CÁTEDRA: BIOQUÍMICACarreras: Farmacia Profesorado en QuímicaLicenciatura en QuímicaLicenciatura en Alimentos

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

1) Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolíticas y los cofactores necesarios. ¿Cuál es la distribución de 14C en el piruvato? Realice el mismo seguimiento con glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6.

2) En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de músculo de conejo (tubo A) y de levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotópicamente (14C) en forma uniforme en un medio anaeróbico (con NaN3) a pH 5 y 30°C. Las medidas de radioactividad, en alícuotas iguales de medio, a tiempo cero (antes de agregar las células) y luego de 1 h de incubación se muestran en la siguiente tabla:

Tiempo (min) % Radiact. Tubo A % Radiact. Tubo B0 100 10060 98 65

a) ¿Qué explicación encuentra para estos resultados?b) Construya una tabla con los valores teóricos de % de radioactividad que esperaría encontrar si el experimento se realizara en idénticas condiciones pero con (14C1) glucosa.c) Igual que en b pero con (14C3) glucosa.

3) Un experimento de pulso y caza usando fuentes de carbono marcadas radioactivamente es llevado a cabo en un extracto de levaduras mantenido bajo estrictas condiciones de anaerobiosis para producir etanol. El experimento consiste en incubar una pequeña cantidad de sustrato marcado radioactivamente (el pulso) con el extracto de levaduras el tiempo necesario para que cada intermediario en la ruta metabólica resulte marcado. La marca es luego “cazada” durante la ruta metabólica por la adición de un exceso de sustrato no marcado. El propósito de la “caza” es prevenir el reciclaje de los productos marcados y su ingreso a otras rutas metabólicas.a) ¿Cuál es la localización del 14C en el etanol producido si la glucosa usada como sustrato estaba marcada en C1?b) ¿Dónde se encontraría inicialmente la marca en la glucosa si todo el 14C se liberara como CO2?

4) En uno de sus clásicos experimentos Harden y Young, estudiando la fermentación anaeróbica de glucosa a etanol y CO2 por levaduras, observaron que el fosfato era esencial para la fermentación, y cuando éste se eliminaba o era consumido, la fermentación cesaba aún en exceso de glucosa. En estas condiciones se acumulaba etanol, CO2, y una hexosa bisfosfato. Además, si se agregaba arseniato en estas condiciones, no se acumulaba la hexosa bifosfato y la fermentación proseguía hasta terminar la glucosa. Explique.

5) Calcule la eficacia de recuperación energética en la glucólisis del eritrocito en base de los siguientes datos:

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Glucosa 2 LactatoG’0 = -47,0 Kcal/molATP + H20 ADP + Pi G’,0 = -7,3 Kcal/mol

Concentración intracelular (mM)

Glucosa 5Pi 1

ADP 0,14ATP 1,85

Lactato 2,90

6) Se prepararon varios tubos de ensayo que contenían 1 ml de levaduras (2.107

células/ml) + 1 ml de una solución reguladora + 3 ml de una solución de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se pusieron a incubar a 30°C (la reacción se disparó por el agregado de la glucosa). A los 3 min se les hicieron los agregados (1 ml en total) que se detallan en la columna A de la tabla y se tomó una alícuota de 1 ml de la mezcla, se centrifugó y a 0,5 ml de sobrenadante se lo hizo reaccionar por el método de la glucosa oxidasa, obteniéndose los valores de concentración de glucosa que se indican en la columna B de la tabla. A los 30 min. se repitió la operación (los datos obtenidos figuran en la columna C).

Una con flechas los datos de la columna C a los de la columna B según lo esperado para el consumo de azúcar en cada condición. Determine en cada caso la velocidad de consumo de glucosa en µmol/min.

A B CAGUA

2.5 mM

2,5 mMPi 50 mM 2,5 mMPi + NaN3 1 mMPi + NaF 2,5 mM

ARSENIATO 50 mM 0,32 mMPi + ARSENIATO 0,625 mM

ARSENIATO + NaN3 1,5 mMSACAROSA + Pi 1,5 mM

SACAROSA 0,90 mM

7) Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa-14C1 y posteriormente se aislan los intermediarios del ciclo del ácido cítrico, ¿Dónde estará el 14C en cada una de las sustancias listadas abajo? Considerar sólo la incorporación inicial de 14C en estos compuestos:a) Fructosa-1,6-bisP, b) Acetil-SCoA, c) Gliceraldehído-3-P, d) Fosfoenolpiruvato, e) Citrato, f) alfa-cetoglutarato, y g) Oxalacetato.

8) La respiración celular puede ser estudiada usando preparaciones de mitocondrias aisladas y midiendo su consumo de O2 bajo diferentes condiciones. Si 10 mM de malonato de sodio se agrega a mitocondrias que se encuentran respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, se detiene la respiración rápidamente y se acumula un intermediario metabólico.a) ¿Cuál es la estructura del metabolito acumulado? Explique por qué se acumula. b) ¿Por qué se detiene el consumo de O2?

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9) Las rutas metabólicas de compuestos orgánicos han sido estudiadas utilizando sustratos marcados radioactivamente.a) ¿Cómo puede usted determinar si la glucosa agregada a una suspensión de mitocondrias aisladas es metabolizada a CO2 y agua?b) Suponga que usted agrega piruvato marcado con 14C en el metilo, después de una vuelta del ciclo del ácido cítrico, ¿Cuál es la posición del 14C en el oxalacetato, y en cada uno de los intermediarios?c) ¿Cuántas vueltas del ciclo son necesarias para que el 14C empiece a desprenderse como CO2?

10) ¿Es posible obtener síntesis neta de oxalacetato agregando acetil-CoA a un extracto que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del ácido cítrico?

11) Supóngase que se añade acetato marcado con 14C en el grupo metilo a cada una de las siguientes preparaciones celulares que respiran:a) Células hepáticasb) Células hepáticas a las que se ha adicionado malonatoc) Plántulas de arvejaA continuación se aisla ácido succínico de cada una de las preparaciones. ¿Cuáles serán los átomos de C del ácido succínico que se espera estén marcados?. Fundamente brevemente.

12) El fluoracetato, preparado comercialmente para el control de roedores, es también producido naturalmente por una planta de Sudamérica. Después de entrar en la célula, el fluoracetato es convertido en fluoracetil-SCoA en una reacción catalizada por la enzima acetato tioquinasa:F-CH2-COO- + CoA-SH + ATP -----> F-CH2-CO-S-CoA + AMP + PPi

Para estudiar el efecto tóxico del fluoracetato se realizó un experimento sobre corazón de rata aislado. Después que el corazón fue perfundido con una solución 0,22 mM de fluoracetato, la velocidad de la captura de glucosa y la glucólisis disminuyó, y se observó acumulación de glucosa-6-P y fructosa-6-P. Un examen de los intermediarios del ciclo del ácido cítrico indicó que sus concentraciones eran inferiores a las normales, excepto para el citrato, cuya concentración intracelular, era 10 veces mayor que lo normal.

a) ¿Dónde ocurriría el bloqueo del ciclo del ácido cítrico? ¿Qué causó la acumulación del citrato y el agotamiento de los otros intermediarios?

b) El fluoracetil-SCoA es enzimáticamente transformado en el ciclo del ácido cítrico. ¿Cuál es la estructura del producto metabólico final del fluoracetato?c) ¿Por qué la captura de la glucosa y la glucólisis disminuyen al perfundir fluoracetato? ¿Por qué éste bloquea el ciclo del ácido cítrico? ¿Por qué se acumulan hexosas monofosfato? d) ¿Por qué el fluoracetato es un veneno fatal?

13) Se incubaron a 37°C 0,5 ml de un extracto de levaduras libres de mitocondrias (conteniendo 1 mg/ml de proteína) con 2 ml de una solución de glucosa 0,5 M en un volumen final de 3 ml. A los 30 minutos se sacaron 2 alícuotas de 0,1 ml cada una, determinándose en una de ellas 13,3 µmoles de glucosa y en la otra 30 µmoles de etanol. a) Determine la velocidad de consumo de glucosa y de producción de etanol

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expresándolas en µmoles/min. mg prot. b) Nombre la/s vía/s involucradas en la utilización de la glucosa y diga qué porcentaje de glucosa es degradada por cada una. c) Si se agrega glucosa marcada radioactivamente en el carbono 1, ¿qué cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? d) Si se agrega glucosa marcada uniformemente, ¿qué cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? Suponga que no se acumula ningún carbohidrato intermediario ni metabolito fosforilado.

14) En un experimento se incubaron 2. 105 eritrocitos en un medio con glucosa uniformemente marcada con 14C, a pH 7,3 y a 37°C, en un volumen final de 7 ml. A tiempo 0, se tomó una alícuota, se centrifugó y en el sobrenadante se determinó glucosa por el método de Glucosa Oxidasa. Para esta determinación se emplearon 200 µl de sobrenadante y se obtuvo 0,65. Este procedimiento se repitió a los 30 minutos y resultó una Abs505 nm = 0,20. Un testigo de glucosa 1 g/l produjo una Abs505

nm = 0,30 empleando una alícuota de 100 µl. Todas las medidas se realizaron llevando a 100 % de transmitancia con el blanco. La velocidad media de aparición de 14CO2 durante ese mismo lapso fue de 5,80 µmoles/min. 106 células. Las células no acumulan carbohidratos ni derivados fosforilados. Calcule la velocidad de consumo de glucosa, la velocidad de aparición de lactato y la velocidad de producción NADPH.

15) Se incubó glucosa-14C6 con una suspensión de eritrocitos en presencia de un potente inhibidor de la fosfoglucoisomerasa. Al cabo de un tiempo se detectó la presencia de piruvato 14C. ¿Mediante qué vía metabólica se llegó a la producción del piruvato marcado? Detalle la vía e indique qué carbono del piruvato espera encontrar marcado.

16) Puede utilizarse un experimento con isótopos para determinar qué fracción del catabolismo de la glucosa procede vía glucólisis vs vía de las pentosas. Las células se dividen en dos fracciones; una se incuba con glucosa 14C1 y la otra con glucosa 14C6. Se comparan las velocidades iniciales por las cuales la marca aparece como CO2. Prediga qué valor puede alcanzar en células hepáticas asumiendo que la velocidad de degradación de la glucosa es igual por ambas vías.

17) a) Se incubaron 10 µl de un extracto de músculo de conejo (conteniendo 1,4 mg/ml prot) con 0,4 ml de una solución de glucosa 1 g/l, en un volumen final de 4 ml (PM Glucosa=180). Al cabo de 10 minutos se extrajo una alícuota de 0,5 ml y se determinó la presencia de 0,10 µmoles glucosa por el método colorimétrico. Exprese la velocidad de consumo de glucosa en µmoles/min. mg prot. b) En otra serie de experimentos se incubaron distintos extractos tisulares, en condiciones tales que el consumo de glucosa fue de 10 µmoles/min.mg prot. Si el 25 % de la misma fue degradada por el shunt de las pentosas, indique los µmoles de 14CO2 producidos por mg de proteína al cabo de 30 minutos, para cada uno de los siguientes casos. (Tenga en cuenta que no se acumulan carbohidratos intermediarios ni metabolitos fosforilados).

14C-Gluc 14C1-Gluc 14C1-14C3-Gluc

Extracto de Levaduras libre de mitocondrias

Extracto de Músculo de conejo libre de mitocondrias

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18) Se estudiaron cuatro casos clínicos cuyos exámenes se exponen más abajo. Para cada caso determine cuál es la enzima que está en defecto y elija un apropiado tratamiento de la lista. Justifique su elección y resuelva las preguntas contenidas en cada caso estudiado.Caso A: El paciente tiene vómitos y diarrea inmediatamente después de ingestión de leche. Se le hizo una prueba de tolerancia a la lactosa que consiste en que el paciente ingiera una cantidad estandarizada de lactosa midiendo luego la concentración de glucosa y galactosa en sangre a tiempos definidos. En un paciente normal los niveles aumentan hasta un máximo en una hora y luego disminuyen. En este paciente la concentración de los azúcares no aumentó y permaneció constante. Explique por qué los niveles de azúcar aumentan y luego disminuyen en individuos normales. ¿Por qué estos azúcares no aumentaron su concentración sanguínea en este paciente?Caso B: Un paciente retardado mental tiene vómitos y diarrea después de la ingestión de leche. El paciente presenta una baja concentración de glucosa en sangre, pero uno de los azúcares reductores es superior a lo normal. Se encontró galactosa en orina. ¿Por qué la concentración de azúcares reductores en sangre es alta? ¿Por qué la galactosa aparece en la orina?Caso C: El paciente presenta fuertes calambres musculares cuando hace ejercicio violento. Una biopsia muscular indicó que la concentración de glucógeno en el músculo es muy superior a la de individuos normales. ¿Por qué se acumula glucógeno?Caso D: El paciente letárgico, presenta hepatomegalia y una biopsia del hígado mostró exceso de glucógeno, también presentó baja concentración de glucosa sanguínea.

Defectos enzimáticos:1.Fosfofructoquinasa muscular2.Fosfomanoisomerasa3.Galactosa-1-P uridil transferasa4.Fosforilasa hepática

5.Triosa quinasa6.Lactasa en mucosa intestinal7.Maltasa en mucosa intestinal

Tratamientos:i.Correr 3 km por díaiiDieta pobre en grasasiiiDieta con baja lactosa

iiiiProhibición de ejercicios extenuantesiiiiiAlimentación frecuente y regular

19) Si en un extracto de hígado de rata que lleva a cabo gluconeogénesis se adiciona HCO3

- marcado (14C), ¿Cuál o cuáles carbonos de la glucosa resultarán marcados?

20) Si en el experimento anterior se suprime el HCO3- marcado y se adiciona

piruvato marcado uniformemente con 14C, ¿Qué átomos de la glucosa resultarán marcados?

21) Un homogenado de hígado fue incubado en un medio que contenía 10 mM de lactato como única fuente de carbono y 20 mM ATP, en un volumen final de 3 ml. Al cabo de 30 minutos, la concentración de lactato fue 0,13 mM. a) ¿Por qué vía metabólica se obtuvo glucosa a partir de lactato? b) Calcule la velocidad de consumo de lactato expresándola en µmoles/min. En base a este dato, ¿qué

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velocidad de producción de glucosa esperaría encontrar? c) Cuando se procesó por el mismo método una alícuota de 0,2 ml de la muestra se observó una velocidad de producción de glucosa de 0,18 µmoles/min. En base a los datos obtenidos ¿qué destinos metabólicos tuvo el resto del lactato consumido?

22) Se realiza un experimento con el objeto de caracterizar el efecto de 3 sustancias desconocidas A, B y C, sobre el metabolismo glucolítico hepático. Para ello se trabajó con homogenados de hígado, incubados en un medio apropiado al cual se adicionaron las sustancias a probar. Luego de someter distintas muestras a cada uno de los tratamientos se midieron en cada homogenado las concentraciones de metabolitos intermediarios de interés, cuyas concentraciones (µM) se encuentran indicadas más abajo. Asuma que los valores están relacionados directamente con las concentraciones citosólicas hipotéticas en células intactas.

Metabolito Control homogenado sin agregados

A B C

Glucosa-6-P 20 19 25 20

Fructosa-6-P 19 9 24 19

Fructosa-1,6-P2 10 16 6 10

Gliceraldehido-3-P + Dihidroxiacetona-P

8 12 13 8

1,3 bisPglicerato 10 12 8 10

3-P-glicerato 13 13 7 14

2-P-glicerato 13 13 8 12

P-enolpiruvato 12 7 18 12

Piruvato 14 18 5 14

Adicionalmente, cuando se ensayaron sobre hepatocitos intactos, se comprobó que ni A ni B poseían efecto sobre la concentración de metabolitos citosólicos; C en cambio, provocó efectos similares en magnitud a los de la sustancia A. Se considera que existe efecto cuando la concentración de un metabolito varía en más del 10%.En base a estos datos responda lo siguiente:a)¿A qué nivel actúan estas sustancias?b) ¿Con qué sustancias activas in vivo que Ud. conozca podría relacionar a A, B, y C? Mencione al menos una en cada caso y fundamente su respuesta.

Respuestas

1) C1 – C2 – C3 -------------------------------------------- C4 – C5 – C6 de la glucosa

corresponde a

H3C1- C2O – C3OOH y HOOC4 – C5O – C6H3 del piruvato (músculo y hematíe)

6

H3C1- C2 H2OH + C3O2 y C4O2 + OH H2C5 - H3C6 del etanol y CO2

(levaduras)

2) a) En la fermentación alcohólica, el C3 y C4 en el tubo B se liberan como CO2 marcado, disminuyendo la radioactividad final.b) No hay liberación de CO2 marcado; la radioactividad es igual a 0 y 60min para los 2 tubos.c) Sólo se libera el C3 como CO2. El tubo B tendría a los 60 min (aprox) 83 % de la radioactividad.

3)a) En el metilo del etanol. B) C3 y C4 de la glucosa.

4) Se acumula 1,6 bisfosfoglucosa, pues no hay fosfato que continue la reacción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Al agregarle arseniato a la muestra continua la fermentación, se regenera el NAD+ y puede ingresar nuevamente a oxidar al gliceraldehído 3 P por la gliceraldehído 3 P deshidrogenasa.

5) 51 %.

6) Se resuelve 1 sólo caso: tubo B 2,5 mM y tubo C 1,0 mM : 9 moles consumidos/30 min = 0,3 moles/min.

En A: agua, Pi + NaF y sacarosa ----------en C 2,5 mMEn A: Pi 50mM y sacarosa + Pi--------------en C 1,5 mMEn A: Pi + arseniato-----------------------------en C 1,0 mMEn A: Arseniato 50 mM-------------------------en C 0,9 mMEn A: Pi + NaN3-----------------------------------en C 0,625 mMEn A: Arseniato + NaN3-------------------------en C 0,32 mM

7) a) C1; b) C2; c) C3; d) C3; e) C2; f) C5; g) OAA 50% C2 y 50 % en C3

8) a) Se acumula succinato. El malonato es un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa por su semejanza estructural con el succinato.b) Se detiene el ciclo de Krebs, no se forma NADH, no se necesita O2.

9) a) Usando glucosa marcada con 14C. Ver si aparece 14CO2 en cantidades estequiométricas.b) OAA, MAL y FUM C2-C3; SUCC C2; SUCC CoA C3; Alfa Oxo GLUT C4; CIT e ISOCIT C4

c) 3

10) No. Porque en el ciclo de Krebs se producen 2 descarboxilaciones previas a la síntesis de OAA. Sólo en aquellos organismos que posean el ciclo del glioxilato.

11) a) C1,C2,C3; b) C2; c) C1,C2,C3

12) a) El fluorocitrato inhibe a la aconitasa, aumentando la cantidad de citrato.b) –OOC-CHF-COHCOO-CH2-COO-

c) La acumulación de Glc 6 P y Fru 6 P se debe a que el citrato inhibe a la enzima fosfofructoquinasa (PFK)d) Por la citrato sintasa se transforma en un inhibidor de la aconitasa. Es fatal pues también inhibe la síntesis de ATP a partir de la glucólisis.

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13) a) Glc: 40 moles/min mg de prot.; etanol: 60 moles/min mg protb) 75 % glucólisis; 25 % ciclo de las pentosas.c) 50 moles; d) 600 moles.

14) Consumo de glucosa: 4,9 moles/min 106 cél; aparición de lactato: 7,94 moles/min 106 cél; producción de NADPH: 11,6 moles/min 106 cél

15) Ciclo de las pentosas; el C3 del piruvato.

16) C1 el doble que C2.

17)a) 10 moles/min mg prot.900 75 375450 75 150

18) Defectos:1C; 3B; 4D; 6 ATratamientos: iii A y B; iiii C; iiiii A

19) En ninguno.

20) En los 6.

21) a) Gluconeogénesis; b) 0,987 moles de lactato/min ; 0,4935 moles de glucosa/min c) Se oxidó.

22) A: Fructosa 2,6 bis fosfato; B ATP- Citrato; C: Insulina.

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Glucólisis

Fermentación homoláctica. Fermentación alcohólica

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Destino de los carbonos de la glucosa

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Entrada de glucógeno, almidón, disacáridos y hexosas en la glucólisis.

11

…….

Glucólisis y gluconeogénesis. La primer etapa a partir de piruvato (y lactato) se muestra en la siguiente imagen.

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Inicio de gluconeogénesis a partir de piruvato y lactato

Gluconeogénesis. Destino del CO2 en la carboxilación del piruvato.

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Ciclo de Krebs

Esquema del ciclo de las pentosas

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Fase oxidativa del ciclo de las pentosas. El C1 de la glucosa se pierde como CO2.

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Fase no oxidativa del ciclo de las pentosas

Ciclo del glioxilato

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Síntesis del glucógeno ( siempre a partir del extremo no reductor)

Degradación del glucógeno ( siempre a partir del extremo no reductor)

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