(Aus dem Veterin~r-Bakteriologischen Institut, Sofia. Direktor: Prof. Dr. St. AngeloH.)

Wie lange halten sich Milzbrandbacillen im 0rganismus der wei6en Maus lebend ?

V o n

K. I v a n o f f und M. Sabeva, Leiter der bakt . Abt. , Tlerarzt.

Robert Koch land 14---16 Stunden nach der Infektion im Blur der mit Milz- brandkulturen infizierten weifen Mausen die ersten Milzbrandbacillen.

Frank und Lubarsch infizierten mit Milzbrandsporen Meerschweinchen, die nach 34 Stunden starben; sie fanden niemals vor 17 .Stunden, gewShnlich erst nach 22 Stunden; Baeillen im Blur. Bei Kaninchen, die subcutan infiziert wur- den, sahen sie die Bacillen erst im Blute im Moment des Sterbens, ohne dab d iese Feststellungen so regelm~Big waren, wie bei Meerschweinchen. Zum Eindringen der Milzbrandbacillen yon der Infektionsstelle in den ganzen KSrper sind naeh Sirena wenigstens 12--24 Stunden notwendig, w~hrend Wilde der Ansicht ist, dab die Bacillen massenhaft in das Blur erst im Moment der Agonie eintreten.

Bitter und Metschniko//haben Sehafe und Kaninchen mit nicht tSdlieh wir- kenden Dosen abgeschw~ehter Kultur infiziert und fanden Bacillen nur am Platze der Infektion, wo dieselben langsam eingingen.

Auf Grund der Versuche yon Nennin~j nimmt man an, da~ sieh die Bacillen der zweiten Milzbrand-Vaccine, wenn sie allein oder gleiehzeitig mit Milzbrand- serum Kaninehen injiziert werden, bis zum 6. Tage nach der Injektion auf der Injektionsstelle oder in deren Umgebung vorfinden; die inneren Organe einschlieB- lieh des Knochenmarkes sind frei yon Mflzbrandbacillen.

Die Inkubationsperiode des Milzbrand bei kiinstlicher Infektion der Schafe per os und bei kliniseher Beobachtung yon erkrankten Pferden und Rindern ist auf 2- -3 Tage festgestellt. Nach dem Dtsch. Tierseuchen-Jb. von 1900 betragt dieselbe 11/2--9 Tage.

Die I~rankheitserseheinungen sind abhs yon der Ar~ der erkrankten Tiere und der Starke der Infektion. Xach Zwicl~ sterben die Tiere an Milzbrand innnerhalb 1--3 Tage. Subakute Falle, bei denen die Tiere innerhalb 3--7 Tagen sterben, sind selten; die ehronischen Milzbranderkrankungen, die wit bei Schweinen treffen, miissen a]s Ausnahme gelten.

Als empfindliehste Tiere fiir Milzbrand miissen weife Mause, )Ieerschwein- ehen und Kaninehen angesehen werden. Mit virulenten Milzbrandbaeillen in- fizierte Kaninehen sterben im Verlauf yon 24--48 Stunden. Anfiinglich hat man l~atten fiir unempf~nglieh ftir Milzbrandhffektion angesehen; sp~tere genaue Untersuehungen haben gezeigt, daft sich auch Rat ten infizieren lassen. Wenn Frank in die BauchhShle der weil3en Rat te einen mit Milzbrandsporen impr~,- gnierten Seidenfaden einfiihrte, starben die Tiere regelm~ifig am 3. Tage an Milz- brand-Septic~mie.

538 K. Ivanoff und M. Sabeva: Wie lange halten sioh Milzbrandbacillcn

Zwick infizierte subcutan und durch Fiitterung wei~e Rattcn mit Milzbrand; dieselben erkrankten akut, subakut und chronisch und starben nach 4--38 Tagen. Alle die Infektion iiberlebenden l~atten wurden durch Ersticken get6tet; dabei land Zwick Milzbrandbacfllen nur an den Infektionsstellen - - dies sogar bei Ratten, welcho die Infektion 72 Tage iiberlcbten - - aber niemals in den inneren 0rganen.

Aus dem hier Wiedergegebenen ist ersichtlich, nach welcher Zeit und wie lange die Milzbrandbaeillen im Organismus der mehr oder weniger empfindlichen Versuchstiere gefunden wurden. In der Literatur ist aber bis heuto nichts dari~ber angegeben, wie lange Milzbrandbacillen im Organismus des emp]indlichsten Versuchstieres, der weiflen Maus, leben kSnnen.

Bei der Priifung dieser Frage gingen wir yon unseren Beobachtungen in dem Jahre 1928 aus, wonach wei]]e M/iuse, die mit formalinisierten MJlzbrandbacillen infiziert werden, sehr sp~t an Milzbrand sterben. I)iese formalinisierten Milzbrandemulsionen benutzten wir zur Gewin- hung von pr~zipitierendem Serum yon Pferden.

Am 12. XII. 1928 hatten wir 1 ccm einer solchen Emulsion subcutan der weiBen Maus 283 injiziert; di~selbo starb naeh 52 Tagen an Milzbrand. Am 15. I. 1929 injizier~en wir Maus 8 ebenfalls mi~ 1 ccm subcutan der gleichen Art Emulsion yon Milzbrandbacillen; diese st~rb nach 19 Tagen und aus ihr wurden ebenfalls Mi]zbrandbacillen geziichtet. Mit dieser Mflzbrandkultur infizierten wir Maus 30 durch Einfiihren einer ~)se in eine ttauttasche; diese Maus s~arb nach 48 Stunden.

Zur weiteren Kl~rung der Frage maehten wir nunmehr eine Reiho yon Versuehen mit Milzbrandemulsionen, die mit Formalin in ver. schiedenen Prozenten versetzt waren (Tab. A).

Die Mflzbrandemulsion bereiteten wit aus einer 24s~iindigen Mflz. brand-Agar-Kultur yon grol~en Kolle-Flaschen; jeder Flasche wurde mit 10--15 eem physiologischer Kochsalzl6sung abgeschwemmt und zu dieser dichten Aufsehwemmung fiigten wit Formalin 3--70/00 hinzu. Naeh dem Formalinzusatz liel3en wir die Emulsion im Brutschrank 48 Stunden lang stehen und kontrollierten nachher durch Uberimpfen atff Agar- oder Bouillon.RShrchen, ob die Bacillen abget6tet waren. Die ~berimpfung machten wir mit einer Pasteur-Pipette, um eine grol~e Menge yon Bakterien auf bzw. in die Nihrb6den zu bringen. Die so beimpften Agar. und Boufllon-l~6hrchen lieBen wir 24 48 Stunden im Brutsehrank. GewShnlich fanden wir naeh Ablauf dieser Fris~ die R6hrchen sterfl, Was anseheinend dafiir sprach, dab die Milzbrand- baeillen und Sporen get6tet waren. Alsdann nahmen wit die Injektion der weil]en Ms vor. Das Ergebnis der Tierimpfungen ist aus der Tab. B ersiehtlieh. Im einzelnen verliefen unsere Versuehe wie folgendes Beispiel zeigt:

Am 12. II. 1932 warde die Emul~on A vier M~usen ~uf dem Riicken subcutan tnjizier~. 2 M~use st~rben 3, die 3. starb 4 und die 4. 5 Tage nach der Injektion.

im Organismus der weillen ,Maus lebend? 539

Tabelle A. Die zu den Versuchen benutzten Emulsionen.

- ~ , Verwendeto Emulsion D i e Tiere

i For- I Injektions- sl~a?einge.Tagennach Herstellungsart !malin- Alter

zusatz dosis ~

Bemerkungen

V-

f -

I

5 Kolle- Schalen 4~ 48 Std. bei 37 ~ 24stiind. Kultur, 48 Std. bei 37 ~ abgesehwemm~ 48 Std. bei 37 ~

in 100 ccm phy- 2 Tage bei 37 ~ siolog. Koehsalz- 3 Tage bei Z.T. 1

]6sung 2 Tage bei 37 ~ 8 Tage bei Z.T.

Wie bei Serie A

Kolle-Schalen, sonst wie bei A

in ,

~-~6- 24s

siol

H

6 Kolle - Schalen 24 stiind. Kultur, abgeschwemmt ~

in 150 ccm phy- siolog. Kochsalz-

16sung 6 Kol le- Sehalen 4~ 24s~find. Kultur, abgesehwemmt

in 100 ccm phy- ~iolog. Koehsalz-

16sung Kolle-Seh~lenl 5-~0o

24stfind. Kultur , I abgeschwcmmt I

in 500 ccm phy- I siolog. Kochsalz- I

16sung 4 ~ - K o n ~ l 6~/o0 24 s~find. Kultur, I abgesehwemmt I

in 600 ecru phy- I siolog. Kochsalz- I

16sung 30/o0 5 Kolle - Sehalen

24 stiind. Kultur , I abgesehwemm~ I

in 120 cem phy-] siolog. Kochsalz-

16sung

0,5 ccm 1 e c r u

0,6 cem a

2 - -5 3 - -5

2 T a g e b e i 3 7 ~ 0,5 ccm 9--19 32 Tage bei ZT. +0 ,5 ccm 4

0,5 cem 5 3 Tage bei 37 ~ I 1-~l~m--cm 3 Tage bei 37 ~ 1 cem 21 TagebeiZ.T. 2 Tage bei 37 o ~

Verd. I : 3 2 Tage bei 37 ~ ~

Verd. 1 : 3

3 Tage bei 37 ~ u. 4 Tage Z.T. Verd. 1 : 3

Y

0,25 ccm 27 d. Verd.

1 :3 6 3 - 8 4

3 Tage bei 37 o - 1 - ~ Verd. 1 :

2 T a g e b e i 3 7 ~ ~ , __ j . d.

I 5 Tage bei 37 ~ 0,5eemd. :'28--417 u. 12 Tage Z.T. Verd. 1:2 ,

~ Z i m - mertemperatur 1 Tier 2 Tiere

4 Milzbrandser. Wesselin. 1 Tier 2 Ticre

m

Diese 6 Kolle- Sehalen waren f. C u. D geziichte~; die Keime wurd. ausgewasehen u. nochm, bebriitet

5 4 0 K , I v a n o f f u n d hi . S a b e v ~ : W i e l a n g e h u l t e n s i c h ~ [ i l z b r a n d b a c i l l e n

oqo~,t-.r[oasu

Zl!i ~

~nlqz,r~lq"

OliO:~s+uot+~to [uI

++i.ti s

"~ :+nlqz~ott

':r P~T uaqau.ro~qas:too~

-gg+ .g+,: ~ce-.

oqo,~-!IOO~ V

OlIa~uo!~r[o.tuI

~nlqzaott

~[.t N

�9 ~ ~.nlqzaa~r

'a~ Taat[o u to~qag.zoo~s

+ + + + + + + + + + + q - q - + + + + + + ++"

+ + q - - l - + + + + +++

+ - t - - t - q - + + + + + + - } - - I - + + + + I + + +4-+

-+-+-+-+ - + - + + + + + + +- i -+-+--+- I + + J-t-+

+ + - l - + + + + I - t - + + - t - + - l - + - t - I + + I+§

+ - t - + + + q - q - + + q - q - - l - q - + + + t + + I+'+

- l - + + - t - + + + - k -J-q--+- + + + + - t - l - t - + J+"

4 - - ~ i

-~ +e-~ +-'+ , + - 4 - . -

+- +~ �9 -t.-- + - - "-t.-- - i - - ,-+

+ m E e >

2 ~

+.to!,1-, aop [q+zu V

im 0rganismus der weiBen Maus lebend ? 5 4 1

�9 . : . ~ ,~ ~

:o .,~

§ 2 4 7 § § 2 4 7 1 § I § I § 2 4 7 I

§ § +- I 1 § 11 I

§ § § I I § I I I

§ § § I i § I I I

+ + § I I + I I I

+ + + I I + J I I

+ + + I 1 + I I I

X X X X

X X

X X X X

g

:0

li

: + + + + + + + + + + + I + + + x ~ + + + - I - -t- I I + + + + I + + +

+ + - k + + J I § 2 4 7 2 4 7 2 4 7 .. l W § 2 4 7

: + + + § § ] I + + + + 1 + + +

: 1 + + + + + [ - k - k § 2 4 7 F § 2 4 7

i ~ + + + + + I + + + + [ + § li

i+ f - - F § § I ' § 2 4 7 2 4 7 I + § 2 4 7 .:2

;, .+- o .,,.- .N

Zeitschr. I. Hygiene . Bd. 114. 36

542 K. Ivanoff und M. Sabeva: Wie lange halten sich Milzbrandbaeillen

Von allen gestorbenen M~usen wurde eine bakteriologische ~ntersuchung gemacht und die mikroskopische und kultm-elle Untersuchung vom I-Ierzblut, der ~ilz und der Injektionsstelle vorgenommen. Die Praparate wurden nach der Methode yon Klett gefarbt. Von den inneren Organen jeder Maus (tterz, Milz und Leber) wurden serologische Untersuchungen nach Ascoli ausgefiihrt. Den Ex- trakt ffir diese Untersuchungen gewannen wir durch 10 Minuten langes Kochen der 0rgan-Aufsehwemmung in KochsalzlSsung und Filtration dutch Filtrierpapier, welches mit Kieselgur imprhgniert war.

Am gleichen Tage mach t en wir die Versuche mi t den Serien I I A und I I I A (s. Tabelle) u n d am 15. I I . m i t der Serie IV A, am 20. I I . m i t V A und am 16. I I I . 32 mi t V I A . Die Versuche mi t Serie I ]3 wurden am 23. I I . 32 , I I ]3 am 15. I I I . 32, I C am 18. I I I . 32, I D am 18. I I I . 32, I E am 23. I I I . 32, I F am 14. IV. 32, I G am 27. V. 32 u n d I H am 2. V I I I . 32 vorgenommen. Besonders geschildert seien noeh die Ver- suche der Serie G.

Versuche mit Emulsion G. Diese Emulsion wurde am 22. IV. 1932 yon 40 Kolle- flaschen einer 24stiindigen Milzbrandkultur bereitet, welche in 600 ccm physio- logischer Kochsalzl5sung unter Zusatz yon 6~ Formalin abgeschwemmt wurden. Die Emulsion wurde 48 Stunden im Thermostat gelassen und dann dutch ~ber- impfen auf je 2 Agar- und Bouillonr6hrehen auf ihre Sterili~t geprfift.

Am 27. V. 1932 wurden 6 weiBe M~use subcutan am Rticken mit 0,25 ccm Emulsion injiziert, nachdem die Emulsion, 1:2 mit physiologischer Koehsalz- 15sung verdtinnt, inzwischen bei Zimmertemperatur gestanden hatte. Am 27. VII., also 2 Monate nach der Injektion, waren s~mthche M~use noch am Leben. Von die- sen 6 M~usen sonderten wir 3 Stiick ab, um sie dutch Ersticken und Hungern zum Eingehen zu bringen. Zu diesem Zweeke haben wir die 3 Mause am 27. VII. in einen Glaszylinder 1 Stunde im Thermostat gelassen; am 28. VII. wiederholten wir denselben Versuch, jedoeh 11/~ Stunde lang; nach dem Herausnehmen aus dem Thermostat beniil~ten wit die Tiere mit kaltem Wasser und heBen sie dann im Zylinder ohne Futter. Die ~ iuse starben am 29. VII. und 1. VIII. 1932. Bei einer der eingegangenen M~use verlief nur die Ascoli-Reaktion positiv, bei der 2. waren s~imtliehe Untersuehungen negativ; bei der 3. Maus baben wir jedoch mikroskopisch einzelne Milzbrandbacillen ohne Kapse]n festgestellt. Durch Impfen auf kiinstliehe N~l~'bSden konnten wir Milzbrandbaeillen nachweisen.

Zur Kontrolle setzten wir in denselben Zylinder, in welchem sich die 3 Mttuse aus Serie G befanden, eine weitere Maus unter denselben Verhaltnissen. Auch diese Maus starb nach 4 Tagen. Die Untersuehung wurde genau so vorgenommen, wie bei den anderen Mausen. Wir konnten jed0eh keine positiven Resultate ffir Milzbrand erhalten. Die Ascoli-Reaktion fiel negativ aus.

Wei tere Versuche s tel l ten wir in der Weise an, da~ wir infizierte, aber am Leben gebl iebene weil3e M~use, und zwar 2 aus Serie I C, 1 aus Serie I D u n d 3 aus Serie I E, u n d als Kont ro l le 2 normale weiBe M~iuse am 11. IV. mi t M~iusetyphus i~ffizierten; ebenso am 13. V I I I 3 Mause aus Serie I G z u s a m m e n mi t einer no rma len Kont ro l lmaus . Die Infek- t ion mach t en wir m i t einer 24s t i indigen Bouf l lonkul tur des Bacillus typh i m u r i u m (auf ]3rot). Durch die ki inst l iehe In fek t ion mi t MiSuse- t yphus woll ten wir den Organismus sehw~ehen u n d so die Milzbrand- In fek t ion au f f l ammen lassen. Der Verlauf des Versuches war folgender.

im Organismus der weiBen Maus lebend? 543

Von den M~usen der Serie C starb eine am 14. IV., also 27 Tage, die andere am 18. IV., also 31 Tage nach der Milzbrandinfektion. Bei der am 14. IV. gestor- benen Maus fandcn wir bei der mikroskopischen Untersuchung einige Baeillen sehr ~hnlich dem Mi]zbrandbacillus, aber ohne Kapsel. Dutch Verimpfen auf N~hrb6den isolierten wir aus alien Stellen Milzbrandbacillen. Die Ascoli-Reaktion verlief positiv. Bei der am 18. IV. gestorbenen Maus ergaben sich bei der mi- kroskopisehen Untcrsuchung und durch Abimpfen auf kfinstliche N~hrb6den keine Mflzbrandbacillen, dagegen M~use-Typhus-Bacillen. Die Ascoli-Reaktion war positiv.

Die Maus aus Serie D starb nach der Infektion mit M~use-Typhus-Bacillen am 15. IV., also 28 Tage naeh der Milzbrandinjektion. Bei allen Untersuchungen wurde Mflzbrand konstatiert. Bei der mikroskopischen Untersuchung fanden wir einzelne Bacfllen mit nieht so sch6n gefarbter Kapsel.

Von den 3 mit M~use-Typhusbacillen infizierten M~usen der Serie E starben die beiden ersten am 19. IV., also 27 Tage nach der Milzbrandinfektion. Am 25. IV. starb die 3. Maus, also 33 Tage naeh der Milzbrandinfektion. Bei den am 19. IV. gestorbenen beiden Mausen konnten wir bei der mikroskopischen Untersuchung und bei Impfung auf kiinstlichen l~ahrboden keine Milzbrand- baeillen feststellen; wir haben lediglich Mause-Typhusbacillen isoliert. Die Ascoli- Reaktion war positiv. Bei der am 25. IV. eingegangenen Maus haben wir bei allen Untersuehungen Milzbrandbacillus festgestellt.

Von den Mausen der Serie G starben die erste (und die Kontrollmaus) am 17. VIII. Die 2. Maus am 18. VIII. und die 3. am 19. VIII., also 82--84 Tage nach der Milzbrandinjektion. Bei allen M~usen wurden alle Untersuchungen vorgenommen, wie bei den frfiheren SelSen. Die 1. )laus und die Kontrollmaus gaben keine positive Ascoli-Reaktion und alle anderen Untersuehungen auf Milz- brand verliefen negativ. Bei den anderen M~usen war die Ascoli-Reaktion positiv ffir Milzbrand, bei allen Untersuchungen konnten wir keine Mflzbrandbacillen isolieren.

E i n weiteres beachtenswer tes Unte rsuehungsergebnis war folgendes.

Da nicht alle Kulturen in dem obenerwahnten Versuch reine Milzbrand- kulturen lieferten, sondern mit Bacillus Proteus fiberwuehert waren, infizierten wir am 3. VIII. eine Maus mit einer Platin6se yon Agarkultur in Hauttasehe, um so eine Reinkultur zu bekommen. Am 5. VIII. starb diese Maus an Milzbrand; wir isolierten eine reine Milzbrandkultur. Parallel mit diesem Versuch erhitzten wir alle mit Proteus verunreinigten Bouillonr6hrchen und Aufschwemmungen von Agarkulturen in physiologiseher KochsalzlSsung 1 Stunde bis auf 80 ~ und maehten Aussaaten mit der Pasteur-Pipette auf Agar- und Bouillonr6hrchen; n~eh 24 stfindiger Bebriitung konnten wir auch so Reinkulturen yon Milzbrand- bacillen von allen Untersuchungsstellen bekommen.

Diese so isolierten, also zum Teil auch aus Sporen s t a m m e n d e n Mi lzbrandkul tu ren haben wh" auf ihre Virulenz an Mdiusen, Meerschwein- chen und Kaninchen ge19rii/t. Zu diesem Zwecke macl l ten wir am 13. V I I I .

eine Auf schwemmung yon Milzbrandbaci l len von einer P la t in6se in

50 cem physiologischer Kochsalzl6sung. Der K o r k e n der F lasche wurde

paraff in ier t und im Verlauf yon 5 - - 1 0 Minuten mi t der H a n d gu t ge-

schfit telt , zum Zweck, eine feine Emuls ion zu bekommen. Von dieser

Emuls ion in j iz ier ten wir ein K a n i n c h e n mi t 0,5 ccm und ein Meersehwein-

then mi$ 0,25 cem subcu tan auf die rech te Brustse i te sowie eine weiBe

36*

544 K. Ivanoff und M. Sabeva : Wie lange ha1~en sich Milzhrandbacillcn lebend ?

Maus mi t 0,25 ccm subcutan auf den Riicken. Alie Tiere sind an Milz- b r a n d gestorben, das Kaninchen nach 4, das Meerschweinchen naeh 2 und die Maus 1 Tag nach der Injektion.

Es sei nochmals betont, dab yon allen gestorbenen und getSteten M~usen und yon den Kontroli t ieren in alien Serien si~mtliche Unter. suchungen so gemacht wurden, wie sie bei Serie I A geschildert wurden. Die bereiteten Milzbrandbacilien-Aufschwemmungen dienten uns, wie eingangs erwiihnt, auch zur Injekt ion von Pferden, um pr~zipitierendes Milzbrandserum zu gewhmen.

Aus unseren Untersuchungen kSnnen wir folgende Schli~sse ziehen. 1. Mit versehieden starken Formaliimus~tzen behandelte Mflzbrand-

bacillen und -sporen, wvlehe beim ~]berimpfvn auf kfinstliche N~hrbSden kein Waehs tum mehr zeigen, kSnnen sich im Tierversueh als lebens- f~hig erweisen.

2. Die Lebensdauer der M~use nach Einspritzung formalinisierter Milzbrandemulsion ist ~bhi~ngig yon der Konzentrat ion und Dauer der Einwirkung des Formalins und der Menge der injizierten Emulsion.

3. Mit Formalin behandelte Milzbrandbacilien kSnnen im KSrper des empfindlichsten Versuchstieres, der weil~en Maus, 65 Tage leben, ohne das Tier zu tSten.

4. Die 65 Tage lang im TierkSrper verbliebenen Mflzbrandkeime behielten ihre ursprfingliehe Virulenz, die sie vor der Behandlung mR Formalin und vor der Injekt ion in den Tierk6rper besaBen.

5. Organe yon am 83. und 84. Tage nach der Milzbrandinfektion intercurrent gestorbenen M~usen gaben noch positive Aseoli-Reaktion.

Literaturverzeichnis. Bierbaum u. Boehncke, Arch. Tierheilk. 52, 192. - - Ivano//, K., Z. Hyg. 113

(1932). - - Poppe, K., Neue Ergebnisse der Milzbrandforschung und Milzbrand- bek~mpfung in Weichardts Erg. Hyg. 5 (1921). - - Sobernheim, G., Milzbrand im Handbueh der pathogen. Mikroorganismen yon Kolle, Kraus, Uh]enhuth, 3, 3. Aufl., 1042 (1931). - - Zwick, W., Z. Inf.krkh. ttaustiere 14, 31 (1913) - - Zbl, Bakter. I Orig. 57, 271 (1913). --Weitere Literaturangaben siehe bei Sobernheim.