht und der erhaltene ExSrakt naeh Trocknen noehmals in reinem S4ther ~ufgenommen wird. Der so gewonnene J~therex~rakt enthMt Cholesterin und eine gelbgef~rbte, unbekannte Zwischensubstanz (wahrscheinlich entspreehend der *)Begleit- substanz(~ Wackers).

6. Erhebllche Mengen wirksamer Substanz gehen dagegen in den J~therextrakt fiber, wenn der Extrakt in a lkoho l i scher L6sung mit ~ther ausgesehfittelt wird. Wird dieser Ex~rakt getrocknet und in reinem Ather aufgenommen, so bleibt die wirksame Substanz mit einer Reihe anderer Stoffe ungelSst zuriick. Die in reinem }~ther gelSsten Substanzen (haupts~chlich Cholesterin) sind nicht spezifisch wirksam. Der jodhaltige Riiekstand 15st sieh zum grSl~ten Tell in neutralem H~O. Die wi~13rige LSsung ist stark wirksam, ebenso der geringe zurfickbleibende Niedersehlag, der sich in sehwaeh alkalisehem Wasser 15st. Noeh reiehlicher ist der Ubergang wirksamer Substanz in den Alkohol- ~xther-Extrakt nach vorhergehendem Ans~uern mit H2S04.

7. Die spezifisch wirkende Substanz wird aus dem enteiweil~ten, gereinigten Extrakt dutch Phosphorwolframs~ure bei schwefelsaurer Reaktion gef~llt. Sie geht beim Zersetzen des Phosphorwolframs~ure- niedersehlags mi~ Baryt in LSsung. Im Bariumphosphorwolframat- niederschlag bleibt eine mit NaOH oder NH~ zu extrahierende Sub- stanz zuriick, die beim Neu~ralisieren grSBtenteils ausf~llt und im Kaulquappenversuch Wachstumshemmung ohne gleichzeitige Entwick- lungsbeschleunigung hervorruf¢.

8. Die dutch Phosphorwolframs~ure nieht gef~llten, in das Filtrat iibergehenden Substanzen rufen keine spezifische Wirkung hervor.

9. Die dutch Phosphorwolframsi~ure gef~llte und dureh Barium- hydroxyd in Freiheit gesetzte wirksame Substanz ist in 90%igem Alkohol 16slich. In ihr konnte mit den angewandten Methoden kein Jod naehgewiesen werden. Trotzdem rief sie im Kaulquappenversuch die typische Sehilddriisenwirkung hervor.

10. Nach mehrmatigem L6sen in 90%igem Alkohol konnten aus sehwach schwefelsaurer LSsung geringe Mengen einer kristallisierenden


Substanz erhalten werden, die im Kaulquappenversuch Dissimilations- steigerung, Waehstumshemmung und Entwicklungsbeschleunigung ver- ursaohte. Wie schon das Fehlen von Jod zeigt, stimmt diese Sub- stanz mit dem K e n d a l l s c h e n Thyroxin nicht iiberein.

11. Die wirksame Substanz wird ferner aus dem enteiweiBten Extrakt dureh Sublimat aus neutraler Liisung gef~ll$. Am besten f~llt Sublimatnatriumazetat. Aueh ~lkoholisehe SublimatlSsung fi~llt ziemlich vollst~ndig. Die nieht gef~Ilten Substanzen besitzen keine speziiisehe Wirksamkeit. Bei saurer Reaktion wird die Substanz nieht ausgefi~llt.

12. Ein wassriger, mit Aluminiumsilikat bei saurer Reaktion ent- eiweiBter Schflddriisenextrakt wirkt im Kaulquappenversuch waehs- tumsfSrdernd und leicht entwicklungsbesehleunigend. Die entwicklungsbeschleunigende Wirkung unterscheidet sich durch das •ehlen der Dissimilationssteigerung deutlich yon typiseher Schilddriisenwirkung. Die spezifiseh wirkende Substanz wird bei dieser Methode zugleieh mit den EiweiBk6rpern entfernt.

13. Beim Ausschiitteln eines naeh obiger Methode (s. Abs. 2) mit Alkohol enteiweiBten Extraktes mit Aluminiumsilikat wird die wirksame Substanz durch Aluminiumsilika¢ adsorbiert. D i e nicht adsorbierten Substanzen besitzen keine oder nur geringe spezifisohe Wirkung.

14. Die adsorbierte wirksame Substanz l~Bt sieh aus dem Ad- sorptionsmittel durch Extraktion mit NaOH oder NHa wieder gewinnen. Die auf diese Weise isolierte Extraktfraktion ist frei yon EiweiB, Albumosen oder Peptonen. Sie ist jodhaltig.

15. Eine beira Neutralisieren oder Ans~uern dieser Extraktfraktion ausfallende Substanz wirkt stark dissimilationssteigernd und m~Big entwieklungsbeschleunigend. Aueh das davon abgetrennte Fil trat ist noch spezifisch wirksam.

16. In gleieher Weise wie dutch Aluminiumsilikat wird die wirksame Substanz durch Tierkohle adsorbiert. Das ablaufende Fil trat hat seine spezifische Wirksamkeit verloren.

17. Die yon Aluminiumsilikat adsorbierte und in NaOH gel6ste Substanz bleibt bei Dialyse durch Kollodiummembran zum grSBten Tefl im Sohlauch zuriick; sie ist jedoeh keine Albumose.

18. KJOa, KJ , NaJO3, NaJ und Lugo l sche LSsung verurs~chen im Kaulquappenversueh in Verdiinnungen yon 1 : 50000- -1 : 500000 weder Entwicklungsbeschleunigung noeh Waehstumshemmung.

Sti~rkere Konzentration hat haufig das Absterben der Tiere zur Folge.

19. Dijodtyrosin ruft sehon in geringen Dosen (20--40 rag) setlr deutliche Dissimilationssteigerung, Entwicklungsbeschleunigung und

464: B. Romeis:

Waehstumshemmung hervor. Die Wirkung hat sehr grebe ~hntichkeit mi t den nach starker Schilddrfisenfiitterung odor Jodothyl~inverab - reichung auftretenden Erscheinungen. Bei Einwirkung auf sehr junge Esculenta-Larven kommt die Wirkung etwas langsamer zur Geltung ats bei Jodothyrin.

20. Dijodtyramin ist dagegen nicht oder nut sehr sehwach wirksam. Der Unterschied in der Wlrksamkeit von Dijodtyramin und Dijodtyrosin hi~ngt also aM dem Vorhandensein der Karboxylgruppe; bei deren Ersatz durch die Aminogruppe geht die spezifische Wirk- samkeit mehr odor weniger verloren.

21. Dureh die vorliegenden Yersuche ist erwiesen, dab sich die spezifisehe Wirkung der Schilddriisenfiitterung auf Kaulquappen durch eine aus der frisehen Driise extrahierte eiweiflfreie Substanz hervorrufen l~Bt. Dieselbe ist auch noeh wirksam, wenn sich in ihr kein Jod" mehr nachweisen l~i~t; doch wird ihre Wirksamkeit dutch das Vorhandensein yon Jod in einer gewissen, noch unbekannten :Form der Bindung zweifellos gesteigert. Die Substanz is~ abiuret, sehwefel- frei und gibt keine Mi l lonsche Reaktion. Der negative Ausfall der Mi l lonschen Reaktion wiirde bei der jodhaltigen Substanz nieht gegen das Vorhandensein Yon Dijodtyrosin spreehen. Die Probe ist abet auch bei dem jodfreien Prii.parat negativ. Der negative Ausfall der A d a m - k i e w i c z - H o p k i n s c h e n Probe, die bei einigen PrEparaten festzustellen war, ohne dab sich deren Wirksamkeit gegeniiber solchen mit posi- t iver A.-H. Reaktion unterschieden h~tte, deutet auf das Fehle'n des Tryptophankomplexes hin, was im t]inblick auf das K e n d a l l s c h o Thyroxin, das ein Tryptophanderivat ist, yon Interesse ist.

22. Ob die in vorliegenden Versuehen isolierte Substanz dem in vivo sezernierten Hormon der Schilddriise entsprieht, muI3 erst in weiteren Versuchen gepriift werden, zumal noeh nich?~ erwiesen ist, dal~ sieh die an Kaulquappen gewonnenen Ergebnisse ohne Ein- schrgnknng aueh auf h6here Wirbeltiere iibertragen lassen.

L i t e ra tu rve rze ichn i s .

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* Zit ier t nach A b e l i n , 1921, da im Original n icht zug~inglich.

T a f e l e r k l ~ r u n g .

T a f e l X I u n d X I I . Abb. la--e: Versuch 1. 31tSgige Rana temporaria-Kaulquappen; phot. 1. Mai

1918. Versuehsbeginn: 10. April 1918. Abb. l a : Gruppe a; Kont ro l le ; Abb. l b : Gruppe b; frisehe Sehild-

drfise; Abb. 1 c: Gruppe c; Pr~iparat 62, mi t Alkohol gef~illtes Sehilddriisen- eiwcii~; Abb. l d: Gruppe d ; Prgpara t 63, mi t Alkohol enteiweiBter Sehild- driisenextrakt) petrol~therunlSsl ieh; Abb. 1 e: Gruppe e; P r f p a r a t 64, petrol- ~itherlSsIieher Tell des enteiweii]ten Ex t rak te s ,

466 B. Romeis :

Abb. 2a, d und e: Versueh 1. 53t~igige t~ana temporaria-Kaulquappen; phot. 23. Mai 1918. Versuchsbeginn 10. April 1918.

Abb. 2a : Gruppe a; Kontrolle; Abb. 2d: Gruppe d; Pr~parat 63, mit Alkohol enteiwei~ter Schilddriisenextrakt, petrol~therunlSslich; Abb. 2e: Gruppe e; Pr~parat 64, desgl, petrol~therlSslich.

Abb. 3a--c. 60t~igige Rana temporaria-Larven; phot. 9. Juni 1920. Versuchs- beginn: 5. Juni 1920.

Abb. 3a : Gruppe a; Kontrolle. Abb. 3b: Gruppe b; Ather-Alkohol- Extrakt; ~qiederschlag.

Abb. 4a und b. 23t~gige Rana temporaria-Larven; phot. 21. April 1920. Ver- suchsbeginn: 9. April 1920.

Abb. 4 a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 4 b : .~thcr-Alkohol-Extrakt, ausgeschiittelt aus schwefelsaurer LSsung.

Abb. 5a und b. 72t~gige Rana temporaria-Larven; phot. 21. Juni 1920. Ver- suchsbeginn: 14. Juni 1920.

Abb. 5a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 5b: Gruppe b: AtheroAlkohol- Extrakt, ausgeschiittelt aus schwefclsaurcr LSsung.

Abb. 6a und b. Versuch 5. 46t~igige Rana temporaria-Kaulquappen; phot. 12. Mai 1921. Versuchsbeginn: 10. April 1921.

Abb. 6a : Gruppe a; Kontrolle; Abb. 6b: Gruppe b; Pr~parat 184, eiweiiL und jodfreies Schilddriisenpriiparat.

Abb. 7a und b. Versuch 6. 62thgige l~ana temfloraria-Kaulquappen; phot. 18. Mai 1921. Versuchsbeginn: 17. April 1921.

Abb. 7a : Gruppe a; KontroUe; Abb. 7b: Gruppe b, Pr~iparat 184, eiweil~- und jodfreies Schilddriisenpr~parat.

Abb. 8a und b. Versuch 7. 44t~igigc Rana temporaria-Kaulquappen; phot. 10. Mai 1921. Versuchsbeginn- I. Mai 1921.

Abb. 8a : Gruppe a; Kontrolle; Abb. 8b: Gruppe b, Pr~para~ 190, jodfreie, kristallisierende Substanz.

Abb. 9a und b. Versuch 9. 31t~igige t~ana tenvporaria.Kaulquappen; phot. 1. Mai 1918. Versuchsbeginn: 10. April 1918.

Abb. 9a : Gruppe a; Kontrolle; Abb. 9b: Gruppe b, mit Aluminium- silikat enteiweiBter w~t~riger Schilddriisene~rakt.

Abb. 10a und b. Versuch 9. 52t~gige Bana temporaria-Kaulquappen; phot. 22. ~ a i 1918. Versuchsbeginn: 10. April 1918.

Abb. 10a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 10b: Gruppe b, mit Aluminium- silikat enteiweil3ter w~13riger Schilddriisenextrakt.

Abb. 11a, b und c, Versuch 10. 42tiigige Rana temporaria-Kaulquappen; phoL 23. Mai 1918. Versuchsbeginn: 26. April 1918.

Abb. l l a : Gruppe a; Kontrolle; Abb, 11b: Gruppe b, Pri~parat 70, mit Aluminiumsilikat enteiweillter Schilddriisenex~rakt, Alkoholfiillung; Abb. 11c: Gruppe c, desgl. Filtrat,.

Abb. 12a und b. Versuch 11. 56t~igige Bana temporaria-Kaulquappen; phot. 24. Mai 1920. Versuchsbeginn: 12. Mai 1920.

Abb. 12a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 12b: Gruppe b, Pr~parat 145, mit Alkohol ertteiwei$ter Schilddriisenextrakt, adsorbiert[dureh Aluminium- silikat,.

Abb. 13a und b. Versuch 12. 39ti~gige Rana temporaria-Kaulquappen; phot. 11. Mai 1921. Versuchsbeginn: i. Mai 1921.

At)b. 13a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 13b: Grupp 9 b, Pr~para~ 192, mit Alkohol enteiweii~ter Schilddriisenextrakt, adsorbiert durch Aluminium- silikat, gelSst in NH s.

Versuche zur lsolierung des Schilddrtisenhormones. L 467

Abb. 14a, b, v und d, Versuch 13. Abb. 14a, c und d: 52t~igige Rana temporaria-Kaulquappen; phot. am 18. Mai 1921; Abb. 14b: 43t:~igige Kaul- (tuappen; phot. am 9. ~[ai 1921. Versuchsbegina: 2. 5Iai 1921.

Abb. 14a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. 14b: Gruppe b, mit Alkohol enteiwei~ter Schilddrfisenextrakt, adsorbiert (lurch Aluminiumsilikat, gelSst in:NH3, gef~illt durvh Ans~uern; zkbb. 14c: Gruppe c, desgl., desgl.; beim Anshuera in LSsung bleibende Substanzen; Abb. 14d: Gruppe d, desgl.; durch Aluminiumsilikat nicht adsorbierte Substanzen.

Abb. 15a, b und c. Versuch 15. 47tiigige Rana temporaria-Kaulquappcn; phot. am 15. )lai 1921. Versuchsbeginn: 5. Mai 1921.

Abb. 15a: Gruppe a; :Kontrolle; Abb. 15b: Gruppe b, Dijodtyrosin; Abb. 15 c : Grutlpe c, Katium]odat.

Abb. 16a und b. Versuch 17. 61t~gige Rana temporaria-Kaulquappen; phot. am 27. Mai 1921. Versuchsbeginn: 6. Mai 1921.

Abb. 16a: Gruppe a; Kontrolle; Abb. t6b: Gruppe b, nach 9maliger Dij odtyramineinwirkung.

Archiv iiir Entwickiungsmechanik Bd° 50. 31

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Versuche zur Isolierung des Schilddrüsenhormones