25
Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian
Pengambilan sampel tanah dari lahantambang timah di Belitung
Isolasi bakteri pengoksidasibesi dan sulfur
Pemurnian isolat bakteri
Karakteriasi isolat bakteripengoksidasi besi dan sulfur
Pengamatanmakro
morfologi
PewarnaanGram
Pengamatanmikro
morfologi
Seleksi Bakteri Pengoksidasi Besi dan SulfurBerdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium
Yang Mengandung Fe dan S
Identifikasi Isolat Bakteri TerpilihSecara Molekuler
Sekuensing
Analisis urutan sekuen gen 16S rRNA
26
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan
No. Nama Alat Merk/Type Kegunaan Tempat1. Autoklaf HL36AE (Hirayama
Manufacturing Corp.)Sterilisasi alat dan bahan Lab. Mikrobiologi
2. pH meter Thermo ElectronCorporation (RL060P)
Mengukur pH medium Lab. Mikrobiologi
3. Shaker Inkucator Lab Companion SI-600 Menginkubasi biakan bakteri Lab. Mikrobiologi4. Alat elektroforesis CBS Scientific EPS – 300X Memisahkan DNA
berdasarkan berat molekulLab. Genetika danMolekuler
5. Nanophotometer Implen Mengukur kemurnian DNA Lab. Riset6. Alat PCR Thermal Cycler Techne
(TC-5000)Perbanyakan DNA tempat Lab. Riset
7. Gel Doc UVP MultiDoc-It Visualisasi DNA Lab. Genetika danMolekuler
8. Mikroskop Olympus CO11 Mengamati sel bakteri Lab. Mikrobiologi9. UV-Vis
SpektrophotometerShimadzu UV mini 1240 Mengukur nilai OD Lab. Lingkungan
10. Sentrifuge Eppendorf Centrifuge5415R
Memisahkan supernatan Lab. Genetika danMolekuler
No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan1. Alkohol 70% Sterilisasi permukaan2. SDS 10% Lisis sel bakteri3. Tenderizer 30% Lisis sel bakteri4. Alkohol absolut 99% Pencuci DNA5. TE 1x Larutan Buffer6. TAE 1x Larutan Buffer7. Primer 27F dan 1540R 100 pm Templat replikasi DNA genom8. Agarose 1,5% Running DNA saat elektroforesis9. HCl 10 M Menurunkan pH medium
27
Lampiran 3. Gambar Hasil Isolasi dan Pemurnian Isolat Bakteri Pengoksidasi Besi danSulfur
Hasil isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
Hasil pemurnian isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur
28
Lampiran 4. Gambar Hasil Pewarnaan Gram
29
Lampiran 5. Komposisi dan Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri
a. Medium Cair dari Dunger and Fielder (1989) dengan garam ferro
Komposisi :
K2HPO4 0,05 gram
(NH4)2SO4 0,15 gram
Ca(NO3)2 0,01 gram
MgSO4. 7H2O 0,50 gram
KCl 0,05 gram
FeSO4. 7H2O 1,00 gram
Akuades 1000 ml
pH 3,5
Cara Pembuatan Medium :
Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali
FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C dan didinginkan. FeSO4. 7H2O,
dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya, sebesar
3,5 dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut
kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam tabung yang
telah steril.
30
b. Medium Padat 9K (Silverman and Lundgreen, 1959)
Komposisi :
K2HPO4 0,05 gram
(NH4)2SO4 0,15 gram
Ca(NO3)2 0,01 gram
MgSO4. 7H2O 0,50 gram
KCl 0,05 gram
FeSO4. 7H2O 1,00 gram
Agar 15 gram
H2SO4 1 N 10 ml
Akuades 1000 ml
pH 3,5
Cara Pembuatan Medium :
Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali
FeSO4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121˚C kemudian didinginkan. FeSO4.
7H2O dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan pHnya
sebesar 3,5 dengan H2SO4 1 N, dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan.
Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi
ke dalam cawan petri yang telah steril.
31
Lampiran 6. Kromatogram Urutan Basa Gen 16S rRNA
a. Isolat L2K5
b. Isolat L2K3
32
c. Isolat L1K1
33
Lampiran 7. Hasil Alignment Sekuen Forward dan Reverse Urutan Basa Gen 16S rRNAdengan Program BioEdit
a. Isolat L2K5
AATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGA
b. Isolat L2K3
GTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT
34
GTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGAT
c. Isolat L1K1
GAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGAGCGTCCACCGCATGGTGGGTGTTGGAAAGATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGTCCGGGGCTTAACCCCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTTCTCGATCGCCGTAGAGATACGGTTTCCCCTTTGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACGTCGTGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTTAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCAGCGATT
35
Lampiran 8. Hasil Analisis Sekuen 16S rRNA dengan Program BLASTN NCBI
a. Isolat L2K5
d. Isolat L2K3
36
e. Isolat L1K1