Spektroskopske metode
*Interakcija molekula i elektromagnetskog zračenja
•Detekcija, identifikacija i odredjivanje koncentracije
•Detaljna struktura molekula
Elektromagnetni talas
talasna dužina
pravac prostiranja talasa
-talas i čestica (foton)
talasna dužina brzina svetlosti
frekvencija
rastojanje
-foton ima diskretnu količinu energije ili kvant (E=h)
vidljiva oblast
radio talasi mikrotalasi infracrveni ultraljubičasti X zraci γ zraci
niska frekvencija visoka frekvencija
velika talasna dužina mala talasna dužina
Shematski prikaz elektromagnetnog spektra
(400-750 nm)
(UV-180-400 nm)(IC)
APSORPCIJA; EMISIJA; RASEJAVANJE
Spektrofotometrija (IC, UV, vidljiva)
NMR
Fluorescencija
Laserska spektroskopija
E2 - E1 = hν, E = hν = h(c/λ) h= 6,63·10-34 Js
I = I0·10-εcl log(I/I0) = - εcl log(I0/I) = εcl = A
Lamber – Berov zakon:h - Plankova konstanta
Difrakcija x-zraka
T = I/I0 T - transmisija apsorbancija
Energija
rotacioni energetski nivoi vibracioni nivoi, u okviru elektronskog energetskog nivoa
Energetski prelazi elektrona pri apsorpciji svetlosti (UV i vidljiva) –ekscitacija
-vibracije se ekscituju infracrvenom svetlošću, a rotacije mikrotalasima
n →π*, π→π*
Kontinualnost apsorpcionih spektara, jer je svaki energetski prelaz elektrona praćen vibracionim i rotacionim prelazima
Primeri energetskih prelaza elektrona u peptidnoj vezi pri apsorpciji svetlosti:
tranzicije na 190 nm,
na 210-220 nm
energija
λ
A
Apsorpcioni spektar tirozina i triptofana
triptofan
tirozin
Spektrofotometrijske analize
upadna svetlost propuštena svetlost
rastvor
kiveta
A apsorbancija
molarni ekstinkcioni koeficijent koncentracija
dužina puta svetlosti
A = OD (optička gustina)
OD – merenje turbidnosti (odbijene svetlosti)
T=I0/I
Komponente spektrofotometra
lampa monohromator
kiveta sa uzorkom
detektor
Kivete za spektrofotometar
spektrofotometar
-kvarcne
-staklene, polistirenske
Primena UV i vidljive spektrofotometrije:
-Identifikacija supstanci
-Odredjivanje koncentracije
-Procena čistoće izolata
-Detektovanje i praćenje konformacionih promena
DNK: 1OD260 – 50 g/ml
RNK: 1 OD260 – 40 g/ml
proteini: c (mg/ml)=1,55xA280 – 0,76xA260
olorimetrija: Lowry, Bradford; difenilaminska, orcinolska reakcija
A260/280=1,8
-izgled spektra zavisi od pH, koncentracije, polarnosti rastvarača, strukturne organizacije molekula, uključivanja u polimernu strukturu
Na izgled spektra utiču: pH, polarnost rastvarača, koncentracija supstance, interakcija sa sredinom i drugim molekulima...
jednolančana DNK
dvolančana DNK
λ
A
hipohromizam (smanjenje apsorpcije)hiperhromozam“crveni šift”-batohromni efekat“plavi šift” – hipsohromni efekat
fluorescencija
apsorpcija
A
apsorpcija
emisija
talasna dužina
rastojanje između atoma,
energija ekscitiranog stanja
prenos energije
fluorescencija
ekscitacijaenergija osnovnog stanja
Fluorescentni spektri
Q – kvantni prinos=(broj emitovanih fotona) / (broj apsorbovanih fotona)
Fluorescencija tirozina
Obeležavanje proteina fluorescinom
TGase - transglutaminaza
Fluorescentna boja SYBR Green interkalira se samo u 2s DNK-primena u RT-PCR
Primena fluorescentnih boja kod sekvenciranja DNK
Fragmenti koji se sintetišu u reakcijama obeležavaju se fluorescentno. Jedan od načina obeležavanja je primena obeleženih dideoksinukleotida. Svaki dideoksi nukleotid (ddT, ddA, ddC, ddG) obeležen je posebnom fluorescentnom bojom. Fragmenti koji nastaju u reakciji i koji se završavaju odgovarajućim dideoksi nukleotidom, razdvajaju se elektroforezom i detektuju na osnovu odgovarajuće fluorescencije.
fragment koji se sekvencira
sintetisani komplementarni fragmenti, koji se završavaju sa ddT
2.kretanje fragmenata DNK
fragmenti, sintetisani u reakcijama i obeleženi fluorescentnim bojama, dužina koje se razlikuju za jedan nukleotid, razdvajaju se na kapilarnom gelu kao pojedinačne trake; gel se skenira laserskim zrakom, fluorescencija se pobuđuje i detektuje
detektor
laserski zrak
laser
Kompjuter prevodi zapis fluorescencije u sekvencu DNK
zapis detektovanih fragmenata (traka)
sekvenca DNK
Primeri korišćenja fluorescentnih boja za analizu ekspresije gena
Izolovanje iRNK iz dva različita uzorka (stadijuma razvića)
Sinteza i obeležavanje cDNK primenom fluorescentno obeleženih nukleotida
iRNK
cDNK
reverzna transkriptaza
Nanošenje cDNK na pripremljene mikroereje; cDNK prepoznaju komplementarne sekvence na mikroereju i vezuju se za njih
mikroerej ploča
odstranjivanje nehibridizovene probe
Svaka fluorescentna tačka predstavlja gen eksprimiran u uzorcima
Izgled DNK čipa, sa fluorescentno obojenim probama
Izdvajanje ćelija koje eksprimiraju fluorescentno obeležene proteine pomoću FACS-a
Struktura zelenog fluorescentnog proteina (GFP), često korišćenog u obeležavanju rekombinantnih proteina
suspenzija ćelija
detektori
analizatorlaser
-praćenje jednog molekula u živoj ćeliji, u “realnom” vremenu- prostorna rezolucija 1-10 nm, vremenska rezolucija < 1 ns- BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy
• distance-dependent interaction between the electronic excited states of two dye molecules in which excitation is transferred from a donor molecule to an acceptor molecule without emission of a photon.
• The mechanism of fluorescence resonance energy transfer involves a donor fluorophore in an excited electronic state, which may transfer its excitation energy to a nearby acceptor chromophore in a non-radiative fashion through long-range dipole-dipole interactions. The theory supporting energy transfer is based on the concept of treating an excited fluorophore as an oscillating dipole that can undergo an energy exchange with a second dipole having a similar resonance frequency. In this regard, resonance energy transfer is analogous to the behavior of coupled oscillators, such as a pair of tuning forks vibrating at the same frequency.
• The process of resonance energy transfer (RET) can take place when a donor fluorophore in an electronically excited state transfers its excitation energy to a nearby chromophore, the acceptor. In principle, if the fluorescence emission spectrum of the donor molecule overlaps the absorption spectrum of the acceptor molecule, and the two are within a minimal spatial radius, the donor can directly transfer its excitation energy to the acceptor through long-range dipole-dipole intermolecular coupling.
•Donor and acceptor molecules must be in close proximity (typically 10–100 Å).
•The absorption spectrum of the acceptor must overlap the fluorescence emission spectrum of the donor (see Figure).
•Donor and acceptor transition dipole orientations must be approximately parallel.
Schematic representation of the FRET spectral overlap integral.
Primary Conditions for FRET
Strategy for detection of protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer and mutant fluorescent proteins. If two proteins, one labeled with BFP (the donor) and the other with GFP (the acceptor), physically interact, then increased intensity at the acceptor emission maximum (510 nanometers) will be observed when the complex is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor. Failure of the proteins to form a complex results in no acceptor (GFP) fluorescence emission.
A typical investigation of intracellular protein-protein association in a living cell culture is illustrated in Figure for events associated with apoptosis, a physicological process of cellular death resulting from an intricate cascade of sequential interactions. Gene products directly involved in the chain of events can be labeled by fusion to appropriate members of the fluorescent protein family (in this case, BFP and GFP) for co-expression in the same cell in order to probe specific associations by FRET. The proteins involved with apoptosis interact within the mitochondria and display a gradual decrease in binding as programmed cell death proceeds. Thus, an image of donor emission (Figure 8(a)) contains only fluorescence from the BFP-labeled proteins, while the corresponding acceptor emission profile (Figure 9(b)) illustrates signals due to proteins labeled with GFP (and some contribution from donor emission). A FRET filter (Figure 8(c)) reveals fluorescence derived from resonance energy transfer between the two proteins
visoki napon
kapilara rastvor uzorka
-jonizacija uzorka-
analizator mase
Masena spektrometrija, kao vid spektroskopije kod koje se informacije o molekulu ne dobijaju na osnovu njegove interakcije sa elektromagnetnim zračenjem
Masena spektroskopija
Izgled masenog spektra
(određivanje molekulske mase, Mr, proteina)
m – masa
z - naelektrisanje
Sistemi za jonizaciju molekula:
ESI –Electrospray Ionisation
FAB – Fast Atom Bombardment
MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)
Analizatori:
TOF (Time of Flight)
quadrupoles
Tandemska masena spektrometrija MS/MS ili MS2
Tandemska masena spektrometrija – primena za sekvenciranje proteina
Princip nuklearne magnetne rezonancije (NMR)
Apsorpcija energije dovodi do reorijentacije spina jezgra aroma
apsorbovana energija
povećanje frekvencije
rezonancija
relativna energijaenergija primenjenog elektromagnetnog zračenja
13C19F, 31P
radio talasi
Apsorpcija zračenja dovodi do promene pravca momenta spina jezgra
vreme
magnetno polje
frekvencija
Hemijski “šift”:
Href-H)/Href)x106
ppm
“cepanje traka”
Rekonstrukcija trodimenzionalne strukture proteina na osnovu NMR spektara
Trakasti modeli strukture proteina
Primer primene NMR spektroskopije u proučavanju interakcije proteina i nekog malog molekula (inhibitor)
Difrakcija x – zraka, koja se koristi, kao i NMR, za određivanje konformacije proteina
izvor x-zraka
snop x-zraka
kristal proteina
skretanje zraka
slika (pattern) nastala difrakcijom x- zraka na kristalu proteina
model strukture proteina, rekonstruisan na osnovu analize difrakcione slike kristala
Cirkularni dihroizam (CD) – razlika u apsorpciji levo i desno cirkularno polarizovane svetlosti
Primena cirkularnog dihroizma (CD) u analizi strukture proteina (procena sadržaja sekundanih struktura, promene konformacije proteina)
električno polje
električno polje
ploča slučajno ispresavijani lanac
heliks
talasna dužina (nm)
CD spektar za mioglobin